Thiết kế vector biểu hiện mang gen scfv kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn e coli

Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat.... Các kết quả đã công bố cho thấy CD47 không những là marker hữu dụng để nh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN

TRONG VI KHUẨN E coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Vân Anh

THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN MANG GEN scFv KHÁNG CD47 VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN

TRONG VI KHUẨN E coli

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Không có sự thành công của một học viên nào mà không có sự hỗ trợ, giúp đỡ và đóng góp của các Thầy cô Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, em đã nhận được sự hướng dẫn

và giúp đỡ của các Thầy cô trong Trường và đặc biệt là các Thầy cô trong Khoa Sau đại học

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS

TS Nguyễn Quang Huy – Trưởng khoa Hoá sinh Trường Đại học Khoa học

Tự Nhiên Hà Nội, TS Lã Thị Huyền – Phòng công nghệ động vật viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và hoàn thành luận văn

Tiếp theo, em xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô của Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện giúp đỡ để em có thể hoàn thành luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn toàn thể các GS, TS, cán bộ nghiên cứu của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, luôn tận tình sát sao chỉ bảo, chia sẻ những kinh nghiệm và cho em những lời khuyên quý báu trong công việc cung như cuộc sống

Và cuối cùng, bằng tình cảm chân thành và yêu mến em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình và người thân, những người luôn ủng hộ, động viên và tạo cho em những điều kiện tốt nhất về tinh thần cũng như vật chất trong suốt thời gian học tập và thực tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Vân Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 1

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về bệnh ung thư 3

1.1.1 Ung thư 3

1.1.2 Ảnh hưởng của bệnh ung thư 5

1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư 5

1.2 Protein kháng nguyên CD47 và kháng thể kháng CD47 7

1.2.1 Protein kháng nguyên CD47- đích trong điều trị ung thư 7

1.3.3 Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư 9

1.3 Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư 10

1.4 Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) 11

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Vật liệu 13

2.1.1 Hóa chất và sinh phẩm 13

2.2 Thiết bị 13

2.3.1 Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR 14

2.3.2 Điện di trên gel agarose 14

2.3.5 Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+ 16

2.3.6 Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt 16

2.3.7 Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli theo phương pháp mini-prep của Sambrook 17

2.3.8 Chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang gen antiHer2 bằng phương pháp PCR 17

2.3.9 Quy trình biểu hiện kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện E.coli 18

2.3.10 Quy trình điện di protein SDS-PAGE 18

2.3.11 Tinh sạch kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với Ni-NTA resin 19

2.3.12 Nuôi cấy dòng tế bào Jurkat 19

2.3.13 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20

3.1 Kết quả nhân gen mã hóa kháng thể kháng CD47 22

3.2 Kết quả thiết kế vector biểu hiện tái tổ hợp pET22b+ mang gen anti-CD47 22

3.2.1 Cắt vector pET22b+ và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn 22

3.2.2 Kết quả gắn tạo thành công vector tái tổ hợp mang gen anti-CD47 23

3.3 Kết quả biểu hiện gen mã hóa kháng thể kháng CD47 ở hệ thống biểu hiện E coli 28

3.4 Kết quả tinh sạch kháng thể anti-CD47 29

3.5 Xác định khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 30

KẾT LUẬN 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Liệu pháp nhắm đích CD47/SIRPα 9Bảng 1.2 Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPα 10

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ ung thư thế giới 3

Hình 1.2 Bản đồ ung thư tại Việt Nam 4

Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thư 6

Hình 1.5: Mô hình cấu trúc thụ thể CD47 7

Hình 1.6 Các cơ chế nhắm trúng đích con đường CD47- SIRPα trong ung thư 8

Hình 3.1 Kết quả nhân gen anti-CD47 bằng phản ứng PCR 22

Hình 3.2 Cắt vector pET22b+ bằng enzyme cắt giới hạn 23

Hình 3.3 Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối gen giữa sản phẩm PCR (khuếch đại gen antiCD47) 24

