KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở việt nam

Phương pháp phân loại học hiện đại Phân loại học phân tử Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh học, các kỹ thuật chỉthị sinh học phân tử ra đời từ thập kỷ 80 của thế kỷ

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC 

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN

DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH)

Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2020

Trang 2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC 

Người thực hiện:

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN

DÂY THƯỜNG XUÂN (HEDERA NEPALENSIS K.KOCH)

Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ ITS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã may mắn nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ quý báu cả về vật chất, tinh thần của thầy cô, bạn bè Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ

sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm ThịHồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người

đã trực tiếp hướng dẫn tôi, chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình thực hiện nghiêncứu và hoàn thành khóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn cô Đỗ Thị Lệ Hằng, bạn Đỗ Hạnh Nguyên đãgiúp đỡ, hỗ trợ tôi trong thực hành thí nghiệm Các thầy cô, các bạn không chỉ trang

bị cho tôi kinh nghiệm và kỹ năng chuyên môn mà còn truyền cho tôi tình yêu, lòngnhiệt huyết với nghiên cứu và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học cơ sở đãhết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu vàhoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu - Bộ Y tế đã khôngquản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài mộtcách thuận lợi nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm Khoa, cùng toàn thể các thầy côgiáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báutrong quá trình học tập tại nhà trường

Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Côngnghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủtrì để thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình,người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điềukiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này

Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2020

Tác giả

Trang 4

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

H.helix Hedera helix L (Thường xuân)

H.nepalensis Hedera nepalensis K.Koch (Dây thường xuân)

Chromatography)

Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit

(Thermo Scientific, Mỹ)

(National Center for Biotechnology Information)

Averages

Trang 5

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin các m ẫ u th ự c v ật đượ c nghiên c ứ u 19

27

Bảng 3.3 Các haplotype trong nghiên cứu 30

Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotide sai

septemlobus (MH711151.1) 31

Bảng 3.6 Các trình tự tham chiếu trên Genbank 35

Trang 6

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật 9

Hình 1.2 D ạ ng cây phát sinh loài bi ế t rõ ngu ồ n g ố c 11

Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis 13

Hình 1.4 Phân bố địa lý của H nepalensis tại miền Bắc nước ta 14

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21

Hình 2.2 Hi ể n th ị k ế t qu ả gi ả i trình t ự qua ph ầ n m ề m BioEdit 23

Hình 3.1 Ảnh điệ n di DNA t ổ ng s ố c ủ a m ộ t s ố m ẫ u trên gel agarose 1,2 % 24

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen ITS 26

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen ITS 26

Hình 3.4 T ối ưu nồng độ m ồ i ph ả n ứ ng nhân dòng gen ITS 27

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen ITS của một số mẫu 28

Hình 3.6 K ế t qu ả hi ể n th ị gi ả i trình t ự c ủ a m ẫ u H1 qua ph ầ n m ề m BioEdit 28

Hình 3.7 Kết quả so sánh BLAST của mẫu H4 và H nepalensis (AJ131238). 29

Hình 3.8 Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i xây d ự ng b ằng phương pháp UPGMA d ự a trên ch ỉ th ị phân t ử ITS 35

Hình 3.9 Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i xây d ự ng b ằng phương pháp N J d ự a trên ch ỉ th ị phân t ử ITS 36

Hình 3.10 Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i xây d ự ng b ằng phương pháp ML dự a trên ch ỉ th ị phân t ử ITS 36

Hình 4.1 Phân b ố đị a lý các haplotype c ủa Dây thườ ng xuân ở các t ỉ nh Lào Cai, Hà Giang, L ạng Sơn 46

Trang 7

MỤC LỤC

ĐẶ

T V ẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 T Ổ NG QUAN 3

1.1.Đa dạ ng và phân lo ạ i sinh h ọ c 3

1.1.1.Khái ni ệm đa dạ ng sinh h ọ c 3

1.1.2 dạĐa ng di truy ề n 3

1.1.3 ự c trTh ạng đa dạ ng sinh h ọ c ở Vi ệ t Nam 3

1.1.4 phươngCác pháp phân loạ i h ọ c 4

1.2.Công c ụ phân tích đa dạ ng di truy ề n và ti ế n hóa 6

1.2.1 ổ ngT quan v ề ch ỉ th ị DNA 6

1.2.2 k ỹ thuCác ậ t ch ỉ ch ị DNA 7

1.2.3.Vùng đệm trong được sao mã ( Internal Transcribed Spacer - ITS ) 8

1.2.4.Các phương pháp xây dự ng cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i 10

1.3.T ổ ng quan v ề Dây thườ ng xuân ( Hedera nepalensis K. Koch) 13

1.3.1.Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch 13

1.3.2 điểĐặc m hình thái và phân b ố đị a lý 14

1.3.3 t r ị y h ọ c Giá 14

CHƯƠNG 2 VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 19

2.1.V ậ t li ệ u nghiên c ứ u 19

2.1.1 ậ t liV ệ u th ự c v ậ t 19

2.1.2.Hóa ch ấ t chính s ử d ụ ng trong nghiên c ứ u 20

2.1.3 ế t bThi ị 20

2.2.Phương pháp nghiên cứ u 21

2.2.1.Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 21

2.2.2.Nhân dòng đoạn gen đích bằ ng k ỹ thu ậ t PCR 22

2.2.3 ả i trìnhGi t ự 22

2.3.4 X ử lý s ố li ệ u và phân tích k ế t qu ả 23

CHƯƠNG 3 KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U 24

Trang 8

3.1.Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 24

3.2.K ế t qu ả nhân dòng đoạ n gen ITS b ằ ng ph ả n ứ ng PCR 25

3.2.1 ế t quK ả các ph ả n ứ ng t ối ưu 25

3.2.2 ế t quK ả nhân dòng gen ITS t ừ các m ẫ u th ự c v ậ t 28

3.3.Gi ả i trình t ự 28

3.4.Độ tương đồ ng c ủ a trình t ự gen ITS đượ c khu ếch đạ i 29

3.5.Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i d ự a trên vùng gen ITS 30

3.5.1 ự a chL ọ n mô hình 30

3.5.2.Kho ả ng cách di truy ề n 30

3.5.3.Xây d ự ng cây ch ủ ng lo ạ i 35

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬ N 37

4.1.Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 37

4.2.T ối ưu quy trình nhân dòng gen ITS b ằ ng ph ả n ứ ng PCR và gi ả i trình t ự 38

4.3.Kho ả ng cách di truy ề n 40

4.5.So sánh gi ữa các phương pháp xây dự ng cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i 41

4.5.1.Phương pháp UPGMA 41

4.5.2.Phương pháp Neighbor- Joining 42

4.5.3.Phương pháp Maximum LikeLihood 42

4.6.D ự đoán trong bả o t ồ n và ch ọ n t ạ o gi ố ng 43

4.7.So sánh v ớ i phân tích hình thái h ọ c 44

4.8.Phân tích đị a lý c ủ a các m ẫ u nghiên c ứ u 45

CHƯƠNG 5 KẾ T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị 47

Trang 9

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới cũng như ở nước ta xu hướng sử dụng dược liệu và các sảnphẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật ngày một tăng cao Theo số liệucủa Tổ chức Y tế thế giới (WHO), khoảng 80% dân số ở các nước đang phát triển

có nhu cầu chăm sóc sức khỏe ban đầu liên quan đến y học cổ truyền [23] Tronggần 20 năm trở lại đây, ước tính có khoảng 40 - 50% các thuốc được đưa ra thịtrường đều trực tiếp hoặc gián tiếp có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [25].Tại Mỹ, doanh số bán thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thực vật tăng 8,5%,đạt tổng doanh thu khoảng 8 tỷ USD trong năm 2017 [51] Cây dược liệu được coi

là kho tàng vô giá cung cấp các hợp chất sinh học phục vụ nghiên cứu phát triểnthuốc, là thành phần không thể thiếu của ngành dược liệu, góp phần phục vụ chămsóc sức khỏe cộng đồng, nâng cao đời sống và phát triển kinh tế - xã hội [23] Đây

là một trong những lý do ngày càng có nhiều loài cây thuốc được đầu tư nghiên cứu,

mở rộng quy mô sản xuất để phát triển thành các sản phẩm chất lượng đáp ứng chothị trường [23]

