KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược học FULL (dược LIỆU và dược cổ TRUYỀN) lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen

Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắclực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phươngpháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC 

LỰA CHỌN QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN TÍCH ĐA DẠNG

DI TRUYỀN NGUỒN GEN DÂY THƯỜNG XUÂN

(HEDERA NEPALENSIS K.KOCH) Ở VIỆT NAM

DỰA TRÊN CHỈ THỊ GBSSI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu cả

về vật chất lẫn tinh thần, về những kinh nghiệm và kiến thức chuyên môn của cácthầy cô, bạn bè và gia đình Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơnsâu sắc tới PGS.TS Đinh Đoàn Long và ThS Phạm Thị Hồng Nhung – Giảng viênkhoa Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, những người tận tình chỉ bảo giúp tôithực hiện đề tài khóa luận, tôi xin cảm ơn ThS Đỗ Thị Lệ Hằng đã hướng dẫn vàgiúp đỡ tôi về kỹ năng thực hành thí nghiệm Các thầy, cô không chỉ trang bị cho tôikiến thức, mà còn truyền cho tôi niềm đam mê, lòng nhiệt huyết với nghề và luônsẵn sàng giúp đỡ mỗi khi tôi gặp khó khăn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Bộ môn Y dược học cơ sở đã hếtlòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu vàhoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin cảm ơn những cán bộ tại Viện dược liệu (Bộ Y Tế) đã khôngquản ngại khó khăn thu thập và cung cấp mẫu vật giúp đỡ tôi thực hiện đề tài mộtcách thuận lợi nhất

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, cùng toàn thể các thầy côgiáo Khoa Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báutrong quá trình học tập tại nhà trường

Chúng tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ kinh phí của Bộ Khoa học và Côngnghệ Việt Nam cho đề tài mã số NVQG-2018/02 do PGS.TS Đinh Đoàn Long chủtrì để thực hiện nghiên cứu này

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn và sự yêu thương đến gia đình,người thân và bạn bè, những người đã luôn ở bên cổ vũ, động viên và tạo mọi điềukiện giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện đề tài khóa luận này

Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm

2019

Tác giả

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

GBSSI Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-Bound Starch

Synthase)

H.nepalensis Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

H.helix Hedera helix L.

Mini CTAB Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984

CTAB cải tiến Elias và cộng sự, 2004

Kit Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức)

Kit Thermo GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini Kit

(Thermo Scientific, Mỹ) PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

DNA Axit deoxyribo Nucleic (Deoxyribonucleic acid)

dNTP Deoxyribonucleotit 5’ triphosphate

ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal transcribed spacer)

Genbank Ngân hàng dữ liệu gen quốc tế

bp Cặp bazơ (base pair)

OD Mật độ quang học (Optical Density)

NCBI Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia (National

Center for Biotechnology Information)

DANH MỤC CÁC

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.1 Nồng độ DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu 26

Bảng 3.2 Chỉ số OD260/280 của các mẫu nghiên cứu 27

Bảng 3.3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR 29

Bảng 3.4 Các trình tự tham chiếu được sử dụng trong nghiên cứu 31

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền và số lượng nucleotit sai khác giữa trình tự GBSSI của 9 mẫu nghiên cứu với H.nepalensis, H.sinensis và H.helix 34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae 8

Hình 1.2 Hình ảnh cho mẫu lá Dây Thường Xuân 9

Hình 1.3 Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam 9

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A 10

Hình 1.7 Giải trình tự theo phương pháp Sanger 15

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20

Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA theo bộ kit 22

Hình 2.3 Nguyên lí hoạt động màng silica 22

Hình 2.4 Kết quả giải trình tự một đoạn gen trên phần mềm Bioedit 24

Hình 3.1 Kết quả DNA tổng điện di trên gel agarose 1,2% 25

Hình 3.2 Tối ưu nhiệt độ gắn mồi gen GBSSI 28

Hình 3.3 Tối ưu nồng độ DNA gen GBSSI 28

Hình 3.4 Tối ưu nồng độ mồi gen GBSSI 28

Hình 3.5 Kết quả PCR nhân dòng gen GBSSI trên gel agarose 1,5% 30

Hình 3.6 So sánh trình tự vùng GBSSI của H.nepalensis với các loài có quan hệ gần gũi thuộc chi Hedera 32

Hình 3.7 Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Likelihood 35

Hình 3.8 Cây quan hệ phát sinh theo phương pháp Maximum Parsimony 35

MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đa dạng di truyền 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Phân loại học sinh vật 3

1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam 4

1.1.4 Mã vạch DNA 5

1.1.5 Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt 7

1.2 Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) 8

1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân 8

1.2.2 Đặc điểm phân bố địa lý 9

1.2.3 Thành phần hóa học 10

1.2.4 Tác dụng dược lý 10

1.3 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 13

1.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 13

1.3.2 Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR 14

1.3.3 Giải trình tự gen 15

1.3.4 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng 18

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu 18

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 19

2.4.2 Khuếch đại đoạn gen đích bằng kỹ thuật PCR 23

2.4.3 Tinh sạch và giải trình tự 24

2.4.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại phân tích sự đa dạng di truyền của

nguồn gen 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 Tách chiết DNA tổng số 25

3.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình nhân dòng đoạn gen GBSSI bằng kỹ thuật PCR27 3.2.1 Tối ưu quy trình PCR 27

3.2.2 So sánh khả năng nhân dòng đoạn gen GBSSI của 4 quy trình 29

3.3 Độ tương đồng của trình tự gen GBSSI được khuếch đại 31

3.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên chỉ thị GBSSI 34

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật thuộc họ Nhân sâm

(Araliaceae), được ghi nhận tổng cộng có 16 loài với đặc điểm hình thái chung dạng

dây leo Loài Dây Thường Xuân có tên khoa học là Hedera nepalensis K.Koch

được báo cáo xuất hiện tại một số vùng núi cao Việt Nam, chứa hai hợp chất chính

có tác dụng chống ung thư là hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla

saponin A [36] Ngoài ra, H.nepalensis đã được nghiên cứu về tác dụng dược lý, cụ

thể có khả năng chống lại một số bệnh như: đái tháo đường, oxy hóa, nhiễm khuẩn,ung thư, [27, 50] Với tiềm năng như vậy, song đến nay các nghiên cứu về

