KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen dây thường xuân (hedera nepalensis k koch) ở miền bắc

Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị DNA ngàycàng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinhhọc, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và q

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC 

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN

DÂY THƯỜNG XUÂN (Hedera nepalensis K Koch)

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ

matK

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC 

Người thực hiện:

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN

GEN

DÂY THƯỜNG XUÂN (Hedera nepalensis K Koch)

Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả

về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của cácthầy cô, bạn bè và gia đình Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơnsâu sắc tới ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viên Khoa Y Dược – Đại họcQuốc gia Hà Nội, người tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong suốt quá trìnhnghiên cứu đề tài và hoàn thành khóa luận này Tôi xin cảm ơn ThS Đỗ Thị LệHằng và bạn Bùi Thị Yến đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm Các

cô, các bạn không chỉ trang bị cho tôi kiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam

mê, lòng nhiệt huyết, sự kiên trì và luôn sẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y Dược học cơ sở đãhết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu vàhoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện Dược liệu - Bộ Y tế đã khôngquản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài mộtcách thuận lợi nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy côgiáo Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báutrong quá trình học tập tại nhà trường

Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Côngnghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủtrì để thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình vàbạn bè đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thờigian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 06 năm 2020

Tác giả

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

DNA Axit deoxyribonucleic (Deoxyribonucleic acid)

dNTP Deoxyribonucleotide 5’ triphosphate

GBSSI Gen mã hóa enzyme tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch

Synthase)Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

H.helix Thường xuân (Hedera helix L.)

H.nepalensis Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal transcribed spacer)

Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo

Scientific, Mỹ)

NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National

Center for Biotechnology Information)

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

RNA Axit ribonucleic (Ribonucleic acid)

UPGMA Unweighted PairGroup with Method using arthmetic Averages

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số cặp mồi được sử trong nghiên cứu phân loại 9

Bảng 1.2 Các tác dụng dược lý của H nepalensis 20

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Các thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân dòng đoạn gen matK 30

Bảng 3.3 Các trình tự tham chiếu lấy từ Genbank sử dụng trong nghiên cứu 31

Bảng 3.4 Phân nhóm các mẫu trong nghiên cứu 32

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền (phía dưới bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía tên bên phải) giữa 03 haplotype với 03 trình tự tham chiếu 32

Bảng 4.1 Trình tự các mồi của gen matK được sử dụng trong các nghiên cứu về chi Hedera trên thế giới 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Vị trí của gen matK 11

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái Dây thường xuân 17

Hình 1.3 Phân bố địa lý của Dây thường xuân ở miền Bắc Việt Nam 18

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 1,2% 26

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng nhân dòng gen matK 28

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA phản ứng nhân dòng gen matK 29

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi phản ứng nhân dòng gen matK 29

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng đoạn gen matK 30

Hình 3.6 Kết quả hiển thị giải trình tự của mẫu đại diện H4 của gen matK qua phần mềm BioEdit 31

Hình 3.7 So sánh trình tự đoạn gen matK của các haplotype nghiên cứu với các trình tự tham chiếu 33

Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA của 03 haplotype nghiên cứu với 03 trình tự tham chiếu dựa trên chỉ thị matK 34

Hình 3.9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood của 03 haplotype nghiên cứu với 03 trình tự tham chiếu dựa trên chỉ thị matK 35

Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp UPGMA của 03 haplotype nghiên cứu với trình tự các loài Hedera dựa trên chỉ thị matK 36

MỤC LỤC

Trang

ĐẶ

T V ẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔ NG QUAN TÀI LI Ệ U 3

1.1.Đa dạ ng và phân lo ạ i sinh h ọ c 3

1.1.1.Khái ni ệm đa dạ ng sinh h ọ c 3

1.1.2 dạĐa ng di truy ề n 3

1.1.3 ự c trTh ạng đa dạ ng sinh h ọ c t ạ i Vi ệ t Nam 4

1.1.4 phươngCác pháp phân loạ i h ọ c 5

1.2.Công c ụ phân tích đa dạ ng di truy ề n và ti ế n hóa 8

1.2.1 ổ ngT quan v ề mã v ạ ch DNA 8

1.2.2 ng dỨ ụ ng c ủ a mã v ạ ch DNA ở th ự c v ậ t 9

1.2.3.Vùng gen l ụ c l ạ p matK ( maturase K ) 11

1.3.Phân tích phát sinh gen (Phylogenetic Analysis) 12

1.3.1 ự a chL ọ n trình t ự sinh h ọ c 12

1.3.2 ắ p xS ếp đa chuỗ i 13

1.3.3 ự a chL ọ n mô hình ti ế n hóa 13

1.3.4.Xây d ự ng cây phát sinh loài 14

1.3.5.Đánh giá cây phát sinh loài 15

1.4. ổ ngT quan v ề loài Dây thườ ng xuân ( Hedera nepalensis K.Koch) 15

1.4.1.Đặc điể m hình thái chung c ủa loài Dây thườ ng xuân 15

1.4.2 điểĐặc m phân b ố , sinh thái 18

1.4.3.Thành ph ầ n hóa h ọ c 19

1.4.4 d ụ ngTác dượ c lý 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 21

2.1.Đối tượ ng nghiên c ứ u 21

2.1.1.Đối tượ ng 21

2.1.2.Tiêu chu ẩ n l ự a ch ọ n m ẫ u 21

2.2.Th ời gian, địa điể m nghiên c ứ u 22

2.3.D ụ ng c ụ , trang thi ế t b ị và hóa ch ấ t nghiên c ứ u 22

2.3.1.Hóa ch ấ t 22

2.3.2.Trang thi ế t b ị 23

2.4.Phương pháp nghiên c ứ u 23

2.4.1.Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 24

2.4.2.Khu ếch đại đoạn gen đích bằ ng k ỹ thu ậ t PCR 24

2.4.3.Tinh s ạ ch và gi ả i trình t ự 25

2.4.4 ử lý X s ố li ệ u và phân tích k ế t qu ả 25

CHƯƠNG 3 KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U 26

3.1 Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 26 3.2.K ế t qu ả t ối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạ n gen matK b ằ ng k ỹ thu ậ t PCR 27

3.2.1 T ối ưu quy trình PCR 27

3.2.2 K ế t qu ả nhân dòng gen matK t ừ các m ẫ u th ự c v ậ t 29

3.3.Gi ả i trình t ự 31

3.4.Độ tương đồ ng c ủ a trình t ự gen matK đượ c khu ếch đạ i 31

3.5.Cây phát sinh ch ủ ng lo ạ i d ự a trên vùng gen matK 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬ N 38

4.1.K ế t qu ả xây d ựng quy trình phân tích đoạ n gen matK 38

4.1.1.Tách chi ế t DNA t ổ ng s ố 38

4.1.2.Khu ếch đại đoạ n gen matK 39

4.1.3 ả i trìnhGi t ự và so sánh độ tương đồ ng 40

4.2.Nghiên c ứu đa dạ ng di truy ề n ngu ồn gen Dây thườ ng xuân s ử d ụ ng mã v ạ ch matK 40

4.2.1.Kho ả ng cách di truy ề n 40

4.2.2.Phân tích đa dạ ng di truy ề n ngu ồn gen Dây thườ ng xuân ở mi ề n B ắ c Vi ệ t Nam 41

K Ế T LU Ậ N VÀ KI Ế N NGH Ị 47

TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O .