Họ Nhân Sâm (Araliaceae) là thực vật cung cấp nhiều cây thuốc quý, được

dân gian sử dụng lâu đời Tuy nhiên, các loài trong chi Hedera của họ này còn ít được biết đến ở Việt Nam Trong chi này, Thường xuân (Hedera helix) và Dây thường xuân (Hedera nepalensis) là hai loài được nghiên cứu nhiều nhất [19] Ởchâu Âu, Thường xuân đã được sử dụng từ rất lâu đời, một trong những sản phẩmnổi tiếng trên khắp thế giới là siro ho Prospan® của Công ty Engelhard ArzneimitelGmbH&Co.KG (Cộng hòa Liên bang Đức) Ở Việt Nam, Thường xuân không phảicây bản địa nhưng Dây thường xuân được ghi nhận phân bố ở nhiều vùng núi caomiền Bắc và hai loài này có hình thái dễ nhầm lẫn Một số nghiên cứu dược lý đãghi nhận Dây thường xuân có nhiều tác dụng như chống ung thư, chống oxy hóa, hạđường huyết, giảm đau, kháng viêm…[32, 39, 43, 57] Mặc dù có tiềm năng dược

lý như vậy, song nghiên cứu về Dây thường xuân ở Việt Nam còn hạn chế, đặc biệt

là nghiên cứu về đa dạng di truyền

Khai thác dược liệu quá mức, không có định hướng và kiểm soát chặt chẽ đã

và đang đe dọa trực tiếp đến nguồn tài nguyên cây thuốc ở nước ta Do đó, công tácbảo tồn đa dạng sinh học, các nguồn gen quý đang là mối quan tâm hàng đầu củacác nhà quản lý và Nhà nước Đánh giá được mức độ đa dạng di truyền nguồn gencây thuốc kết hợp với các phân tích thành phần hóa học của từng giống cây chophép chúng ta chọn lọc được giống cây sản xuất hiệu quả hợp chất quan tâm Qua

Trang 10

đó, thông tin về nguồn gen giúp chúng ta đưa ra được chiến lược bảo tồn và pháttriển cây thuốc tiềm năng một cách hiệu quả và bền vững Hiện nay, các chỉ thịDNA đã trở thành một trong những công cụ hỗ trợ đắc lực cho nghiên cứu phânloại, phân tích đa dạng sinh học Nó giúp xác định khoảng cách di truyền và đặctrưng cấp độ cá thể, quần thể phục vụ bảo tồn và chọn giống [14, 26, 38] Vùng đệm

trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer, viết tắt là ITS) là một chỉ thị phân loại tốt ở thực vật Song ITS có phải là một chỉ thị tốt để đánh giá mức độ đa dạng

di truyền nguồn gen Dây thường xuân ở Việt Nam hay không? Để đi tìm lời giảicho câu hỏi này chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn

gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị

ITS” với hai mục tiêu:

1 Xây dựng quy trình tối ưu nhân dòng vùng gen ITS của cây Dây thường

xuân

2 Định danh khoa học của các mẫu Dây thường xuân thu thập tại Việt Nam

thông qua xây dựng cây phát sinh loài dựa trên chỉ thị phân tử ITS.

Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu trên, tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu như sau:

1 Tách chiết DNA tổng số của 45 mẫu Dây thường xuân

2 Tối ưu quy trình nhân dòng gen ITS với cặp mồi đặc hiệu.

3 Nhân dòng gen ITS bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen.

4 Phân tích số liệu thu được và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trang 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Đa dạng và phân loại sinh học

1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học

Theo Công ước đa dạng sinh học năm 1992: Đa dạng sinh học là sự phongphú của mọi cơ thể sống có từ tất cả các nguồn trong các hệ sinh thái mà chúng tạonên; đa dạng sinh học gồm sự đa dạng trong loài (đa dạng di truyền), giữa các loài(đa dạng loài) và các hệ sinh thái (đa dạng các hệ sinh thái) Đa dạng sinh học cótầm quan trọng to lớn đối với thiên nhiên và con người Nó mang giá trị sinh thái vàmôi trường, bảo vệ tài nguyên đất và nước, điều hòa khí hậu, mang giá trị kinh tếlớn nếu biết khai thác và sử dụng đúng cách [9]

Đa dạng di truyền là sự đa dạng ở cấp độ phân tử, là nền tảng cho sự đa dạngcủa sinh giới [4] Đây là mức độ nhỏ nhất để cấu thành nên các tổ chức lớn hơn như

tế bào hoặc cơ quan Nghiên cứu đa dạng di truyền chính là nghiên cứu sự biến đổicủa sinh vật hay quần thể sinh vật ở cấp độ di truyền (gen, DNA) Ngày nay, nghiêncứu đa dạng sinh học nói chung, đa dạng di truyền nói riêng đang ngày càng đượcphát triển, góp phần giúp định danh chính xác hệ thống sinh vật khổng lồ Ngoài ra,đây còn là cơ sở cho bảo tồn phát triển nguồn gen, lai chọn tạo giống mới, nghiêncứu tiến hóa…

1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam

Việt Nam là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, trải dài gần 3260 kmtheo chiều dọc, địa hình ¾ là đồi núi, nên có nguồn tài nguyên sinh vật vô cùngphong phú Theo các tài liệu thống kê, Việt Nam là một trong 25 nước có mức độ

đa dạng sinh học cao trên thế giới, trong đó xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học(chiếm 6,5% số loài có trên thế giới) Chỉ kể đến thực vật, Việt Nam có khoảng

20000 loài trên cạn và dưới nước; gần 4000 loài thực vật có giá trị làm thuốc và cónhiều loài thuộc dược liệu quý hiếm

Trang 12

Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, suy thoái đa dạng sinh học đang ngàymột nặng nề Đó là một vấn đề gây nhức nhối toàn cầu Các chuyên gia cho rằng tốc

độ tuyệt chủng hiện tại của các loài thực vật đang cao hơn 100 đến 1000 lần so vớimức tự nhiên Cứ sau 2 năm, chúng ta lại mất ít nhất một loại dược liệu [23] Trongkhi đó, còn tới 90% số loài chưa được thống kê, nghiên cứu thì nhiều loài trong số

đó đã bị tuyệt chủng Nhiều nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp khác nhau dẫn đến

sự suy thoái đó như khai thác, sử dụng không bền vững; cháy rừng, chuyển đổiphương thức sử dụng đất, ô nhiễm môi trường, chiến tranh, yếu kém trong công tácquản lý [4 9] Hàng ngày, hàng giờ đều đang có sự gia tăng nguy cơ tuyệt chủngcủa một số loài nào đó Do đó, các nghiên cứu phục vụ bảo tồn và phân tích đa dạngsinh học là vô cùng cần thiết, quan trọng, có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Hiện nay, nước ta có nguồn dược liệu lớn, dự báo một nguồn gen phong phúnhưng việc tạo ra giá trị kinh tế từ nguồn dược liệu này còn rất hạn chế Các sảnphẩm từ dược liệu chưa được chuẩn hóa, dẫn đến khó tạo ra các sản phẩm ổn định,

có giá trị cao Đặc biệt, phát triển thuốc từ dược liệu gặp nhiều hạn chế do mối nghingại lớn về tác dụng, sự ổn định về chất lượng, khó phân biệt về hình thái Vì vậy,nghiên cứu đa dạng di truyền càng trở lên có ý nghĩa, giúp xác định chính xác danhpháp khoa học của các loài, từ đó kết hợp với các nghiên cứu dược lý để có biệnpháp bảo vệ và phát triển các nguồn gen tạo được các sản phẩm chất lượng tốt

1.1.4 Các phương pháp phân loại học

Phân loại học có vai trò và ý nghĩa đối với nhiều ngành, nhiều lĩnh vực [13]

