Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bách xanh tự nhiên calocedrus macrolepis kurz ở tây nguyên

Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR .... Hệ số tương đồng di truyền dưới và khoảng cách di truyền trên theo Nei 1973 giữa các q

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Quỳnh

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ

BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS

MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Quỳnh

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ

BÁCH XANH TỰ NHIÊN (CALOCEDRUS

MACROLEPIS KURZ) Ở TÂY NGUYÊN

Hà Nội – 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa đƣợc sử dụng công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015

Học viên

Lê Thị Quỳnh

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS.TS Đinh Thị Phòng đã tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như thực hiện nghiên cứu để thoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn đến Ban Giám đốc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, toàn thể cán bộ Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong cả quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Tiến Hiệp đã cung cấp mẫu cho nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ của trường Đại học Khoa học tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học

Luận văn này là một phần kết quả của đề tài TN3/T15 thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ Chương trình

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên khích lệ của gia đình, bạn

bè và các đồng nghiệp trong suốt thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 25 tháng 11 năm 2015

Học viên

Lê Thị Quỳnh

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG 3

DANH MỤC HÌNH 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5

MỞ ĐẦU 7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh 9

1.1.1 Vị trí phân loại Bách xanh 9

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh 9

1.1.3 Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam 11

1.2 Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật 12

1.2.1 Khái niệm về quần thể thực vật 12

1.2.2 Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật 13

1.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường được dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở thực vật 13

1.3.1 Kỹ thuật isozyme 13

1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 14

1.3.3 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 15

1.3.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 15

1.3.5 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat) 16

1.3.6 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) 17

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền ở thực vật 17

1.4.1 Thế giới 17

1.4.2 Trong nước 18

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Địa điểm nghiên cứu 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 26

2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh 26

2.4.2 Phương pháp nhân bản PCR 27

2.5 Phương pháp phân tích số liệu 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh 29

3.2 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị ISSR 29

3.2.1 Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR 29

3.2.2 Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 34

3.2.3 Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 36

3.2.4 Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị ISSR 39

3.3 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị SSR 39

3.3.1 Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị SSR 39

3.3.2 Đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 43

3.3.3 Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh của 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 48

3.3.4 Nhận xét chung kết quả phân tích đa dạng di truyền quần thể Bách xanh với chỉ thị SSR 50

3.4 Mối quan hệ di truyền giữa 70 mẫu Bách xanh với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

1 KẾT LUẬN 58

2 KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử 22 Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 30 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 3.1 Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích

với 30 mồi ISSR 30 Bảng 3.2 Thông số đa dạng di truyền quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 34 Bảng 3.3 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 36 Bảng 3.4 Hệ số tương đồng di truyền (dưới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa các quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 36 Bảng 3.5 Giá trị PIC, đa dạng gen trong một locus và tỷ lệ phân đoạn đa hình của

70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 42 Bảng 3.6 Một số thông số đa dạng di truyền của từng quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 44 Bảng 3.7 Một số thông số di truyền chính của quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR 46 Bảng 3.8 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với 17 cặp mồi SSR 47 Bảng 3.9 Hệ số tương đồng (dưới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei (1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 48 Bảng 3.10 Một số thông số di truyền của 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR+SSR 52 Bảng 3.11 Mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa và trong quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR+SSR 53 Bảng 3.12 Hệ số tương đồng (dưới) và khoảng cách di truyền (trên) theo Nei

(1973) giữa 3 quần thể Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR vàSSR 53

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Bách xanh ở Vườn quốc gia Chư Yang Sin, Đắk Lắk 10 Hình 2.1 Vị trí thu mẫu các quần thể Bách xanh trong nghiên cứu 22 Hình 3.1 DNA tổng số tách từ lá đại diện của một số mẫu Bách xanh điện di trên gel agarose 0,9% 29 Hình 3.2 Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR3 trên gel agarose 1,5% 32 Hình 3.3 Sản phẩm PCR-ISSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với mồi ISSR62 trên gel agarose 1,5% 33 Hình 3.4 Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA 37 Hình 3.5 Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR 38 Hình 3.6 Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm3 trên gel polyacrylamide 5% 40 Hình 3.7 Sản phẩm PCR-SSR của 70 mẫu Bách xanh phân tích với cặp mồi Cm7 trên gel poly acrylamide 5% 41 Hình 3.8 Biểu đồ hình cây của 70 mẫu Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR tính theo hệ số di truyền của Jaccard và kiểu phân nhóm UPGMA 49 Hình 3.9 Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị SSR 50 Hình 3.10 Biểu đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu Bách xanh phân tích với tổ hợp chỉ thị ISSR và SSR tính theo phương pháp của Jacccard và kiểu phân nhóm UPGMA 54 Hình 3.11 Biểu đồ tọa độ của 70 mẫu thuộc 3 quần thể Bách xanh phân tích với chỉ thị ISSR và SSR 55