Hình 3.4 Kiểm tra sơ bộ các dòng plasmid tái tổ hợp mang gen anti-CD47 25

Hình 3.5 Kiểm tra các dòng plasmid mang gen anti-CD47 26

Hình 3.7 Kiểm tra sự biểu hiện của kháng thể kháng CD47 ở tế bào vi khuẩn E.coli 28 Hình 3.8 Kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể anti-CD47 30

Hình 3.9 Khả năng liên kết đặc hiệu của kháng thể anti-CD47 với kháng nguyên CD47 biểu hiện trên bề mặt tế bào Jurkat 31

DANH SÁCH CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Amp Ampicillin

AML Tế bào ung thư máu

Bp Base pair (cặp bazơ)

CD47 Cluster of Differentiation 47

DNA Deoxyribonucleic acid

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetraacetic acid

EtBr Ethidium bromide

HEK Tế bào thận phôi thai ở người

HSC Tế bào gốc tạo máu

IPTG Isopropyl-β-D-l-thiogalactopyranoside MCS Mutiple cloning site

LB Luria-betani medium

LSC Tế bào gốc ung thư máu

NHL Non-Hodgkin’s lymphoma

PEG Polyethylen glycol

RNA Ribonucleic acid

V/p Vòng / phút

Fc Kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh

SIRPα Signal regulatory protein alpha

ScFv Mảnh kháng thể đơn chuỗi

Fab Fragment of antigen binding

MỞ ĐẦU

CD47 là glycoprotein chuyển màng thuộc siêu họ globulin miễn dịch CD47 có khối lượng phân tử 50 kDa bao gồm vùng IgV ngoại bào chứa đầu N, 5 vùng chuyển màng và đuôi nội bào ngắn chứa đầu C CD47 liên kết đặc hiệu với một số protein bao gồm integrins, thrombospondin-1, và liên quan đến các quá trình sinh lý tế bào như di chú tế bào, hoạt hóa tế bào T và tế bào tua, và sự phát triển của sợi trục thần kinh [16] Ngoài ra, CD47 còn là phối tử đặc hiệu của SIRPα Protein này biểu hiện trên bề mặt của các tế bào đại thực bào Tương tác CD47-SIRPα ức chế quá trình thực bào bởi đại thực bào và

tế bào tua [44]

CD47 được xác định là kháng nguyên ung thư buồng trứng người lần đầu tiên vào những năm 1980 [17] Sau đó, CD47 được xác định biểu hiện ở nhiều loại khối u người bao gồm AML, CML [11], ALL [7], bạch cầu không liêu quan đến lympho bào NHL [8], đa uy tủy [21], ung thư bàng quang [32] và các khối u rắn khác [11] Điều đặc biệt là, CD47 biểu hiện yếu ở các tế bào bình thường và biểu hiện mạnh ở các tế bào khối u Xác định mức độ biểu hiện CD47 ở hai mẫu tế bào HSC và tế bào LSC bằng phương pháp flow cytometry cho thấy mật độ kháng nguyên CD47 ở tế bào LSC cao hơn ở tế bào HSC [10; 7] Định lượng CD47 mRNA trong mẫu máu ngoại vi của một nhóm gồm 132 bệnh nhân AML bằng phương pháp real-time PCR cho thấy hàm lượng CD47 mRNA của bệnh nhân AML cao hơn so với nhóm chứng [40] Các kết quả đã công bố cho thấy CD47 không những là marker hữu dụng để nhận dạng LSC, AML và một số tế bào khối u khác mà còn là đích để phát triển các loại thuốc đặc hiệu

và liệu pháp miễn dịch tiêu diệt tế bào ung thư biểu hiện kháng nguyên CD47

Ung thư máu cấp tính có tốc độ phát triển rất nhanh ở tủy xương cùng với sự biểu hiện của một số kháng nguyên bề mặt bao gồm CD19, CD22, CD33, CD123,

và CD47 Trong đó, CD47 biểu hiện mạnh ở cả tế bào ung thư máu và tế bào gốc ung thư máu Tế bào gốc ung thư máu là một trong những nhân tố tiềm tàng khiến cho bệnh ung thư máu dai dẳng, khó điều trị dứt điểm và dễ tái phát Do đó, CD47

là một trong các đích để tấn công nhằm tiêu diệt tận gốc bệnh ung thƣ bạch cầu cấp tính