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa nên có hệ thực vậtphong phú và đa dạng, trong đó đặc biệt phải kể đến nhóm tài nguyên cây thuốc.Theo kết quả điều tra của Viện Dược liệu, Việt Nam có 3948 loài thực vật bậc cao,bậc thấp và nấm lớn được dùng làm thuốc [2 ] Tuy nhiên, phần lớn các cây thuốcđược sử dụng theo kinh nghiệm dân gian hoặc theo Y học cổ truyền mà chưa đượcnghiên cứu một cách chuyên sâu và đầy đủ Vì vậy, cần có thêm nhiều nghiên cứuđánh giá chính xác mức độ đa dạng di truyền của các loài cây thuốc nhằm địnhhướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống để đáp ứng yêu cầu phát triển của nền côngnghiệp chế biến dược liệu bền vững

Trong hệ thực vật đó, Hedera (L.) là một chi thuộc họ Nhân sâm

(Araliaceae) trên thế giới đã ghi nhận 16 loài, một số loài được biết có giá trị làmthuốc [15] Trong số đó, 2 loài đến nay được sử dụng rộng rãi và nghiên cứu nhiều

hơn cả về dược học là Thường xuân - H helix và Dây thường xuân - H nepalensis đều có phạm vi phân bố tương đối hẹp trên thế giới Theo đó H helix được tìm thấy chủ yếu ở Châu Âu và một phần Nam Á, còn H nepalensis được phát hiện phân bố

ở các nước châu Á như: Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Nepal, Thái Lan,… Ở ViệtNam, loài này được báo cáo xuất hiện tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc như Lào

Cai, Hà Giang, H helix đã được các nhà khoa học trên thế giới chứng minh có

nhiều tác dụng dược lý trong điều trị các bệnh về hô hấp, nhiễm khuẩn, bảo vệ gan

và đã được phát triển thành thuốc điều trị viêm đường hô hấp cấp và mạn tính

(Prospan) Trong khi đó ở Việt Nam, Dây thường xuân (H nepalensis) chủ yếu

được dùng làm cây cảnh và chưa có một nghiên cứu nào về thành phần hoá học vàtác dụng dược lý

Trong Dây thường xuân có chứa các hợp chất n-hexan và ethyl acetate có tácdụng chống ung thư [55], ngoài ra còn chứa lupeol, một triterpenoid có hoạt tính ứcchế dipeptidyl peptidase-4 với tiềm năng chữa bệnh tiểu đường [40, 83] Không chỉ

vậy, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng H nepalensis có tác dụng bảo vệ thần

kinh [40], chống viêm, giảm đau, chống đông máu và chống trầm cảm [52] Với

những tiềm năng dược lý như vậy, song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.

nepalensis, đặc biệt là các nghiên cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ

công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen Chúng tôi cho rằng việc phântích đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân là thực sự cần thiết nhất là khiphạm vi phân bố tự nhiên của loài này trên thế giới tương đối hạn chế Ngoài yêu

9

cầu đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân ở Việt Nam, định loạichính xác loài để từ đó có chiến lược bảo tồn, khai thác và phát triển cũng là vấn đềnghiên cứu cấp thiết hiện nay Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị DNA ngàycàng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinhhọc, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực vật nhằmmục đích bảo tồn và chọn giống So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái vàchỉ thị hóa học), thì chỉ thị DNA mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực hiện trongđiều kiện phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và hiệntượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị DNA trong các giai đoạnkhác nhau và ở các cơ quan khác nhau của thực vật Để phục vụ cho nghiên cứu

này, chúng tôi sử dụng chỉ thị phân tử là matK (maturase K) trong vùng gen lục lạp

làm công cụ giúp xây dựng cây phát sinh loài Mã vạch này là chỉ thị phân tử nổibật được ứng dụng thành công trong nhiều nghiên cứu giúp phân tích đa dạng di

truyền và định danh nhiều loài thực vật, có thể kể đến như chi Panax, chi

Alium[14], họ Valerianaceae [46] hay chi Dalbergia [22],… Nhưng câu hỏi được

đặt ra là liệu matK có phải là chỉ thị DNA thích hợp để phân tích đa dạng di truyền

loài Dây thường xuân hay không?

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở miền Bắc Việt Nam dựa trên chỉ thị matK” Nghiên cứu này hướng đến hai mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình nhân dòng đoạn gen matK của Dây thường xuân.

2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa vào chỉ thị matK và dùng chỉ thị

này để đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gen Dây thường xuân thuthập ở miền Bắc Việt Nam

Để thực hiện được mục tiêu nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên cứu sau:

1 Tách DNA tổng số thu từ mẫu lá khô Dây thường xuân

2 Tối ưu phản ứng PCR và tiến hành nhân dòng đoạn gen matK

3 Giải trình tự vùng gen matK được nhân dòng

4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị matK

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đa dạng và phân loại sinh học

1.1.1 Khái niệm đa dạng sinh học

Năm 1982, định nghĩa của Wilcox “Đa dạng sinh học là sự đa dạng của cácdạng sống ở tất cả các cấp độ của hệ thống sinh học” được đưa ra bởi Liên minhquốc tế về bảo tồn tài nguyên và tự nhiên (IUCN) Đến năm 1984, Wilcox cho rằng

đa dạng sinh học có thể được định nghĩa về mặt di truyền là sự đa dạng của cácalen, gen của sinh vật Cho đến năm 1992, một định nghĩa khác được quốc tế côngnhận và được sử dụng trong Công ước Liên hợp Quốc về đa dạng sinh học: Đa dạngsinh học là sự biến đổi sinh vật sống từ tất cả các nguồn bao gồm các hệ sinh thái vàcác phức hợp sinh thái mà chúng là một phần: bao gồm sự đa dạng trong loài (đadạng di truyền, đa dạng gen), giữa loài (đa dạng loài) và hệ sinh thái (đa dạng hệsinh thái) [41] Ngoài ra, trong cuốn sách “Biodiversity: an introduction”, Gaston vàSpicer định nghĩa “Đa dạng sinh học là sự biến đổi của sự sống ở tất cả các cấp độ

1.1.2 Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là sự đa dạng ở cấp độ phân tử về thành phần gen giữa các

cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể ditruyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể, tồn tại trong một loài vàgiữa các loài khác nhau Đa dạng di truyền là cơ chế giúp sinh vật tồn tại trongnhững điều kiện khác nhau nên cần thiết cho tất cả các sinh vật để duy trì nòi giống.Thông qua đa dạng di truyền, sinh vật tạo nên những cơ chế mới, kháng lại các loạidịch bệnh và thích nghi với biến đổi môi trường [34] Mỗi loài có chứa những gen

riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể có thể thíchnghi được với môi trường sống thay đổi Với các áp lực như: chọn lọc nhân tạo, môitrường sống khắc nghiệt,… một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơ hội cao hơntrong việc sở hữu những biến dị alen phù hợp với môi trường giúp duy trì nòi giống

có alen đó Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệ nhờ sự thành công củanhững cá thể này

Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên

sự khác biệt của các cá thể trong quần thể Đa dạng sinh học dù trong phạm vi mộtloài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ đa dạng

di truyền Nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chínhxác nhất về sự khác biệt giữa các loài Tuy nhiên, đa dạng di truyền vẫn chưa đượcquan tâm đúng mức mặc dù loại đa dạng này chính là nền tảng cho sự đa dạng củasinh giới [5] Ứng dụng của nghiên cứu đa dạng di truyền bao gồm: Bảo tồn nguồngen; Lai tạo giống mới và Nghiên cứu tiến hóa

