Công nghệ sinh học của acid citric sản xuất

Bên cạnh đó axít citric còn dùng để sản xuất các chất trao đổi ion dùng để làm mềm nước bằng cách tách ion kim loại ra khỏi phức citrat.. A.niger được nuôi để sản xuất nhiều chất trong c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VI SINH VẬT

 Giảng viên: TS Nguyễn Thị Bạch Huệ

 Đề tài: Công nghệ sinh học của acid citric sản xuất

 Thành viên_Nhóm 4:

Nguyễn Thị Xuân Diệu 1118061

20/10/2014

Mục lục

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 1

I Axit citric 3

1) Giới thiệu 3

2) Thông tin tổng quát 3

- Tên theo IUPAC: 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid 3

3) Tính chất 3

4) Lịch sử tìm ra 4

5) Sản xuất 4

6) Ứng dụng 4

II. Aspergillus niger 5

1) Giới thiệu A niger 5

2) Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid citric 5

3) Môi trường 6

III Sản xuất acid citric 9

1) Các phương pháp sản xuất acid citric 9

a Phương pháp lên men bề mặt 9

b Phương pháp lên men chìm 11

2) Công nghệ sản xuất acid citric bằng phương pháp lên men chìm sử dụng nấm mốc Aspergillus niger 12

3) Các yếu tố quyết định đến quá trình sản xuất acid citric 14

IV Tình hình sản xuất acid citric hiện nay 15

V Hướng tương lai trong sản xuất acid citric 15

I Axit citric

1) Giới thiệu

• Axít citric là một axít hữu cơ thuộc loại yếu và nó thường được tìm thấy trong các loại trái cây thuộc họ cam quít Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua Ở lĩnh vực hóa sinh thì axít citric đóng một vai trò trung gian vô cùng quan trọng trong quá trình trao đổi chất xảy ra trong các vật thể sống

• Ngoài ra axít citric còn đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với môi trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa Axít citric có mặt trong nhiều loại trái cây và rau quả nhưng trong trái chanh thì hàm lượng của nó được tìm thấy nhiều nhất, theo ước tính axít citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô của trái chanh

2) Thông tin tổng quát

- Tên theo IUPAC: 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid

- Tên thông thường: axit chanh

- Công thức phân tử: C6H8O7

- Công thức cấu tạo:

- Khối lượng phân tử: 192.13 g/mol

- Có dạng: tinh thể màu trắng

3) Tính chất

• Tính axít của axit citric là do ảnh hưởng của nhóm carboxyl -COOH, mỗi nhóm carboxyl

có thể cho đi một proton để tạo thành ion citrat Các muối citrat dùng làm dung dịch đệm rất tốt để hạn chế sự thay đổi pH của các dung dịch axít

• Các ion citrat kết hợp với các ion kim loại để tạo thành muối, phổ biến nhất là muối canxi citrat dùng làm chất bảo quản và giữ vị cho thực phẩm Bên cạnh đó ion citrat có thể kết hợp với các ion kim loại tạo thành các phức dùng làm chất bảo quản và làm mềm nước

• Ở nhiệt độ phòng thì axít citric tồn tại ở dạng tinh thể màu trắng dạng bột hoặc ở dạng khan hay là dạng monohydrat có chứa một phân tử nước trong mỗi phân tử của axít citric Dạng khan thu được khi axít citric kết tinh trong nước nóng, trái lại dạng monohydrat lại kết tinh trong nước lạnh Ở nhiệt độ trên 74oC dạng monohydrat sẽ chuyển sang dạng khan

• Về mặt hóa học thì axít citric cũng có tính chất tương tự như các axít carboxylic khác Khi nhiệt độ trên 175oC thì nó phân hủy tạo thành CO2 và nước

4) Lịch sử tìm ra

• Vào thế kỷ thứ 8 nhà giả kim thuật Jabir Ibn Hayyan người Iran đã phát hiện ra axít citric Các học giả châu Âu thời trung cổ cũng đã biết về axít tự nhiên trong chanh, những kiến thức sơ bộ về axít này cũng đã được ghi nhận vào thế kỷ XIII Axít Citric được nhà hóa học người Thụy Sĩ tách được vào năm 1784, ông đã kết tinh được axít citric từ nước chanh ép Năm 1860 ngành công nghiệp nước ép trái cây của Ý đã đưa công trình sản xuất axít citric vào hoạt động