Mảnh kháng thể scFv là một trong những định dạng phổ biến nhất của mảnh kháng thể tái tổ hợp Mặc dù chúng là những đại diện khá nhỏ của dạng kháng thể tái tổ hợp (26-28 kDa) nhƣng chúng cung cấp đầy đủ các đặc tính của kháng thể và

vị trí gắn kết kháng nguyên không bị thay đổi So với các kháng thể đầy đủ chúng ít phức tạp hơn, bao gồm chỉ các miền biến đổi của chuỗi nặng kháng thể (VH) và vùng biến đổi của chuỗi nhẹ kháng thể (VL), các VH và VL đƣợc liên kết bởi một polypeptide linh hoạt

Với sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp từ những năm 1970, protein bắt đầu đƣợc biểu hiện nhiều ở dạng tái tổ hợp trong các tế bào vi sinh vật một cách nhanh hơn và thuận tiện hơn so với nguồn tự nhiên Trong những năm gần đây, kỹ thuật sản xuất protein tái tổ hợp trong các hệ thống sinh học ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi Trong đó, các ―nhà máy‖ vi khuẩn đƣợc lựa chọn sử dụng nhiều do các ƣu điểm nhƣ chi phí thấp, sinh khối lớn và tốc độ sản xuất nhanh Chủng biểu hiện Escherichia coli là chủng đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu cũng nhƣ trong sản xuất protein tái tổ hợp

Do đó, tác giả lựa chọn đề tài: ―Thiết kế vector biểu hiện mang gen scFv

kháng CD47 và biểu hiện protein trong vi khuẩn E.coli‖ với mục tiêu: Thiết kế

thành công vector biểu hiện mang gen scFv đặc hiệu CD47 và biểu hiện đƣợc

protein trong vi khuẩn E.coli

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về bệnh ung thư

1.1.1 Ung thư

Ung thư là một thuật ngữ trong y học để chỉ khối u ác tính Đây là một loại bệnh

mà một nhóm tế bào biểu thị sự tăng sinh không kiểm soát (các tế bào có sự phân chia vượt quá giới hạn bình thường), sau đó xâm nhập và tiêu diệt các mô liền kề nó, đôi khi

tế bào di căn (xâm nhập vào các vùng khác trên cơ thể theo đường bạch huyết hoặc máu) [1; 2] Có khoảng 200 loại bệnh ung thư đã được khoa học tìm ra

Tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 2018 công bố tình hình ung thư hiệu chỉnh theo độ tuổi tại 185 quốc gia và vùng lãnh thổ

Hình 1.1 Bản đồ ung thư thế giới [18]

Trong đó, 10 quốc gia có tỉ lệ ung thư cao nhất đều là những nước phát triển:

Úc đứng số 1 với tỉ lệ mắc ung thư cả 2 giới ở mức 468/100.000 dân; New Zealand (438); Ireland (373); Hungary (368); Mỹ đứng thứ 5 với tỉ lệ 352, kế đó là Bỉ, Pháp, Đan Mạch, Na Uy, Hà Lan

Trong khu vực Đông Nam Á, Singapore có tỉ lệ mắc ung thư cao nhất, kế đó

là Philippines (163, vị trí 89 thế giới); Thái Lan vị trí 92 thế giới (152); thứ 4 khu vực là Lào (154, vị trí 97 thế giới)

Việt Nam xếp vị trí 99/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ mắc ung thư 151,4/100.000 dân, xếp 19 châu Á và thứ 5 tại khu vực Đông Nam Á Vào năm

Theo thống kê của WHO, số ca mắc mới ung thư tại Việt Nam không ngừng tăng, từ 68.000 ca năm 2000 lên 126.000 năm 2010 Năm 2018, số ca mắc mới tăng lên gần 165.000 ca/96,5 triệu dân, trong đó gần 70% trường hợp tử vong, tương đương 115.000 ca