H.nepalensis tương đối ít Chưa có nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền nguồn

gen Dây Thường Xuân ở Việt Nam nào được tiến hành, trong khi nhu cầu phát triểnthuốc có nguồn gốc dược liệu trên thế giới và ở Việt Nam nói chung đang ngày mộttăng cao

Công tác thu thập, bảo tồn, đánh giá mức độ đa dạng di truyền nguồn gencây trồng là bước nghiên cứu quan trọng quyết định tới thành công trong chọn tạogiống Những hiểu biết đầy đủ về sự đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể củanguồn gen Dây Thường Xuân thực sự cần thiết trong công tác bảo tồn và phát triểnnguồn dược liệu quý Sự nghèo nàn trong mô tả đánh giá nguồn gen là cản trở chínhtrong công tác chọn tạo giống Hiện nay, những tiến bộ di truyền phân tử hỗ trợ đắclực cho công tác đánh giá tính đa dạng di truyền nguồn gen dược liệu, nhiều phươngpháp phân tích đã được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: giảitrình tự, RFLP, RAPD để phân tích minisatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể,

hệ gen nhân,…[12]

Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule-bound starch synthase, GBSSI)

là chỉ thị DNA đã được sử dụng thành công để xây dựng cây phát sinh chủng loại

của họ Araliaceae ở châu Á [39] Nhưng chỉ thị GBSSI có phải là chỉ thị tốt để đánh

giá đa dạng di truyền loài Dây Thường Xuân Việt Nam là một câu hỏi chưa có lờigiải Để có thêm thông tin di truyền của loài này, bước đầu tiên và cũng rất quan

trọng là tách chiết được DNA tổng số từ tế bào một cách hiệu quả Có nhiều phươngpháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu thực vật được công bố nhưng chưa có nghiêncứu nào đánh giá được phương pháp nào là hiệu quả nhất đối với mẫu lá khô DâyThường Xuân Vì vậy, vấn đề đặt ra hiện nay là cần nghiên cứu được quy trình táchchiết DNA tổng số cho sản phẩm có chất lượng tốt làm nguyên liệu cho phản ứngPCR, cung cấp những thông tin và hiện trạng di truyền của loài này góp phần vàochiến lược bảo tồn, khai thác bền vững nguồn dược liệu Xuất phát từ ý nghĩa thực

tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Lựa chọn quy trình tách chiết DNA tổng số

và bước đầu phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch) ở Việt Nam dựa trên chỉ thị GBSSI” với 2 mục tiêu như sau:

1 Xác định được quy trình tách chiết DNA tổng số có hiệu quả từ mẫu lákhô của loài Dây Thường Xuân

2 Dựa vào giải trình tự gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI để bước

đầu xác định được tính đa dạng di truyền của nguồn gen Dây ThườngXuân thu nhập tại các tỉnh vùng núi phía Bắc Việt Nam nhằm phục vụcho việc khai thác, quản lý bền vững nguồn cây dược liệu

Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loàithực vật, động vật và vi sinh vật, là sự giàu có về nguyên liệu di truyền trong cácloài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường Dovậy, đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp độ: đa dạng gen, đa dạng loài và đa dạng hệ

Đa dạng di truyền là đa dạng ở cấp độ phân tử, đề cập đến sự biến đổi cácđặc điểm di truyền giữa các cá thể trong loài và cả trong quần thể Mỗi loài có chứanhững gen riêng biệt thể hiện đặc tính riêng của nó như một cách để các quần thể cóthể thích nghi được với môi trường sống thay đổi Với các áp lực như: chọn lọcnhân tạo, môi trường sống khắc nhiệt,… một số cá thể trong một quần thể sẽ có cơhội cao hơn trong việc sở hữu những biến dị phù hợp với môi trường giúp duytrì nòi giống có alen đó trong cơ thể Quần thể đó sẽ tiếp tục có thêm nhiều thế hệnhờ sự thành công của những cá thể này

vi một loài hay giữa các loài và các hệ sinh thái với nhau thì cũng đều xuất phát từ

vẫn chưa được quan tâm đúng mức mặc dù các loại đa dạng này chính là nền tảngcho sự đa dạng của sinh giới []

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.2 Phân loại học sinh vật

Phân loại học sinh vật là sự sắp xếp các sinh vật theo các đơn vị phân loại(taxon) phù hợp dựa trên những đặc điểm giống nhau của chúng Đồng thời, hệthống phân loại có thể giúp dự đoán được vị trí của sinh vật trong hệ thống phânloại, giúp ta hiểu rõ được quá trình tiến hóa của sinh vật Một ý nghĩa thực tiễn quantrọng khác là nhờ có hệ thống phân loại với hệ thống danh pháp khoa học đặt chosinh vật đã giúp tránh được nhầm lẫn vì nhiều sinh vật mang tên dân gian, được gọitên khác nhau ở các vùng đất khác nhau [11]

Việt Nam xếp thứ 16 về mức độ đa dạng sinh học, được biết đến như một trung tâm đa dạng sinh học của thế giới với các hệ sinh thái tự nhiên phong phú và

Có nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau trong phân loại và xác định

loài ở động, thực vật và hầu hết các phương pháp này đều dựa trên nguyên tắc như

những loài có chung nguồn gốc, có những tính chất giống nhau, càng gần nhau thì

tính chất giống nhau càng nhiều Sự giống nhau có thể về đặc điểm hình thái, giải

phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học Đối với thực vật, đặc điểm hình thái học của

các loài thực vật qua nhận biết hình thái lá, hoa, quả, cách thức phân cành…có ưu

điểm dễ quan sát trực tiếp bằng trực quan, nhưng chỉ dựa vào thống kê phân tích

một hoặc nhiều tính trạng được thể hiện ra bên ngoài nên hiệu quả thấp Điều này

thật sự gặp nhiều khó khăn khi các mẫu vật cần giám định không còn nguyên vẹn,

mất hình thái bên ngoài Do vậy, việc định danh dựa trên quan sát hình thái và kinh

nghiệm dân gian sẽ được hỗ trợ chính xác hơn nếu sử dụng các kỹ thuật sinh học

phân tử hiện đại

Việc ứng dụng sinh học phân tử trong phân loại học là một phương pháp

mới: giúp xác định các loài dựa trên trình tự DNA nucleotit của một đoạn gen đặc

trưng được coi như dấu hiệu đặc trưng cho loài Phương pháp này đặc biệt có ích

trong trường hợp giải quyết các vấn đề về loài đồng hình hay nghiên cứu các biến

dị Các dữ liệu về trình tự DNA nucleotit của các loài được tạo thành hệ thống dữ

liệu mã vạch DNA

Phân loại học phân tử có thể dựa trên sự nghiên cứu các gen trong hệ gen

nhân, hệ gen của các bào quan như ty thể, lục lạp hoặc các sản phẩm của gen như

protein, enzym Mỗi loại gen, sản phẩm của gen lại phù hợp với từng đối tượng và

mục đích nghiên cứu khác nhau Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm: kỹ

thuật isozym (đồng enzym), giải trình tự DNA, đa hình chiều dài các đoạn cắt giới

hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism), đa hình các đoạn DNA nhân bản

ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA), đa hình chiều dài các đoạn

DNA được nhân bản (Amplified Fragment Length Polymorphism),…[12] đã giúp

giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di

truyền, quan hệ chủng loại và tiến hoá của nhiều loài động, thực vật và vi sinh vật

Thêm vào đó các kỹ thuật này cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác

định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến tính trạng nào đó của các cá thể,

loài hay các nhóm loài

1.1.3 Thực trạng đa dạng sinh học tại Việt Nam

đa dạng Trong đó, đã xác định được khoảng 49.200 loài sinh vật bao gồm: khoảng

7.500 chủng vi sinh vật; 20.000 loài thực vật trên cạn và dưới nước; 10.500 loài động vật trên cạn; 2.000 loài động vật không xương sống và cá sống ở nước ngọt; khoảng trên 11.000 loài sinh vật biển Đặc biệt, một bộ phận lớn của các giống thực vật, động vật này có các đặc tính quý chỉ có ở nước ta, nên tiềm năng phát triển và đem lại giá trị kinh tế rất cao [].Với số lượng 500 loài nguồn gen dược liệu, sở hữu nhiều loài dược liệu quý, hiếm và là nơi có nguồn đa dạng sinh học phong phú, nhưng những sản phẩm từ

tại một số tỉnh miền núi phía Bắc) và H.helix (Thường Xuân) được chứng minh là

lý song hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về H.nepalensis, đặc biệt là các nghiên cứu đánh giá tiềm năng đa dạng sinh học phục vụ công tác bảo tồn, khai thác và phát triển nguồn gen ở Việt Nam Chưa kể đến, việc phân loại và định danh Dây Thường Xuân dựa vào đặc điểm hình thái có thể dễ gây nhầm lẫn do đặc điểm xẻ

góp phần giải quyết nhu cầu khai thác hiệu quả và quản lý bền vững nguồn tài nguyên dược liệu

Mã vạch DNA là một khái niệm tương đối mới nhằm cung cấp nhận dạng

loài nhanh chóng, chính xác và tự động hóa, bằng cách sử dụng đoạn DNA ngắn

trong phân loại học và trong các ngành khoa học khác như là khoa học pháp y, công

nghệ sinh học, công nghiệp thực phẩm,…giúp cung cấp cái nhìn sâu hơn để nhận

diện, phân định ranh giới giữa các loài và góp phần nhận diện các mẫu vật chưa xác

định được thuộc loài nào []

Ước tính có khoảng 300.000 loài thực vật trên thế giới, việc phân loại và xác

định chính xác một số lượng lớn các loài như vậy vẫn đang còn là một thách thức

dược liệu quý của nước ta chưa trở thành hàng hóa có giá trị cao và chưa được sử

dụng rộng rãi trong cộng đồng Điển hình trong số đó là chi Hedera, phân bố trên

thế giới trên 16 loài nhưng chỉ có 2 loài H.nepalensis (Dây Thường Xuân, xuất hiện

có tác dụng dược lý trong phòng và điều trị bệnh Mặc dù có những tiềm năng dược

thùy của lá cây (phần hay được thu hái làm thuốc) có mức độ phân hóa lớn Vậy

nên, phân tích đa dạng di truyền và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về nguồn gen

1.1.4 Mã vạch DNA

của hệ gen như một mã vạch đặc trưng để nhận diện Mã vạch DNA có tiềm năng

ngay cả với các chuyên gia phân loại Hơn nữa, phân loại từng loài dựa trên chỉ thị

truyền thống (chỉ thị hình thái, giải phẫu) mất rất nhiều thời gian và công sức, lại

chỉ phù hợp ở từng giai đoạn sống, giới tính cụ thể của loài, nhiều cá thể sẽ không

loại học giúp đáp ứng tốt những hạn chế của phương pháp truyền thống trước kia vànhận định được Sự xuất hiện của mã vạch DNA đã có tác động tích cực đến phân

ngày càng trở nên phổ biến, có ý nghĩa trên quy mô toàn cầu [28]

Đặc điểm quan trọng nhất của mã vạch DNA là tính đặc hiệu cao dễ sử dụng.Một mã vạch DNA lý tưởng cần đáp ứng các tiêu chí sau: Một là, nó phải đủ độ độtbiến phân biệt giữa các loài khác nhau và phải có vùng bảo tồn để nhận diện đượcgiữa những cá thể thuộc cùng một loài [34,15] Hai là, phổ biến trong các loài để cóthể được sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau Ba là, đoạn DNA đủ ngắn(khoảng 700 bp hoặc nhỏ hơn [19]) chứa đủ thông tin phát sinh gen để dễ dàng địnhdanh các loài cho nhóm phân loại của nó một cách nhanh chóng Cuối cùng, các vịtrí mồi được bảo tồn cao, khuếch đại và giải trình tự DNA có độ tin cậy cao

Năm 2004, hiệp hội mã vạch cho cuộc sống (barcode of life) được thành lậpnhằm mục đích xác định một công cụ mã vạch chính xác, đáng tin cậy cho nghiêncứu về phân loại thực vật và động vật Năm 2006, Hebert và các cộng sự của ông đã

đề xuất sử dụng gen ti thể cytochrom oxyase tiểu đơn vị 1 (CO1) như là một trình tự

mã vạch chung cho động vật Và kể từ đó, đã có hàng loạt ấn phẩm minh chứng sựhữu ích của nó trong phân loại các loài động vật [32] CO1 không chỉ chứa vùngtrình tự được bảo tồn cao trong một loài mà còn chứa đủ biến dị phục vụ nghiên cứuphân biệt giữa các nhóm riêng biệt trong một loài Ghi nhận về CO1 còn cho biếtkhả năng phân biệt nhiều mẫu động vật cùng tổ tiên và thậm chí có hiệu suất caongay cả với những mẫu đã lưu trữ qua thời gian dài

