KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của tinh dầu loài vương tùng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘIKHOA Y DƯỢC---- -------- NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG MURRAYA GLABRA GUILLAUMIN SWINGLE THU HÁI Ở SƠN LAKHÓA

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC  

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TINH DẦU LOÀI VƯƠNG TÙNG (MURRAYA GLABRA (GUILLAUMIN) SWINGLE)

THU HÁI Ở SƠN LAKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC  

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã may mắn nhận được rất nhiều sự giúp đỡquý báu cả về vật chất, tinh thần của thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sựkính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Đoàn Long - Phó Chủ nhiệmKhoa Y dược (Đại học Quốc gia Hà Nội), PGS.TS Phạm Thanh Huyền - TrưởngKhoa Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu), những người thầy cô đã trực tiếphướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoànthành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Thị Ngọc, ThS Nguyễn Quỳnh Nga vàcác cán bộ Khoa Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu) đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trongquá trình làm khóa luận Trong quá trình học tập và làm việc tại đây, tôi đã học tập

và tích lũy được nhiều kiến thức, kinh nghiệm và được truyền cảm hứng về tình yêu,niềm say mê và nhiệt huyết với công tác nghiên cứu về cây thuốc.Tôi xin chân thànhcảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học cơ sở đặc biệt là ThS Phạm Thị HồngNhung đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiệnnghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình,người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điềukiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này

Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020

Tác giả

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt

GC-MS

Viết đầy đủGaschromatography – mass spectrometry (sắc ký khí kếthợp khối phổ)

M glabra Loài Vương Tùng (Murraya glabra)

6 Hình 3.1: Hình thái chung của Vương tùng

(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle)

21

7 Hình 3.2 Lá kép Vương tùng (Mặt trên

8 Hình 3.3: Các dạng lá chét của Vương tùng

(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle)

(Mặt trên (A), Mặt dưới (B))

22

9 Hình 3.4: Gân lá chét mặt trên (A); mặt

dưới (B)

22

10 Hình 3.5: Lỗ tiết tinh dầu trên bề mặt lá,

11 Hình 3.6: Lỗ tiết tinh dầu ở mép lá, Mặt

22 Hình 3.17: Vi phẫu thân Vương tùng

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 2

1.1.1.Chi Murraya 2

1.1.2.Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle 9

1.2.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 10

1.2.1.Chi Murraya 10

1.2.2.Các nghiên cứu về loài Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle 11

1.3.Giới thiệu về phương pháp sắc ký khí khối phổ 14

1.3.1.Nguyên tắc 14

1.3.2.Ứng dụng trong kiểm nghiệm tinh dầu 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1.Vật liệu nghiên cứu 16

2.1.1.Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2.Hóa chất sử dụng 16

2.1.3.Thiết bị sử dụng 16

2.2.Nội dung nghiên cứu 16

2.3.Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1.Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu 17

2.3.2.Phương pháp hình thái so sánh 17

2.3.3.Phương pháp nghiên cứu giải phẫu 17

2.3.4.Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1.Xác định tên khoa học của loài Vương tùng thu hái ở Sơn La 21

3.2.Đặc điểm hình thái 21

3.3.Đặc điểm giải phẫu 26

3.3.2.Thân 28

3.3.3.Rễ 29

3.4.Thành phần hóa học trong tinh dầu 30

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

4.1.Kết luận 33

4.2.Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trong số các chi thuộc họ Cam, có một chi được biết đến với với khảnăng chiết suất tinh dầu rất cao từ lá Đặc biệt nhất là cây Murraya Glabra,hay còn được gọi là Vương tùng Từ năm 1965, cụ Đào Đình Khuê đã sử dụngtinh dầu của Vương tùng để chữa cảm mạo, sốt rét, đau nhức Không chỉ thế,tinh dầu Vương tùng còn có trong công thức cao xoa Lam Sơn (Công tydược phẩm Thanh Hóa) và dầu xoa Thăng Long xuất khẩu (Viện Dươc liệu

và Xí nghiệp dược phẩm trung ương 2 kết hợp sản xuất)

Cho đến nay, loài này mới chỉ được ghi nhận là phân bố ở Việt Nam Tuy

có nhiều ứng dụng như vậy nhưng Vương tùng vẫn chưa được nghiên cứu mộtcách cụ thể Vì vậy chúng tôi thực hiên đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật

và thành phần hóa học của tinh dầu loài Vương tùng (Murraya glabra(Guillaumin) Swingle) thu hái ở Sơn La” nhằm mục đích:

1 Xác định đặc điểm hình thái và đặc điểm vi phẫu của Vương tùng

(Murraya glabra (Guillaumin) Swingle

2 Xác định thành phần hóa học trong tinh dầu Vương tùng (Murraya

glabra (Guillaumin) Swingle

Theo 2 tác giả Dianxiang Zhang và Thomas G Hartley trình bày trongThực vật chí Trung Quốc [53] là tài liệu đầy đủ nhất về chi Murraya hiện nay,chi Murraya được mô tả đầu tiên bởi J Koenig ex Linnaeus vào năm 1771, cóđặc điểm chung như sau:

Cây gỗ nhỏ hoặc cây nhỡ, không có gai, không có lông tơ hay vảy trênngọn, chồi nách hoặc cụm hoa non Lá mọc so le, lá kép lông chim lẻ Cụmhoa ở ngọn hoặc ở nách, kiểu chùm kép hoặc cắt giảm thành xim hai ngả hoặcxim một ngả Hoa lưỡng tính, hình bầu dục tới hình trứng khi còn là nụ Đài 4hoặc 5, rời hoặc hàn liền đến một nửa chiều dài của chúng Tràng hoa 4 hoặc

5, tiền khai hoa kiểu vặn hoặc lợp Nhị từ 5 đến 8 hoặc 10, rời, không giốngnhau về chiều dài, chỉ nhị mảnh hoặc rất mảnh, thẳng hoặc không thẳng Đĩahình nhẫn, phồng lên hoặc hình cột Bộ nhụy 2-5 lá noãn, hàn liền, vách ngănthẳng đi từ trung tâm trở ra, mỗi lá noãn chứa 1-2 noãn Vòi nhụy 3-7 chomột bầu nhụy, rụng đồng loạt hoặc rụng không hết khi tạo quả Quả mọngcùng với thịt nhầy, không có các khoảng trống trong quả, vỏ quả trong mọngnước Hạt có lớp vỏ mỏng hoặc dầy, nội nhũ ít, cây mầm thẳng, lá mầm hìnhelip, một bên lồi một

bên phẳng, không cuộn vào cũng không gập lại, thân cây mầm phân ra ở giữagắn các lá mầm.

Ngoài ra chi Murraya còn được Guillaumin mô tả trong Thực vật chí Đông Dương năm 1912 với 3 loài là M alata, M koenigii và M exotica [55].1.1.1.3 Phân loại chi Murraya

Theo Dianxiang Zhang và Thomas G Hartley trình bày trong Thực vật chí Trung Quốc [53], khóa phân loại chi Murraya được thể hiện như sau:1a Cánh hoa 1-2 cm, hạt có lông nhỏ

2a Cuống lá chét cấp 1 có cánh……….…… 1 M alata2b Cuống lá chét cấp 1 không có cánh

3a Phiến lá chét hình từ gần tròn đến hình ovan đến hình elip rộng 1,5 đến 6 cm ………2 M paniculata3b Phiến lá chét hình trứng, ngọn phiến lá rộng hơn phần gốc phiến lá, rộng từ 0,5 đến 3 cm ………3 M exotica

1b Cánh hoa không dài quá 0,8 cm, hạt không có lông

4a Tràng hoa 4 (hoặc 5) – nhiều, bộ nhị 8 hoặc 10

5a Phiến lá chét hình mũi mác, rộng 0,8-2 cm, gân phụ không rõ

………4 M tetramera

5b Phiến lá chét hình ovan đến elip hoặc hiếm khi là hình mũi mác hoặc hình trứng ngược; rộng từ 2-4 cm, gân phụ ở mặt trên hơi nhô ra

………5 M euchrestifolia4b Tràng hoa 5 - nhiều, bộ nhị 10

6a Lá kép 11-31 lá chét

7a Phiến lá chét rộng 3-6 mm, đỉnh lá tròn 6 M.microphylla7b Phiến lá chét rộng 5-20mm, đỉnh lá có một mũi nhọn ngắn nhô ra ………7 M koenigii

6b Lá kép 3-11 lá chét

8a Mặt dưới phiến lá có nhiều lông ngắn 9 M kwangsiensis8b Phiến lá không có lông

9a Phiến lá chét 5-6 x 2-3 cm 8 M.crenulata9b Phiến lá chét 7-18 x 4-10 cm 9 M kwangsiensisTuy nhiên, hiện nay người ta đang đề xuất một hệ thống phân loại mớicho chi này đó là chia chi Murraya ra làm 2 phân chi là Murraya và Bergera[26, 29, 49, 57] Sự phân đôi này được chứng minh bằng sự khác biệt đáng chú