Nhìn tổng quan trên bản đồ ung thư thế giới, tỉ lệ mắc của Việt Nam không cao, tuy nhiên tỉ lệ tử vong tương đối lớn, xếp vị 56/185 quốc gia và vùng lãnh thổ với tỉ lệ 104,4/100.000 dân Vào năm 2016, tỉ lệ tử vong của Việt Nam ở mức 110/100.000 dân

Hình 1.2 Bản đồ ung thư tại Việt Nam [18]

Tính chung cả 2 giới, 5 loại ung thư có tỉ lệ mắc nhiều nhất tại Việt Nam gồm: Ung thư gan, hơn 25.000 ca (15,4%), kế đó là ung thư phổi (14,4%), ung thư

dạ dày (10,6%), ung thư vú, ung thư đại tràng

5 loại ung thư phổ biến nhất ở nam giới Việt gồm: Ung thư phổi (21,5%), ung thư gan (18,4%), ung thư dạ dày, ung thư đại tràng; ung thư hầu họng Ở nữ giới, hàng đầu vẫn là ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư phổi, ung thư gan

Tổ chức sáng kiến toàn cầu về ung thư (GICR, thuộc WHO) cho biết, các số liệu có được dựa trên những nguồn tốt nhất được cung cấp tại mỗi nước

WHO cho biết, ung thư đang là một trong những thách thức sức khoẻ cộng đồng quan trọng nhất của thế kỷ 21 Khoảng 40% trường hợp ung thư có thể được ngăn ngừa bằng cách giảm tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ bao gồm chế độ ăn uống, dinh dưỡng, hoạt động thể chất

1.1.2 Ảnh hưởng của bệnh ung thư

Bệnh ung thư gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống và kinh tế ở mỗi quốc gia Không những dẫn đầu về nguyên nhân gây tử vong trên thế giới, bệnh ung thư vẫn là một căn bệnh mà cho đến nay vẫn chưa có biện pháp điều trị triệt để Đối với một nước phát triển như Mỹ, mỗi năm có khoảng 0,5% dân số được chẩn đoán ung thư Hiện nay, vẫn đang còn rất nhiều người phải sống và chống chọi với căn bệnh này với chi phí điều trị rất lớn Các nhà khoa học, bác sĩ trên toàn thế giới đang nỗ lực không ngừng để tìm ra các biện pháp phát hiện sớm, phòng ngừa và chữa trị ung thư Đây là một vấn đề rất quan trọng đối với mỗi quốc gia và thế giới, đòi hỏi tập trung nguồn nhân lực trình độ cao và tài chính lớn

1.1.3 Nguyên nhân gây ung thư

Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư Các nhà khoa học xác định rằng các dạng ung thư đều có nguyên nhân từ những bất thường trong gen của các

tế bào bị biến đổi Sự bất thường này do ảnh hưởng của các chất sinh ung thư như khói thuốc lá, chất phóng xạ, chất hóa học,… Một số nguyên nhân ung thư khác có thể là do sai sót mang tính di truyền trong quá trình tự sao của ADN, do đó tất cả các tế bào đều tăng sinh bất thường Sự di truyền của ung thư được xác định do ảnh hưởng của các yếu tố gây ung thư và hệ gen chủ Một số yếu tố di truyền khác ảnh hưởng đến ung thư là sự methyl hóa ADN và ARNs micro [1;2;4]

Bình thường sự cân bằng giữa tốc độ của quá trình sinh sản và quá trình chết của tế bào được điều hòa để đảm bảo tính toàn vẹn của cơ quan và mô Tuy nhiên khi các gen đột biến gây ung thư trong tế bào được hoạt hóa thì tế bào tránh được sự chết theo chương trình (apoptosis) và phân chia không kiểm soát, có khả năng hình thành các khối u lành hoặc ác tính (ung thư) [4]

Hai yếu tố quan trọng trong hệ gen dẫn đến ung thư là sự tích lũy các đột biến soma và tăng cường tính bất ổn di truyền