• Năm 1893 C Wehmer đã phát hiện ra rằng nấm mốc (Penicillium) cũng có thể tạo nên axít citric từ đường Sản xuất axít citric theo kiểu vi sinh này đã không được đưa vào sản xuất công nghiệp cho đến thế chiến thứ I, do cục xuất khẩu nước hoa quả của Ý bác bỏ Vào năm 1917 nhà hóa học thực phẩm James Currie người Mỹ đã phát hiện ra rằng nấm mốc hình sợi (Aspergillus niger) có thể dùng để sản xuất axít citric rất hiệu quả Hai năm sau tập đoàn dược phẩm Pfizer đã ứng dụng kỹ thuật này vào sản xuất axít citric theo qui

mô công nghiệp

5) Sản xuất

• Kỹ thuật mà ngày nay người ta vẫn dùng trong công nghiệp sản xuất axít citric là nuôi nấm sợi trên đường ăn, sau đó lọc nấm mốc ra khỏi dung dịch và axít citric được tách bằng cách cho kết tủa với nước vôi tạo thành canxi citrat, sau đó kết tủa được xử lý bằng axít sulfuric

• Ngoài ra axít citric còn được tách từ sản phẩm lên men của nước lèo bằng cách dùng một dung dịch hydrocacbon của một bazơ hữu cơ Trilaurylamin để chiết Sau đó tách dung dịch hữu cơ bằng nước

6) Ứng dụng

• Với vai trò là một chất phụ gia thực phẩm, axít citric được dùng làm gia vị, chất bảo quản thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước giải khát, nó mang mã số E330 Muối citrat của nhiều kim loại được dùng để vận chuyển các khoáng chất trong các thành phần của chất

ăn kiêng vào cơ thể Tính chất đệm của các phức citrat được dùng để hiệu chỉnh độ pH của chất tẩy rửa và dược phẩm

• Citric axít có khả năng tạo phức với nhiều kim loại có tác dụng tích cực trong xà phòng

và chất tẩy rửa Bằng cách phức hóa các kim loại trong nước cứng, các phức này cho phép các chất tẩy rửa tạo nhiều bọt hơn và tẩy sạch hơn mà không cần làm mềm nước trước Bên cạnh đó axít citric còn dùng để sản xuất các chất trao đổi ion dùng để làm mềm nước bằng cách tách ion kim loại ra khỏi phức citrat

• Axít citric được dùng trong công nghệ sinh học và công nghiệp dược phẩm để làm sạch ống dẫn thay vì phải dùng axít nitric

• Citric axít là một trong những hóa chất cần thiết cho quá trình tổng hợp Hexametylen triperoxit diamin (HMDT) là một chất dễ phát nổ giống Axeton peroxit, nhạy với nhiệt và

ma sát Ở một số nước nếu bạn mua một số lượng lớn axít citric bạn sẽ bị liệt kê vào sổ đen của các âm mưu khủng bố

• Axít citric cũng được cho vào thành phần của kem để giữ các giọt chất béo tách biệt Ngoài ra nó cũng được thêm vào nước ép chanh tươi

• Citric axit được coi là an toàn sử dụng cho thực phẩm ở các quốc gia trên thế giới Nó là một thành phần tự nhiên có mặt ở hầu hết các vật thể sống, lượng dư axít citric sẽ bị chuyển hóa và đào thải khỏi cơ thể

• Điều thú vị là mặc dù axít citric có mặt khắp nơi trong cơ thể nhưng vẫn có một vài trường hợp mẫn cảm với axít citric Tuy nhiên những trường hợp này rất hiếm và người

ta thường gọi đó là phản ứng giả vờ của cơ thể Axít citric khô có thể làm kích thích da và mắt do đó nên mặc áo bảo hộ khi tiếp xúc với axít này

II Aspergillus niger

1) Giới thiệu A niger

• Có nhiều loài nấm mốc có khả năng oxy hóa gluxit thành axit citric như Rhizopus,

Aspergillus, Penicillium Trong đó quan trọng nhất là Aspergillus niger

• Aspergillus niger là một loại nấm sợi và một trong những loài phổ biến nhất của chi