ý của các chất chuyển hóa thứ cấp với 3-prenylindoles ở Murraya và carbazole

ở Bergera Đối với các chất chuyển hóa khác của chi Murraya, coumarin đượctìm thấy trong cả 2 phân chi, nhưng khác nhau rõ ràng về thành phần, 8-prenylcoumarin được tìm thấy trong toàn bộ phân chi Murraya trong khi furfurmarin geranylated được biết đến từ một số loài của phân chi Bergera Vềtính chất hóa học, phân chi Bergera gần với chi Clausena hơn phân chiMurraya Đây chính là yếu tố quyết định để phân biệt M exotica và M.panticulata

1.1.1.4 Thành phần loài và phân bố

Trên thế giới có khoảng 12 loài thuộc chi Murraya J Koenig ex Linnaeusphân bố ở phía Đông, Nam và Đông Nam của châu Á, Australia, khu vực TâyNam Thái Bình Dương gồm : Murraya alata Drake, Murraya crenulata,Murraya euchrestifolia Murraya koenigii (L.) Sprengel, Murrayakwangsiensis, Murraya microphylla, Murraya ovatifoliolata (Engl.) Domin,Murraya paniculata (L.), Murraya stenocarpa (Drake) Swingle, Murrayatetramera [53]

1.1.1.5 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học được nghiên cứu nhiều nhất trong chi Murraya là cácnhóm hợp chất sau: tinh dầu, alcaloid, flavonoid, coumarin

Tinh dầu

Một nghiên cứu của QianLi, Liang-FengZhu và các cộng sự vào năm

1988 đã tách được khoảng 60 chất từ tinh dầu của 6 loài thuộc chi Murraya(gồm M alata; M exotica; M kwangsiensis; M koenigii; M micmphylla;

M paniculate), sự tương phản về thành phần của 2 phân chi là rất rõ nét.Trong 3 loài từ phân chi Bergera thì tinh dầu chủ yếu chứa monoterpene.Trong M microphylla, hơn 60% là 2-phellandrene và các thành phần quantrọng khác cũng là monoterpen monocyclic Tinh dầu của M kwangsiensisbao gồm phần lớn các hợp chất oxy hóa acyclic neral, geranial và geranylacetate Trong cả hai trường hợp, Sesquiterpene chiếm ít hơn 10% tổng số

M koenigii thì khác một chút; thành phần phong phú nhất là O-pinene vàmonoterpen chiếm hơn

50% tinh dầu nhưng các hợp chất sesquiterpene cũng rất phong phú, đáng chú

ý là t-caryophyllene và y-elemene Ngược lại, ba loài từ phân chi Murraya đãcho các loại dầu chủ yếu hoặc hoàn toàn là Sesquiterpene Hợp chất chính(30%) từ M alata được xác định là l-gurjunene trong khi 50% dầu của M.exotica là caryophyllene Tinh dầu từ M paniculata chứa y-elemene là thànhphần chính (30%) với nerolidol và t-caryophyllene đều đóng góp hơn 10%[29] Nghiên cứu này cho thấy thành phần dễ bay hơi trong lá của chi Murrayacung cấp 1 đặc điểm hóa học khác để phân biệt 2 phân chi trong chi này.Năm 2015, Chun-xue You và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc kýkhí khối phổ để xác định một số thành phần tinh dầu trong chi Murraya (trong

đó bao gồm Murraya tetramera, Murraya euchrestifolia, Murraya koenigii,Murraya kwangsiensis, Murraya exotica, và Murraya alata) đã được nghiêncứu Từ các mẫu cành mang lá của chúng, thu hái tại tỉnh Quảng Tây và VânNam Trung Quốc vào tháng 5,6,7 năm 2014, tinh dầu thu được bằng cách cấtkéo hơi nước với hàm lượng không cao, đạt từ 0,03 đến 0,23 % Tất cả 36thành phần được xác định bởi GC-MS từ các mẫu tinh dầu Các thành phần

có hàm lượng tương đối cao hơn bao gồm α-cedrene (4,22 - 21,82%), caryophyllene (8,15 - 27,73%), γ-elemene (4,38–12,65%), γ-selinene(3,80– 21,09%), α-

β-selinene (2,60–10,68%), α-zingiberene (2,08–12,68%), spathulenol (3,08–11,80%), caryophyllene oxit (1,58–10,59%), β-eudesmol (1,33–25,32%), vv.Hơn nữa, tám hợp chất , được công nhận là thành phần quan trọng trong tinhdầu của M tetramera và M kwangsiensis, đã được phân lập xác định là α-terpinene, β-caryophyllene, α-caryophyllene, alloaromadendrene, spathulenol,β-eudesmol, camphene và oxit caryophyllene [51]

Hình 1.1: Cấu trúc một số thành phần thường gặp trong tinh dầu chiMurraya

Alkaloid

Năm 1986, Yun-Cheung Kong và cộng sự đã tiến hành phân tích 8 loàitrong chi này và phát hiện ra chúng đều có chứa alkaloid ở bộ phận nào đó[28] Hầu hết các alkaloid trong chi này đều thuộc nhóm Carbazole alkaloidnhưng cũng có một phần nhỏ thuộc nhóm indo alkaloid

Đặc biệt là các carbazole alkaloid đầu tiên được phân lập từ M koenigii,hơn nữa M euchrestifolia là nguồn carbazole rất dồi dào Rất nhiều cacbazoleđều được phân lập từ loài này [18].