1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam

Việt Nam đứng thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học trên thế giới và được biếtđến như một trung tâm đa dạng sinh học với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và

sự giàu có về các loài và nguồn gen sinh vật Trong đó, đã xác định được khoảng

49200 loài sinh vật bao gồm: khoảng 7500 chủng vi sinh vật; 20000 loài thực vậttrên cạn và dưới nước; 10500 loài động vật trên cạn; 2000 loài động vật khôngxương sống và cá sống ở nước ngọt; khoảng trên 11000 loài sinh vật biển Đặc biệt,một bộ phận lớn của các giống thực vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ởnước ta, nên tiềm năng phát triển và đem lại giá trị kinh tế rất cao [6] Việt Nam có

số lượng lớn nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý hiếm và là nơi

có nguồn đa dạng sinh học phong phú Tuy nhiên, những sản phẩm từ dược liệu quýcủa nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử dụng rộng rãitrong cộng đồng Cũng như nhiều quốc gia khác trên thế giới, Việt Nam đang đốidiện với nguy cơ suy thoái đa dạng sinh học và sự mất cân bằng sinh thái diễn ramạnh mẽ Tài nguyên đa dạng sinh học đang trên đà suy giảm một cách đáng báođộng, các hệ sinh thái bị thu hẹp, suy giảm và bị chia cắt, nguồn gen bị thất thoát,mai một Nguyên nhân là do áp lực của gia tăng dân số kéo theo tài nguyên sinh vật

bị khai thác quá mức và không được tái tạo Ngoài ra, công tác bảo tồn còn nhiềubất cập, hệ thống các quy định pháp luật về bảo tồn đa dạng sinh học chưa đồng bộ

Vì vậy, vấn đề cấp thiết hiện nay là cần phải bảo tồn và phát triển nguồn gen

1.1.4 Các phương pháp phân loại học

Phân loại học là lĩnh vực sinh học liên quan đến xác định, đặt tên và phânloại các loài Phân loại học là quá trình các nhà khoa học nhóm các sinh vật sốngdựa trên mức độ giống nhau của chúng nhằm phản ánh sự liên quan tiến hóa của cácsinh vật và các nhóm sinh vật Trong lịch sử, sự giống nhau được xác định bằngcách kiểm tra các đặc điểm vật lý, hóa học Theo truyền thống những đặc điểm này

có thể quan sát bằng hình thái nhưng với sự ra đời và phát triển của giải trình tựgen, trình tự DNA và các dấu hiệu phân tử cũng được sử dụng để phân loại, địnhdanh các loài

1.1.4.1 Phương pháp phân loại học truyền thống

Phân loại học truyền thồng gồm 2 phân loại là phân loại dựa trên các chỉ thịhình thái và dựa vào các chỉ thị hóa học (như sắc ký lớp mỏng - TLC hay sắc ký lớpmỏng hiệu năng cao – HPLC,…) Trong đó, phân loại học hình thái được sử dụngphổ biến hơn và đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực phân loại học

Phân loại học hình thái dựa trên sự tương đồng rõ ràng nhất giữa các loài và

đã được đưa ra từ rất lâu trước khi ý tưởng về sự tiến hóa xuất hiện Phân loại họcnày chủ yếu dựa trên sự khác biệt đặc điểm hình thái các cơ quan của thực vật, đặcbiệt là hoa (cơ quan sinh sản) Phương pháp phân loại học hình thái có lịch sử lâuđời và nhờ vào phương pháp này mà hệ thống phân loại thực vật được hoàn thiệnkhá đầy đủ Ưu điểm của nó là có thể phân biệt các loài dựa trên sự quan sát các đặcđiểm bên ngoài, dễ ứng dụng và thân thiện với nhiều đối tượng Tuy nhiên, nhượcđiểm của phương pháp này là sẽ gặp khó khăn khi phân loại các mẫu đang tronggiai đoạn phát triển (chưa ra hoa) hoặc có các đặc điểm hình thái giống nhau docùng sinh trưởng và phát triển trong cùng một điều kiện môi trường địa lý hay cónhiều điểm tương đồng do ở mức độ phân loại thấp như loài và dưới loài [57].Không chỉ vậy, phương pháp này thường được sử dụng bởi các chuyên gia hình thái

và cần một khoảng thời gian tương đối dài và tốn nhiều công sức [42] Dù còn tồntại nhiều nhược điểm nhưng không thể phủ nhận tầm quan trọng của phân loại họchình thái trong lĩnh vực phân loại học hiện nay

1.4.1.2 Phương pháp phân loại học hiện đại

Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp phân loại học truyềnthống, hiện nay các nhà khoa học đã xây dựng nhiều phương pháp phân loại họcmới, trong đó:

Phân loại học phân tử

Với sự phát triển của sinh học phân tử vào những năm 1990 cùng với thànhcông của việc giải trình tự gen, phân loại học phân tử được hình thành Phươngpháp phân loại này dựa trên việc phân tích các dữ liệu về gen (DNA) trong hoặcngoài nhân hoặc cả hệ gen hay các sản phẩm của chúng như protein, enzyme Từ đógiúp định danh và xây dựng mối quan hệ tiến hóa và di truyền giữa các loài Tùyvào mục đích nghiên cứu, có thể lựa chọn một trong các công cụ DNA hay protein.Các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng gồm: giải trình tự DNA, đa hình cácđoạn DNA nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hìnhchiều dài các đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) hay

kỹ thuật đồng enzyme (isozyme),…[10] Các kỹ thuật này đã được ứng dụng thànhcông trong việc phân loại, định danh và xác định mối quan hệ tiến hóa của nhiềuloài sinh vật và ngày càng cho thấy những lợi ích thiết thực So với phân loại họctruyền thống thì phương pháp này giúp quá trình xác định các loài trở nên nhanh,chính xác và ít tốn kém hơn [9] Mục tiêu chính của phân loại học phân tử là:

(i) Xác định mối quan hệ phân cấp giữa các loài hiện có theo mối quan hệ tiến hóacủa chúng Vì vậy, các sinh vật có chung một tổ tiên chung được nhóm lại sớmhơn so với những sinh vật có tổ tiên chung xa hơn

(ii)Ước tính thời gian phân kỳ giữa các loài, tức là thời gian tồn tại của tổ tiên chunggần nhất

Phân loại học hiện trạng số (Numerical taxonomy)

Phân loại học hiện trạng số là một hệ thống phân loại cho phép so sánh sốlượng lớn các đặc điểm (từ 60 dấu hiệu trở lên) cho số lượng lớn các chủng bằngcách phân tích bộ dữ liệu được tạo ra bằng máy tính Phương pháp này áp dụng cácquy trình toán học khác nhau cho dữ liệu trạng thái ký tự được mã hóa số Nó nhằmmục đích tạo ra một phân loại sử dụng các thuật toán số như phân tích cụm thay vì

sử dụng đánh giá chủ quan các thuộc tính Các bộ dữ liệu về ma trận cho thấy mức

độ tương đồng giữa từng cụm rồi từ đó tạo thành một bức tranh chung về đặc điểmkiểu hình của một nhóm cụ thể Khái niệm này được đưa ra lần đầu tiên bởi Robert

R Sokal và Peter HA Sneath vào năm 1963 [87], sau đó được xây dựng và pháttriển bởi cùng nhóm tác giả [86] Ưu điểm của phương pháp này là dữ liệu phân loạiđược thu thập từ nhiều nguồn khác nhau, như hình thái, hóa học, sinh lý,… Sự trợgiúp của hệ thống dữ liệu điện tử cho phép nhiều công việc phân loại được thực

hiện Tuy nhiên, vẫn tồn tại nhược điểm bao gồm: Đối xử với sinh vật như nhữngđối tượng phi sinh vật; Loại trừ yếu tố tiến hóa, không phân loại được phát sinh gen;

Sự lựa chọn trọng số ngầm định hoặc rõ ràng của các đặc điểm bị ảnh hưởng bởi dữliệu sẵn có và lợi ích của điều tra viên Phân loại số đã được áp dụng thành côngtrong các nghiên cứu về sự tương đồng và khác biệt ở vi khuẩn và một số nhóm

động vật, phân định một số chi như Oryza, Sarcostemma Solarium.