Có nhiều cách phân chia về các phương pháp phân loại học, phần dưới đây sẽ trìnhbày một số phương pháp phân loại chính được sử dụng hiện nay

1.1.4.1 Phương pháp phân loại học truyền thống

Trong phân loại học truyền thống có bao hàm phân loại học dựa trên chỉ thịcảm quan (hình thái, màu sắc, mùi vị…) và chỉ thị hóa học (sắc ký lớp mỏng - ThinLayer Chromatography - TLC; sắc ký lỏng cao áp - High-Performance LiquidChromatography - HPLC )

Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (phương pháp hình thái học)

là một phương pháp giữ vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu phân loại học Nóđược sử dụng rất rộng rãi và phổ biến Phương pháp cho phép so sánh các đặc điểmhình thái của các cơ quan trong cơ thể sinh vật, trước hết là cơ quan sinh dưỡng vàsinh sản Nhờ việc làm nổi bật các đặc điểm giống, khác nhau và nhờ tính ổn định

Trang 13

của chúng mà ta có thể sắp xếp các sinh vật vào các nấc thang phân loại khác nhau,xác định được mối quan hệ thân cận Hạn chế lớn nhất của phương pháp là phânbiệt các loài đồng hình Đôi khi do lợi ích kinh tế hoặc lỗi trong khâu thu hái màngười ta có thể nhầm lẫn các sinh vật với nhau một cách vô tình hoặc cố ý; gây hậuquả nghiêm trọng nhất là với các cây có chất độc [3, 6, 8] Tuy vậy, chúng ta khôngthể phủ nhận và thay thế được vai trò to lớn của các cách phân loại truyền thống đốivới phân loại học nói chung.

1.1.4.2 Phương pháp phân loại học hiện đại

Phân loại học phân tử

Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và tin sinh học, các kỹ thuật chỉthị sinh học phân tử ra đời từ thập kỷ 80 của thế kỷ trước đem lại những thành tựu

kỳ diệu và bước tiến quan trọng trong phân loại học [13, 14, 26] Phân loại học phân

tử xác định các loài dựa trên các đặc điểm khác biệt về trình tự DNA, protein hoặcisozyme Phần lớn chỉ thị phân tử được sử dụng hiện này là các chỉ thị DNA, cácchỉ thị này nằm gần hay liên kết với gen và không có hoặc ít ảnh hưởng đến kiểuhình Bằng phương pháp này, sự khác biệt giữa các cơ thể hoặc các loài khác nhautrở nên nhanh và chính xác Phương pháp đặc biệt có ích trong trường hợp giảiquyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến dị, khắc phục một phầnnhược điểm của phương pháp phân loại truyền thống [13]

Phân loại học hiện trạng số (numerical taxonomy) sử dụng các dấu hiệu

giống nhau của sinh vật (từ 60 trở lên) mà không xét nguồn gốc của các dấu hiệu.Phương pháp căn cứ vào mức độ giống nhau của các đối tượng để xác định quan hệphân loại bằng cách dùng các thuật toán Ưu điểm của phương pháp này là loại bỏđược tính chủ quan và đảm bảo tính tự nhiên của hệ thống phân loại Tuy nhiênnhược điểm lớn là đã loại trừ yếu tố tiến hóa và không thể thay thế phương phápphân loại truyền thống [13]

Phân loại học Phylocod xác định các đặc điểm tổ tiên, các đặc điểm phân ly

từ tổ tiên và hình thành các bậc tiến hóa đơn dòng xác định như các loài Khác vớiphân loại truyền thống phân chia thành nhiều thứ bậc (loài, giống, họ, bộ ),Phylocod chỉ là hệ thống danh pháp Theo phương pháp này, số lượng loài sẽ tănglên hay vấn đề mẫu chuẩn của loài sẽ là những điểm hạn chế Vì vậy, hệ thống danhpháp này chỉ mang tính tham khảo [13]

Trang 14

Cận phân loại học (Parataxonomy) sử dụng để so sánh tổng quát về mức độ

phong phú của sinh vật nói chung của một khu vực Phương pháp phân loại này chủ

trương phân thành các đơn vị phân loại mà không thành các loài theo những nguyêntắc chung Nó có thể phù hợp cả những người không chuyên về phân loại học bằngcách phân loại bằng mắt thường Vì vậy, nhiều nhà khoa học cho rằng đây sẽ chỉ làmột kỹ thuật trợ giúp trong phân loại học [13]

1.2 Công cụ phân tích đa dạng di truyền và tiến hóa

1.2.1 Tổng quan về chỉ thị DNA

Nhiệm vụ chính cho bất kỳ chuyên gia về hệ thống thực vật, sinh thái học,sinh học tiến hóa và bảo tồn hoặc chuyên gia pháp y ứng dụng là định danh chínhxác mẫu động thực vật một cách nhanh chóng, có thể lặp lại và độ đáng tin cậy cao.Chỉ thị DNA sử dụng các đoạn trình tự gen hoặc DNA đặc hiệu là một công cụ hữuích để xác định, nhận dạng loài Số lượng nghiên cứu sử dụng mã vạch được sửdụng ngày càng nhiều Bằng cách kết hợp các thế mạnh của di truyền phân tử, côngnghệ giải trình tự và tin sinh học, chỉ thị DNA cung cấp một phương tiện nhanhchóng và chính xác để nhận biết các loài đã biết, mô tả và đặt tên trước đó và lấythông tin về chúng Cho đến ngày nay, công cụ này khám phá hàng ngàn loài độngthực vật chưa được đặt tên, đặc biệt là trong quần xã sinh vật nhiệt đới Là một công

cụ khám phá đa dạng sinh học mang tính cách mạng [26], chỉ thị DNA đã giúp tìmkiếm các loài có tiềm năng mới đối với khoa học, phân tích dữ liệu di truyền củachúng, đặc biệt là với các loài có nguy cơ tuyệt chủng

Dựa trên chỉ thị DNA, nhiều mã vạch DNA được phát triển Mã vạch DNA

là các trình tự đặc hiệu cho phép xác định một đơn vị phân loại nào đó như loài Đốivới những người sử dụng phân loại học ứng dụng, mã vạch DNA đóng vai trò làphương tiện để xác định các loài quy định, các loài xâm lấn và các loài có nguy cơtuyệt chủng Ngoài ra nó còn để kiểm tra danh tính và độ tinh khiết của các sảnphẩm thực vật, như thuốc thảo dược thương mại và thực phẩm chức năng Mã vạchDNA hiện đang được sử dụng để giải quyết các vấn đề sinh thái, tiến hóa và bảotồn Quá trình tạo và áp dụng mã vạch DNA thực vật cho mục đích nhận dạng đòihỏi hai bước cơ bản: 1) xây dựng thư viện mã vạch DNA của các loài đã biết và 2)khớp với chuỗi mã vạch DNA của một mẫu chưa biết so với thư viện mã vạchDNA Bước đầu tiên yêu cầu các nhà phân loại chọn một đến vài cá thể cho mỗiloài để làm mẫu tham chiếu trong thư viện mã vạch DNA Mô, tế bào có thể đượcthu trực tiếp từ các mẫu vật tươi hoặc các mẫu khô, không bị nhiễm nấm mốc Khi

Trang 15

thư viện mã vạch DNA hoàn tất, mẫu chưa biết sẽ được tách chiết DNA tổng số và

mã vạch DNA được tạo ra của mẫu vật sẽ được so sánh với mã vạch DNA đã biếtbằng cách sử dụng một số loại thuật toán phù hợp [38]

