KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây cỏ nhọ nồi (eclipta alba)

@ Một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền là cây cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cây cỏ mực.. Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

2

Hà Nội – 2019

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận này là kết quả cho quá trình học tập, rèn luyện của em tại Khoa YDược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại Khoa HóaThực vật 2 – Viện Dược liệu

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bài luận văn này, em đã nhận đượcrất nhiều sự giúp đỡ quý báu từ các Thầy, Cô giáo, các nhà khoa học của Khoa YDược, Đại học Quốc gia Hà Nội và Viện Dược Liệu cùng gia đình và bạn bè

Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại họcQuốc gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho emđược làm khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Dương Thị Ly Hương,

PGS.TS Đỗ Thị Hà, Ths Nguyễn Thị Hồng Anh, TS Trần Thanh Hà cùng các

cán bộ nghiên cứu tại Khoa Hóa Thực vật 2 – Viện Dược liệu đã giúp đỡ em trongquá trình thực hiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 23 tháng 3 năm 2019

Sinh viên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

(Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

CC Sắc ký cột (Column Chromatography)

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

DMSO Dimethyl sulfoxide

DL/DM Tỉ lệ dược liệu/dung môi

ESI-MS Phổ khối ion hóa phun mù điện tử

(Electronspray Ionization Mass Spectrum)

HMBC Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)HSQC Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

UV-Vis Phổ tử ngoại (Ultra violet- Visible)

DANH MỤC CÁC BẢNG, CÁC HÌNH

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton 19

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin 20

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat 22

Hình 1.1 Cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 3

Hình 1.2 Cấu trúc của các hợp chất Alkaloid 5

Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất Coumestan 5

Hình 1.4 Cấu trúc của các hợp chất Flavonoid 6

Hình 1.5 Cấu trúc của các hợp chất Sterol 6

Hình 1.6 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 1 7

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2 8

Hình 1.8 Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen 8

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi 15

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của Cỏ nhọ nồi 16

Hình 3.3 SKĐ TLC của N01 và cao EtOAc 17

Hình 3.4 SKĐ TLC của N02 và cao EtOAc 17

Hình 3.5 SKĐ TLC của N03 và cao EtOAc 17

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton) 18

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin) 21

Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất N03 (Methyl gallat) 23

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae) 2

1.2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 2

1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 2

1.2.2 Đặc điểm thực vật Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 3

1.2.3 Thành phần hóa học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 4

1.2.4 Tác dụng sinh học Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) 9

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng 12

2.2 Hoá chất, thiết bị 12

2.2.1 Hoá chất 12

2.2.2 Thiết bị 12

2.3 Phương pháp chiết xuất phân lập và xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết 13

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 13

2.3.2 Phương pháp xác định và nhận dạng cấu trúc 14

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân đoạn etyl acetat 15

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi 15

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi 16

3.2 Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi 18

3.2.1 Biện luận cấu trúc N01 18

3.2.2 Biện luận cấu trúc N02 20

3.2.3 Biện luận cấu trúc N03 21

3.3 Bàn luận 23

3.3.1 Về chiết xuất 23

3.3.2 Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất 23

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

@

Một trong số các loài cây được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc cổ truyền là cây cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cây cỏ mực Cỏ nhọ nồi là dược liệu được nghiên

Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn Ethyl acetat

Xác định cấu trúc của các chất phân lập được trong phân đoạn Ethyl acetat

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia có khí hậu nhiệt đới rất thuận lợi cho sự phát triển của

nhiều loại cây thuốc Với sự đa dạng, phong phú về cây thuốc đã tạo ra nguồn tài

nguyên dược liệu vô cùng quý báu cho nước ta Từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng

những bài thuốc cổ truyền từ các loại cây để chữa trị một số bệnh thường gặp như:

cảm, sốt, chảy máu, đau bụng,… Đó là những bài thuốc được sử dụng rất phổ biến

và được truyền lại từ đời này sang đời khác Tuy nhiên những bài thuốc này mới chỉ

dựa trên kinh nghiệm của cha ông ta mà chưa có cơ sở về khoa học

Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển thì con người đã đi sâu vào nghiên

cứu làm sáng tỏ các thành phần, cấu trúc, tác dụng,… của các loài cây thường được

sử dụng trong các bài thuốc dân gian Trong các nghiên cứu y dược hiện đại, các

hợp chất hữu cơ từ các cây thuốc như flavonoid, saponin, alkaloid, coumarin,… là

những nguồn cung cấp các hợp chất có tiềm năng để thử hoạt tính sinh học, phục

vụ cho nhiều lĩnh vực khoa học, đặc biệt là y học

cứu rất nhiều cả trong nước và quốc tế như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Thái

Lan,…với nhiều tác dụng như kháng viêm, kháng nấm, cầm máu, chống ung thư…

và sử dụng trong các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh như: nôn, chảy máu

cam, rụng tóc, suy nhược thần kinh, nấm, viêm loét, lở ngứa, ban chẩn,…[2]