Phân loại học PhyloCode

PhyloCode hay còn gọi là Bộ luật danh pháp phát sinh quốc tế (InternationalCode of Phylogenetic Nomenclature) là một dự thảo phát triển một bộ chính thứccủa quy tắc chi phối danh pháp phát sinh loài [85] Khác với phân loại học truyềnthống, PhyloCode không chia thành nhiều thứ hạng phân loại (như bộ, họ, chi,loài,…) mà chỉ gồm các bậc tiến hóa được xác định bởi các đặc điểm tổ tiên và cácđặc điểm phân ly từ tổ tiên ban đầu từ đó tạo thành các nhánh tiến hóa đơn dòng [9 ].Tất cả các bậc tiến hóa hình thành trong một nhánh đều được xác định như các loài,không có thứ hạng trên loài như trong phân loại học truyền thống Ưu điểm củaphương pháp này là cho phép đặt tên các cấp bậc trung gian; Cải thiện sự ổn địnhdanh pháp; Tạo điều kiện cho việc đặt tên của các nhánh mới khi chúng được pháthiện; Cho phép loại bỏ các cấp bậc phân loại, loại bỏ khía cạnh chủ quan nhất củaphân loại truyền thống và được áp dụng ở tất cả các cấp độ của phân loại Tuynhiên, PhyloCode còn gây nhiều tranh cãi và chưa được sử dụng rộng rãi [73]

Cận phân loại học (Parataxonomy)

Cận phân loại học là một hệ thống phân công lao động sử dụng trong nghiêncứu đa dạng sinh học Trong đó các nhiệm vụ sắp xếp sơ bộ của việc thu thập mẫu,nhận dạng và bảo quản được thực hiện bởi người ít chuyên môn hơn do đó giảm bớtkhối lượng công việc cho các chuyên gia phân loại học Phương pháp này được sửdụng để cải thiện hiệu quả và đẩy nhanh tốc độ phân loại [19] Xu hướng của cậnphân loại học không phân loại sinh vật thành các loài theo những nguyên tắc chung

mà phân thành các đơn vị phân loại có thể thừa nhận dựa trên những đặc điểm dễnhận biết bằng mắt thường [9] Tuy nhiên, không thể sử dụng Parataxonomy vàoviệc thống kê sinh vật như trong phân loại học mà chỉ nên coi là một biện pháp kỹthuật hỗ trợ phân loại học chứ không thể thay thế phân loại hoc truyền thống

1.2 Công cụ phân tích đa dạng di truyền và tiến hóa

1.2.1 Tổng quan về mã vạch DNA

Để định danh loài cũng như phân tích mối quan hệ di truyền và tiến hóa, cácnhà khoa học thường sử dụng chỉ thị phân tử như dấu vân tay DNA (DNAfingerprinting), PCR RFLP (sử dụng enzyme giới hạn kết hợp với lai DNA) và đặcbiệt là mã vạch DNA (DNA barcode) Nguyên lý chung của các phương pháp nàyđều dựa trên sự khác biệt của trình tự nucleotide (base nitơ) trong cấu trúc hóa họccủa DNA để xác định loài Mã vạch DNA được ứng dụng và có tiềm năng trongnhiều ngành khoa học như phân loại học, công nghệ sinh học, công nghệ thựcphẩm, pháp ý, giúp nhận diện và định danh nhiều mẫu vật [42]

DNA Barcode hay mã vạch DNA lần đầu tiên được đề xuất là phương phápđịnh danh loài bởi Paul Hebert (Đại học Guelph – Cananda) vào năm 2003 [42] Mãvạch DNA có thể là vùng gen trong nhân hay ngoài nhân mã hóa hoặc không mãhóa protein Mã vạch này tương tự như mã vạch sọc đen dán vào các sản phẩmtrong siêu thị Tuy nhìn hai sản phẩm bên ngoài giống nhau và không thể phân biệtđược bằng mắt thường nhưng khi quét mã vạch lại có thể xác định được chúng [88]

Để trở thành một mã vạch DNA, cần đáp ứng những yêu cầu sau:

(i) Tồn tại phổ biến (có mặt trong nhiều loài sinh vật);

(ii) Trình tự có hiệu suất nhân dòng cao và đặc hiệu;

(iii) Khả năng phân biệt được nhiều loài [50]

Hiện nay thì nhiều mã vạch DNA ngày càng được sử dụng phổ biến, có thể

kể đến chỉ thị nằm trong hệ gen nhân (ITS, ) [18, 27, 28], hệ gen ty thể (Cytb,

COI ) [18, 25, 43] hay hệ gen lục lạp (matK, trnK, rbcL, ) [48, 49, 71] Đặc điểmchung của những chỉ thị này là đều có tính đặc hiệu cao và dễ sử dụng Chúng cónhững đặc tính lý tưởng bao gồm: đủ độ bảo thủ để xác định những sinh vật cùngloài nhưng cũng đủ đột biến để phân biệt các loài [65]; có độ dài thích hợp (khôngquá ngắn để xuất hiện vị trí đa hình giữa các taxon, không quá dài để thuận lợi trongquá trình giải trình tự); vị trí mồi bảo tồn cao, DNA được khuếch đại và giải trình tự

có độ tin cậy cao Trong đó, ở động vật, vùng gen ty thể có ưu thế hơn vùng gennhân do có tốc độ tiến hóa nhanh [26, 81] Còn ở thực vật, vùng gen ty thể khôngđược lựa chọn làm mã vạch DNA do hệ gen này tiến hóa chậm [38, 48] Thay vào

đó, hệ gen lục lạp được cho thấy khả năng phân biệt tốt các loài [23, 48, 74] Ngoài

ra, để tăng độ chính xác khả năng phân loại, các nghiên cứu thường kết hợp nhiều

hơn một chỉ thị phân tử Thông tin về một số cặp mồi trong nghiên cứu phân loại

được trình bày chi tiết trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1: Một số cặp mồi được sử trong nghiên cứu phân loại

ITS P1 F ATT GAA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G [77]

P2 R AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTAC [77]Is2P1 F ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT [27]Is2P1 R TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC [27]

rbcL rP1 F ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC [63]

rP1 R GTA AAA TCA AGT CCA CCT CG [63]

matK KIM 3F CGT ACA GTA CTT TTG TGT TTA CGA G [38, 58]

KIM 1R ACC CAG TCC ATC TGG AAA TCT TGG TTC [38, 58]390F CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C [29]1326R TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T [29]1F ACC GTA TCG CAC TAT GTA TC [93]1R GAA CTA GTC GGA TGG AGT AG [93]