Chỉ thị DNA là công cụ hữu ích giúp phân loại các loài [13, 26, 38] Đoạngen được sử dụng có thể tìm thấy ở tất cả các sinh vật (hoặc ít nhất là trong cácthành viên của một nhóm loài), các trình tự nucleotide sẽ giống nhau hoặc rất giốngnhau ở các cá thể trong cùng một loài Vì vậy khu vực này có thể được sử dụng chonhận dạng các loài bằng cách so sánh trình tự của chỉ thị DNA trong sinh vật thửnghiệm với trình tự tham khảo từ các cơ sở dữ liệu Các vùng gen được dùng làmchỉ thị DNA ở thực vật bao gồm các trình tự DNA trong lạp thể và DNA trongnhân Hiện nay, các chỉ thị dựa trên trình tự DNA là một phương pháp xác định cácloài một cách hiệu quả Tuy nhiên, mỗi phương pháp phân loại đều có những mặthạn chế Chỉ thị DNA phân biệt các loài với nhau, nhưng không có đủ dữ liệu để mô

tả các loài mới nên có thể gây xáo trộn, làm thay đổi hệ thống phân loại truyềnthống đã ổn định với hệ thống danh pháp từ hàng trăm năm nay [13]

1.2.2 Các kỹ thuật chỉ chị DNA

Các kỹ thuật chỉ thị DNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ ditruyền, phát sinh chủng loại và phân loại phân tử; trong lập bản đồ liên kết ditruyền, nhận biết gen; trong chọn giống bao gồm đánh giá đa dạng di truyền, nhậnbiết giống, chọn lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi củamôi trường, năng suất và phẩm chất giống Mỗi kỹ thuật khác nhau sẽ được ứngdụng vào từng đối tượng mà nhà nghiên cứu hướng đến, hoặc kết hợp nhiều các

phương pháp khác nhau để phân tích Các kỹ thuật không sử dụng PCR như đa hình

độ dài đoạn cắt hạn chế (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP), lấydấu cắt hạn chế (Restriction Endonuclease Fingerprinting - REF) Các kỹ thuật sửdụng PCR như DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên (Randomly AmplifiedPolymorphic - DNA/ RAPD); PCR với mồi ngẫu nhiên (Arbitrarily primed PCR -AP-PCR); đa hình độ dài chuỗi nhân bản (Amplified Sequence LengthPolymorphism - ASLP); nhân bản chọn lọc các locus đa hình (SelectiveAmplification of Polymorphic Loci - SAMPL) Kỹ thuật chỉ thị dựa trên các tiểu vệtinh gồm có chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter-Simple Sequence Repeats - ISSR);chuỗi lặp lại ngược được đánh dấu (Inverse Sequence-Tagged Repeats - ISTR) Các

kỹ thuật PCR các chuỗi đặc trưng như vị trí chuỗi đánh dấu (Sequence-Tagged-Site

- STS); đa hình độ dài chuỗi đơn giản (Single Sequence Length Polymorphism

Trang 16

-SSLP); các chuỗi lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats - SSR) Các kỹ thuậtchỉ thị gen nhảy như đa hình gen nhảy ngược giữa được nhân bản (Inter-Retrotrasposon Amplified Polymorphis - IRAP); đa hình sự gắn dựa trên gen nhảyngược (Retrotrasposon-Based Insertion Polymorphism - RBIP) Các kỹ thuật chỉ thịnhân khác có thể kể đến vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer

- ITS); đa hình đơn nucleotide (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) Các kỹthuật chỉ thị lục lạp như chuỗi lặp lại đơn giản lục lạp (Chloroplast SimpleSequence Repeats - cpSSR); phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn DNA lục lạp(Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis cpDNA - RFLPA cpDNA).Công nghệ hỗ trợ hiện đại như công nghệ sắp xếp đa dạng (Diversity arrayTechnology - DarT); giải trình tự thế hệ thứ hai (Next-geneation sequencing - NGS)

1.2.3 Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS)

Vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed Spacer - ITS) nằm giữa

gen RNA ribosome tiểu đơn vị nhỏ và gen RNA ribosome tiểu đơn vị lớn là một

dấu hiệu phát sinh gen được sử dụng rộng rãi cho phân loại nhiều loài ITS ở thực vật nhân thực chứa rRNA 5,8S được bảo tồn và các khu vực có thể biến đổi là ITS1

và ITS2 Các vùng này có chiều dài có thể thay đổi và khuếch đại bằng cách sử

dụng các đoạn mồi bổ sung cho các vùng được bảo tồn của các gen sườn của chúng

Có nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng việc loại bỏ các khu vực được bảo tồn dẫnđến phân loại chính xác hơn [47]

Các vùng tổ chức nhân (nucleolar organizing regions – NORs) nằm trongnhiễm sắc thể chứa các DNA ribosome (rDNA) là các phần của các đơn vị lặp lại

(Hình 1.1a) được sắp xếp theo thứ tự nhất định với số lượng bản sao lên đến 30000

trong một tế bào [14, 20, 45] Do đó, vùng rDNA như một công cụ cho các nghiêncứu phát sinh gen do thành phần cấu trúc của nó khác nhau về mức độ bảo tồn [31]

Xen kẽ giữa các rDNA là các vùng intron không được sao mã với chức năngchưa được biết rõ Mỗi Exon (rDNA) chứa các tiểu phần ribosome nhỏ (16S-18S),

vùng ITS và tiểu phần lớn (26S-28S) Theo đó, Hình 1.1b thể hiện được vùng ITS

bao gồm ba phần là ITS1, 5,8S và ITS2 nằm xen kẽ giữa các tiểu phần ribosome Vùng này được gọi chung là vùng đệm trong được sao mã (Internal Transcribed

Spacer –ITS).

Trang 17

Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc tổng quát của vùng rDNA trong thực vật (a) Vị trí nhiễm

sắc thể của các vùng rDNA (b) Cấu tạo của vùng Intron, Exon liền kề [45]

Hai vùng đệm ITS1 và ITS2 có độ dài không vượt quá 300 bp [20], tổng độ

dài vùng ITS dao động từ 600 – 700 bp [14] Có một điểm lý thú cho vùng gen này

là mức độ tiến hóa của nó nhanh nên dễ dàng thay đổi về trình tự cũng như độ dài.Bên cạnh đó, các vùng liền kề thì có trình tự rất bảo thủ, thuận tiện cho việc thiết kế

mồi cho phản ứng PCR nhân dòng vùng gen ITS Ngoài ra, do đoạn trình tự gen

không dài, nên việc khuếch đại là không khó khăn

Phân tích vùng gen ITS là một kỹ thuật chỉ thị phân tử quan trọng cho nghiên

cứu đa dạng di truyền giúp phân loại phân tử các nhóm taxon có liên kết gần gũi

[44] Bởi vì ITS có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác

nhau [22] Có nhiều nghiên cứu đã tiến hành phân tích riêng biệt từng vùng trình tự

ITS1 và ITS2, song kết quả cho thấy chưa đủ bằng chứng để phân tích tiến hóa Do

đó sự kết hợp dữ liệu vùng ITS cho kết quả khả quan hơn Hầu hết các nghiên cứu được báo cáo, sự khác biệt giữa các chuỗi ITS chủ yếu là do đột biến điểm Một tỷ

lệ tương đối nhỏ của những vị trí bị chèn (insert) hoặc xóa (indels) nucleotide trongcác trình tự tương tự nhau để giữ lại tín hiệu đủ cho phân tích phát sinh gen [20]

Nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng vùng gen ITS có thể được tiến hành bằng

cách: Sử dụng những cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại số lượng bản sao vùng genmong muốn; tiến hành giải trình tự trực tiếp; xây dựng cây phát sinh phân loài sửdụng các trình tự nghiên cứu và các trình tự tham chiếu có sẵn trên Genbank

Với đặc tính như trên, hiện nay, ITS đã và đang được ứng dụng rất rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực như phân tích di truyền và phân loại, nghiên cứu phát sinh

Trang 18

loài…Điển hình có thể kể tên các nghiên cứu ứng dụng của các chi, họ khác nhau

như Sorghum (Poaceae) [53], Glycine [37], họ Rosoideae [27], chi Bambusa [29],thậm chí cả nấm…[50] hoặc các nghiên cứu về sự khác biệt di truyền trong họAraliaceae [42, 55, 58], Dendropanax [41], sự khác biệt di truyền qua không gian

và thời gian của Dây thường xuân (Hedera sp.) [30],… Ngoài ra, hiện nay để dữliệu phân tích thêm đồ sộ và có độ tin cậy lớn hơn, người ta thường kết hợp phântích da dạng di truyền của nhiều gen chỉ thị khác nhau Trong đó, một sự kết hợp

phổ biến là sử dụng cả vùng gen nhân ITS và cả cùng gen lục lạp (matK, atpB,

ndhF, rbcL, tnrH - tnrK,…) để phân tích.