Đối với mã vạch DNA ở thực vật, gen lục lạp được xem là mã vạch có độ tincậy cao trong xác định các loài thực vật do sự biến đổi rất chậm của hệ gen ty thể

Có một số mã vạch thường được sử dụng cho thực vật như: matK, RbcL,

TrnH-psbA Gen matK có tốc độ tiến hóa cao, chiều dài phù hợp và sự khác biệt rõ ràng

giữa các vùng cũng như tỷ lệ chuyển đổi thấp [31] Tuy nhiên, để thực hiện phản

ứng PCR khuếch đại gen matK thì sử dụng một cặp mồi đơn thường không đem lại

hiệu quả cao Các loài khác nhau yêu cầu cặp mồi khác nhau, hiệu suất nhân dòng

các loài cũng khác nhau Gen matK có thể phân biệt được >90% trong các loài phong lan, tuy nhiên lại chưa đến 49% trong họ hạt nhục đậu khấu [47] Gen rbcL

được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phát sinh gen với hơn 50.000 trình tự

có sẵn trong Genbank Những lợi thế của gen này là dễ dàng khuếch đại trình tự và

là một mã vạch DNA tốt trong phân loại thực vật ở cấp độ gia đình và chi, nhưng lại

không hiệu quả ở cấp độ loài [19] trnH-psbA hiện đang là mã vạch được sử dụng

phổ biến, với những ưu điểm như thiết kề mồi đơn giản, chỉ sử dụng một cặp mồiđơn để khuếch đại gen, nằm giữa 2 vùng trình tự bảo tồn cao là đoạn trình tự không

mã hóa có tỷ lệ biến đổi cao [33] Tuy nhiên độ dài chuỗi trình tự TrnH-psbA ngắn

trong chi Solidago có thể là nhược điểm của mã vạch này khi không cung cấp đủbiến dị cho phân tích phân loại Đối với thực vật, quá trình tìm kiếm một chỉ thịDNA chung cho các loài gặp nhiều khó khăn Hệ gen ty thể ở thực vật thường quábảo thủ nên không được dùng cho chỉ thị DNA, trong khi đó hệ gen lục lạp lại mangnhiều đặc điểm mong muốn đối với chỉ thị DNA như ở hệ gen ty thể ở động vật Ở

hệ gen nhân, vùng DNA nằm giữa các gen hay còn gọi vùng sao chép nội bộ

(Internal Transcribed Spacer, ITS) và vùng gen nhân có số lượng bản sao thấp như gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt GBSSI cũng được sử dụng trong việc phân loại

thực vật và cho hiệu quả cao Hiện nay hệ thống mã vạch DNA cho thực vật vẫnchưa hoàn chỉnh Tuy nhiên, với các trình tự mã vạch DNA này, các nhà khoa học

đã có những nghiên cứu, ứng dụng đầy hứa hẹn cho xác định loài ở thực vật, mở ramột triển vọng mới cho cho công tác đánh giá, phân loại và bảo tồn đa dạng sinhhọc [5]

1.1.5 Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt

Quan tâm đến việc sử dụng các gen nhân có số lượng bản sao thấp để phântích phát sinh thực vật đã phát triển nhanh chóng, đặc biệt khi mà các chỉ thị phổbiến như DNA lục lạp và DNA ribosom không thể tạo ra các giả thuyết phát sinhgen mạnh Gen mã hóa enzym tạo liên kết hạt (Granule Bound Starch Synthase I,

GBSSI), hay gen waxy chỉ có một bản sao duy nhất trong tế bào Những đoạn exon

của GBSSI có tốc độ thay thế nucleotit tương đối chậm nên có vai trò là vùng bảo

tồn, trong khi đó những đoạn không được mã hóa inton lại có tỷ lệ thay thế nucleotitkhá cao cung cấp các dấu hiệu phát sinh gen ở các bậc phân loại [45]

Hiện tại, dữ liệu về gen GBSSI vẫn chưa được hiểu đầy đủ, và còn cần nghiên cứu thêm GBSSI là một chỉ thị còn mới trong nghiên cứu phân tử để nghiên

cứu phát sinh loài với kích thước gen khoảng 4 kb, bao gồm 13 intron trongSolanum tuberosum và có khả năng là một nguồn thông tin hữu ích về thực vật học[39, 21]

Vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân loại thực vật như sau:

Lớp Ngọc lan Magnoliopsida

Phân lớp Hoa hồng Rosidae

Bộ Hoa tán Apiales

Chi Hedera

Họ Nhân sâm Araliaceae

Hình 1.1 Cấu trúc một phần trình tự gen GBSSI cho Araliaceae Mũi tên chỉ vị

trí cặp mồi nhân dòng [39]

1.2 Tổng quan về loài Dây Thường Xuân (Hedera nepalensis K.Koch)

1.2.1 Đặc điểm hình thái chung của loài Dây Thường Xuân

* Đặc điểm hình thái chung của chi Hedera

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

Cho đến ngày nay, chi Hedera đã ghi nhận tổng cộng 16 loài với đặc điểm

hình thái chung dây leo, mọc thành một lớp bao phủ mặt đất với chiều cao từ

6-10 cm, có thể leo cao tới 30 m [20] Hedera có thể leo được là nhờ hệ thống rễ

mọc ký sinh có thể tạo ra chất bám dính Lá cây thuộc loại lá đơn, không có lá kèm,phiến lá phân thùy, dài 5-10 cm, rộng 3-8 cm, gân chân vịt Cụm hoa chùy, gồmnhiều tán, có lông sao Hoa nhỏ, màu vàng trắng và lục trắng, lá bắc rất nhỏ, dài có

5 răng nhỏ, tràng 5, gốc rộng, có một mào cuốn ở giữa, nhị 5, bầu 5 Quả hạch tròn,mọng dài từ 5-9 mm, đường kính 6-9 mm, trọng lượng trung bình khoảng 281,5 mg,trái của nó chứa từ 2-5 hạt, quả khi chín có màu đen [1, 17]

* Đặc điểm hình thái loài Hedera nepalensis

H.nepalnensis K.Koch là loài có dây leo có thể dài tới 20 m, có nhiều rễ mọc

ký sinh ở các mắt, lá đơn, cụm hoa mọc dấu ở cành thành tán tròn hoặc tán ngù,mọc rải rác trong rừng thưa; phổ biến ở độ cao 1000-3000 m [3]

Hedera nepalensis K Koch thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae), có nguồn gốc

từ Nepal, Bhutan cũng như ở Trung Quốc, Afganistan, Ấn Độ, Lào, Thái Lan,Myanmar và Việt Nam ở độ cao khoảng 1000-3000 m [] Tại Việt Nam DâyThường Xuân được tìm thấy ở một số vùng núi cao phía Bắc như Lai Châu, Sơn La,

Hòa Bình, Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn Hình 1.3 [].