Số lượng đột biến ở tế bào ung thư nhiều hơn tế bào bình thường Khi các đột biến diễn ra ở các gen sửa chữa ADN, các gen ức chế khối u hay đột biến gen tiền ung thư thành gen ung thư được kết hợp với nhau thì gây ra sự tăng sinh một cách không kiểm soát của các tế bào [2; 4]

Hình 1.3: Đột biến bất hoạt gen ức chế khối u gây ung thư [3]

Sự có mặt của các đột biến khác nhau dẫn đến nguy cơ chọn lọc không mong muốn trong quần thể tế bào Trong trường hợp ung thư, tế bào nào mang đột biến tăng cường sinh trưởng sẽ có ưu thế được chọn lọc [2; 4]

lệ sống sót sau 5 năm đối với các trường hợp dương tính với CD47 thấp hơn đáng

kể so với các trường hợp âm tính với CD47 (54,8 so với 79,9%; p = 0,0067), cho thấy sự biểu hiện quá mức của CD47 có thể là một yếu tố tiên lượng xấu độc lập cho ung thư dạ dày Tương tự, một nghiên cứu gần đây [44] tiết lộ rằng CD47 thường được biểu hiện quá mức trong khối u của bệnh nhân ung thư buồng trứng và

có liên quan đến các đặc điểm lâm sàng bất lợi và tiên lượng xấu Các bệnh ung thư khác ở người cũng đã được báo cáo, một số trong đó bao gồm ung thư bạch cầu tủy cấp tính, ung thư hạch không Hodgkin (NHL), ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư vú [17] Trong hầu hết các trường hợp, biểu hiện CD47 cao có liên quan đến di căn xa và tiên lượng xấu, cho thấy rằng liệu pháp chống CD47 là một chiến lược đầy hứa hẹn để chống ung thư

Điều hòa tăng biểu hiện CD47 là một cơ chế đặc biệt quan trọng được các tế bào gốc ung thư sử dụng để vượt qua hệ thống miễn dịch, điều này dẫn tới sự tái phát của bệnh ung thư [6] Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự gia tăng biểu hiện protein CD47 trên các tế bào tạo máu ở người, đặc biệt là trong bệnh ung thư bạch

cầu tủy bào cấp tính (AML) và trong bệnh bạch cầu tủy mãn tính, các tế bào chống lại quá trình thực bào thông qua tương tác CD47-Sirpα [7; 9]

1.2.2 Kháng thể kháng CD47 và liệu pháp điều trị đích CD47 trong điều trị ung thư

Nhiều hướng nghiên cứu đã được xây dựng nhằm vô hiệu hóa tương tác CD47-SIRPα theo các cơ chế khác nhau [37] Cơ chế thứ nhất, kháng thể kháng

CD47 có thể khóa tương tác giữa CD47 trên tế bào khối u và SIRPα trên các tế bào

thực bào cho phép quá trình thực bào diễn ra

Cơ chế thứ hai, kháng thể kháng CD47 có thể loại bỏ các khối u thông qua

cơ chế phụ thuộc vào Fc bao gồm gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể và gây độc tề bào phụ thuộc bổ thể.Một kháng thể kháng CD47 đã được chứng minh có tác dụng kích thích gây độc tế bào qua trung gian NK để kháng lại dòng tế bào ung thư ở người [39] Cơ chế thứ ba, kháng thể kháng CD47 loại bỏ khối u bằng cách kích hoạt trực tiếp quá trình apoptosis.Kết quả của một số nghiên cứu đã công bố cho thấy, một vài kháng thể kháng CD47 kích thích các tế bào ung thư chết theo chương trình thông qua cơ chế không phụ thuộc caspase [38; 41; 24; 42] Cơ chế thứ tư , kháng thể kháng CD47 có khả năng bất hoạt tương tác CD47-SIRPα dẫn đến tế bào tua có khả năng tóm bắt khối u và trình diện kháng nguyên cho tế bào T-CD4 và T-CD8, kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch kháng lại khối u [15]

Hình 1.6 Các cơ chế nhắm trúng đích con đường CD47- SIRPα trong ung thư [10]