Trước sự đa dạng về cấu trúc lý hóa, hoạt tính sinh học cũng như mối tương

quan giữa cấu trúc và tác dụng, để hiểu được rõ hơn về vai trò của từng hợp chất có

trong cỏ nhọ nồi và đặt cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây thuốc, ta cần tiếp tục

tiến hành tách chiết và xác định cấu trúc của các thành phần hóa học đặc biệt và các

thành phần chưa được phân lập trong cây, từ đó đặt tiền đề để nghiên cứu thêm về

tác dụng, hoạt tính sinh học của các hợp chất này

Để góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây Cỏ nhọ nồi, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong

cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)” với 2 mục tiêu:

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về họ Cúc (Asteraceae)

Trong lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), họ Cúc (Asteraceae hay Compositae) là

họ lớn nhất trong lớp này, với hơn 1.600 chi và 23.000 loài Chúng thường tậptrung chủ yếu ở đồng cỏ và thảm thực vật trên núi, ít gặp hơn trong các vùng rừngnhiệt đới ẩm với độ cao thấp Họ Cúc là họ thực vật nổi bật trong số các loài thựcvật được sử dụng bởi các dân tộc trong các nền văn hóa bản địa ở tất cả các nơi trênthế giới, đặc biệt là cho các mục đích y học [8]

Các loài thuộc họ Cúc có các đặc điểm: cụm hoa dạng đầu, bao phấn hữu tính,chùm lông trên quả, quả là loại quả bế tạo thành từ một lá noãn và không nẻ ra khichín [1]

Họ Cúc có chứa các chất chuyển hóa thứ cấp phong phú và đa dạng, sự pháttriển của các hợp chất này rất quan trọng trong sự tiến hóa của họ Nguồn thông tin

về các hợp chất này rất có giá trị trong việc phân loại; sự xuất hiện hoặc vắng mặtcủa các hợp chất hóa học cụ thể hoặc nhóm hợp chất thường biểu thị mối quan hệphân loại ở phân họ và cấp thấp hơn [8]

1.2 Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

1.2.1 Vị trí phân loại của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là cỏ mực, hạn liên thảo và có tên khoa học là

Eclipta alba hoặc Eclipta prostrata (L.), thuộc họ Cúc Asteraceae (Compositae)

[1], [2]

Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam” của tác giả Võ Văn Chi [1], Cỏ nhọ nồi có

vị trí phân loại như sau:

Loài: Eclipta alba

1.2.2 Đặc điểm thực vật của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [2]

Mô tả: Cây thảo mọc hằng năm, thân cao 10-60 cm, phân nhánh, màu lục,

đôi khi hơi đỏ tía, phủ lông cứng Lá mọc đối, phiến hình ngọn giáo tới bầu dục –thuôn, dài 3-10 cm, rộng 0,5-2,5 cm, mép nguyên hoặc khía răng, có lông tơ dày ở

cả hai mặt Cụm hoa hình bán cầu, đường kính 1-1,2 cm, trên cuống dài 1,5 mm, ởnách lá hoặc ở ngọn cành Tổng bao gồm 1 hàng lá bắc hình bầu dục, có lông tơ

ở mặt lưng Đế hoa lồi, rộng 1 cm Các hoa ở mép là hoa cái có tràng dạng lưỡinhỏ, màu trắng, đầu có hai thùy; các hoa lưỡng tính ở giữa, hình ống, ở đầu có 4-5thùy Quả bế dẹt, có 3 cạnh màu đen

Hình 1.1 Cây cỏ nhọ nồi (Eclipta alba) [12]

Bộ phận dùng: Phần cây trên mặt đất Có thể thu hái quanh năm, dùng tươi

hay phơi khô

Phân bố: Ra hoa và kết quả từ tháng 3 đến tháng 11 Mọc hoang ở chỗ ẩm

mát ven làng, đồng ruộng từ vùng thấp lên tới độ cao 1800m Phân bố phổ biếnkhắp nơi từ Bắc vào Nam và còn phân bố ở các nước nhiệt đới khác thuộc châu Á,châu Phi

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, chua, tính hàn Quy kinh vào can và thận.

Công dụng: Tư âm bổ thận, lương huyết, bổ huyết, thanh nhiệt giải độc.

Thường được sử dụng để trị nôn ra máu, chảy máu cam, tử cung xuất huyết; Viêmgan mạn, viêm ruột, lỵ; Trẻ em suy dinh dưỡng; Ù tai, rụng tóc do đẻ non, suynhược thần kinh; Nấm da, vết loét, chảy máu, viêm da Còn dùng làm thuốctrong viêm họng, ban chẩn, lở ngứa, đau mắt, sưng răng, đau dạ dày, bệnh nấmngoài da gây rụng tóc