Người ta đã phát hiện ra được Yuehchukene – 1 indol alkaloid ở trong 4loài thuộc chi Murraya là M paniculata, M paniculata var omphalocarpa(Hay.) Tanaka, M exotica và M alata Drake Ở một số loài còn lại thì gần nhưkhông thấy được thành phần này [52]

Flavonoid

Flavonoid được tìm thấy trong 1 số loài thuộc chi Murraya điển hình nhưtrong lá, quả của M paniticula [20, 27, 39]; lá của M koenigii [21, 22]; lá, thâncủa M tetramerrra [54], M.exotica [25] Tuy đã có một số nghiên cứu vềflavonoid thuộc chi này nhưng người ta không đi vào quá sâu mà chỉ nghiêncứu qua về cấu tạo và một vài tác dụng sinh học của flavonoid

Courmarin

Cũng như Flavonoid thì Courmarin cũng được tìm thấy trong hầu hếtcác loài thuộc chi Murraya như: lá của M paniculata[43], M koenigii[45], M exotica [15], Murraya siamensis [24], M alata [31] và M.tetramera [50] nữa

4 loại vi khuẩn là Staphylococcus aureus , Escherichia coli, Salmonellatyphimurium và Enterococcus faecallis cho thấy hoạt động kháng khuẩn yếuđối với Staphylococcus aureus và kháng khuẩn trung bình cho tất cả các chủng

vi khuẩn khác với kết quả MIC lần lượt là 1,0;0,5;0,5;0,5 (mg/mL) [42]

Kháng nấm

Cũng trên thử nghiệm kháng khuẩn của tinh dầu M paniculata người ta thực hiện kiểm tra khả năng kháng nấm của nó với 4 loại nấm là Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticum và Fusarium Solani thì thu được MIC là 0,2;0,2;0,1;0,2 (mg/ml) Từ đó có thể thấy được khả năng kháng nấm mạnh của tinh dầu này [33].

Theo một nghiên cứu khác, dịch chiết methanol của lá M koenigii có khả năng ức chế tăng trưởng sợi nấm với Rhizoctonia solani (70%) và

Fusarium oxysporum (58%), còn dịch chiết ethanol thì là Fusarium

oxysporum (61,07%) và Rhizoctonia solani (53,77%) Trong khi đó thì tinh dầu của M koenigii chỉ có khả năng ức chế trung bình với 2 loại nấm là

Fusarium oxysporum (55,69%) và Rhizoctonia solani (48,38%) [38]

Chống viêm

Tác dụng của các nhóm hợp chất khác: Yuehchukene – một indol

alcaloid được phát hiện chỉ trong bốn trong số chín loài thuộc chi Murraya được phân tích (M paniculata , M paniculate var omphalocarpa, M exotica

và M alata) với hoạt tính chống viêm nổi bật [17, 52]

Các thử nghiệm trên chuột đã chứng minh được rằng dịch chiết của M.koenigii có khả năng chống viêm, giảm đau [23], có được các tác dụng này là

do nó có khả năng chứa nguồn alkaloid carbazole rất phong phú [14]

Ngoài M koenigii thì còn có 2 loài M paniculate [36] và M exotica [48]cũng có khả năng giảm đau và chống viêm đáng kể

Chống oxi hóa

Năm 2015, Tejal K Gajaria, Dipak K Patel, Ranjitsinh V Devkar và cáccộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết của M koenigii đã ngăn chặn quá trình oxyhóa, cải thiện về khả năng sống của tế bào và điện thế màng ty thể của các tếbào được điều trị Ox-LDL Sự gia tăng Ox-LDL trong khi mất cân bằng oxyhóa nội bào, ngưng tụ nguyên tử và chết rụng tế bào đã được ngăn chặn mộtcách hiệu quả nhờ dịch chiết M koenigii có thể có các chất chống oxy hóa vàgốc tự do được coi là sự hiện diện của flavonoid có trong chiết xuất Điều nàycung cấp bằng chứng sơ bộ về tiềm năng chống xơ vữa động mạch của nó vàđảm bảo làm sáng tỏ và xác nhận thêm cho việc sử dụng in-vivo và có thể hữuích như một thực phẩm chức năng bổ sung và một loại thuốc thay thế để ngănchặn quá trình oxy hóa LDL và độc tính gây ra oxy hóa LDL [21]