1.2.2 Ứng dụng của mã vạch DNA ở thực vật

1.2.2.1 Ứng dụng ở thực vật nói chung

Ở thực vật, nghiên cứu mã vạch DNA không chỉ dùng để đánh giá sự khácnhau giữa các vùng DNA mà còn tiến tới những ứng dụng thực tế hơn Các ứngdụng này bao gồm:

(i) Cung cấp thông tin sâu hơn về phân loại học ở cấp độ loài đồng thời tham gia vàoquá trình phân loại học: Nhận diện và phân biệt các loài

(ii) Hỗ trợ nhận diện các mẫu vật chưa được nhận biết thuộc loài nào hoặcxác định loài mới (Đây là ứng dụng chính)

Với những loài có hình thái đơn giản, phân bố rộng, kích thước nhỏ hay hệthống phân loại chưa đầy đủ và chưa được phân loại một cách triệt để thì mã vạchDNA giúp hoàn thiện hệ thống phân loại Ngoài ra, nó còn cung cấp thêm thông tin

hữu ích về đa dạng loài có thể kể đến như nghiên cứu về nhóm thực vật bryphytes(rêu) [71] hay nhận diện những loài lan ẩn danh [66] Ngày nay, mã vạch DNAđược ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu bao gồm:

(i) Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của một vùng địa lý (các mẫu nghiêncứu thuộc nhiều bộ, họ, chi, loài);

(ii) Phân biệt tập hợp mục tiêu các loài họ hàng có khả năng thay thế loài có giá trịthương mại;

(iii) Nhận diện mẫu vật mà người sử dụng không có khái niệm quen thuộc

1.2.2.2 Ứng dụng trong nhận biết dược liệu

Ngày nay, thuốc được phát triển từ dược liệu ngày càng trở nên phổ biến vànhu cầu sử dụng các sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc thiên nhiên ngàycàng tăng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính khoảng 80% dân số thế giới sửdụng cây thuốc để chăm sóc sức khỏe ban đầu [17] Ở nước phương Tây, cây thuốc

là nguồn gốc của nhiều loại thuốc thảo dược hỗ trợ chăm sóc sức khỏe Còn ở cácnước phương Đông, đặc biệt là Trung Quốc, việc sử dụng nguyên liệu thảo dược đã

có lịch sử lâu đời, thống kê cho thấy có đến hơn 10000 loài, hơn 2000 chi và 400 họđược sử dụng để làm thuốc [27] Thị trường toàn cầu cho dược liệu và cây cho tinhdầu thơm là 62 tỷ đô la vào năm 2002 và có thể đạt 5 nghìn tỷ đô la vào năm 2050[85] Nhu cầu sử dụng dược liệu thúc đẩy sự mở rộng và phát triển của thị trườngxuyên quốc gia về nguồn nguyên liệu thảo dược Tuy nhiên, nó cũng làm xuất hiệntình trạng giả mạo dược liệu Các loài thảo dược này có thể bị thay thế bởi các loài

có quan hệ gần gũi, thậm chí là bị giả mạo hoàn toàn Tồn tại tình trạng này là do:

(i) Nguyên liệu không phân biệt được bằng đặc điểm hình thái

(ii) Nguyên liệu có đặc điểm tương tự nhau

(iii) Thay thế các nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng các nguyên liệu dễ kiếm

và rẻ tiền hơn

Ngoài ra, việc định danh và xác định nguyên liệu thảo dược theo phươngpháp truyền thống như đặc điểm cảm quan và phân tích hóa học đôi khi gặp khókhăn nhất là khi nguyên liệu được chế biến thành các dạng bào chế như bột hay bịphân cắt thành các đoạn nhỏ Chính vì vậy, mã vạch phân tử có lợi thế ưu việt trongviệc nhận biết nguồn gốc dược liệu từ các mẫu mô nhỏ Không chỉ vậy, mã vạchphân tử còn được sử dụng phổ biến trong những năm gần đây để đánh giá đa dạng

sinh học phục vụ công tác bảo tồn và kiểm soát chất lượng sản phẩm Việc địnhdanh các nguyên liệu thảo dược bằng cách sử dụng mã vạch DNA giúp bảo vệngười dùng khỏi nguy cơ bị tổn hại sức khỏe bởi các thuốc giả mạo.

1.2.3 Vùng gen lục lạp matK (maturase K)

Gen matK (maturase K), trước đây được gọi là orfK, là chỉ thị quan trọng

được biểu hiện từ bộ gen lục lạp [47] Gen này có tỷ lệ thay thế cao trong loài vànổi lên như một ứng cử viên tiềm năng để nghiên cứu hệ thống tiến hóa thực vật[75] matK là một trong hai gen plastid (rbcL và matK) được Nhóm công tác

thực vật (PWG) của Hiệp hội mã vạch sự sống (CBOL) khuyến nghị sử dụng làm

mã vạch DNA thực vật tiêu chuẩn [38, 50] matK là gen mã hoá một protein có liên

quan đến quá trình cắt nối intron - exon nhóm II, dài khoảng 1500 bp, nằm trong

intron của gen lục lạp trnK [20, 47] (Hình 1.1) Trong số các maturase, protein này

chỉ giữ lại một miền X được bảo tồn tốt và tàn dư của một miền phiên mã ngược[72] Các phức hợp gen matK-trnK thường được sử dụng cho các nghiên cứu tiến

hóa thực vật và giải quyết quan hệ di truyền ở các mức phân loại khác nhau [54]

Hình 1.1:Vị trí của gen matK [47]

Gen matK có tính đa dạng hơn những gen khác trong lục lạp, do vậy nó trở

thành chỉ thị quan trọng giúp phân loại thực vật Những đặc điểm của gen được khaithác bao gồm: có kích thước lý tưởng, tỷ lệ chuyển đổi cao và có trình tự bảo thủ

Tỷ lệ thay thế trong matK cao hơn gấp ba lần ở mức nucleotide và cao gấp sáu lần ở mức axit amin so với rbcL Mặt khác sự hiện diện của vùng 3' tương đối được bảo

tồn và vùng 5' ít được bảo tồn có thể được sử dụng để giải quyết các mối quan hệphát sinh loài từ các mức độ phân loại nông đến sâu [31, 47]

Việc khuếch đại và giải trình tự vùng mã vạch matK rất khó khăn do tính

biến thiên trình tự cao trong các vị trí liên kết mồi, đặc biệt khi đối tượng nghiêncứu không phải là thực vật hạt kín [38, 48, 50] Hiện tại, có ba cặp mồi matK được

sử dụng phổ biến để khuếch đại là: 390F/1326R [29, 90], KIM 3F /KIM 1R [38, 58]

và XF/5R [33] Kress và c ộ ng s ự (2009) đã sử dụng ba cặp mồi này để khuếch đại

mã vạch DNA từ 296 loài thực vật [64] Sự kết hợp mồi này đã thành công khuếchđại trong 85% và thành công tuần tự ở 69% các loài, chứng minh rằng khuếch đại làđáng tin cậy Tuy nhiên, việc sử dụng nhiều hơn một cặp mồi có thể tốn thời giancũng như kinh phí và thường phức tạp đối với các dự án quy mô lớn [44].