1.2.3 Thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

Các nghiên cứu khác nhau về thành phần hóa học đã cho thấy cỏ nhọ nồi cóchứa nhiều hợp chất hóa học bao gồm coumestans, alkaloids, glycosides, flavonoids,triterpenoids, saponins, lipids, hợp chất polyacetylen, steroids, phytosterol,….Trong

lá cây có chứa wedelolactone, demethylwedelolactone,

demethylwedelolactone-7-glucoside, stigmasterol và β-terthienylmethanol Rễ chứa hentriacontanol và heptacosanol [15] Phần trên mặt đất chứa phytosterol, β-amyrin trong chiết xuất n- hexane và luteolin-7-glucoside, β- glucoside của phytosterol, glucoside của axit

triterpenic và wedelolactone [23]

a Alkaloid

Các nghiên cứu về thành phần hóa học trên Eclipta alba cho thấy sự xuất

hiện của các alkaloid như ecliptine và nicotine, và các alkaloid steroid có hoạt tínhsinh học verazine, dehydroverazine ecliptalbine Năm 1998, M S Kader và cộng sự(Đại học Quốc gia Virginia, Hoa Kỳ) đã phân lập từ phần dịch chiết methanol của

Eclipta alba được tám hợp chất alkaloid có khung steroid Alkaloid chính được xác

định là (20S,25S)-22,26-iminocholesta-5,22 (N) -dien-3-β-ol (verazine) (1),

(20R)-verazine

(2) và các alkaloid khác được xác định là

20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-4,5 dehydroverazine (3), ecliptalbine [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol]

(4), (20R)-4β-hydroxyverazine (5), 4β-hydroxyverazine (6),

(20R)-25β-hydroxyverazine

(7) và 25β-hydroxyverazine (8) [4].

Coumestan là một dẫn xuất của coumarin được tìm thấy trong nhiều loại thực

vật Wedelolactone (9), demethylwedelolactone (10), glucosid (11) là các coumestan chính phân lập được từ cỏ nhọ nồi [33].

demethyl-wedelolactone-7-9 R=CH3

10 R=H

11 R=Glc Hình 1.3 Cấu trúc của các hợp chất Coumestan

d Saponin triterpen

Saponin triterpene là eclalbatin (20), cùng với α-amyrin, axit ursolic và axit

oleanolic đã được phân lập từ Eclipta alba [34], [53] Năm 1997, S Yahara và cộng

sự thuộc Đại học Kumamoto, Nhật Bản đã phân lập được eclalbasaponin VII-X

(21-24) [55] Năm 2008, M K Lee và công sự tại Đại học quốc gia Seoul Hàn Quốc đã

phân lập được acid echinocystic (25) và các dẫn xuất glycosid, eclalbasaponin I-III (26-28) và eclalbasaponin V (29) [40].

21 R=H 22 R=H

Hình 1.7 Cấu trúc của các hợp chất Saponin triterpen 2

e Dẫn xuất thiophen và polyacetylen

Năm 1966, F Bolhman và cộng sự thuộc Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin

Đức đã phân lập 2 dẫn xuất thiophen (30, 31) và polyacetylen (32) từ lá khô của cỏ

nhọ nồi Cùng năm 1966, N R Krishnaswamy và cộng sự tại Đại học Delhi Ấn Độ

đã xác định được cấu trúc của α-terthienyl methanol (33) từ Eclipta alba Năm

1985,

P Sing và cộng sự tại Đại học tổng hợp Kỹ thuật Berlin Đức đã phân lập từ rễ và

phần trên mặt đất của Eclipta alba được một thành phần dithienyl acetylen (34).

34 Hình 1.8 Cấu trúc của các dẫn xuất thiophen và polyacetylen

f Tinh dầu

Các thành phần tinh dầu chính bao gồm heptadecane, pentadecanone, axit n-hexadecanoic, pentadecane, eudesma-4 (14), 11-diene,phytol, octadec-9-enoic axit diisooctylester, (Z, Z) -9,12- octadecadienoic acid,(Z) -7,11- dimethyl-3- methylene-1,6,10-dodecatriene và (Z, Z, Z) -1,5, 9,9-tetramethyl-1,4,7- cycloundecatriene D-dithienylacetylene ester, ecliptal hoặc α-terthienyl aldehyd, α- terthienyl-metanol và α-formylterthienyl [31]

6,10,14-trimethyl-2-1.2.4 Tác dụng sinh học của Cỏ nhọ nồi (Eclipta alba)

a Tác dụng giảm đau, chống viêm

Dữ liệu thu được từ các thí nghiệm cho thấy dịch chiết ethanol và alkaloid

toàn phần của Eclipta alba có hoạt tính giảm đau tốt khi được dùng với liều

150mg/kg, 250 mg/kg và 500 mg/kg theo đường uống Tác dụng giảm đau này cóhiệu quả như nhau ở cả cơn đau trung tâm cũng như ngoại biên [47]

Khả năng chống viêm của dịch chiết methanolic của lá cỏ nhọ nồi đã đượcnghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và lòng trắng trứng

Sử dụng liều 100 và 200 mg/kg dịch chiết methanol của cỏ nhọ nồi bằng đườnguống cho thấy hoạt động chống viêm đáng kể trên mô hình gây phù chân chuộtbằng carrageenin và lòng trắng trứng được so sánh với indomethacin(10mg/kg) và cyproheptadine (8 mg/kg) [9]

b Tác dụng kháng khuẩn, chống nấm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu tiềm năng chống vi khuẩn của Eclipta

alba và đã chỉ ra rằng Eclipta alba có đặc tính kháng khuẩn Các nghiên cứu cho

thấy rằng các hợp chất thu được từ Eclipta alba cho hoạt động tốt chống lại

Staphylococcus aureus, Eclipta Coli, Staphylococcus cholermidis và Salmonella typhimurium [18].

Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống lại các chủng nấm: Aspergillus niger,

Aspergillus fumigatus, Fusarium solani và Aspergillus flavus Hoạt tính kháng nấm

in vitro của dịch chiết Eclipta alba đã được nghiên cứu chống lại nấm Candida tropicalis, Rhodotorula glutinis và Candida albicans [29].

c Tác dụng bảo vệ gan

Dịch chiết ethanol/nước (1:1) của Eclipta alba ức chế tác dụng của CCl4 vàđiều chỉnh các enzyme chuyển hóa thuốc của microsome gan (amidopyrine-N-demethylase và glucose-6-phosphatase liên kết màng) Nghiên cứu cho thấy rằng

hoạt động bảo vệ gan của Eclipta alba là sự điều chỉnh mức độ của các enzyme

chuyển hóa thuốc của microsome gan Các dịch chiết methanol của lá và dịch chiết

chloroform của rễ Eclipta alba cho thấy các hoạt động tương ứng làm giảm 72,8%

và 47,96% enzyme lysosomal Từ dịch chiết methanol của lá, triterpenoideclabasaponin làm giảm 78,78% và alkaloid làm giảm 60,65% lượng CCl4 làmtăng enzyme lysosomal trong máu Coumestan và saponin triterpenoid từ dịchchiết chloroform của rễ tương ứng làm giảm 75,6% và 52,41% nồng độ CCl4

Eclipta alba được báo cáo là có tác dụng bảo vệ đối với tổn thương gan cấp tính

do CCl4, bằng cách làm giảm hoại tử, thoái hóa của các tế bào nhu mô gan [48],[50]

d Tác dụng lên thần kinh và chống độc

Các nghiên cứu liên quan đã chỉ ra rằng dịch chiết Eclipta alba với liều 300

mg/kg cho thấy hoạt động của các chất cải thiện khả năng hoạt động của hệ thầnkinh ở chuột [51]

Chiết xuất ethyl acetate của Eclipta alba và wedelolactone đã chứng minh

hoạt tính chống tăng huyết áp và chống lại nọc độc rắn Malaya Pit Viper [44]

Hoạt tính chống sốt rét của dịch chiết từ lá Eclipta alba đã được đánh giá là chống lại chủng Plasmodium berghei ANKA ở chuột [10].

e Hoạt động diều hòa miễn dịch

Các nghiên cứu sơ bộ đã cho thấy hoạt động điều hòa miễn dịch của dịch

chiết methanol của Eclipta alba Wedelolactone và demethylwedelolactone, được phân lập từ Eclipta alba đã chứng minh tác dụng ức chế trypsin Cả hai hợp chất cho thấy hoạt động mạnh mẽ với giá trị IC50 là 2,9 và 3,0 μg/ml, tương ứng.

Eclipta alba có tác dụng bảo vệ các mô thần kinh có thể là do hoạt động điều hòa

miễn dịch của Eclipta alba Do đó, Eclipta alba có thể phục vụ như một bộ điều

biến bộ nhớ tiềm năng Thử nghiệm được thực hiện để đánh giá hoạt tính điều hòa

miễn dịch của dịch chiết metanol của toàn bộ cây Eclipta alba ở năm mức liều từ

100 đến 500 mg/kg làm tăng đáng kể chỉ số thực bào và hiệu giá kháng thể và tỷ

lệ F của chỉ số thực bào và số lượng bạch cầu cũng tăng [32]

f Hoạt động chống ung thư

Dịch chiết methanol của Eclipta alba được đánh giá là hoạt động chống ung

thư của nó chống lại Ehrlich Ascites Carcinoma (EAC) ở chuột bạch tạng Hoạtđộng chống ung thư được kiểm tra bằng cách xác định khối lượng khối u, số lượng

tế bào khối u, số lượng tế bào khối u còn sống, số lượng tế bào khối u không thểsống, thời gian sống trung bình và tăng tuổi thọ trong các mô hình động vật thínghiệm Dịch chiết làm tăng tuổi thọ của chuột được điều trị EAC và khôi phục cácthông số huyết học so với chuột mang EAC [25]

Coumestans cũng được biết là hoạt động như phytoestrogen Ở nhiều nước,

nó được sử dụng như chế độ ăn uống đóng vai trò là tác nhân phòng ngừa hóa họctrong ung thư vú và tuyến tiền liệt Dasyscyphin-C (saponin) một hợp chất phân lập

mới từ Eclipta alba được báo cáo với hoạt tính chống ung thư - gây độc tế bào [40].