1.2.4 Các phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Theo Darwin, tất cả các loài sinh vật đều tiến hóa từ một tổ tiên chung Mốiquan hệ giữa các loài sinh vật được biểu diễn bởi một cây phân loài Dữ liệu đầuvào cây tiến hóa hay cây phân loài có thể là một hay nhiều yếu tố chứa thông tinkhác nhau liên quan đến chúng, như là thông tin về cấu trúc hoặc là thông tin vềhình dáng bên ngoài [16] Về mặt nguyên tắc, các sinh vật có cấu trúc bên ngoài vàhình dáng càng giống nhau thì chúng càng có quan hệ gần gũi

Ngày nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, sinh học phân tử cũngnhư tin sinh học, chúng ta hoàn toàn có thể giải mã bất kỳ một hay nhiều đoạn gennào chúng ta mong muốn, thậm chí là toàn bộ hệ gen của sinh vật Đó là dữ liệuquan trọng và là bước tiến vượt bậc hữu ích cho ngành phân loại học Những gìchúng ta cần là những đoạn DNA hay axit amin của mẫu nghiên cứu để so sánhgiữa chúng với nhau và với dữ liệu sẵn có Từ đó, chúng ta có cơ sở để xây dựngcây phát sinh loài Đây là một công cụ suy luận giúp các nhà phân loại học tái lậplại sự tiến hóa và phân loài trong tự nhiên

Một cây phân loài thường có cấu trúc nhị phân thể hiện mối quan hệ tiến hóagiữa các loài sinh vật: (1) mỗi đỉnh (nút lá) của cây biểu hiện cho một loài sinh vậthiện tại; (2) mỗi nút bên trong biểu diễn cho một loài sinh vật tổ tiên; (3) mỗi cạnhcủa cây sẽ nối hai nút của cây và biểu diễn mối quan hệ trực tiếp giữa hai loài sinhvật ở hai nút của cây; (4) độ dài của cạnh cho biết khoảng cách tiến hóa giữa chúng

Có 2 dạng cây thường gặp là cây không gốc (không có thông tin về các loài tổ tiên,cạnh của cây không thể hiện mối quan hệ cha - con giữa các đỉnh của cây) và cây cógốc (các cạnh trên cây thể hiện mối quan hệ cha con giữa các đỉnh của cây) [16]

Trang 19

Hình 1.2 Dạng cây phát sinh loài biết rõ nguồn gốc

Cụ thể, có nhiều phương pháp khác nhau sử dụng những thuật toán khácnhau để giúp chúng ta tái hiện mối quan hệ phát sinh có thể có được thể hiện thôngqua cây phát sinh chủng loại từ dữ liệu một nhóm các trình tự đã biết Một sốphương pháp hay được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loại sẽ được trìnhbày ở phần dưới đây

1.2.3.1 Phương pháp Ma trận khoảng cách (Distance Matrix)

Đây được cho là một nhóm các thuật toán đơn giản nhất đã được sử dụng từlâu trong các nghiên cứu phát sinh loài Được bắt đầu sử dụng từ những năm 1990các thuật toán này sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấuhiệu hình thái Trong đó thuật toán lập nhóm không có trọng số dùng trung bình sốhọc (UPGMA - Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages)

[52] phân tích tất cả các dấu hiệu qua đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cảcác cặp trình tự, biểu diễn thành dạng ma trận khoảng cách (dạng đối xứng) rồi gộptừng cặp mẫu có khoảng cách di truyền giữa chúng là nhỏ nhất [10] Ma trậnkhoảng cách D = (dij) biểu diễn khoảng cách giữa n loài là ma trận trong đó mỗiphần tử dij là khoảng cách giữa 2 nút của cây trong quan hệ phát sinh [16] Khoảngcách giữa các đỉnh (nút lá) và các nút bên trong cây được chỉ rõ Khoảng cách dijthỏa mãn 3 điều kiện: Tính đối xứng (dij = dji với mọi i, j); tính phân biệt (dij ≠ 0chỉ khi i ≠ j); bất đẳng thức tam giác: dij < dik + dkj với mọi i, j Nhìn chung cácthuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phân tích nhanh, phù hợp để

xử lý một lượng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyền tương đối giữa các loàinhưng không phản ánh được sự tiến hóa của mỗi gen [10]

Ngoài ra, một phương pháp khác là Gom cụm lân cận (NJ – Neighborjoining cũng rất được hay dùng trong xây dựng cây phát sinh chủng loại với lượng

dữ liệu đồ sộ) [48] Theo thuật toán này, tỷ lệ tiến hóa được tính toán tự do và khácnhau giữa các dòng khác nhau Phương pháp này gần như tương tự với UPGMA,

Trang 20

tuy nhiên xuất hiện “cụm lân cận” tức là, hai trình tự được gọi là lân cận (gần nhau)trong một cây, nếu như giữa chúng chỉ có duy nhất một nút.

1.2.3.2 Phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parisimony)

Dựa trên nguyên tắc sinh học là “đột biến hiếm khi xảy ra” Thuật toán nàycho rằng: Cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất trên tất cả các câytiến hóa có thể giữa các taxon được phân tích Do vậy, cây tiến hóa thu được từphương pháp này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu [10] Chỉ số tin cậy chotừng nhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ được coi là có độ tincậy khi giá trị này đạt trên 70% [33] Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tínhtoán nhanh và được cho là khách quan nhất Phương pháp không đưa ra bất kì mộtgiả định nào về quá trình tiến hóa, mà dựa trên nguyên lý giản tiện tối đa: Cây tốtnhất được chọn ra dựa vào việc giảm thiểu hóa số lượng các vị trí thay thế cần thiết

để giải thích cho các vị trí mang thông tin

1.2.3.4 Phương pháp Xác suất tối đa (Maximum Likelihood)

Đây là một phương pháp xác suất [10, 60] thuần túy thường được dùng đểkiểm chứng lại các cây tiến hóa đã xây dựng bởi các phương pháp khác Phươngpháp này đánh giá một giả thiết tiến hóa bằng xây dựng tất cả các cây tiến hóa cókhả năng xảy ra Tiếp theo, xác định cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy racao nhất qua việc phân tích các yếu tố tiến hóa Chẳng hạn, về đại thể tần số độtbiến đồng hoán cao hơn khoảng 3 lần so với các đột biến dị hoán [10] Đây đượccoi là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn cả so với cácphương pháp khác Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thông tin theo phương pháp nàychậm và không khả thi khi phân tích một lượng dữ liệu lớn Phương pháp này cũngcho ra cây tiến hóa có độ tin cậy khi giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt trên 70% ởmỗi nhánh [33]

Thông thường trong các nghiên cứu được tiến hành dựa trên nhiều phươngpháp khác nhau, kết quả nghiên cứu tốt là khi các cây tiến hóa được xây dựng từnhiều phương pháp nhưng cho cấu trúc tương đồng Trong nghiên cứu này chúngtôi sử dụng ba phương pháp là: Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony), hợp lý tối

đa (Maximum Likelihood) và phương pháp ma trận khoảng cách với thuật toánUPGMA bằng phần mềm MEGA X

Trang 21

1.3 Tổng quan về Dây thường xuân (Hedera nepalensis K Koch)

1.3.1 Phân loại học loài Hedera nepalensis K Koch

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

và châu Á Trong họ Nhân sâm (Araliaceae), chi Hedera (L.) là chi đại diện duy

nhất có đặc điểm hình thái dạng dây leo Chúng là những cây leo thường xanh cónhiều rễ móc khí sinh, nhẵn và không có gai Lá mọc so le, lá đơn không có lá kèm,phiến lá phân thùy, dài từ 5 – 10 cm, rộng từ 3 - 8 cm, gân chân vịt Cụm hoa chùy,gồm nhiều tán, có lông sao Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng; lá bắc rất nhỏ,dài có 5 răng nhỏ; tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa; nhị 5; bầu 5 Quảhạch tròn, khi chín có màu đen [1, 3, 5] H nepalnensis là loài có dây bò dài có thể

lên tới 20 m, có nhiều rễ mọc khí sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa có lông đỏ nâu,mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000 – 3000 m [1 2]

Hình 1.3 Cây Dây thường xuân H nepalensis [61].