Năm 2016, Davinder Kaur, Arvinder Kaur và Saroj Arora đã sử dụngUHPLC để xác định để kiểm tra thành phần của dịch chiết M exotica Họ đã

nhận ra được rằng dịch chiết từ phân đoạn ethyl acetat có khả năng chống gốc

tự do rất tốt cũng như giảm khả năng đột biến của gen [25]

Diệt côn trùng

Từ các mẫu của 6 loài thuộc chi Murraya: Murraya tetramera, Murrayaeuchrestifolia, Murraya koenigii, Murraya kwangsiensis, Murraya exotica vàMurraya alata, các thành phần tinh dầu của chúng đã được phân tích và chứngminh tác dụng chống lại Tribolium castaneum [51]

Lá của M koenigii làm giảm buồn nôn, khó tiêu, nôn mửa Ngoài ra,người ta còn ăn như một phương thuốc chữa tiêu chảy và kiết lỵ [17] Lácủa M paniculata có chứa các nhóm chất kích thích có tác dụng làm se được

sử dụng trong điều trị tiêu chảy, kiết lỵ và các bệnh về răng và nướu; phòngchống bệnh thấp khớp, ho và hysteria, nó còn được chứng minh là có khả năngkháng khuẩn vừa phải và kháng nấm rất mạnh [42]

Nghiên cứu so sánh tinh dầu giữa M paniculate và M exotica đã chứngminh rằng β-caryophyllene có trong 2 loài này có tác dụng gây tê cục bộ có thể

so với procaine Ngoài ra nó còn có tác dụng chống viêm và giảm đau do viêm[30]

Một số nghiên cứu đã chỉ ra hoạt tính kháng khuẩn, chống tiểu đường,chống oxy hóa, chống bài tiết, chống ung thư từ M paniculata [33, 40] Hoạttính chống viêm bởi các coumarin và benzocoumarin chiết xuất từ loài M alatacũng đã được chứng minh [31]

Tác dụng khác

Ngoài việc sử dụng để chữa bệnh thì một số loài trong chi Murraya cònthường được sử dụng làm gia vị, cây cảnh hoặc hương liệu

1.1.2 Cây Vương tùng - Murraya glabra (Guillaumin) Swingle

Trên thế giới hiện chỉ có một số tài liệu đề cập đến cây M glabra và chỉ

ra tiêu chí để phân biệt chứ chưa thấy có tài liệu chi tiết nào về đặc điểm thựcvật, vi phẫu, tinh dầu của loài này [41]

Loài này còn được cho là có tên khoa học là Micromelum glabrumGuillaumin Nó được mô tả lần đầu năm 1910 trong thực vật chí Đông dươngbởi Guillaumin như sau:

Cây bụi nhỏ 1 mét Cành cây hoàn toàn đẹp, với các tuyến rất thơm Ládài 12-46 cm; lá chét xen kẽ từ 3-9, nhẵn, hình ovan hoặc thuôn dài (kíchthước 5-17 cm x 2-9 cm) không đều nhau và phình ở gốc, nhọn ở đỉnh, hầunhư không

có răng cưa; gân lá 6-9 đôi, nhô ra bên dưới, tĩnh mạch không chặt lắm vàkhông nhô ra bên dưới; cuống lá hình trụ, nhẵn, dài 3-4 mm; cuống lá hình trụ,nhẵn, tuyến Cụm hoa ngắn hơn lá, có lông rất ngắn; cuống nhỏ dài hơn hoa,được cung cấp ở gốc hoặc ở phần dưới thấp hơn với 2 nhánh nhỏ; Hoa dài 4

mm, màu trắng Tràng với 4 lá đài hợp nhất, giống nhau, rất ngắn Cánh hoadài 4-6 mm, nhẵn, hình mũi mác Nhị 8, gồm 4 nhị dài và 4 nhị ngắn; chỉ nhị

mở rộng và có lông; bao phấn đính lưng, hình bầu dục, có một số lông Đĩangắn Bầu hình trụ, nhiều nốt sần, không có lông; vòi nhụy dài hơn bầu, ở đỉnh

là nhụy hình cầu [55]