Hình 1.2 Cây Dây Thường Xuân [53]

1.2.2 Đặc điểm phân bố địa lý

Hình 1.3 Phân bố địa lý của Dây Thường Xuân tại phía Bắc Việt Nam [2]

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới, thành phần hóa học chủ yếu trong lá vàthân của H.nepalensis K Koch là saponin Trong đó, hai hợp chất chính có tác dụng

được T Li và cộng sự phân lập bằng phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp

tích hóa sinh đã chứng minh trong Dây Thường Xuân còn có chứa các nhóm chấtkhác như: carbohydrate, protein, alkaloid, tanin, terpenoid và các hợp chất

1.2.4 Tác dụng dược lý

1.2.3 Thành phần hóa học

chống ung thư hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và pulsatilla saponin A đã

quang phổ vào năm 2015 [36] Ngoài ra, các hợp chất phenolic và phenolic có khả

năng chống oxy hóa cũng được phát hiện trong H.nepalensis khi định tính bằng

phương pháp so màu với quercetin và axit gallic Để định lượng các hợp chất trênphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được sử dụng Hai hợp chất catechin và

caffeic cũng được tìm thấy trong phân đoạn etyl acetate của H.nepalensis Các phân

phytosterol [22, 41, 30, 42]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của hederagenin 3-O-α-L-arabinopyranoside và

pulsatilla saponin A [26]

1.2.4.1 Theo y học cổ truyền

Bộ phận dùng: rễ, thân, lá và quả tươi hoặc phơi khô

Về tính vị quy kinh: Dây Thường Xuân có vị đắng, tính mát thường có tácdụng trong khu phong, giải độc, hoạt huyết, tiêu sưng; quả vị ngọt, tính ấm đượcdùng để trừ phong huyết

Công dụng: Chữa đơn sưng: chế rượu với lá thường xuân giã nhỏ, gạn lấydịch uống, phần bã còn lại được đắp vào chỗ sưng đau Khi gặp vấn đề về mụn lở

thuốc chườm nóng trị sưng hạch, quả dùng hãm uống tác dụng trị thấp khớp [].

nồng độ glucose đo bằng máy đo đường huyết, sau đó so sánh các thông số giữa

thì lấy thân hoặc rễ cây sắc thuốc hoặc ngâm với rượu uống Sắc hoặc ngâm rượuvới quả Dây Thường Xuân có công dụng chữa huyết bế trong bụng, giúp giảm cáctriệu chứng đau lưng, mỏi gối ở người già [2] Ở Ấn Độ, lá cây còn có thể dùng làm

1.2.4.2 Theo y học hiện đại

Tác dụng chống đái tháo đường:

Một nghiên cứu đã được thực hiện trên chuột mắc bệnh tiểu đường nhằm

đánh giá hiệu quả của dịch chiết thô H.nepalensis Hiệu quả được đánh giá dựa trên

chuột được điều trị và không được điều trị Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra

H.nepalensis làm giảm đáng kể mức đường huyết theo thời gian và làm phục hồi

chức năng gan [26] Nghiên cứu khác cũng chỉ ra H.nepalensis chứa các hợp chất tự

nhiên với hoạt tính ức chế dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) Một trong số cơ chế củathuốc chống đái tháo đường hiện nay dựa trên nguyên lý ức chế DPP-4, đây là mộtenzym phá hủy incretins Incretins là hóc-môn tự nhiên do cơ thể tiết ra lượng lớnsau bữa ăn, với vai trò điều chỉnh lượng đường huyết thông qua kích thích tuyến tụytiết insulin Khi ức chế enzym DPP-4 sẽ làm tăng nồng độ và kéo dài thời gian tácdụng của incretins, làm tăng tiết insulin và giảm tiết glucagon trong tuần hoàn, dẫn

đến giảm glucose máu Do đó, H.nepalensis được đánh giá có tiềm năng trong điều

trị đái tháo đường [44]

Tác dụng chống oxy hóa:

Nghiên cứu của Samia Inayatullah và cộng sự về tiềm năng chống oxy hóa

của dịch chiết methanol H.nepalensis thử nghiệm trong môi trường nước và lipid.

Khả năng chống oxy hóa đã được nghiên cứu trong nước bằng cách sử dụng xétnghiệm quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và gốc ABTS (2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) Trong khi hoạt tính chống oxy hóatrong lipid được xác định bằng đánh giá chỉ số ôi hóa (TBARS - ThiobarbituricAcid Reactive Substances) Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơchế diệt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch có chứa nồng độ chất tự do xácđịnh Sau đó, khả năng chống oxy hóa xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang ởbước sóng thích hợp Nghiên cứu đưa ra kết quả hàm lượng gốc DPPH là 26,7 ± 0,2(mM TE/g); ABTS là 54,7 ± 1,6 (mmol TE/g); TBARS là 393 ± 3,4 (mmol TE/g).Trong đó, mM TE/g là µmol đương lượng chất chuẩn Trolox (Trolox Equivalent -

TE) trên 1 g chất khô Hai hợp chất chính trong dịch chiết thô của H.nepalensis có

chất có khả năng chống oxy hóa là axit chlorogen và rutin [36]