Trang 22

1.3.2 Đặc điểm hình thái và phân bố địa lý

Theo các nghiên cứu về phát sinh chủng loài cho thấy Châu Á chính là trung

tâm xuất xứ của chi Hedera, sau đó các loài thuộc chi phát tán đến Châu Âu và vùng Địa Trung Hải Ngày nay, các loài thuộc chi Hedera phân bố chủ yếu ở các

vùng ôn đới và cận nhiệt đới như Châu Âu và một số vùng Châu Á với nền nhiệttrung bình tương đối mát từ 26 – 30oC và cần độ ẩm cao [7] Hai loài đến nay được

sử dụng rộng rãi và nghiên cứu nhiều hơn cả về dược học là Thường xuân (H helix)

và Dây thường xuân (H nepalensis) đều có phạm vi phân bố tương đối hẹp trên thế

giới Theo thống kê của Viện Dược liệu ở Việt Nam có trữ lượng lớn Dây thườngxuân phân bố chủ yếu ở các tỉnh miền phía Bắc nước ta như Sơn La, Lào Cai, Hòa

Bình, Lai Châu, Hà Giang… (Hình 1.3)

Hình 1.4 Phân bố địa lý của H nepalensis tại miền Bắc nước ta

chiết H nepalensis Thí nghiệm sử dụng 05 mẫu thử là chiết xuất thô (HNC), phân

đoạn n-hexane (HNN), phân đoạn ethyl acetate (HNE), phần dịch chiết còn lại(HNA) và Lupeol Các phân đoạn này lần lượt được tiến hành các xét nghiệm

Trang 23

Nitrate, xét nghiệm NFκB, xét nghiệm aromatase và xét nghiệm quinone reductase

1 (QR1) Tiềm năng gây độc tế bào được đánh giá trên 3 dòng tế bào ung thư làMCF-7, MDA-MB-231, Hela với xét nghiệm sulforhodamine B (SKB) Kết quả

phân tích chỉ ra rằng cả chiết xuất thô và các phần phân đoạn trong H nepalensis

đều có khả năng ức chế sự tăng trưởng (hơn 60%) của ba dòng tế bào ung thư Cụthể là chất lupeol được phân lập từ n-hexane, ethyl acetate có giá trị IC50 thay đổi đadạng 2,32 – 10,2 μM; ức chế 84,78% sản xuất oxid nitric (50 μM) với giá trị IC50

2,1 ± 1,3 μM Đồng thời, lượng lupeol được đánh giá trên HPLC đầu dò DAD trong

các mô khác nhau (rễ, thân, lá) đã chứng minh được lá H.nepalensis là một nguồn

lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) Báo cáo này là báo cáo đầu

tiên đưa ra tiềm năng của H nepalensis chứa các tác nhân hóa trị ung thư và gây

độc tế bào [35]

Các phân tích dược lý của T Li và cộng sự (2015) thực hiện chứng minh

saponin từ H nepalensis K Koch có tác dụng chống ung thư thông qua việc gây

ra sự chết theo chu trình của các tế bào ung thư trong ống nghiệm Họ đã tìm thấy

rằng một chiết xuất ethanol 95% từ H nepalensis K Koch có thể ức chế sự phát

triển của dòng t ế bào ung thư phổi không phải tế bào nhỏ ở người A549(28,39 ± 4,36 μg/ml) Hai hợp chất chống ung thư là pulsatilla saponin A và

hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside (phân lập từ chiết xuất ethanol 95% của H nepalensis K Koch) dựa trên khả năng ức chế s ự phát triển của t ế bào A549

trong ống nghiệm Các hoạt động ức chế tăng trưởng của pulsatilla saponin A thôngqua việc gây ra sự chết theo chu trình cho tế bào A549 đã được báo cáo trước đâybởi những người khác Tuy nhiên, các hoạt động ức chế tăng trưởng tế bào A549

của hederagenin 3- O -α-L-arabinopyranoside, cũng như hành động gây ra apoptosis

của nó chưa từng được báo cáo trước đây Những kết quả này có thể giúp phát triển

hướng trị liệu mới trong tương lai chống ung thư phổi không phải tế bào nhỏ từ H.

nepalensis K Koch [43]

Một nghiên cứu mới đây nhất của Qamar và cộng sự (2019), các tác giả đã

nỗ lực thực hiện các thí nghiệm để sàng lọc một số cây thuốc ít được khám phátrước đó Tổng cộng 10 cây thuốc thuộc các họ, chi khác nhau được sử dụng, trong

đó có H nepalensis Thí nghiệm chứng minh các cây thuốc lựa chọn có hoạt tính

chống ung thư mạnh với giá trị gây độc tế bào tối thiểu (IC50 > 3 μM) và độc tínhthấp hoặc không đáng kể Theo đó, những cây thuốc được đánh giá về gây độc tếbào phụ thuộc vào liều thông qua xét nghiệm MTT trong ống nghiệm và mô hình

Trang 24

khối u trên động vật (IC50 trong khoảng 0,009 - 0,528 mg/mL) Các phát hiện chỉ rarằng những cây này có khả năng ức chế sự phát triển của khối u bằng cách nhắmvào các mục tiêu phân tử như chống tăng sinh, prooptotic, chống di căn và chốngangiogen Chúng được sử dụng rộng rãi vì tính có sẵn, giá cả phải chăng và tácdụng phụ tối thiểu [46].

Tác dụng chống oxi hóa

Nghiên cứu được thiết kế để xác định các hợp chất polyphenolic (có tác dụng

chống oxy hóa) trong các phân đoạn H nepalensis được thực hiện bởi Laila Jafri và cộng sự (2014) Các mẫu nghiên cứu bao gồm: chiết xuất thô của H nepalensis và các phần phân đoạn của nó thu trong các dung môi n -hexane, ethyl acetate và nước

loại bỏ nhóm hydro peroxide (H2O2) Tất cả các phân đoạn dịch chiết cho thấy tiềm

năng loại bỏ hydro peroxide đáng kể ( P < 0,05) với giá trị IC50 từ 31,19 đến

200 g/mL Trong đó, phần ethyl acetate cho thấy hoạt tính chống oxy hóa cao nhất

bằng phương pháp phosphomolybdenum, sau đó là n -hexane, chiết xuất thô và phần nước Nghiên cứu là bằng chứng cho thấy phần ethyl acetate của H.

nepalensis có tiềm năng chống oxy hóa với hàm lượng phenolic và flavonoid cao

[36]

Một nghiên cứu khác xác định tiềm năng chống oxy hóa của dịch chiết

methanol của H nepalensis thử trong môi trường nước và lipid Trong môi trường

nước, nghiên cứu sử dụng các xét nghiệm dọn gốc tự do DPPH picrylhydrazyl) và ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Trongkhi đó, ở môi trường lipid đánh giá khả năng chống oxy hóa bằng đánh giá chỉ số ôihóa (TBARS – Thiobarbituric Acid Reactive Substances) Cơ chế dọn gốc tự dotrong dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xác định là làm giảm màu của dungdịch; sau đó đo độ hấp thụ quang ở bước sóng thích hợp Kết quả của nghiên cứuđưa ra hàm lượng các gốc DPPH, ABTS, TBARS lần lượt là 26,7 ± 0,2 (mM TE/g);54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); 393 ± 3,4 (mmol TE/g) Nghiên cứu xác định trong dịch

(1,1-diphenyl-2-chiết (1,1-diphenyl-2-chiết thô của H nepalensis chứa hai chất có khả năng chống oxy hóa là axit

chlorogen và rutin [43]