Aspergillus có nhiều công dụng trong công nghệ sinh học, nhiệt độ tối ưu ở 35 – 370C,

pH từ 1,4 - 9 Nó gây ra một căn bệnh được gọi là nấm mốc đen trên một số loại trái cây

và rau quả như nho, hành tây, đậu phộng, và là một chất gây ô nhiễm phổ biến của thực phẩm Aspergillus niger là vi sinh vật hiếu khí phát triển trên các chất hữu cơ, do đó nó

có thể được tìm thấy gần như ở khắp mọi nơi trong môi trường có chứa đất Ngoài ra, nó được tìm thấy trong chất thải, nguyên liệu thực vật phân hủy và phân hữu cơ trong môi trường ngoài trời Môi trường trong nhà tạo ra một môi trường sống tốt cho sự phát triển của nấm mốc Chẳng hạn như trong các lĩnh vực hộ gia đình thông thường, trên các bức tường trong phòng tắm hoặc các khu vực khu vực khác có độ ẩm cao

A.niger được nuôi để sản xuất nhiều chất trong công nghiệp, trong đó có axit citric

2) Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid citric

• Trong quá trình này glucose được chuyển hoá thành axit pyruvic theo con đường EMP (Embden-Mayerhof-Parnas), sau đó axit pyruvic tiếp tục chuyển hoá thành axit citric Phương trình tổng quát của quá trình này như sau:

2C6H12O6 + 3 O2 → 6C6H8O7 + 4H2O

Cơ chế của sự chuyển hoá này có thể được biểu diễn như sau:

Đường C6H12O6 thuỷ phần thành acid pyruvic (CH3COCOOH)

CH3COCOOH + CO2 → HOOCCH2COCOOH

(Acid oxaloacetic) HOOCCH2COCOOH + CH3COOH → CH2COOHCOHCOOHCH2COOH

(Acid citric)

3) Môi trường

Đa số các quy trình công nghiệp hiên nay sử dụng nguồn cơ chất là rỉ đường Nhưng dù có sử dụng nguồn cơ chất như thế nào thì người ta vẫn cần phải chú y đến hai yếu tố quan trọng là giá thành và các yếu tố cần chuẩn bị để cung cấp điều kiện thuận lợi nhất cho vi sinh vật lên men Nguồn cơ chất cơ bản được dùng trong các quy trình lên men nổi là mật rỉ đường mía hoặc mật rỉ

củ cải đường Còn đối với các quy trình lên men nổi thì nguồn cơ chất có thể được sử dụng không chỉ là mật rỉ đường mà còn là những cơ chất có độ tinh khiết cao hơn như glucose tinh khiết, đường thô hoặc đường tinh, nước ép mía và củ cải đường cô đặc Sử dụng các nguồn cơ chất tinh khiết như trên có thế giúp làm năng năng suất hoặc giúp giảm thời gian nuôi cấy

Dưới đây là bản nồng độ các chất trong nuôi cấy Aspergillus niger nhằm lên men acid citric:

Sucrose/Glucose 125-225 kg/m3 180 kg/m3

NH4NO3 (hoặc muối NH4+ khác) 0.5-3.5 kg/m3 1.5 kg/m3

MgSO4.7H2O 0.1-2.0 kg/m3 0.25 kg/m3

1 Mật rỉ

Đây là nguồn cơ chất phổ biến hiện nay, có chất lượng rất đa dạng tùy theo nguồn Và để dùng sản xuất acid citric thì ta cần dùng những nguồn mật rỉ có chất lượng cao Hai loại mật rỉ này có thành phần không giống nhau, do đó người ta sẽ chọn một trong hai cho quy trình của mình Cũng có những trường hợp người ta trộn cả hai loại mật rỉ với nhau, nhằm thu được những nguồn dinh dưỡng từ cả 2 nguồn Chất lượng lượng của mía hoặc củ cải phụ thuộc vào các yếu tố canh tác như: điều kiện đất trồng và khí hậu, hình thức bón phân, phương pháp gieo trồng, thời gian và điều kiện bảo quản, kỹ thuật sản xuất, dụng cụ kỹ thuật, quy trình kỹ thuật,…

• Rỉ đường mía

Rỉ mía có khoảng 65-80% lượng chất kho và 20-25% là nước Thành phần các chất dinh dưỡng của nó được liệt kê trong bảng sau:

Đường tổng số (%) -48 – 56

Chất hữu cơ khác(%) -9 – 12

Protein(%) -2 – 4

K(%) -1.5 – 5

Ca(%) -0.4 – 0.8

Mg(%) -0.06

P(%) -0.6 – 2

Biotin (vitamin H) mg/kg -1 – 3

Axit pantothenic mg/kg -15 – 55

Inositol mg/kg -2500 – 6000

Thiamin mg/kg -1.8

Trong đường tổng số bao gồm sucrose (44-54%), đường chuyển hóa (0.4-1.5%), raffinose (0.5-2%), kestose và neokestose (0.6-1.6%), arabinose, xylose và mannose (0.5-1.5%) Trong đó, raffinose là một thành phần tự nhiên của đường mía, trong khi kestose là sản phẩn của các chủng

vi sinh trong quá trình xử lý Tất cả các đường trên (trừ sucrose) đều được xem là cơ chất hữu cơ không nito trong rỉ đường.Các sản phẩm hóa và nhiệt phân hủy của đường (melanoidine và caramel) và các acid hữu cơ cũng thuộc nhóm này.Caramel chứa đường anhydride và các chất có màu, còn melanoidine là sản phẩm của một phản ứng giữa đường giảm và acid amin

Ngoài ra, trong rỉ đường còn chứa các acid hữu cơ không bay hơi và bay hơi, và nếu lượng acid không bay hơi cao hơn 1% thì thường sẽ có màu rất đậm và không được dùng cho quy trình lên men acid citric

Các chất chửa nito trong rỉ mía gồm chủ yếu là betaine (có trong mía nhưng không được vi sinh vật sử dụng làm nguồn N), sau đó là acid amin, protein và các chất vi lượng như ammonium nitrate và amid

Ngoài các yếu tố trên thì một yếu tố cũng rất quan trọng để đánh giá chất lượng rỉ mía nhằm đạt năng suất cao trong sản xuất acid citric là lượng các nguyên tố vi lượng trong mỗi loại rỉ

pH của mật rỉ phụ thuộc vào cộng nghệ chiết, và pH được cho là tối ưu để lên men acid citric là trung tính hoặc kiềm nhẹ Nhằm đạt được độ giảm pH cần thiết trong quy trình sản xuất acid citric, ta cần mật rỉ với khả năng đệm thấp

• Rỉ dường củ cải

Rỉ đường củ cải có thành phần khá khác biệt so với rỉ đường mía: chứa ít sucrose hơn và nhiều đường chuyển hóa hơn, chứa ít nito và raffinose, màu sắc đậm hơn và khả năng đệm cũng thấp hơn

Cả hai loại rỉ ngoài những thành phần chính còn chứa các yếu tố vi lượng, dù rất ít nhưng lại là thành phần quyết định xem rỉ có đủ điều kiện để đưa vào sử dụng sản xuất acid citric hay không Các chất này bao gồm thuốc trừ sâu, trừ nấm và trừ cỏ (từ quá trình canh tác) và cả các chất phá bọt (từ quá trình sản xuất đường), là những chất có tính độc và có ảnh hưỡng tiêu cực đến chất lượng mật rỉ.Thường thì mật rỉ mía được dùng phổ biến hơn trong sản xuất acid citric, đặc biệt là trong lên men chìm, khi mà chất lượng của mật rỉ trở nên càng quan trọng hơn

Các vi sinh vật cũng là nhân tố ảnh hưởng đến chất lượng, có khi lượng vi sinh trong mật rỉ lên

đến hơn 10,000/g mật rỉ (Bacillus, các loài thuộc Candida, Penicillium – dù rất hiếm,

Aspergillus, và các loài khác) Ngoài ra để xử lý mật rỉ ta còn phải loại một số kim loại nặng

bằng nhiều phương pháp như sử dụng kali ferrocyanide và EDTA (và một số chất khác) Tuy

nhiên cũng cần lưu ý giữa lại những chất cần thiết cho Aspergillus niger sử dụng trong quá trình

lên men

2 Sucrose:

Đường tinh luyện được xem như là nguồn sucrose nguyên chất mà A.niger có khả năng sử dụng

rất tốt.Nồng độ tối ưu của sucrose là vào khoảng 15% - 22%, và dương nhiên ta cần thêm vào các nguồn dinh dưỡng khác như NH4NO3, KH2PO4, MgSO4, đồng thời cần acid hóa bằng acid sulfuric đến khi đạt pH 2.6-3.0