Nghiên cứu khám phá các chất chống oxy hóa tự nhiên bao gồm nghiên cứu

các hợp chất polyphenolic và khả năng chống oxy hóa của H.nepalensis cũng đã

được thực hiện Nguyên liệu sử dụng là dịch chiết thô và các dịch chiết phân đoạncủa nó thu trong dung môi: n-hexan, ethyl acetate và nước Tổng hàm lượngflavonoid và phenolic được định tính bằng phương pháp so màu sử dụng quercetin

và axit gallic Sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC-DAD) để phát hiện cáchợp chất flavonoid Theo đó, hàm lượng flavonoid là 2,4 ± 0,164 QE /100 mg(đương lượng quercetintrên mỗi gram dịch chiết) và hàm lượng phenolic là 12,90 ±0,15 mg GAE/100 mg (GAE/g - đương lượng acid galic trên mỗi gram dịch chiết).Tác dụng chống oxy hóa được đánh giá bằng khả năng dọn sạch nhóm hydroperoxide (H2O2) Các chiết suất thô cũng như phân đoạn của H.nepalensis cho thấy

khả năng chống oxy hóa cao với chỉ số IC50 từ 31,19 đến 200 µg/mL Trong đó,dịch chiết ethyl acetate được cho là có khả năng chống oxy hóa cao nhất, dịch chiếtn-hexan thấp hơn và sau cùng là dịch chiết với nước [35]

Tác dụng chống ung thư:

Laila Jafri và cộng sự đã thực hiện phân tích các đặc tính hóa học và gây độc

tế bào ung thư trong ống nghiệm của cây Xét nghiệm hóa trị ung thư trong ốngnghiệm được thực hiện bằng xét nghiệm nitrite, xét nghiệm NFB, xét nghiệmaromatase và xét nghiệm quinone reductase 1 (QR1) Tiềm năng gây độc tế bàođược đánh giá trên ba dòng tế bào ung thư: MCF-7, MDA-MB-231 và xét nghiệmsulforhodamine B (SRB) Kết quả xét nghiệm hóa trị ung thư cho thấy các dịchchiết phân đoạn n-hexan và ethyl acetate của cây được thử nghiệm có tiềm năngngăn ngừa ung thư Dịch chiết thô và các phần dịch chiết phân đoạn của nó đã ứcchế sự tăng trưởng của ba dòng tế bào ung thư hơn 60%, giá trị IC50 của lupeol thayđổi từ 2,32 đến 10,2 μM.M Định lượng lupeol dựa trên HPLC-DAD trong các mô

thực vật khác nhau đã được chứng minh rằng lá của H.nepalensis là một nguồn

lupeol phong phú (0,196 mg/100 mg trọng lượng khô) [29]

Hai hợp chất chống ung thư chính là hederagenin

3-O-α-L-arabinopyranoside (IC50 = 13,69 ± 1,29 g/mL) và pulsatilla saponin A (IC50 = 2,80

± 0,94 g/mL) có vai trò chính cho các hoạt động chống ung thư của H.nepalensis K.

Koch, được nghiên cứu bởi T.Li và cộng sự Các hợp chất được phát hiện thông quacác phương pháp sắc ký hóa học và phương pháp quang phổ Thực hiện phân lập

Để xác định khả năng chống viêm, dịch chiết thô của H.nepalensis ở nồng độhiệu quả nhất (200 mg/kg) được đánh giá bằng cách sử dụng mô hình với histamin.

Sự ức chế phù tối đa được phát hiện ở 90 phút Mẫu đối chứng dương được thực

các thành phần chống ung thư và thử nghiệm các hoạt động ức chế tăng trưởng củachúng trên tế bào ung thư phổi A549 ở người Kết quả cho thấy chiết xuất ethanol

95% của H.nepalensis K Koch đã ngăn chặn đáng kể sự phát triển tế bào A549 phụ

thuộc vào liều [36]

Tác dụng giảm đau:

Với phương pháp thử nghiệm Hot Plate, được sử dụng trong nghiên cứuphản ứng đau cơ bản và trong thử nghiệm hiệu quả của thuốc giảm đau bằng cách

quan sát phản ứng với cơn đau do nhiệt H.nepalensis cho kết quả về khả năng giảm

đau lên tới 59,1% so với morphine là 80% (p < 0,01) [25] Thử nghiệm sự đau đớn

để đánh giá hiệu quả giảm đau ngoại vi được đặc trưng bởi sự giải phóng các chấttrung gian giảm đau nội sinh chẳng hạn như axit arachidonic, cyclooxygenas Cóthể nhận định rằng các polyphenol có mặt trong cây có vai trò chính trong hoạtđộng giảm đau

Tác dụng kháng viêm:

hiện với chlorpheniramine maleate Tỷ lệ phần trăm ức chế của chlorpheniramine

maleate là 77% và của H.nepalensis là 63,5% (p < 0,01) Kết quả cho thấy rằng dịch chiết của H.nepalensis giúp làm giảm đáng kể tình trạng viêm do histamine tạo ra

[25]

1.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

Tách chiết axit deoxyribonucleic (DNA) tổng số là quá trình tách DNA khỏiprotein, và các vật liệu tế bào khác có trong tế bào bằng cách sử dụng kết hợp cácphương pháp vật lí và hóa học Tách chiết DNA lần đầu tiên được thực hiện vàonăm 1869 bởi Friedrich Miescher Đây có thể là một trong những phần tốn nhiềucông sức nhất trong phân tích DNA Các phương pháp tách chiết có thể yêu cầu ủqua đêm, hoàn thành trong vài phút hoặc vài giờ phụ thuộc vào từng quy trình [43]

Các quá trình tách chiết DNA đòi hỏi xử lý cẩn thận nhằm ngăn chặn nhiễmmẫu và nhiễm chéo Tiêu chuẩn chung đối với các phương pháp phân lập DNA là:lượng DNA phân lập đủ nhiều, độ tinh sạch cao, ít đứt gãy phù hợp cho các quytrình phân tích tiếp theo

of

Khả năng chiết xuất DNA chất lượng cao là rất quan trọng để nghiên cứu di truyền phân tử của một sinh vật Khác với tế bào động vật, ở thực vật có vách tế bào dày đồng thời các chất polysacarit và tannin rất khó để loại bỏ vì chúng khó tách khỏi DNA Hơn nữa, phân lập DNA từ các mô thực vật đòi hỏi sự tham gia của carbohydrate và enzym đảm bảo ly giải thành tế bào [] Hầu hết các chất gây nhiễm giống như polysacarit, polyphenol và các hợp chất hữu cơ khác khó phát hiện có thể ảnh hưởng đến chất lượng DNA và ức chế phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) [] Bước đột phá đầu tiên trong phân lập DNA vào năm 1980 với ứng dụng của cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) được nghiên cứu bởi M.G.Murray and