Gen matK cho thấy khả năng phân biệt cao các loài thực vật hạt kín và hỗ trợđịnh danh cho nhiều loài thực vật [80] Chỉ thị này đã được ứng dụng thành công đểxây dựng cây phát sinh loài cho họ Valerianaceae [46], Saxifragaceae,Polemoniaceae, Poaceae [47],… và giải quyết mối quan hệ di truyền của họ

Aurantioideae đặc biệt là chi Citrus [76],… Mã vạch này được sử dụng thành công

để phân biệt Panax notoginseng (Araliaceae) giữa các vùng địa lý khác nhau [95]

và xây dựng cây phân loài của Panax vietnamensis và 5 trình tự liên quan [62]

1.3 Phân tích phát sinh gen (Phylogenetic Analysis)

Việc xác định mối quan hệ phân cấp giữa các loài và ước lượng thời gianphân kỳ giữa chúng dựa trên các trình tự sinh học như protein hoặc DNA được thựchiện bởi các nghiên cứu phát sinh gen Các nghiên cứu phát sinh gen thường đượcchia làm 5 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Lựa chọn trình tự sinh học cần phân tích

Giai đoạn 2: Xây dựng sự liên kết (sắp xếp đa chuỗi) giữa các trình tự sinhhọc được chọn

Giai đoạn 3: Lựa chọn các mô hình thay thế, các mô hình thống kê về tiếnhóa phân tử cho các trình tự

Giai đoạn 4: Xây dựng các cây phát sinh loài

Giai đoạn 5: Đánh giá thống kê các cây phát sinh loài

1.3.1 Lựa chọn trình tự sinh học

Các nghiên cứu phát sinh gen dựa trên việc so sánh các trình tự sinh họctương đồng Nghiên cứu về sự khác biệt giữa các trình tự cho phép ước tính mốiquan hệ tiến hóa giữa các loài tương ứng và thời gian phân kỳ của chúng Để cóđược các chuỗi tương đồng, các cơ sở dữ liệu như RefSeq, Uniprot hoặcHomoloGene có thể rất hữu ích Một cách khác để có được các chuỗi tương đồng là

sử dụng các trình tự từ các kết quả BLAST

Hai trình tự DNA ở hai sinh vật khác nhau tiến hóa từ một trình tự DNA tổtiên thì được gọi hai trình tự DNA tương đồng Tuy nhiên, vẫn có những khác biệt

giữa hai trình tự tương đồng trong quá trình tiến hóa do những đột biến (biến đổi).

Có 3 loại biến đổi chính là: Thay thế (một nucleotide này bị thay thế bằng mộtnucleotide khác); Xóa (một hoặc một số nucleotide bị xóa khỏi trình tự); Chèn (mộthoặc một số nucleotide được chèn vào trình tự)

1.3.2 Sắp xếp đa chuỗi

Việc sắp xếp các trình tự sinh học cần phân tích (sắp xếp thẳng hàng) là bướcquan trọng nhất trong nghiên cứu phát sinh gen vì nó liên quan trực tiếp đến việc sosánh sự giống và khác nhau giữa các trình tự Có một số công cụ để thực hiện sắpxếp chuỗi trong đó có BioEdit, MEGA Các công cụ này cho phép căn chỉnh nhiềuchuỗi thông qua các phương pháp căn chỉnh MUSCLE và ClustalW

1.3.3 Lựa chọn mô hình tiến hóa

Sau khi hoàn thành việc sắp xếp chuỗi, có thể tính được khoảng cách ditruyền giữa các trình tự khác nhau Khoảng cách di truyền giữa hai chuỗi tươngđồng được định nghĩa là số lượng thay thế được tích lũy giữa chúng kể từ khi chúngtiến hóa từ một tổ tiên chung Ước tính khoảng cách di truyền là quan trọng vìkhông phải tất cả các sự biến đổi đều có thể quan sát được, đặc biệt là trong nhữngchuỗi có 2 dạng biến đổi là đồng hoán và dị hoán Phân tích phát sinh gen dựa trên

sự lựa chọn chính xác mô hình tiến hóa, phổ biến nhất là:

Mô hình JC69 (Jukes và Cantor, 1969) [59]: Là mô hình thay thế đơn giảnnhất Nó giả sử xác suất đột biến một nucleotide là độc lập với vị trí của nucleotide

và chính nucleotide đó Nghĩa là tần số cơ bản và tỷ lệ đột biến của mỗi loạinucleotide (A, T, G, C) bằng nhau Do đó tham số duy nhất của mô hình này là tỷ lệthay thế tổng thể Tuy nhiên, JC69 không đủ để tính khoảng cách tiến hóa theo các

mô hình phức tạp hơn

Mô hình K80 (Kimura 1980) [61]: Thường được gọi là mô hình hai tham sốcủa Kimura (hoặc mô hình K2P), phân biệt giữa đồng hoán (A<=>G, tức là từpurine đến purine, hoặc C<=>T, tức là từ pyrimidine sang pyrimidine) và dị hoán(từ purine sang pyrimidine hoặc ngược lại) Trong mô tả ban đầu về mô hình, α và βđược sử dụng để biểu thị tốc độ của các loại thay thế này

Mô hình T92 (Tamura 1992) [91]: T92 là một phương pháp toán học đơngiản được phát triển để ước tính số lượng thay thế nucleotide trên mỗi vị trí giữa haichuỗi DNA, bằng cách mở rộng phương pháp hai tham số của Kimura (1980) cho

trường hợp tồn tại sự thiên về hàm lượng G+C Phương pháp này hữu ích khi có nhiều chuyển đổi đồng hoán, dị hoán và sự thiên về hàm lượng G+C.

Mô hình TN93 (Tamura và Nei 1993) [92]: Mô hình TN93 phân biệt giữa hailoại đồng hoán, nghĩa là (A <=> G) được phép có tỉ lệ khác với (C <=> T) Các dịhoán được giả định xảy ra ở tỷ lệ tương tự, nhưng tỷ lệ này được phép khác tỷ lệđồng hoán

1.3.4 Xây dựng cây phát sinh loài

Cây phát sinh loài (Phylogenetic tree) hay còn gọi là cây phả hệ hay câyphân loài được sử dụng để mô hình hóa lịch sử tiến hóa của một nhóm các trình tựhay các sinh vật Theo thuyết tiến hóa của Darwin, nhóm các loài với những đặctính khác nhau đều tiến hóa và hình thành từ một tổ tiên chung trong quá khứ Đốitượng nghiên cứu truyền thống của cây phân loài là biểu diễn mối quan hệ giữa cácloài Để xây dựng cây phát sinh loài, có một số phương pháp sau:

Phương pháp ma trận khoảng cách – Distance Matrix

Ma trận khoảng cách được tính toán dựa trên khoảng cách di truyền giữa cácchuỗi được phân loại bao gồm một nhóm các thuật toán Trên cơ sở khoảng cáchgiữa từng cặp trình tự (số nucleotide khác nhau giữa các trình tự), biểu diễn thànhdạng ma trận khoảng cách Trong đó, thuật toán lập nhóm không có trọng số dùngtrung bình số học (UPGMA - Unweighted PairGroup with Method using arthmeticAverages) [86] phân tích tất cả các dấu hiệu qua đó xác định khoảng cách di truyềngiữa tất cả các cặp trình tự, biểu diễn thành dạng ma trận khoảng cách (dạng đốixứng) rồi gộp từng cặp mẫu có khoảng cách di truyền giữa chúng là nhỏ nhất [8]

Phương pháp Neighbor – Joining

Phương pháp này tương tự phương pháp gom cụm Tuy nhiên, hai trình tựđược coi là hàng xóm trong một cây nếu như giữa chúng chỉ có duy nhất một nút.Phương pháp NJ tương đối nhanh nhưng nó chỉ tạo ra một cây và bỏ qua các câykhác có thể tốt hơn Hơn nữa, vì các lỗi ước tính khoảng cách theo cấp số nhân,trong một số điều kiện, phương pháp này sẽ tạo ra một cây thiên vị

Phương pháp tiết kiệm tối đa – Maximum Parsimony

Phương pháp này sẽ lựa chọn cây tiến hóa thỏa mãn điều kiện là số lượngđặc tính bị biến đổi phải thấp nhất để giải thích những dữ liệu đã quan sát được.Maximum Parsimony giả định rằng cây tiến hóa tốt nhất mô tả quá trình tiến hóa tốt

nhất là cây mô tả được các loài ít thay đổi nhất (ít đột biến nhất) nên cây có điểm thấp nhất.