Tuy nhiên tên này không được chấp nhận và sau đó loài này được Walter

T Swingle nhắc đến lần đầu trong bài báo "A new taxonomic arrangement ofthe orange subfamily, Aurantioideae" và được đăng lần đầu vào ngày3/11/1938 trên tạp chí Journal Of The Washington Academy Of Sciences [44].Theo tác giả Tyozaburo Tanaka thì M glabra có chỉ nhị dài và có lôngmịn Lá kép gồm 5-11 lá chét, rất lớn, làm cho nó khác với các loại cây khác[56] Ngoài ra, thành phần hóa học của M glabra được dự đoán là sẽ chứacarbazole [28]

1.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.2.1.2 Phân loại

Hiện nay, chi Murraya mới ghi nhận được 4 loài có ở Việt Nam Trongluận văn nghiên cứu về phân loại các loài trong họ Cam – Rutaceae, TS BùiThu Hà đã phân loại chi Murraya của họ này như sau :

1a Cuống lá có cánh M alata1b Cuống lá không có cánh

2a Số lượng hoa trong cụm hoa ít, cánh hoa dài hơn 1,5cm M.paniculata

2b Số lượng hoa trong cụm hoa nhiều, cánh hoa ngắn hơn 1cm3a Số lượng lá chét từ 17-31………M koenigii 3b Số lượng lá chét từ 5-9……… M glabra1.2.2 Các nghiên cứu về loài Vương tùng - Murraya glabra

(Guillaumin) Swingle

1.2.2.1 Đặc điểm thực vật

Đặc điểm thực vật của Vương tùng được mô tả ở nhiều sách, cụ thể là:Theo Danh lục thực vật Việt Nam do Nguyễn Tiến Bân làm chủ biên thìVương tùng là cây dạng bụi nhỏ, cao 1-1,5m Mọc rải rác trên núi đá vôi.Theo cuốn Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam của Đỗ Tất Lợi (2004)thì đặc điểm thực vật của Vương tùng là cây nhỏ mọc thành bụi, cao 1-2m, đặcbiệt có thể cao từ 3-4m Lá kép lông chim lẻ gồm 5-9 lá chét có cuống dài 5-7mm, màu tía, trên cuống lá chét dôi khi có đốt, phiến lá hình trứng dài 4-6,5cm, rộng 1,8-3,8cm mặt trên màu xanh xám, mặt dưới xanh nhạt, nổi rõ ởmặt dưới, mép lá có rang cưa giả do túi tiết tinh dầu gợn lên Hoa nở vào mùaxuân, mọc thành chum xim, hoa rất nhỏ Quả chin già vào tháng 8-9, to bằnghạt ngô Vỏ quả chứa rất nhiều tinh dầu Lá, vỏ quả rất thơm, mùi dễ chịu.Theo Sách đỏ do Nguyễn Tiến Bân làm chủ tịch hội đồng biên soạn thìVương tùng là cây gỗ nhỏ, thường mọc thành bụi, cao 2 - 4m Ngọn cành vàcuống lá non màu đỏ tím Lá kép hình lông chim, mọc so le, dài 10 - 25cm, có

3 - 9 lá chét Lá chét hình mũi mác, dài 3,5 - 7,5cm, rộng 1,5 - 3,5cm, đầu láthuôn hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống lá dài 3 - 5mm Mặt trên phiến lá bóng,soi lên ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinh dầu Mép lá nguyên, có nhiều túi tiếtnằm sát mép lá trông như có răng cưa nhỏ Cụm hoa là một chùm xim ở đầucành, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, mùi thơm Hoa mẫu 4 Cánh hoa dài 4 -6mm, rộng 1,5mm Nhị 8, bốn nhị ngoài dài 5mm, bốn nhị trong dài 4mm Bộnhuỵ dài khoảng 3mm, bầu sần sùi Quả hình cầu hay bầu dục, đường kính 7 -9mm, chứa 1 - 2 hạt; vỏ quả có nhiều túi tiết tinh dầu, khi chín màu đỏ

Còn theo Bùi Thu Hà thì Vương tùng là cây gỗ nhỏ, thường mọc thànhbụi, cao 2 - 4m Ngọn cành và cuống lá non màu đỏ tím Lá kép hình lôngchim, mọc so le, dài 10 - 25cm, có 3 - 9 lá chét Lá chét hình mũi mác, dài 3,5