DNA với CTAB CTAB là chất tẩy cation, ở nồng độ muối cao có khả năng tạo kết

(NaCl 1N) Ngoài phương pháp tách bằng hóa chất CTAB, các bộ kit thương mại được sử dụng với ưu điểm tiết kiệm thời gian, tách DNA có độ tinh sạch cao nhờ nguyên lí trao đổi ion trên màng silica

Trong quá trình tách chiết DNA thực vật, không có phương pháp tách chiết

nhau và mô tùy thuộc vào kích thước bộ gen, số lượng tế bào và tuổi của từng mẫu [, ] Để đánh giá phương pháp tách chiết DNA, cần đánh giá không chỉ dựa trên nồng độ và độ tinh sạch của DNA thu được, mà còn dựa trên khả năng phân lập thành công các đoạn gen đích sử dụng kỹ thuật PCR

W.F.Thompson [40] Đến nay, sử dụng hóa chất CTAB để tách chiết DNA được sử dụng trong nhiều loài thực vật Kỹ thuật dựa trên khả năng tạo kết tủa chọn lọc

tủa với DNA, khi đó các tạp chất trong hỗn hợp không tạo được kết tủa sẽ được loại

bỏ [40] Kết tủa DNA với CTAB sau đó sẽ được hòa tan với muối nồng độ thấp

nào được chứng minh là tối ưu nhất Năng suất DNA khác nhau giữa các loài khác

1.3.2 Phương pháp khuếch đại đoạn gen đích bằng PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là một thành phần không thể thiếu và là kỹthuật chính của sinh học phân tử Sử dụng enzym DNA polymerase có khả năngliên kết với khuôn để tổng hợp phân tử DNA mới từ phân tử DNA khuôn ban đầuvới nguyên liệu là các dNTP Trong phản ứng PCR có sự thay đổi nhiệt liên tụctheo chu kỳ, một chu kỳ thường gồm ba giai đoạn: Giai đoạn biến tính với nhiệt độcao (94-980C) tác động làm mạch DNA tách thành hai mạch; giai đoạn gắn mồinhiệt độ được hạ xuống tạo điều kiện thuận lợi để mồi gắn vào được sợi DNAkhuôn Nhiệt độ gắn mồi phụ thuộc nhiều yếu tố như đặc tính mồi, trình tự mồi,…;

giai đoạn kéo dài: Trong bước này DNA polymerase sẽ tổng hợp chuỗi DNA mới

có trình tự bổ sung với DNA mạch khuôn bằng cách thêm các dNTPs từ hỗn hợp

3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotit mới vào chuỗi Khi mộtddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên nucleotit không đượcgắn thêm vào chuỗi, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.

thành phần phản ứng theo chiều từ 5’-3’ Sản phẩm được tạo thành sẽ là nguyên liệucho chu kỳ tiếp theo Số lượng sản phẩm phân tử DNA tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ,

từ một phân tử DNA ban đầu sau n chu kỳ sẽ tạo thành 2n phân tử DNA [49]

1.3.3 Giải trình tự gen

Hình 1.5 Giải trình tự theo phương pháp Sanger

Giải trình tự gen là phương pháp xác định trình tự sắp xếp của bốn loạinucleotit trên phân tử DNA Nguyên tắc dựa trên phương pháp Sanger – kỹ thuậtkết thúc chuỗi bằng 2’, 3’dideoxynucleotit (ddNTP) đã mất nhóm C3’-OH Nhóm

Trong thí nghiệm của Sanger theo mô tả Hình 1.5, 4 ống nghiệm tách biệt

chứa sẵn đoạn mồi, DNA khuôn, dNTP, mỗi ống nghiệm chỉ bổ sung 1 loại ddNTP

đã được đánh dấu phóng xạ, sau đó thực hiện phản ứng tổng hợp Sản phẩm tổnghợp điện di trên gel polyacrylamide Đặc điểm của những đoạn DNA này là hỗnhợp nhiều phân tử DNA được sao chép không hoàn chỉnh giống nhau ở đầu 5’nhưng khác nhau về chiều dài và nucleotit kết thúc ở đầu 3’, kích thước sai khácnhau 1 nucleotit

Phương pháp giải trình tự gen thủ công theo Sanger được ứng dụng rất rộngrãi, Tuy nhiên để giải trình tự DNA ở hệ gen lớn, đa số đều thực hiện phương phápgiải trình tự tự động Phương pháp này sử dụng bộ các ddNTP được gắn chất phátquang khác nhau cho mỗi loại Nguồn sáng Argon của máy giải trình tự kích thíchcác ddNTP, đầu đọc laser trong máy sẽ kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ

và phát ra các màu, mỗi màu ứng với một loại nucleotit và được hiển thị bằng mộtđỉnh Trình tự đọc được trên máy tự động thường dài khoảng 600 đến 1.000 bp Ưuđiểm của giải trình tự tự động là khả năng tự động hóa phần lớn các bước, tốc độđọc và mức độ chính xác rất cao [9, 10]

1.3.4 Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại

Phương pháp Ma trận khoảng cách - Distance Matrix

Đây là một nhóm các thuật toán được sử dụng từ lâu trong các nghiên cứutiến hóa Được bắt đầu sử dụng từ những năm 1990, các thuật toán này giúp xácđịnh mối quan hệ giữa các loài dựa trên các dấu hiệu hình thái Trong đó thuật toánUPGMA (Unweighted pair group with arthmetic) phân tích tất cả các dấu hiệu qua

đó xác định khoảng cách di truyền giữa tất cả các cặp mẫu, rồi gộp từng cặp mẫu cókhoảng cách di truyền thấp nhất

Nhìn chung các thuật toán dựa trên “ma trận khoảng cách” cho kết quả phântích nhanh, phù hợp để xử lí một lượng dữ liệu lớn, cho biết khoảng cách di truyềntương đối giữa các loài nhưng không phản ánh được sự tiến hóa của mỗi gen [10]

Phương pháp Tiết kiệm tối đa - Maximum Parisimony

Dựa trên nguyên tắc sinh học là đột biến hiếm khi xảy ra, thuật toán này chorằng: cây tiến hóa phù hợp nhất là cây có đột biến thấp nhất trên tất cả các cây tiếnhóa có thể giữa các taxon được phân tích Do vậy cây tiến hóa thu được từ phươngpháp này được gọi là cây tích phân tiến hóa tối ưu [10].Chỉ số tin cậy cho từngnhánh cây gọi là giá trị tin cậy (bootstrap), một nhánh chỉ được coi là có độ tin cậykhi giá trị này đạt trên 70% [52] Ưu điểm của phương pháp này là tốc độ tính toánnhanh và được cho là khách quan nhất vì không đưa ra bất kì một giả định nào vềquá trình tiến hóa

Phương pháp Hợp lý tối đa - Maximum Likelihood

Đây là một phương pháp xác suất thuần túy thường được dùng để kiểmchứng lại các cây tiến hóa đã xây dựng bởi các phương pháp khác Phương phápnày đánh giá một giả thiết tiến hóa bằng xây dựng tất cả các cây tiến hóa trên cơ sở

giả thiết đó rồi xác định cây tiến hóa nội suy là cây có xác suất xảy ra cao nhất quaviệc phân tích các yếu tố tiến hóa Chẳng hạn, về đại thể tần số đột biến đồng hoáncao hơn khoảng 3 lần so với các đột biến dị hoán [10].