g Ngăn rụng tóc, kích thích mọc tóc

Eclipta alba được sử dụng trong các chế phẩm dưỡng tóc vì nó thúc đẩy mọc

tóc và duy trì độ đen của tóc 10% w/v của Eclipta alba là thành phần chính trong

việc điều chế công thức thảo dược hỗ trợ cho sự phát triển của tóc

Eclipta Alba là một loại thảo dược phổ biến để kích thích sự phát triển của

tóc Dịch chiết ether và dịch chiết ethanol đã được phối hợp vào dạng kem (nướctrong dầu) và bôi tại chỗ trên da bị bong tróc của chuột bạch tạng trong một thửnghiệm Thời gian cần thiết để bắt đầu phát triển tóc cũng như hoàn thành chu kỳtăng trưởng tóc được ghi lại Dung dịch Minoxidil 2% được áp dụng tại chỗ vàđóng vai trò chứng dương để so sánh Kết quả điều trị với dịch chiết ether 2% và5% tốt hơn so với minoxidi 2% (chứng dương) [46]

h Tác dụng hạ đường huyết

Về tác dụng hạ đường huyết, sử dụng Eclipta alba qua đường uống trong 2

tháng đã được chứng minh là làm giảm glucose máu, glycosylated hemoglobinHbA1c, giảm hoạt động của glucose-6-phosphatase và fructose-1,6-bisphosphatase,

và tăng hoạt động của hexokinase gan Eclipta alba đã được chứng minh có hoạt

động trị tiểu đường và lợi tiểu bằng cách tác động lên tuyến tụy nhờ phục hồi và

tái tạo hoạt động tế bào β của tụy [8].

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Dược liệu nghiên cứu là cây cỏ nhọ nồi Eclipta alba được thu hái từ tỉnh

Thanh Hóa, trong tháng 06/2018 Dược liệu thu về được sấy khô ở nhiệt độ

50-600C đạt độ ẩm khoảng 5%, thái nhỏ hoặc xay nhỏ và bảo quản trong túi polymer

để nơi khô ráo, tránh ẩm

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, n-hexan,

ethyl acetat, dicloromethan, aceton

- Dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong ethanol đốt nóng để phát hiện viếtchất trên bản mỏng

- Bản mỏng tráng DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0,25 mm)

- Bột silica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck)

- Chất chuẩn wedelolacton, quercetin, methyl gallat đạt tinh khiết 98%

2.2.2 Thiết bị

- Máy cất quay Rotavapor R-220 (Buchi)

- Máy cất quay Buchi dung tích bình cất 250ml, 500ml, 1000ml

- Tủ sấy Memmert, Binder-FD115

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Bếp điện, bếp cách thủy Memmert

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu Detector Diode array

- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, Máy đohàm ẩm

- Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV

- Dụng cụ thủy tinh: Bình gạn 1000ml, bình nón 250ml, bình cầu các dungtích 250ml, 500ml, 1000ml, cột sắc ký các loại, phễu thủy tinh, ống đong, ốngnghiệm các kích thước,…

2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập

- Cỏ nhọ nổi được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với methanol,sau đó lọc loại bã dược liệu và gộp dịch chiết Tiếp theo cất thu hồi dung môidưới áp suất giảm thu được cao đặc toàn phần

- Cao toàn phần được phân tán trong nước và chiết phân đoạn lần lượt với

dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat thu được các phân đoạn

tương ứng

- Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột với chất hấp phụ làsilica gel pha thường (0,040-0,063 mm, Merck) kết hợp với phương pháp kết tinhlại trong dung môi Tiến hành quá trình sắc ký cột:

+ Khảo sát cao tổng bằng sắc ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khácnhau, chọn hệ dung môi có khả năng tách tốt để làm dung môi rửa giải

+ Chuẩn bị cột: cột sắc ký khô, sạch, lắp thẳng đứng trên giá cố định Nhồimột lớp bông xuống đáy cột Cân một lượng chất nhồi cột thích hợp vào cốc có mỏ,thêm dung môi thích hợp vào khuấy đều cho hết bọt khí Đưa từ từ hỗn hợp chấtnhồi cột lên cột, gõ nhẹ, đều tránh bọt khí Sau đó, tiếp tục cho dung môi chảy liêntục qua cột đến khi cột ổn định

+ Nạp mẫu: trộn đều chất hấp phụ với dung dịch mẫu phân tích, làm bay hơidung môi đến khi được bột tơi mịn thì đưa mẫu lên cột, rải thành một lớp đều trênmặt cột Sau đó, đặt một miếng bông lên để bảo vệ bề mặt cột

+ Rửa giải: sử dụng hệ dung môi thích hợp để rửa giải

- Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, tiến hành trên bản mỏngtráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck), RP-18 (Merck) Phát hiện chất bằng đèn

tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm, 366 nm và dùng thuốc thử là dung dịch H2SO410% trong ethanol

- Thu gom các phân đoạn có sắc ký đồ giống nhau Kiểm tra độ sạch của cácchất phân lập được bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi phù hợp

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc các hợp chất được xác định thông qua sự kết hợp của các phươngpháp phổ hiện đại và các đặc trưng hóa lý (điểm nóng chảy) Các phương pháp phổ

được dùng phổ biến trong xác định cấu trúc là phổ khối lượng (Mass spectrometry

- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance - NMR).