3 Syrup:

Xi-rô đường cũng có thế được sử dụng làm cơ chất cho lên men acid citric chìm.Ưu điểm nổi trội nhất của nguồn cơ chất này là độ tinh khiết của nó.Tuy nhiên syrup lại rất dễ giảm chất lượng nhanh chóng trong quá trình vận chuyển và lưu trữ.Vì thế nguồn cơ chất này chỉ có thể sử dụng trong những khoảng thời gian sản xuất đường đạt cao điểm, và nhà máy đường phải rất gần với nhà máy sản xuất acid citric

Đối với cơ chất này, ta hòa tan vào nước đến nồng độ 15-20%, thêm vào các chất dinh dưỡng cần thiết (NH4NO3, KH2PO4, MgSO4 và (NH4)2C2O4), acid hóa và sau đó tiến hành hấp khử trùng

4 Tinh bột

Sản xuất acid citric bằng nguồn cơ chất là tinh bột ngô, lúa mì, khoai tây,… tương đối phổ biến Nguồn cơ chất này có độ tinh khiết và phương thức thủy giải (bằng acid hoặc bằng enzyme, hoặc kết hợp cả hai) khá phù hợp cho việc sản xuất acid citric

Sử dụng phương thức thủy giải của tinh bột bằng enzyme cũng có thể sử dụng cho nguồn cơ chất

là syrup dextrose.Quy trình này thậm chí đã được áp dụng vào quy mô công nghiệp Tuy nhiên cần phải chú ý đến lượng kim loại nặng trong dịch lên men và tiến hành loại bỏ chúng nếu chúng vượt ngưỡng cho phép

5 Alkan

Với giá thành rẻ và được nhiều chủng vi sinh vật sử dụng, alkan đã làm thay đổi mạnh mẽ

phương thức sản xuất acid citric trong những thập niên 1960 – 1970 Ví dụ điển hình là quy trình

sử dụng nấm Candida lipolytica Hiện nay alkan không còn được sử dụng phổ biến như trước do vấn đề thu hồi gặp khó khăn (do sự tạo thành acid isocitric)

6 Dầu & chất béo

Hiện nay dầu được sử dụng làm nguồn carbon chính để sản xuất acid citric tương tự như alkan

trước đây Trong một ví dụ cụ thể: dầu cọ được chủng đột biến của Candida lipolytica có thể lên

men tạo acid citric với hiệu suất lên đến 145% Ngoài ra dầu cũng được thêm vào môi trường lên

men bằng Aspergillus niger với nồng độ thấp, thậm chí có trường hợp là nguồn carbon duy nhất

Người ta thấy rằng đây là nguồn carbon có thể cho năng suất cao trong việc tạo acid citric.Dầu

và chất béo có thể thay thế alkan trong vài quy trình, tuy nhiên giá thành thì chưa hẳn vẩn còn ở mức thấp

III Sản xuất acid citric

1) Các phương pháp sản xuất acid citric:

Quá trình tổng hợp sản xuất acid citric bằng công nghệ lên men là phương pháp có giá trị kinh tế nhất và được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Hơn 90% lượng acid citric trên thế giới được sản xuất bằng công nghệ lên men, vì chúng có những ưu điểm sau:

(1) quy trình đơn giản và ổn định

(2) nhà máy thường ít phức tạp và cần ít hệ thống điều khiển phức tạp

(3) yêu cầu kỹ thuật cần thiết ít

(4) tiêu thụ năng lượng ít hơn và những sự cố mất điện thường xuyên không gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hoạt động của nhà máy sản xuất

Sản xuất acid citric bằng công nghệ lên men gồm 3 giai đoạn:

(1) chuẩn bị và cấy nguyên liệu thô (inoculation)

(2) lên men

(3) thu hồi sản phẩm

Trong sản xuất acid citric theo quy mô công nghiệp, thông thường người ta sử dụng 3 phương pháp lên men: lên men chìm, lên men bề mặt và lên men bán rắn (solid-state) hay còn gọi là quá trình Koji

a Phương pháp lên men bề mặt

Phương pháp lên men bề mặt ứng dụng nhiều vào những năm đầu của thế kỷ XX, theo đó các vi sinh vật phát triển hẳn trên bề mặt môi trường nằm giữa pha rắn và pha khí hoặc nằm giữa pha lỏng và pha khí Như vậy, phương pháp lên men bề mặt có thể sử dụng hai loại môi trường: môi trường bán rắn, còn gọi là môi trường xốp và môi trường lỏng