1.3.3 Các thành tựu sử dụng kháng thể kháng CD47 trong điều trị ung thư

Hiện nay, một số các liệu pháp nhắm đích CD47/ SIRPα đang được nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng và tiền lâm sàng, bao gồm các kháng thể thông thường, polypeptide tái tổ hợp và các phân tử bispecific (Bảng 1.1)

Mô tả

được nhân hóa, phân lớp IgG4 của người

được nhân hóa

lớp IgG1 của người

đầy đủ OSE

Immunotherapeutics

Các kháng thể kháng CD47 là các liệu pháp đặc hiệu tốt nhất nhắm tới phức

hệ CD47/ SIRPα Chúng đã được chứng minh hiệu quả in vitro và in vivo và các

kháng thể kháng CD47 đã được thử nghiệm chống lại nhiều khối u máu ác tính và bệnh lý khối u rắn, và chúng đã bắt đầu được thử nghiệm lâm sàng (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Các kháng thể nhắm đích CD47/SIRPa [8,9,35]

Thử nghiệm lâm sàng trị liệu nhắm mục tiêu CD47/SIRPa

Ngày bắt đầu Tên Kháng thể Thử nghiệm trên các bệnh Giai đoạn

11/2015 Hu5F9-G4 Bệnh bạch cầu tủy cấp tính Giai đoạn I

03/2016 CC-90002 Bệnh bạch cầu tủy cấp tính,

hội chứng myelodysplastic có nguy cơ cao

Giai đoạn I

09/2016 TTI - 621 Khối u rắn, nấm mycosis Giai đoạn I 11/2016 Hu5F9-G4 U lympho không Hodgkin tế

bào B

Giai đoạn I/II

02/2017 ALX148 Khối u rắn, u lympho Giai đoạn I

Hiện nay các nghiên cứu về kháng thể kháng CD47 vẫn đang phát triển trên thế giới

1.3 Kháng thể và kháng thể đơn chuỗi ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư

Kể từ khi cấp phép cho liệu pháp kháng thể đơn dòng (mAb) đầu tiên OKT3 vào năm 1986, tính đặc hiệu, tính linh hoạt và tính đa dạng của kháng thể và dẫn xuất kháng thể đã trở thành nhóm dược phẩm sinh học lớn nhất [27] Kháng thể đơn dòng

có tiền sử sử dụng an toàn, cơ sở khoa học rõ ràng Tính đến tháng 10 năm 2018, hơn

80 kháng thể đã được EMA/FDA đưa ra thị trường hoặc phê duyệt cho nhiều chỉ định bệnh bao gồm ung thư, viêm/tự miễn dịch, cấy ghép, bệnh truyền nhiễm và tim mạch, huyết học, dị ứng và nhãn khoa Hơn 500 sản phẩm, bao gồm các sản phẩm thế hệ 2

và các định dạng kháng thể mới, hiện đang được thử nghiệm lâm sàng trên toàn thế giới [27; 28; 29]

Dựa trên bản chất mô hình tự nhiên của kháng thể, cả về cấu trúc và chức năng, cho phép tạo ra các mảnh liên kết kháng nguyên nhỏ hơn, chẳng hạn như mảnh Fab, mảnh đơn chuỗi (scFv), kháng thể đơn miền và mảnh kết tinh (Fc), thông qua tách dòng phân tử, kỹ thuật kháng thể và thậm chí các phương pháp enzyme Các mảnh kháng thể sau đó có thể được sử dụng một mình hoặc liên kết với các phân tử hoặc mảnh khác để tạo ra các phân tử lưỡng tính, đa đặc hiệu, đa liên kết hoặc đa chức năng để đạt được nhiều hiệu ứng sinh học [4]

Các mảnh kháng thể có thể cung cấp một số lợi thế so với việc sử dụng các kháng thể thông thường

1.4 Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv)

Mảnh kháng thể đơn chuỗi (scFv) tạo ra một protein đơn chuỗi có ái lực với kháng nguyên tương đương với kháng thể gốc Trình tự và độ dài peptide liên kết có thể khác nhau giữa các scFv để tối ưu ái lực đối với kháng nguyên và tăng sự bền nhiệt Chiều dài của peptide liên kết có thể tạo ra khoảng cách ~ 3,5nm giữa VL và