- Phổ khối lượng: Cung cấp thông tin về khối lượng của các ion sinh ra từ

phân tử Trong cùng một điều kiện ion hóa, sự phân mảnh tạo thành các ion con từion mẹ sẽ tuân theo những định luật nhất định Các chất có cấu trúc tương tự nhau sẽtạo ra những phân mảnh giống nhau Từ khối lượng các phân mảnh của phân tử,cùng các phương pháp phổ khác người ta có thể xác định được cấu trúc của mộtchất chưa biết So sánh phổ khối của một chất chưa biết với phổ khối của một chất

đã biết có thể giúp định danh chất chưa biết đó dễ dàng và chính xác [3]

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Khi đặt một chất có hạt nhân có số spin (I)

lẻ (1H, 13C ) được đặt trong một từ trường ngoài (B0), các spin hạt nhân sẽ được sắpxếp lại theo hai hướng: thuận và ngược chiều với từ trường và đạt tới trạng thái cânbằng giữa hai trạng thái này với một tỉ lệ xác định của 2 trạng thái Nếu dùng mộtbức xạ điện từ có tần số thích hợp chiếu xạ lên chất đó, các spin sẽ hấp thu nănglượng (cộng hưởng) và chuyển lên mức năng lượng cao (sắp xếp ngược chiều với từtrường) Khi ngưng chiếu xạ, các spin hạt nhân sẽ giải phóng năng lượng để trở vềtrạng thái cân bằng Xác định năng lượng mà các hạt nhân cùng một loại nguyên tốtrong phân tử hấp thu (hay giải phóng) sẽ thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân củacác chất đó Tùy vào mục đích và mức độ phức tạp của cấu trúc, ta có thể đo 1 haynhiều loại phổ khác nhau Xác định phổ của cùng một loại hạt nhân ( 1H hay 13C)như trong các phổ một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) hay các mối tươngquan giữa các loại hạt nhân trong các phổ hai chiều (COSY) [3]

Các phương pháp được sử dụng để xác định cấu trúc các hợp chất được phânlập từ cỏ nhọ nồi là:

- Điểm nóng chảy

- Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS)

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC

CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết các phân đoạn Cỏ nhọ nồi và phân lập các hợp chất từ cao phân

đoạn etyl acetat

3.1.1 Kết quả chiết phân đoạn Cỏ nhọ nồi

Lấy 2 kg cỏ nhọ nồi được xay mịn chiết nóng với MeOH, chiết 3 lần ở 700C,mỗi lần 3 giờ, với tỉ lệ DL/DM: 1/8 Sau đó, lọc lấy dịch chiết và cô dưới áp suấtgiảm thu được cao tổng NTP (288,3 g)

Phân tán 280g NTP vào 2l nước sau đó lắc phân đoạn với hệ dung môi có độ

phân cực tăng dần: n-hexan và EtOAc, 3 lần với mỗi dung môi Gộp dịch chiết và

cô dưới áp suất giảm thu được các phân đoạn tương ứng: phân đoạn n-hexan

(NH: 20,6g), phân đoạn EtOAc (NE: 60,9g) và phân đoạn nước (NW: 197,3 g)được biểu diễn như Hình 3.1

Hình 3.1 Sơ đồ phương pháp chiết xuất phân đoạn Cỏ nhọ nồi

NE (60g)

NE4.4NE4.2 (1,1g) NE4.3

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (10/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (8/1)

CC: pha thường DM: DCM/MeOH (8/1)

3.1.2 Kết quả phân lập các hợp chất trong Cỏ nhọ nồi

Dùng 60g cao phân đoạn NE tiến hành sắc ký cột pha thường silica gel với

hệ dung môi gradient là: DCM-MeOH (100%, 30/1, 20/1, 10/1, 8/1, 5/1) thuđược 7 phân đoạn ký hiệu là: NE1-7

Sắc ký cột pha thường phân đoạn NE4 (5,3g) với hệ dung môi DCM-MeOH(10/1) thu được phân đoạn ký hiệu là: NE4.1- 4.4 Phân đoạn NE4.1 (1,9g) đượctiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi DCM-MeOH (8/1), kết tinh lại thuđược hợp chất N01 (426mg) và N02 (112mg) Phân đoạn NE4.2 (1,1g) được tiếnhành tiến hành sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (8/1), kếttinh lại thu được hợp chất N03 (48 mg)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ cao phân đoạn EtOAc của cỏ nhọ nồi

3.2 Biện luận cấu trúc các hợp chất phân lập được từ Cỏ nhọ nồi

3.2.1 Biện luận cấu trúc N01

Hợp chất N01: chất bột màu trắng.