Phương pháp khả năng xác suất: Hợp lý tối đa – Maximum Likelihood và phương pháp Bayes

Phương pháp này dựa trên một hàm toán học tính xác suất khả năng một câytiến hóa được tạo thành từ dữ liệu có sẵn Hàm này cho phép tích hợp qua trình tiếnhóa các đặc tính dưới dạng mô hình xác suất Cây phát sinh được xây dựng bởiphương pháp hợp lý tối đa là cây tiến hóa có khả năng xảy ra cao nhất (xác suất tạothành lớn nhất) Khác với Maximum Likelihood thì phương pháp Bayes không tìmđỉnh cao nhất (xác suất tối đa) mà tích hợp các thông số trong không gian dữ liệu

1.3.5 Đánh giá cây phát sinh loài

Sau khi xây dựng cây phát sinh loài, cần đánh giá cây và phương pháp đánhgiá phổ biến nhất hiện nay là Bootstrapping Phân tích bootstrap được thực hiệnnhằm kiểm tra độ chính xác và độ tin cậy cho từng nhánh trong cây tiến hóa Đầutiên, các vị trí từ các chuỗi trình tự đã sắp xếp thẳng hàng sẽ được đảo chỗ một cáchngẫu nhiên và được xây dựng cây Quá trình này được lặp lại một số lần nhất định(gọi là sự lặp lại bootstrap) để tính toán giá trị ủng hộ cho một nhánh Do giá trị ủng

hộ được biểu diễn bằng tỷ lệ % nên ít nhất phải có 100 lần lặp lại (thông thường

1000 lần lặp lại) Đối với mỗi nhánh được chỉ định một tỷ lệ xuất hiện trong các cây

và một nhánh có ý nghĩa nếu nó xuất hiện hơn 50% hoặc 70%

1.4 Tổng quan về loài Dây thường xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

1.4.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây thường xuân

* Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera

Hedera thường được gọi là cây thường xuân (ivy) là một chi gồm 16 loài

theo thông tin phân tích từ dữ liệu DNA lục lạp [15] Chi Hedera là đại diện dạng

dây leo duy nhất trong họ Nhân sâm (Araliaceae) Chi này có nguồn gốc ở miền tây,miền trung và miền nam châu Âu, Macaronesia, tây bắc châu Phi và khắp Đông Áđến Nhật Bản và Đài Loan

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)

Giới: Plantae (Thực vật)

Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Ngọc Lan; Hạt kín)

Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan; Hai lá mầm)

Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng)

Bộ: Apiales (Hoa tán)

Họ: Araliaceae (Nhân sâm)

Chi: Hedera Chi Hedera gồm những cây dạng dây leo mọc thành lớp bao phủ trên bề mặt.

Trên mặt đất, cây leo không quá 5-20 m, nhưng trên bề mặt thích hợp như mỏm đá,chúng có thể leo cao tới 30 m [32] Cây leo thường xanh có rễ móc kí sinh Lá đơnkhông có lá kèm, dài 5-10 cm, rộng 3-8 cm, phiến lá phân thùy, gân chân vịt, mọc

so le Cụm hoa chùy gồm nhiều tán có lông sao Hoa nhỏ, màu vàng xanh, trắngxanh, tràng 5, có một mào cuốn ở giữa, nhị 5, bầu 5 Quả màu xanh đen, tím đậmhoặc vàng (hiếm khi) chín vào cuối mùa đông đến giữa mùa xuân Quả hạch tròn cóđường kính 5-10 mm, dài 5-9 mm, khối lượng trung bình khoảng 281,5 mg, chứa từ1-5 quả [1, 45]

* Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis

Hình thái của H.nepalnensis K.Koch (Hình 1.2) được mô tả trong các tài liệu

nghiên cứu vẫn chưa có sự thống nhất, đặc biệt là hình dạng và màu quả khi chín

Cụ thể:

Trong “Cây cỏ Việt Nam” (2000): Dây thường xuân được mô tả là Dây bò

Lá không lông, hình thể hơi biến thiên, thon hình thoi, chóp nhọn, gân từ đáy 3, gânphụ 2-3 cặp, mặt trên oliu đậm, mặt dưới oliu nâu Phát hoa mang tán như hoa đầunhiều hoa, có lông sét Trái tròn, màu cam đỏ [7]

Trong “Danh lục thực vật Việt Nam” tập II (2003) có mô tả H nepalensis:

Dây bò dài tới 20 m, có nhiều rễ móc khí sinh ở các mắt, lá đơn; cụm hoa có lôngmàu đỏ nâu [1]

A B

E

F

Hình 1.2 Đặc điểm hình thái Dây thường xuân

A, B: Một đoạn Dây thường xuân; C: Cành mang

hoa;

D: Cành mang quả; E: Cụm hoa; F: Cụm quả

Theo cuốn “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” (2006), Dâythường xuân được mô tả là dây leo nhỏ, luôn xanh, mọc bám nhờ những rễ phụ mọc

từ các mấu Thân mềm nhẵn, màu lục nhạt hoặc nâu nhạt, có nốt sần Lá mọc so le,rất đa dạng, dài 5-10 cm ở cành có hoa; nhỏ và ngắn hơn ở cành bất thụ; phiến dài,nhẵn, không chia thùy, gốc hẹp; cuống lá mảnh Cụm hoa mọc ở đầu cành thành tántròn hoặc 2-6 tán dạng ngù, cuống có lông hình sao; hoa có cánh hình tam giác, mọccong xuống Quả mọng, hình cầu, đường kính 7,5 mm, màu vàng lục hoặc vàngcam, có thịt nạc Mùa hoa: tháng 10 [2]

Theo Võ Văn Chi (2012), Dây thường xuân là cây leo thường xanh có nhiều

rễ móc khí sinh, không có gai Lá đơn không có lá kèm, phiến lá phân thùy, dài 5-10

cm, rộng 3-8 cm; gân chân vịt Cụm hoa chùy, gồm nhiều tán, có lông sao Hoa nhỏ,màu vàng trắng và lục trắng, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa; nhị 5; bầu 5 Quảhạch tròn, khi chín màu đen [4]

1.4.2 Đặc điểm phân bố, sinh thái

Đặc điểm phân bố

Trên thế giới, H nepalensis K Koch được tìm thấy ở Nepal, Bhutan cũng

như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan, Myanmar và Việt Nam ở độcao khoảng 1000-3000 m [21] Tại Việt Nam, Dây thường xuân phân bố ở một sốvùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La (Mộc Châu), Hòa Bình, Hà Giang(Đồng Văn, Mèo Vạc), Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát), Cao Bằng, Lạng Sơn [1, 2 4, 7,

12, 13] (Hình 1.3).