VH mà không làm gián đoạn sự hình thành vị trí liên kết kháng nguyên [34]

Hình 1.5 Cấu trúc của scFv

ScFv có một số lợi thế so với mAb thông thường Đầu tiên, kích thước nhỏ

lý tưởng cho sản xuất quy mô lớn trong các hệ thống vi sinh vật [35] Ngoài ra, vì

vùng hằng định chuỗi nhẹ (CL) và chuỗi nặng (CH) Điều này cho phép các mảnh được sản xuất nhanh hơn, với năng suất cao hơn và với chi phí thấp hơn so với mAbs kích thước đầy đủ, thường yêu cầu hệ thống biểu hiện động vật có vú [36] Kích thước nhỏ cũng tạo điều kiện cho sự xâm nhập của mô và gắn kết với các epitopes, đặc biệt hữu ích cho sự thâm nhập khối u trong liệu pháp miễn dịch ung thư [37; 38] Việc thiếu vùng Fc sẽ loại bỏ nguy cơ kích hoạt tế bào miễn dịch và các kháng thể như gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), thực bào tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCP), hoặc gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (CDC) [32]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

T7 Promoter: 5’-GTAATACGACTCACTATAGGG-3’ T7 Terminator: 5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’

 Các chủng vi khuẩn E.coli DH5α, BL21(DE3)

 Vector biểu hiện: pET22b+

 Enzyme cắt giới hạn gồm BamHI và XhoI, enzyme gắn nối T4 ligase (BioLabs)

 Hóa chất: Cao nấm men (Yeast extraction), Tryptone, Agar, NaCl, base, Tris-HCl, EDTA, SDS, EtBr, Agarose, Polyarylamide, Bis-acrylamide, IPTG, X-gal, và các hóa chất khác do hãng Merck cung cấp

Tris- Kháng sinh và môi trường nuôi cấy: Ampicilin, Penicilin-Streptomycin, RPMI 1640 (Thermofisher), FBS, môi trường LB lỏng, LB đặc

 Dung dịch: các dung dịch đệm TAE, SDS-PAGE running buffer, PBS, và các dung dịch (dung dịch I, dung dịch II, dung dịch III) với các thành phần chi tiết được trình bày trong bảng phụ lục 2

2.2 Thiết bị

Máy PCR, máy chạy điện di, máy li tâm lạnh, máy lắc ổn nhiệt, bể ổn nhiệt,

các loại (Gilson, Pháp), máy soi chụp gel, kính hiển vi điện tử và các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công Nghệ Sinh Học , Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nhân gen mã hóa scFv kháng CD47 bằng phản ứng PCR

Đoạn gen mã hóa mảnh kháng thể scFv kháng CD47 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi LH47F/LH47R Thành phần phản ứng gồm 12.5 μL GoTaq master mix, 1 μL primer LH47F 10pM, 1 μL primer LH47R 10pM, 2 μL khuôn, 8.5 μL H2O Chu kỳ nhiệt của phản ứng: bước 1: biến tính 94oC trong 3 phút; bước 2: chu trình lặp lại 30 chu kỳ (94o

C trong 45 giây, 52oC trong 45 giây,

72oC trong 1 phút 20 giây); bước 3: hoàn thiện sản phẩm ở 72oC trong 8 phút; bước 4: làm mát sản phẩm PCR ở 10oC trong 30 phút

2.3.2 Điện di trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose 0,8% : cân 0,8g agarose cho vào 100 ml dung dịch TAE 1X, đun trong lò vi sóng cho agarose tan hoàn toàn Để nguội xuống khoảng

50oC rồi rót dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn răng lược Sau khoảng

30 phút khi gel đã đông, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di Rót đệm TAE 1X vào bể để dung dịch ngập cách mặt gel 5mm

 Tra mẫu DNA : Lấy mẫu DNA trộn với loading dye 6X rồi tra vào các giếng trên bản gel