Đây được coi là phương pháp cung cấp thông tin chính xác và chi tiết hơn cả

so với các phương pháp khác Nhưng thực tế, tốc độ xử lí thông tin theo phươngpháp này chậm và không khả thi khi phân tích một lượng dữ liệu lớn Phương phápnày cũng cho ra cây tiến hóa có độ tin cậy khi giá trị độ tin cậy (bootstrap) đạt trên70% ở mỗi nhánh

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

9 mẫu thực vật đã được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái thuộc loài

Hedera nepalensis thu nhập tại một số tỉnh vùng núi phía Bắc Các mẫu được lấy

bởi nhóm nghiên cứu tại Viện Dược liệu, chi tiết thể hiện trong Bảng 2.1.

Một mẫu thuộc loài Hedera helix được sử dụng trong nghiên cứu để đối

chiếu, lấy từ Vườn thực vật Hoa Nam, Trung Quốc

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu

Tiêu chuẩn lựa chọn mẫu: mẫu lá non, sạch đã được sấy khô và bảo quản

trong túi silicagel chống ẩm.

Bảng 2.1 Thông tin mẫu thực vật dùng trong nghiên cứu

TT Ký hiệu

mẫu

1 H1 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N-103°47'31.76"E

2 H2 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°22'37.53"N - 103°47'31.76"E

3 H3 Trạm cây thuốc Sa Pa, Lào Cai 22°21'10.29"N - 103°51'36.04"E

7 H15 Bản Khoang, Sa Pa, Lào Cai 22°23'0.01"N - 103°47'9.97"E

8 H16 Phó Bảng, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'46.36"N - 105°11'30.49"E

9 H21 Sủng Là, Đồng Văn, Hà Giang 23°14'39.08"N - 105°12'48.68"E

Trung Quốc

2.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện nghiên cứu: từ ngày 15/6/2018 – 25/04/2019

Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của Bộ mônY Dược học cơ sở,Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu

2.3.1 Hóa chất

Hóa chất để tách chiết DNA tổng số: bộ kit Dneasy Plant Mini (Qiagen,Đức), bộ kit GeneJET Plant Genomic DNA Purification Mini (Thermo Scientific,Mỹ), hóa chất phân lập DNA theo quy trình CTAB, CTAB cải tiến mua từ Merckbao gồm: CTAB 3% (Tris 1M pH 8, EDTA, NaCl, nước khử ion); TE (Tris 1M pH

8, EDTA, nước khử ion); Isopropanol; Isoamylalcohol; Chloroform; mercaptoethanol

β-Hóa chất thực hiện kỹ thuật PCR: dNTP mix (Thermo Scientific), PhusionPolymerase (Thermo Scientific), cặp mồi đặt tổng hợp từ hãng Phusa Biochem(Việt Nam) đã được sử dụng trong một số nghiên cứu khác trên thế giới [23], cótrình tự như sau: Mồi xuôi F: 5’CAC AAC TGT AAG ATC CTT TCA AA 3’; mồingược R: 5’CAT ACG CAT AGC ATG TAA CTG 3’

Hóa chất điện di: Agarose, Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid (EDTA,Affymetrix), 5X DNA loading dye (Lonza), GeneRuler 100bp DNA Ladder(Thermo Scientific), Lambda DNA/HindIII Ladder (Thermo Scientific), Tris base(Bio basic), axit acetic (Merck)

2.3.2 Trang thiết bị

Máy soi, chụp ảnh gel (Gel Doc It, Mỹ), Hệ thống điện di (Cleaver ScientificLtd, Anh), Máy PCR (Prime Thermal Cycler, Anh), Tủ an toàn sinh học (ESCO,Singapore), Máy li tâm EBA 21 (Hettich Zentrifugen, Đức), Máy lắc VELP(Scientifica, Đức), Máy quang phổ NP80 (Nanophotometer, Đức), Máy làm đá vảy(Fiocchetti, Ý), Tủ ấm (Panasonic, Nhật Bản), Tủ lạnh sâu -30oC (Panasonic, NhậtBản), Tủ mát 4oC (FRIMED, Nhật Bản)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.1.

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số

DNA được phân lập bằng 4 phương pháp là phương pháp sử dụng CTAB (Sanghai-Maroof và cộng sự, 1984), phương pháp CTAB cải tiến (Elias vàcộng sự, 2004), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant GenomicDNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ)

Mini-Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Quy trình DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Đức) và GeneJET Plant GenomicDNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) thực hiện theo khuyến cáo củahãng

Quy trình CTAB cải tiến (Elias và cộng sự, 2004) gồm các bước như sau:

Bước 1: Cân 20 mg mẫu đã nghiền cho vào ống eppendorf 1,5 mL mới

Bước 2: Bổ sung thêm 388 µL đệm CTAB 3% đã ủ ấm ở 65oC và bổ sung 12 µL

β-mercaptoethanol

Bước 3: Ủ mẫu ở 65oC trong 60 phút trong khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/

phút, cứ 20 phút đảo mẫu một lần

Bước 4: Để nguội ống mẫu về nhiệt độ phòng, bổ sung 200 µL Chloroform:

Isoamylalcohol (tỷ lệ 24:1 về thể tích) Trộn đều bằng việc đảo ngược ốngtrong 1 phút, dùng khối ổn nhiệt kết hợp lắc 400 vòng/ phút trong 20 phút.Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

Bước 6: Hút dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf mới

Bước 7: Bổ sung thể tích tương đương Chloroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ về thể

tích 24:1) và 80 µL CTAB 3%