- 7,5cm, rộng 1,5 - 3,5cm, đầu lá thuôn hẹp tạo thành mũi nhọn, cuống lá dài

3 - 5mm Mặt trên phiến lá bóng, soi lên ánh sáng thấy rõ nhiều túi tiết tinhdầu Mép lá

nguyên, có nhiều túi tiết nằm sát mép lá trông như có răng cưa nhỏ Cụm hoa

là một chùm xim ở đầu cành, mang nhiều hoa nhỏ màu trắng, mùi thơm Hoamẫu 4 Cánh hoa dài 4 - 6mm, rộng 1,5mm Nhị 8, bốn nhị ngoài dài 5mm, bốnnhị trong dài 4mm Bộ nhuỵ dài khoảng 3mm, bầu sần sùi Quả hình cầu haybầu dục, đường kính 7 - 9mm, chứa 1 - 2 hạt; vỏ quả có nhiều túi tiết tinh dầu,khi chín màu đỏ Mùa ra hoa tháng 3-4, quả chín vào tháng 9-10 Tái sinh bằnghạt Ưa sáng chịu hạn

Hình 1.2: Tổng quát về Vương tùng ([3])1.2.2.2 Thành phần hóa học

Theo Đỗ Tất Lợi, trong Vương tùng có các nhóm hợp chất: tinh dầu,imperatozin, dentatin, nondetatin [3]

Đa số các nghiên cứu ở Việt Nam về loài này thường tập trung vào tinhdầu do nó có nhiều tiềm năng để nghiên cứu hơn các phần còn lại Đây là thànhphần hóa học chính phân bố chủ yếu ở quả già và lá chét, ở cuống lá hoặc cànhthì hàm lượng tinh dầu không đáng kể Hàm lượng tinh dầu trong M glabra rấtgiàu menthon và isomenthon (85-95%) [13]

Năm 1989, Lê Tùng Châu và các cộng sự đã sử dụng một số phương phápnhư sắc ký khí, sắc ký khí chế tạo, đo phổ khối tử ngoại, hồng ngoại, cộnghưởng từ piroson, sắc ký khí khối phổ, sắc ký khí hồng ngoại và làm các phảnứng hóa học và đã xác định được trong tinh dầu Vương tùng có chứa menthon,isomenthon, limonen, p.cymen và hydroxymenthon [5, 6].

Menthon Isomenthon Limonen P cymene

Hydroxymenthon Hình 1.3: Một số hợp chất chính trong tinh dầu Vương tùng

1.2.2.3 Tác dụng dược lý và ứng dụng

Lê Tùng Châu và cộng sự đã công bố trên tạp chí dược học (1989) tinhdầu Vương tùng có tác dụng diệt khuẩn khá mạnh, diệt được nhiễm trùng vikhuẩn ở nồng độ 50 L/ml môi trường nuôi cấy được xác định bằng phươngpháp khuếch tán và phương pháp nồng độ Ngoài ra tác giả còn nhận thấy tinhdầu này còn có thể chữa cảm cúm, thấp khớp,nhức xương [6]

Theo tài liệu khác thì lá Vương tùng có khả năng chữa cảm cúm, sốt rét, đau khớp, nắn bó gãy xương Rễ chữa tê thấp, phù thũng [5, 12]

1.2.2.4 Phân bố

Theo Sách đỏ Việt Nam – Phần 2: Thực vật do Nguyễn Tiến Bân làm chủbiên thì phân bố của loài Vương tùng là:

Thế giới: Trung Quốc (Vân Nam) [8, 10]

Việt Nam: Quảng Ninh, Hải Phòng (Cát Bà), Hà Nam, Hoà Bình, NinhBình, Thanh Hoá, Quảng Trị, Đà Nẵng [2, 3, 8-10]

Hình 1.4: Phân bố Vương tùng ở Việt Nam ([10])1.3 Giới thiệu về phương pháp sắc ký khí khối phổ

Tinh dầu là một hợp chất chứa các chất thơm dễ bay hơi [16] Vì vậy, để

có thể phân tích được thành phần của tinh dầu, người ta thường dùng sắc kýkhí khối phổ, vốn là phương pháp được tạo ra nhằm xác định được thành phầncủa những chất dễ bay hơi

1.3.1 Nguyên tắc

Sắc ký khí là một phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác nhau củacác chất giữa hai pha không trộn lẫn vào nhau, trong đủ pha động là chất khí(khí mang) đi qua pha tĩnh chứa trong cột Sắc ký khí được áp dụng để táchnhững chất hoặc dẫn xuất của chúng mà có thể hóa hơi ở nhiệt độ phân tích.Phương pháp sắc ký khí dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bổ hoặc loại theo kíchthước (dùng rây phân từ) [1]

Nguyên tắc của MS: Chất phân tích được chuyển sang thể khí và ion hóa,tạo thành các ion dương hoặc âm Phương pháp phổ khố dựa trên việc đo trựtiếp tỉ số m/z, là tỉ số giữa khối lượng m và điện tích z của ion phân tích Từphổ khối ta có thể có được thông tin về khối lượng phân tử và cấu trúc cácmảnh thu được giúp định tính hay định lượng [1]

1.3.2 Ứng dụng trong kiểm nghiệm tinh dầu

Sắc ký khí- khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng đượcứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu bởi ưu điểm

và độ phù hợp của nó Bất chấp thiết bị đắt tiền và tốn nhiều thời gian hơn sovới một số kĩ thuật khác Hiếm có kỹ thuật nào có độ chính xác khi phân tíchtinh dầu như sắc ký khí khối phổ[16].