 Chạy điện di ở điện thế 95-100V, trong thời gian khoảng 25-30 phút DNA di chuyển từ cực âm đến cực dương Quan sát sự di chuyển màu bromophenol blue để biết khi nào cần dừng điện di

 Soi gel: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khay và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 2 µg/ml trong khoảng 5 phút rồi rửa lại bằng nước Hiển thị kích thước DNA dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel Ước tính kích thước của DNA bằng cách đối chiếu với thang DNA chuẩn

2.3.3 Cắt vector và sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn

Sản phẩm PCR nhân gen anti-CD47 với cặp mồi LH47F/LH47R và vector pET22b+ được cắt đồng thời bằng hai enzyme cắt giới hạn BamHI và XhoI

Thành phần phản ứng cắt sản phẩm PCR gồm 20 μL sản phẩm PCR, 3 μL BamHI, 3 μL XhoI, 5 μL Buffer, 19 μL H2O

Thành phần phản ứng cắt vector pET22b+ gồm 15 μL vector, 3 μL BamHI,

 Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để loại hoàn toàn dịch, bỏ dịch qua cột

 Chuyển cột sang ống eppendorf mới Bổ sung 45 µL H2O lên cột, để cột ở nhiệt độ phòng khoảng 1-3 phút

 Ly tâm cột 12 000 v/ph, 1 phút để thu sản phẩm tinh sạch qua cột

Chúng tôi tiến hành nuôi chủng E.coli BL21 tái tổ hợp trong 50 mL môi trường LB

có bổ sung Ampicilin 1000 µg/mL và cảm ứng IPTG 5 mM 3 h ở 37oC, tốc độ lắc

200 vòng/phút Ly tâm loại dịch môi trường nuôi cấy để thu sinh khối tế bào Đồng hóa tế bào trong dung dịch Guanidinium Lysis Buffer (Guanidine HCl 6M, sodium phosphate 20 mM, pH 7.8, NaCl 500 mM), sau đó siêu âm, phá vỡ tế bào và ly têm thu dịch nổi cho quá trình tinh sạch Do kháng thể anti-CD47 tái tổ hợp có 6

này bằng phương pháp sắc ký ái lực với Ni-NTA resin Trong quá trình tinh sạch, Imidazole được sử dụng như chất cạnh tranh Ni2+

trong phức hợp Ni2+- histidine Các protein lẫn trong dịch chiết kháng thể tái tổ hợp được loại bỏ khỏi kháng thể tái

tổ hợp ở nồng độ Imidazole 50 mM Sau đó kháng thể tái tổ hợp được đẩy ra khỏi cột nhờ buffer đẩy (Native Elution Buffer), chúng tôi thu 2 phân đoạn với thể tích 1 mL/phân đoạn ở nồng độ Imidazol 250 mM

2.3.5 Gắn nối sản phẩm PCR vào vector pET22b+

Thể tích phản ứng gắn nối 10 μL gồm 3 μL sản phẩm PCR, 2 μL vector pET22b+, 1 μL buffer, 1 μL T4 ligase, 3 μL H2O Ủ phản ứng ở 16oC qua đêm Sau

đó, sản phẩm ghép nối gen được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α

2.3.6 Biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng

phương pháp sốc nhiệt

Chuẩn bị tế bào khả biến

 Lấy chủng tế bào được cất ở - 20oC, cấy vạch tế bào trên đĩa môi trường

LB đặc, ủ đĩa cấy qua đêm ở 37oC

 Nhặt một khuẩn lạc nuôi cấy trong 2ml môi trường LB lỏng, nuôi lắc ở

37oC qua đêm

 Cấy chuyển 1% dịch nuôi tế bào qua đêm sang môi trường LB mới Nuôi lắc ở 37oC đến khi OD600 đạt 0.5-0.7

 Chuyển dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để trên đá 10 phút

 Ly tâm thu tế bào ở 4o

 Lấy tế bào khả biến giữ trong tủ -80oC ra, đặt trên đá khoảng 30 phút

 Bổ sung dung dịch sau phản ứng gắn vào ống eppendorf chứa bào khả biến, đặt trong đá 30 phút