ESI-MS: m/z 314 [M+]: C16H10O7 Phổ 13C-NMR, phổ 1H-NMR và DEPT(Bảng 3.1) Các số liệu phổ của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với cấu trúc phân

tử của hợp chất wedelolacton (Hình 3.3)

Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton của nhóm methoxy ở δH 3,88 (3H, s, H-15)

Hai tín hiệu proton ở vị trí para của vòng thơm ở δH 7,35 (1H, s, H-13), 7,16 (1H, s,

H-10); Hai tín hiệu ở δH 6,44 (1H, d, J=2,5 Hz, H-6) và 6,59 (1H, d, J=2,0 Hz, H-8)

là tín hiệu proton vòng thơm ở vị trí meta

Phổ 13C-NMR của N01 có 16 tín hiệu carbon, trong đó: tín hiệu cacbon

cacbonyl của vòng lacton ở δC 164,0; 4 tín hiệu ở δC 99,5; 94,5; 99,6 và 106,0 là tínhiệu của 4 nhóm CH kề nối đôi (CH=), 10 tín hiệu ở 103,3; 161,4, 98,4, 156,3, 164,4,157,0, 151,2, 146,7, 115,7 là tín hiệu của 10 carbon bậc 4 kề nối đôi Tín hiệu ở56,3 là cacbon của nhóm OCH3 gắn vào vòng benzene Phổ HMBC cho thấy nhómOCH3 này tương tác với C7 (δ = 164,4)

Tương tác H→C được quan sát thấy trên phổ HMBC cho vị trí chính xác của

các proton và carbon trong phân tử của N01 (Bảng 3.1) Từ đây, dựa vào các kết quả

phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với các tài liệu đã công

bố [42] cấu trúc của chất N01 được xác định là

5,11,12-Trihydroxy-7-methoxycoumestan (Wedelolactone)

H3CO 7 8a O O

2 3

10 OH

1,8,9 - Trihydroxy-3-methoxycoumestan

Hình 3.6 Cấu trúc hợp chất N01 (Wedelolacton)

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất N01 và wedelolacton

3.2.2 Biện luận cấu trúc N02

Hợp chất N02: Chất rắn màu vàng, điểm nóng chảy 313-314 oC

Rf = 0,35 (TLC, silica gel, CH2Cl2/MeOH 9/1,v/v), Hiện màu vàng sau khi

phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dung dịchFeCl3/etanol 5%

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của hợp chất N02 và quercetin

Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của chất N02 cho các tín hiệu

đặc trưng của một flavonol Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 5 proton vòng

thơm trong đó 3 tín hiệu tương tác ABX ở δH 7,82 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2'), 7,69 (1H, dd, J = 8,5; 2,0 Hz, H-6'), 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5') thuộc về vòng thơm

B, hai tín hiệu proton tương tác meta ở δH 6,51 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,26 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6) thuộc về vòng thơm A.

Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra chất N02 gồm 15 cacbon với 5 CH nhân thơm

ở δC 99,1 (C-6), 94,4 (C-8), 115,7 (C-2'), 116,2 (C-5') và 121,4 (C-6'), 10 C trong đó tín hiệu δC 176,5 ppm đặc trưng cho nhóm cacbonyl, bốn cacbon có độ chuyển dịch

δC 145,8, 148,3, 162,3, 164,9 ppm đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm OH của các cacbon C-3', C-4', C-5, C-7 Ngoài ra, tín hiệu của cacbon ở δC

136,7 (C-3) đặc trưng cho cacbon của nối đôi liên kết với một nhóm hydroxyl.

Dựa vào dữ kiện phổ trên đồng thời so sánh điểm nóng chảy và so sánh với

các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó [5], cấu trúc của chất N02 được xác định

là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone hay quercetin

6

24

OH

4' OH

6'10

OH O

3 OH

Hình 3.7 Cấu trúc hợp chất N02 (Quercetin)

3.2.3 Biện luận cấu trúc N03

Hợp chất N03: Chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy là 201-202°C.

Hiện màu nâu ở UV 254 nm, không hiện màu ở UV 365 nm Hiện màu nâusau khi phun thuốc thử H2SO4 10% trong cồn, hơ nóng và hiện màu đen với dungdịch FeCl3/etanol 5%

a n

Bảng 3.3 Dữ liệu phổ của hợp chất N03 và methyl gallat

Phổ 1H-NMR của chất N03 cho một tín hiệu singlet của hai proton trong

vòng thơm δH 7,07 (2H, s, H-2 & H-6) Sự có mặt của một metyl este thể hiện qua

tín hiệu singlet của proton metyl δH 3,83 (3H, s, H-OCH3)

Phổ 13C-NMR của N03 cho tín hiệu của 8 cacbon trong đó tín hiệu của

cacbon cacbonyl ở δC 169,0 (C-7), cacbon metyl este δC 52,3 Sáu cacbon thuộc về

vòng thơm xuất hiện trong khoảng chuyển dịch δ C 110,1-146,4, trong đó C-1 và C-4

cho tín hiệu tương ứng ở δC 121,5; 139,7 Tín hiệu chồng chập của hai cacbon

methin C-2 và C-6 ở δC 110,1 với cường độ mạnh Tương tự vậy, hai cacbon vòng

thơm còn lại C-3 và C-5 xuất hiện ở δC 146,4 Các dữ kiện phổ trên gợi ý cho ta về

cấu trúc một phenolic thế tetra ở các vị trí 1,3,4,5 của hợp chất N03 trong đó có một

metyl este và ba nhóm còn lại là hydroxy Các tương tác HMBC cho phép xác định

cụ thể từng vị trí của các nhóm chức vào nhân thơm Từ nhận định trên, kết hợp

với tài liệu tham khảo [43] cho phép kết luận cấu trúc của hợp chất N03 là methyl