+ Lên men bề mặt với môi trường bán rắn

Phương pháp này ít được áp dụng vì hiệu suất thu không cao và khá phức tạp ở khâu chiết, tách acid citric Trước kia người ta dùng môi trường cám mì, cám gạo có trộn khoảng 15 - 25% trấu

để tăng độ xốp của môi trường Ngoài ra, trong một số cơ sở người ta còn dùng môi trường khác

từ sắn, khoai tây, bắp… Môi trường làm nguyên liệu phải được nghiền nhỏ đến kích thước vừa phải Sau khi nghiền xong môi trường phải được làm ấm đến độ ẩm khoảng 60 - 65% và đem hấp thanh trùng bằng hơi nóng Môi trường làm xong phải được làm nguội và chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy Trước đó ta phải chuẩn bị giống Quá trình này còn gọi là giai đoạn thu nhận bào

tử giống

Phương pháp thu nhận bào tử giống: Có 2 phương pháp thu nhận:

•Phương pháp thứ nhất: Chuẩn bị 3 - 4 bình tam giác dung tích 150 ml, cho vào đó khoảng 50g cám để có độ ẩm 60% Hấp thanh trùng và để nguội

Từ ống giống Aspergillus niger gốc, ta chuyển toàn bộ khuẩn lạc bằng cách cho vào mỗi ống

nghiệm 10ml nước vô trùng, khuấy đều cho bào tử giống trong ống nghiệm hòa trộn trong nước Bằng phương pháp vô trùng chuyển toàn bộ sang các bình tam giác đã chuẩn bị môi trường sẵn Lắc đều cho môi trường trộn đều bào tử Nuôi chúng trong tủ ấm có nhiệt độ 30 - 37oC, trong thời gian 3 ngày Khi thấy trong bình tam giác toàn là bào tử màu đen là kết thúc giai đoạn nuôi cấy

Tiếp đó, cũng môi trường như trên nhưng được chuẩn bị vào khay nhôm hoặc inox Tải đều khi cho 10% môi trường giống từ bình tam giác đã nuôi ở trên vào Chiều dày khối trộn khoảng tử 3

- 5cm Để trong phòng có nhiệt độ ổn định là 32oC Nuôi trong khoảng 3 - 4 ngày khi bào tử màu đen xuất hiện kín bề mặt môi trường, đem sấy ở nhiệt độ < 40oC ta thu được giống bào tử sẵn sàng cho quá trình sản xuất đại trà

•Phương pháp thứ 2: Người ta nuôi trong môi trường lỏng giống Aspergillus niger Môi trường

để thu nhận bào tử có thành phần như sau:

Dung dịch nước malt có nồng độ chất khô 3 - 5%

NH4Cl:0,25g

KH2PO4 1,25g

MgSO4 0,25g

FeSO4 0,0125g

Môi trường đã chuẩn bị xong được đưa vào bình có dung tích 2 - 3lít với chiều cao của dung dịch trong các bình là 1cm, đem hấp thanh trùng ở 1 at trong 30phút Sau đó chuyển giống từ ống nghiệm giống vào Tiến hành nuôi ở nhiệt độ 32oC trong thời gian 4 ngày hoặc lâu hơn cho đến khi trên bề mặt xuất hiện váng nấm sợi, lúc đầu là màu trắng sau đó là đen chứa toàn bào tử Người ta thu bào tử này đem sấy ở nhiệt độ < 40oC và dùng nó như bào tử giống cấp 1 Để sản xuất bào tử giống cấp 2,3, người ta thực hiện như quá trình nuôi nấm sợi trên khay đã trình bày ở trên

Cách thức thực hiện quá trình lên men bề mặt:

Trộn cám với nước theo tỷ lệ 1:1 Hấp thanh trùng ở 1at trong 30 phút và tãi đều ra khay, sau khi làm nguội sẽ được trộn giống với tỷ lệ 0,3 - 0,5% Chiều dày của khối cám + bào tử giống