Tác dụng chống tiểu đường

Samreen Saleem và cộng sự (2014) đã nghiên cứu về các chất có khả năng

ức chế DPP-4 của 2 loài Fagonia cretica và H nepalensis có tác dụng trong điều trị tiểu đường Các mẫu thử bao gồm chiết xuất thô của H nepalensis, các phân đoạn

Trang 25

trong các dung môi hexane, ethyl acetate và nước Tất cả các phần này đều có tácdụng ức chế hoạt động của DPP-4 (DPP-4 được biết đến là làm bất hoạt haihormone incretin được gọi là peptide giống glucagon 1 (GLP-1) và polypeptide phụ

thuộc glucose (GIP)) Triterpenoid lupeol được tìm thấy từ H nepalensis với IC50 là31,6 μM Các hợp chất flavonoid được báo cáo là chất ức chế hiệu quả của DPP-4

và cải thiện được tình trạng đường huyết trong mô hình động vật Tác dụng nàyđược giải thích là do đặc tính chống oxy hóa của ﬂavonoid nên chúng có khả năngchống tiểu đường và ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy ức chế DPP-4 có thể

là một cơ chế hoạt động hợp lý [17, 49]

Waleed Javed Hashmi và cộng sự (2018) sử dụng chiết xuất thô của H.

nepalensis (HNC) trên chuột Kết quả cho thấy làm giảm đáng kể mức đường

huyết (phụ thuộc thời gian) và các dấu hiệu chức năng gan được phục hồi về mức

bình thường tăng cao đáng kể (P < 0,05) HNC làm gia tăng mức độ men catalase

(CAT), superoxide effutase (SOD) và giảm glutathione (GSH) Ngoài ra, định

lượng HPLC cho thấy điều trị HNC dẫn đến sự gia tăng đáng kể (p < 0,001) về

mức độ dẫn truyền thần kinh (dopamine và serotonin) so với nhóm kiểm soát

Alzheimer (AC) Nhìn chung, kết quả nghiên cứu cho thấy H nepalensis có tiềm

năng điều trị trong điều trị các bệnh như Alzheimer và tiểu đường [57 ]

Tác dụng giảm đau

Phản ứng đau cơ bản và thử nghiệm hiệu quả của thuốc giảm đau bằng cáchquan sát phản ứng với cơn đau do nhiệt được thực hiện thông qua thử nghiệm Hot

Plate H nepalensis cho thấy khả năng giảm đau vừa phải là 59,1% so với morphine

là 80% [34] Các polyphenol có mặt trong cây được cho là có vai trò chính tronghoạt động giảm đau Cơ chế của phản ứng này được đặc trưng bởi sự giải phóng cácchất trung gian giảm đau nội sinh như là cyclooxygenase hay arachidonic

Tác dụng kháng viêm

Trong các thử nghiệm chống viêm, chiết xuất thô của cây cho thấy sự ức chếphù nề đáng kể, phụ thuộc vào liều sử dụng Xét nghiệm carrageenan được sử dụng

để đánh giá khả năng chống viêm của cây thuốc H nepalensis được báo cáo là có

khả năng ức chế phù nề lên đến 63,3 %, P < 0,05 có ý nghĩa thống kê Cơ chế chínhcủa tác dụng chống viêm được cho là cây thuốc chứa hoạt tính có khả năng ức chếđược đáng kể các chất trung gian gây viêm như serotonin, histamine, bradykinin…Các tác giả tiếp tục làm xét nghiệm histamine để đánh giá xác nhận lại của thí

Trang 26

nghiệm carrageenan với nồng độ hiệu quả nhất là 200 mg/kg Sự ức chế phù tối đa

được phát hiện ở 90 phút H nepalensis cho kết quả ức chế trung bình ở mức 63,5 %

(P < 0,01), cho thấy khả năng kháng viêm đáng kể do histamine gây ra [34]

Ngoài ra, cũng trong các nghiên cứu đã chỉ ra một vài tác dụng khác của H

nepalensis cần được đánh giá nghiên cứu thêm như tác dụng chống trầm cảm,

chống đông máu [34], tác dụng hạ huyết áp …[49] mở ra tiềm năng nghiên cứu phát

triển thuốc từ H nepalensis là rất lớn.

1.3.3.1 Nghiên cứu dược lý trong nước

Ở Việt Nam, nhìn chung các nghiên cứu về Dây thường xuân còn rất ít vàhạn chế Đã có một vài nghiên cứu về nông – sinh học và nhân trồng như ViệnDược liệu đã ghi nhận Dây thường xuân hay có tên khác là Bách cước ngô công [7]phân bố ở Sơn La, Lào Cai, Hòa Bình, Lai Châu, Hà Giang và bước đầu được xác

định là Hedera nepalensis K.Koch.

Nghiên cứu để xác định đặc điểm sinh thái và khả năng nhân giống của

Hedera nepalensis K.Koch Theo đó, đây là loài có dây bò tới 20 m, có nhiều rễ

mọc khí sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa có lông đỏ nâu, mọc rải rác trong rừngthưa, ở độ cao 100 – 1600 m Về công dụng: Thân, lá, hạt uống với rượu ấm có thểgiải ngộ độc Hạt ngâm rượu chữa bệnh phong huyết, đau lưng Còn dùng trị viêmkhớp, viêm gan, đau đầu, nôn máu, mắt mờ, nhọt độc sưng đau Lá hơ nóng chườmchữa sưng hạch Quả hãm uống trị thấp khớp [1 5, 12]

Theo y học cổ truyền

Bộ phận dùng: tất cả các bộ phận của cây (rễ, thân, lá, quả) có thể dùng tươihoặc phơi khô Tính vị: Dây thường xuân có vị đắng, tính mát, tác dụng trong khuphong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng Quả có vị ngọt, tính ấm được dùng để trừphong huyết [7] Công dụng: Lấy lá dây thường xuân giã nhỏ chế với rượu sau đógạn lấy dịch uống, phần bã còn lại đem đắp vào chỗ sưng đau Trường hợp bị phongthấp hay mụn lở thì lấy thân rễ ngâm rượu uống hoặc sắc Ngoài ra, quả Dâythường xuân đem ngâm rượu hoặc thuốc sắc có công dụng chữa huyết bế trongbụng, giảm đau lưng, mỏi gối ở người già [7] Dây thường xuân là một loại câythông thường có chứa các hợp chất có thể chất làm loãng dịch nhầy và làm cho dễlong đờm hơn Nó thường được kết hợp với các nguyên liệu như: cỏ xạ hương vàhoa anh thảo để làm dịu cơn ho

Trang 27

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

45 mẫu lá thường xuân, trong đó 44 mẫu được thu thập từ các tỉnh khắp ViệtNam; 01 mẫu được thu thập từ vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc do Khoa Tài

nguyên Dược liệu - Viện Dược liệu (Bộ Y tế) cung cấp (Bảng 2.1).