3,4,5-trihydroxybenzoate hay methyl gallat

thành các phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, EtOAc,

để thuận lợi cho quá trình phân tách tiếp theo

3.3.2 Về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất

Quá trình phân lập các chất hóa học sử dụng phương pháp sắc ký cột, phươngpháp này dễ thực hiện, chi phí thấp, hiệu quả tách cao và phù hợp với quy mô phòngthí nghiệm Để lựa chọn phân đoạn, thăm dò hệ dung môi rửa giải, định tính cácchất trong phân đoạn và theo dõi các chất trong quá trình phân lập, đề tài sử sụngphương pháp sắc ký lớp mỏng

Với phương pháp sắc ký và hệ dung môi rửa giải phù hợp, kết quả là đã phân

lập được 3 hợp chất N01, N02, N03 Dựa vào dữ liệu phổ MS, 1H-NMR, 13C-NMR,DEPT, HMBC, HSQC và đối chiếu với các tài liệu đã được công bố, đã xác địnhcấu trúc của các chất trên lần lượt là: wedelolacton, quercetin, methyl gallat

Wedelolacton:

Wedelolacton là một coumestan có hàm lượng lớn và đóng vai trò quan trọngtrong nhiều tác dụng dược lý của cây cỏ nhọ nồi [31] Wedelolactone đã đượcchứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, bao gồm ức chế phospholipase A2,virus viêm gan C RNA-polymerase và các hoạt động Na +, K + -ATPase.Wedelolacton còn

được sử dụng như thuốc để kháng lại nọc độc rắn và có khả năng chống oxy hóa [19], [33], [45], [54].

Tác dụng chống viêm được chứng minh thông qua việc ức chế hoạt độngIKK, có tiềm năng chống viêm bằng cách ức chế nồng độ IL-1β trong các bệnh nhưviêm khớp dạng thấp, hen suyễn và sốc nhiễm trùng [38]

Tác dụng chống ung thư của wedelolacton đã được chứng minh Đầu tiên,wedelolactone đã được chứng minh là ức chế sự phát triển của carcinosarcoma và tế

bào adenoma tuyến yên in vitro [30] và ngăn chặn sự phát triển của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt in vitro và in vivo [52] Wedelolactone ức chế sự tăng trưởng và

gây ra apoptosis trong các tế bào ung thư vú MDA-MB-231, do khả năng liên kếtvới DSDNA, ức chế topoisomerase IIa và ngăn chặn sự tổng hợp DNA [11]

Wedelolacton được nghiên cứu và cho thấy khả năng chống viêm, phòng vàchữa bệnh nhiễm trùng nặng Wedelolactone làm giảm các phản ứng viêm dozymosan gây ra đã được nghiên cứu tại Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội [17]

Quercetin:

Quercetin là một trong những flavonoid nổi tiếng, đã được đưa vào chế độ ănuống của con người trong một thời gian dài Việc sử dụng quercetin có rất nhiều lợiích sức khỏe, bao gồm chống oxy hóa, chống béo phì, chống viêm, kháng vi-rút,kháng khuẩn và chống ung thư [20], [37], [41]

Quercetin đã được báo cáo là có tiềm năng mạnh mẽ trong điều trị ung thư,

nó có thể ức chế sự tăng sinh của các loại tế bào ung thư khác nhau (ví dụ như tếbào ung thư đại trực tràng, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, tế bào ung thư gan, tế bàoung thư tuyến tụy và tế bào ung thư phổi, ) bằng cách tác động đến chu trình tế bàocủa chúng và ngăn chặn chúng phát triển [35], [36], [39], [49] Chức năng chốngung thư của quercetin được báo cáo liên quan đến khả năng chống oxy hóa mạnh

mẽ của nó [16]

Kết quả từ một số nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng của quercetin trong việc

ức chế các bệnh tim mạch Đối với bệnh nhân tăng huyết áp, việc sử dụng quercetin(730 mg / ngày, 4 tuần) đã được ghi nhận là làm giảm huyết áp tâm thu (giảm 7 mmHg), huyết áp tâm trương (giảm 5 mm Hg) và áp lực động mạch trung bình (giảm 5

mm Hg) [21] Trong một nghiên cứu tương tự, huyết áp tâm thu và mức LDL do xơvữa đã giảm đối với một số đối tượng béo phì có triệu chứng hội chứng chuyểnhóa sau khi được sử dụng 150 mg quercetin/ngày trong 42 ngày [22]

Methyl gallat:

Homer et al (1990) đã nghiên cứu về khả năng ngăn chặn các hoạt động

phân giải protein của một số vi khuẩn như Bacteroides gingivalis, Bacteriodes

intermedius và Treponema denticola [27] Methyl gallat ức chế tăng trưởng E coli,

mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn sản xuất axit lactic [6] và kết

hợp hiệp đồng với ciprofloxacin để chống lại Salmonella [14].

Methyl gallat được biết đến như một trong những chất chống oxy hóa [24].Ngoài ra, methyl gallat còn có tác dụng kháng tiểu cầu [41], bảo vệ DNA khỏi tổnthương do stress oxy [28], giảm stress oxy hóa trong tiểu đường [13]