Hình 1.3 Phân bố địa lý của Dây thường xuân ở miền Bắc Việt Nam

Đặc điểm sinh thái

H nepalensis phân bố ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới ấm ở châu Á, từ vùng

cận dãy Himalaya (Ấn Độ) qua Tây – Nam Trung Quốc xuống Bắc Việt Nam Dâythường xuân là loài thực vật ưa khí hậu ẩm ướt, hơi chịu bóng, mọc bám trên đá, rảirác trong rừng thưa, ở độ cao 100 – 1600 m [1, 2]

1.4.3 Thành phần hóa học

Nghiên cứu năm 2014 của Saleem S và cộng sự đã phát hiện hợp

chất triterpenoid lupeol trong H nepalensis [83] Ngoài lupeol, saponin được

chứng minh là hợp chất hóa học chủ yếu trong lá và thân của H.nepalensis K Koch.

Vào năm 2015, T Li và cộng sự đã tìm thấy hai hợp chất chính có tác dụng chống

ung thư trong Dây thường xuân là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và

pulsatilla saponin A bằng phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp quang phổ.Ngoài ra, Jafri và cộng sự đã báo cáo sự tồn tại của catechin và axit caffeic trong

phần ethyl acetate của H nepalensis và tìm thấy tỷ lệ đáng kể các hợp chất phenolic

có hoạt tính chống oxy hóa đầy hứa hẹn [56] Không những vậy, phân tích hóa thực

vật của H nepalensis cho thấy sự tồn tại của các alcaloid, terpenoid, steroid, tannin

và flavonoid [60]

1.4.4 Tác dụng dược lý

1.4.4.1 Theo y học cổ truyền

Dây thường xuân đã được sử dụng từ lâu đời trong y học cổ truyền để phòng

và chữa bệnh Ở mỗi quốc gia, Dây thường xuân có tên gọi khác nhau Ở Việt Nam,Dây thường xuân còn được gọi là Bách cước ngô công [2]; ở Ấn Độ là arambal,kuhru hay laglya; ở Trung Quốc là chang chung teng và ở Nepal là dudela [78]

Bộ phận dùng: lá, thân, rễ, quả tươi hoặc phơi khô

Về tính vị quy kinh: Dây thường xuân có vị đắng, tính mát thường có tácdụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng; quả vị ngọt, tính ấm đượcdùng để trừ phong huyết

Công dụng: Chữa đơn sưng: chế rượu với lá đã giã nhỏ, gạn lấy dịch uống,phần bã còn lại đắp vào chỗ sưng đau Khi gặp vấn đề về mụn lở thì lấy thân hoặc

rễ cây sắc hoặc ngâm với rượu uống Sắc hoặc ngâm rượu còn có công dụng chữahuyết bế trong bụng, giúp giảm các triệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già [2]

Ở Ấn Độ, Nepal lá cây còn có thể dùng làm thuốc chườm nóng trị sưng hạch,quả dùng hãm uống có tác dụng trị thấp khớp [3] Bột nhão khô dùng chống vẩynến; bột cành lá khô trộn với lòng đỏ trứng gà được bôi chống sưng và viêm cơ ỞTrung Quốc, nước sắc lá được dùng để chữa bệnh ngoài da [78] Ở Pakistan, loạicây này được sử dụng theo truyền thống để chống ung thư, tiểu đường và làm thuốctẩy [39, 79].

1.4.4.2 Theo y học hiện đại

H nepalensis K Koch là một trong những cây có nhiều lợi ích nhất để điều

trị các bệnh khác nhau Các nhà khoa học cho rằng H nepalensis có nhiều tiềm

năng để phát triển thành thuốc Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu chứng minh

các tác dụng dược lý của H nepalensis (chi tiết trình bày trong Bảng 1.2).

Bảng 1.2: Các tác dụng dược lý của H nepalensis

STT Tác dụng Nơi thu

mẫu Dạng phân tích TLTK

chống đái tháo đường

Pakistan Dịch chiết thô của H nepalensis và

hợp chất lupeol được phân lập từ nó

[40]

Pakistan Chiết xuất thô của H nepalensis [83]

chống oxy hóa

Pakistan Rutin ở chiết xuất methanol và chiết

xuất thô của H nepalensis

[51,

60]

chống ung thư

Pakistan Chiết xuất thô và các phần phân đoạn

(n-hexan và ethyl acetate)

Pakistan Dịch chiết thô của H nepalensis và

hợp chất lupeol được phân lập từ nó

[40]

chống trầm cảm

Pakistan Chiết xuất thô của H nepalensis [53]

chống đông máu

Pakistan Chiết xuất thô của H nepalensis [53]

9 Hoạt tính

kháng nấm

TrungQuốc

Các thành phần dễ bay hơi trong chiết

xuất thô của H nepalensis

[70]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

43 mẫu lá Dây thường xuân, trong đó 41 mẫu được thu thập từ các tỉnh miềnnúi phía Bắc: Lào Cai, Hà Giang, Lai Châu, Lạng Sơn; 01 mẫu được thu thập ởLâm Đồng; 01 mẫu được thu thập từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc doKhoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu cung cấp

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quảntrong túi silicagel chống ẩm Các mẫu lá nhận về phòng thí nghiệm được nghiềnmịn trong nitơ lỏng, bảo quản trong các ống eppendorf 1,5 mL ở -30 ºC đến khi

được sử dụng Thông tin chi tiết 43 mẫu được trình bày trong Bảng 2.1.

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

Kí hiệu Địa điểm lấy mẫu Toạ độ địa lý

HH** Vườn TV Hoa Nam, Trung Quốc 23°11'12"N - 113°21'51"E

H30* Xín Mần, Hà Giang 22°39'01.08"N - 104°35'31.20"E

H48** Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

H52** Đà Lạt, Lâm Đồng 11°56'11.56"N; 108°27'28.12"E

Nhận dạng hình thái: *Hedera nepalensis; ** Hedera helix

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ ngày 15/6/2018 – 25/11/2019

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

Hóa chất để tách chiết DNA tổng số: Bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific, Mỹ)

Hóa chất thực hiện kỹ thuật PCR: dNTP mix (Thermo Scientific), PhusionPolymerase (Thermo Scientific), cặp mồi 390F/1326R [29] đặt tổng hợp từ công tyPhusa Biochem (Việt Nam), có trình tự như sau:

Mồi xuôi 390F: 5’ CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C 3’

Mồi ngược 1326R: 5’ TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T

3’

Hóa chất điện di: Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA,Affymetrix), 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder(Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific), Tris base(Bio basic), acid acetic (Merck)

2.3.2 Trang thiết bị

Các trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm được tiến hành trong Phòng thínghiệm của bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.Bao gồm: Cân phân tích, Bể ổn nhiệt, Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệthống điện di (Cleaver Scientific Ltd, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler,Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO, Singapore), Máy li tâm EBA 21 (HettichZentrifugen, Đức), Máy lắc VELP (Scientifica, Đức), Máy quang phổ NP80(Nanophotometer, Đức), Máy làm đá vảy (Fiocchetti, Ý), Tủ ấm (Panasonic, NhậtBản), Tủ lạnh sâu -30oC (Panasonic, Nhật Bản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1.