Sự phù hợp của sắc ký khí đối với kiểm nghiêm tinh dầu: Do thành phầntinh dầu chủ yếu là các terpenoid, dễ bay hơi, nên đặc biệt phù hợp để sử dụngsắc ký khí phân tích Sau khi đi qua cột sắc ký các tinh dầu phức tạp có thể chocác peak chồng chất, khi đó, khối phổ trở nên hiệu quả vì có thể nhận ra cácpeak chồng chất [32]

Tóm lại, các loại tinh dầu thường là một hỗn hợp phức tạp của rất nhiềuchất khác nhau, trong đó một số chất có cấu trúc hóa học tương tự nhau Dokhả năng phân tách tốt các hỗn hợp chứa các thành phần dễ bay hơi như tinhdầu nên GC-MS thường được ưu tiên sử dụng khi phân tích tinh dầu

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu thực vật tươi và khô được thu hái ở Bản Lụa, Phường Chiềng An,

TP Sơn La Mẫu được cung cấp bởi khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dượcliệu

- Dung môi chiết xuất: cloroform, ether dầu hỏa, EtOH 96%, nước cất

- Dung môi pha loãng tinh dầu: n-hexan

- Pha động trong GC-MS: Heli

2.1.3 Thiết bị sử dụng

Nghiên cứu đặc điểm thực vật:

- Chụp ảnh mẫu nghiên cứu bằng máy ảnh Canon IXY 30S

- Kim mũi mác, dao lam, chổi lông, phiến kính, lamen, …

- Kính hiển vi soi nổi Nikon SMZ 745T kết nối camera Nikon Fi2 và máy tính

DS Kính hiển vi Nikon Eclipse Ci kết nối camera Nikon DS-Fi2 vàmáy tính

- Tủ sấy WiseVen

Nghiên cứu thành phần hóa học:

- Cân kỹ thuật Sartorius

- Cân phân tích hiện số Shimadzu AY 220

- Máy sắc ký khí khối phổ GC-MS-QP2010 Shimadzu (Nhật Bản),2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định tên khoa học của mẫu thu thập được

- Mô tả chi tiết đặc điểm hình thái cây Vương tùng thu hái ở Sơn La

- Mô tả đặc điểm vi phẫu của loài Vương tùng thu hái ở Sơn La

- Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu loài Vương tùng thu hái ởSơn La.

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp khảo cứu, kế thừa tài liệu

- Tham khảo tài liệu để nắm được các thông tin cơ bản về:

+ Vị trí phân loại và danh pháp loài

+ Nguồn gốc và vùng phân bố(ở Việt Nam và trên thế giới)

+ Đặc điểm hình thái và sinh thái loài

+ Giá trị sử dụng của loài

+ Một số thành phần trong tinh dầu

- Kế thừa tài liệu và các phương pháp nghiên cứu:

+ Kế thừa số liệu, kết quả từ các bài báo, các nghiên cứu trong vàngoài nước

+ Các phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, nghiên cứu viphẫu, tách chiết tinh dầu

2.3.2 Phương pháp hình thái so sánh

Sử dụng phương pháp phân loại so sánh hình thái theo Nguyễn NghĩaThìn (2007) [7] để xác định tên khoa học, nghiên cứu đặc điểm hình thái vàphân loại các taxon của các loài thu thập được Phương pháp này khôngđồi hỏi những thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, đảm bảo độ chính xác và phùhợp với điều kiện trong nước

Đối chiếu các mẫu thu được với mẫu lưu trữ tại phòng tiêu bản Dược liệucủa Viện Dược liệu và ảnh type của mẫu tại Bảo tàng Lịch sử tự nhiên Quốcgia Pháp

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu giải phẫu

Nghiên cứu giải phẫu các phần lá, thân, rễ của các mẫu thu được theophương pháp nghiên cứu của Nguyễn Bá [4], Trần Văn Ơn [11]

Các bước thực hiện:

□ Cắt mẫu và tẩy nội chất

- Cố định mẫu trên dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay microtome và cắtbằng dao lam Sử dụng phẫu thức cắt ngang Cắt những lát mỏng qua rễ,