Các mẫu lá nhận về phòng thí nghiệm đã sấy khô đựng trong túi nilon chứasilicagel bảo quản ở nhiệt độ phòng Sau đó được nghiền mịn trong nitơ lỏng vàchia đều vào các ống eppendorf 1,5 mL và bảo quản ở -30 ºC đến khi được sử dụngtách chiết DNA tổng số

Bảng 2.1 Thông tin các mẫu thực vật được nghiên cứu

mẫu

Địa điểm lấy mẫu (huyện, tỉnh)

Tọa độ lấy mẫu

1 H1* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

2 H2* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3** Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

4 H4* Hoàng Su Phì, Hà Giang 22°39'28.47"N - 104°35'57.14"E

5 H5* Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

6 H6* Sa Pa, Lào Cai 22°20'17.84"N - 103°49'52.89"E

7 H9* Sa Pa, Lào Cai 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E

8 H13* Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

9 H14* Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

10 HH** Vườn TV Hoa Nam, TQ 23°11'12"N - 113°21'51"E

11 H16* Đồng Văn, Hà Giang 23°14'49.81"N - 105°11'36.53"E

24 H29* Xín Mần, Hà Giang 22°38'51.74"N - 104°35'05.68"E

25 H30* Xín Mần, Hà Giang 22°39'01.08"N - 104°35'31.20"E

Trang 28

38 H45* Sa Pa, Lào Cai 22°22'59.25"N - 103°47'6.49"E

39 H46* Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

40 H47* Sa Pa, Lào Cai 22°22'51.15"N - 103°47'45.99"E

41 H48** Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

42 H49* Lộc Bình, Lạng Sơn 21°50'56.21"N - 106°55'4.78"E

45 H52** Đà Lạt, Lâm Đồng 11°56'11.56"N - 108°27'28.12"E

Ghi chú phân loại hình thái: * - H nepalensis; ** - H helix

2.1.2 Hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

Tách DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini(Thermo Scientific, Mỹ)

Nhân dòng đoạn gen đích ITS: Cặp mồi 17SE (5’ACG AAT TCA TGG TCC

GGT GAA GTG TTC3’) và 28SE (5’ TAG AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCGTTA C3’) được đặt tổng hợp từ công ty Phusa Biochem (Việt Nam), 5X Buffer,dNTP mix (Thermo Scientific), Phusion DNA Polymerase (Thermo Scientific),nước khử ion

Điện di: Gel Agarose, 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNALadder (Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific)

2.1.3 Thiết bị

Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm được tiến hành trong Phòng thínghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.Các thiết bị bao gồm: Cân phân tích, Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer,Đức), Máy chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver Scientific Ltd,Anh), Bể ổn nhiệt, Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản),

Tủ lạnh âm sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản)

Trang 29

Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức).

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1.

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá khô đã được nghiền thành bột mịntrong nitơ lỏng, sử dung bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit(Thermo Scientific, Mỹ) Bộ kit sử dụng công nghệ màng silica dưới dạng cột quaythuận tiện, không độc hại và tiết kiệm thời gian, tách chiết được DNA có kích thước

lên đến 30 kb Quy trình tách chiết được thực hiện theo khuyến cáo của hãng (Phụ

lục 1).

Trang 30

Kiểm tra và định lượng DNA

DNA tổng số sau khi tách chiết được kiểm tra sự có mặt bằng cách điện ditrên gel agarose 1,2 % với hiệu điện thế 100 V, 500 mA trong khoảng thời gian 40phút trong đệm TAE 1X Chúng tôi sử dụng tỉ lệ là 4 µL mẫu và 1 µL DYE 5X.Định lượng nồng độ DNA và độ tinh sạch bằng cách đo chỉ số OD260/280 (tỷ lệ hấpthụ quang của DNA ở bước sóng 260 nm so với độ hấp thụ quang tại bước sóng 280nm) trên máy quang phổ NP80 Mỗi mẫu DNA tổng số được đo 02 lần và lấy giá trịtrung bình của 02 lần đo Nồng độ DNA thu được càng cao và giá trị OD260/280 nằmtrong khoảng 1,8 – 2,0 được coi là DNA tách chiết có độ tinh sạch cao

2.2.2 Nhân dòng đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR

Để tìm ra quy trình nhân dòng đặc hiệu và ổn định cho các mẫu trong quátrình PCR, chúng tôi tiến hành 3 loại phản ứng tối ưu: Tối ưu nhiệt độ, tối ưu nồng

độ DNA và tối ưu nồng độ mồi Các phản ứng đều có đối chứng âm là các ống phảnứng không bổ sung DNA khuôn để loại bỏ khả năng bị nhiễm mẫu trong quá trìnhthao tác Đối chứng dương là mẫu DNA Dây thường xuân đã khuếch đại thành công

đoạn gen GBSSI (mẫu H3) Chúng tôi sử dụng enzyme Phusion Hight-Fidelity DNA

Polymerase có hiệu suất cao hơn Taq thông thường đến 52 lần, giảm thiểu thời giancủa phản ứng PCR Enzyme này cho hiệu suất cao ngay cả với những phản ứng cóchứa DNA có nhiều sản phẩm thứ cấp như DNA tổng số có nguồn gốc thực vật.Mỗi phản ứng PCR bao gồm 25 μL bao gồm 5x buffer, dNTP 2M, Phusion DNApolymerase, mồi 17SE/28SE, nước khử ion và DNA khuôn Phản ứng nhân dòng

gen ITS được tiến hành trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700,

Mỹ)

Kiểm tra sản phẩm PCR: Điện di trên Gel agarose 1,5% trong điều kiện 100

V, 500 mA với thời gian 45 phút trong đệm TAE 1x, sử dụng thang chuẩnGeneRuler 100 bp DNA Ladder để xác định kích thước Ảnh điện di được chụp trênmáy soi Gel Doc (Mỹ)

2.2.3 Giải trình tự

Chúng tôi tiến hành đóng gói sản phẩm của phản ứng PCR trong ốngeppendorf 1,5 mL, thể tích khoảng 20 μL gửi đi hãng First Base (Malaysia) để tinhsạch và giải trình tự theo 01 chiều mồi xuôi 17SE Kết quả giải trình tự sau khi nhậnđược hiển thị thông qua phần mềm BioEdit ver 7.2.6.1 hoặc Chromas pro 2.1.6, qua

đó xác định được kiểu gen của mẫu nghiên cứu Cách đọc kết quả: 04 nucleotide

Trang 31

được thể hiện bằng 04 màu khác nhau (G: màu đen, T: màu đỏ, C: màu xanh dương,A: màu xanh lá cây).

Hình 2.2 Hiển thị kết quả giải trình tự qua phần mềm BioEdit

2.3.4 Xử lý số liệu và phân tích kết quả

Sau khi thu được trình tự của đoạn gen ITS của các mẫu cần quan tâm, chúng

tôi tiến hành chỉnh sửa, lắp ghép đoạn trình tự bằng phần mềm Sequencher ver 5.4.6cắt bỏ những đoạn trình tự bị nhiễu (thường là đoạn đầu và đoạn cuối) Tiếp theocác trình tự sẽ được sử dụng để so sánh với các mẫu đã có sẵn trên ngân hàngGenbank thông qua https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xem xét về sự tươngđồng Kết hợp giữ các mẫu thu được cùng với các trình tự có sẵn trên ngân hàngGenbank, chúng tôi tiến hành xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng nhiều phươngpháp khác nhau (UPGMA, Maximum likelihood, Neiber- Joining) thông qua phầnmềm MEGA phiên bản X với giá trị bootstrap 1000 lần lặp lại Dựa trên kết quả thuđược từ cây phát sinh, tiến hành định danh nguồn gen Dây thường xuân dựa theocác phân nhánh với các trình tự đã lựa chọn tham chiếu

Trang 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số của 45 mẫu tách chiết theo Kit Thermo, sau đó điện di trên gelagarose 1,2 % Kết quả bước đầu ghi nhận thông qua điện di như sau: Tất cả cácmẫu đều quan sát được một băng DNA tổng số với kích thước tương ứng khoảng23,1 kb của marker, băng rõ rét chứng tỏ DNA thu được có nồng độ cao, ít đứt gãy

và đủ điều kiện để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo Băng điện di DNA tổng số

của một số mẫu thực vật thể hiện ở Hình 3.1.

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số của một số mẫu trên gel agarose 1,2 % Làn M: Lamda DNA/HindIII marker Làn 01-19: mẫu DNA tổng số thu của mẫu thực

vật có ký hiệu tương ứng Làn (-): Đối chứng âm

Định lượng và đo độ tinh sạch của DNA tổng số các mẫu lá khô cho kết quả:Nồng độ DNA trung bình đạt 12,23 ng/μL ± 4,28; chỉ số hấp thụ quang đo ở bướcsóng 260 và 280 nm có giá trị trung bình 2,00 ± 0,80 Số liệu chi tiết thống kê ở

Bảng 3.1.

STT Ký hiệu mẫu Nồng độ trung bình (ng/µL) OD 260/280 trung bình

Định dạng
Số trang	65
Dung lượng	1,04 MB