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Đa hình chiều dài phân đoạn DNA nhân bản (Amplified Fragment

Length Polymorphism)

AOO Phạm vi cư trú (Area of Occupancy)

bp Cặp bazơ (Base pair)

BTTNVN Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

cpSSR Trình tự lặp lại đơn giản của vùng gen lục lạp (Chloroplasts Simple

Sequence Repeat)

dNTP Deoxyribonucleoside 5‟ Triphosphate

kb 1000 cặp bazơ (Kilobase pair)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EOO Phạm vi khu phân bố (Estimating Extent of Occurrence)

Genbank Ngân hàng gen quốc tế

CTAB Cetyl Trimethyl Amonium Bromide

DNA Axit Deoxyribo Nucleic (deoxyribonucleic acid)

IUCN Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (International Union for

Conservation of Nature)

ISSR Vùng giữa các đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Inter Simple Sequence

Repeat)

ITS Vùng sao chép nội bộ (Internal Transcribed Spacer)

NJ Phương pháp tạo cây phân loại Neighbor Joining (Neighbor Joining)

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

RAPD Đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên (Random

Amplified Polymorphic DNA)

RFLP Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi các enzyme giới hạn

(Restriction Fragment Length Polymorphism)

SSR Trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeat)

TAE Tris Acetate EDTA

Tm Nhiệt độ biến tính (Melting temperature)

UPGMA Phương pháp phân cặp nhóm không có trọng số dùng trung bình số học

(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)

VQG Vườn Quốc gia

VU Sẽ nguy cấp (Vulnerable)

MỞ ĐẦU

Tây Nguyên là một trong những vùng giàu loài lá kim nhất Việt Nam Hầu hết những loài lá kim ở Tây Nguyên đều là những loài có giá trị khoa học và kinh tế

cao trong đó có loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) Bách xanh có khu

phân bố rộng với số lượng cá thể lớn, nhưng gần đây đã bị khai thác nhiều để lấy gỗ

và làm bột hương, nên môi trường sống của loài đang bị thu hẹp dần

Theo số liệu điều tra gần đây nhất của Nguyễn Tiến Hiệp năm 2013, hiện ở vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn những cây nhỏ, đường kính dưới 10cm, ven thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50 cây có đường kính trên 5cm (số liệu chưa công bố) Ước tính cả nước ta hiện tại không còn quá 500 cây Bách xanh có đường kính trên 10cm [6] Môi trường sống của Bách xanh cũng đang bị thu hẹp dần do nạn phá rừng và nạn nương rẫy Theo tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN)

2014, Bách xanh được xếp vào bậc bị đe dọa (VU A2cd) Vì vậy, việc bảo tồn hữu hiệu nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây mới chỉ tập trung vào việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, còn các nghiên cứu về đa dạng di truyền nguồn gen vẫn rất hạn chế và mới chỉ tập trung cho một số loài [6], [8] Đặc biệt các dẫn liệu

về đa dạng nguồn gen di truyền của loài Bách xanh ở Tây Nguyên hầu như chưa được nghiên cứu

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, nhiều loại chỉ thị phân tử đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm cơ sở cho nghiên cứu bảo tồn và tái tạo nguồn gen ở đối tượng sinh vật nói chung và ở các loài cây lá kim nói riêng Trong các loại chỉ thị thì chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) và SSR (Simple Sequence Repeat) đang được ứng dụng rộng rãi

và có hiệu quả trong việc đánh giá đa dạng di truyền ở cả mức độ quần thể và loài

cả trên giới và Việt Nam Chẳng hạn như Wang và cộng sự (2004) đã sử dụng chỉ thị ISSR phân tích đa dạng di truyền của 5 quần thể Bách xanh ở Tây Nam Trung

Quốc [56] và đã chỉ ra tỉ lệ locus đa hình P = 26,9% Hay năm 2010, Wang và Hao

cũng đã sử dụng chỉ thị ISSR để đánh giá đa dạng di truyền của 13 quần thể thông

tự nhiên ở Trung Quốc (Pinus tabulaeformis Carr.) [55] Kết quả chỉ ra rằng mức độ

biến đổi di truyền trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể Sự đa dạng di truyền có xu hướng giảm từ quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên Cả hai yếu tố phân bố tự nhiên và hoạt động của con người đều ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến nay mới chỉ có nhóm tác giả Vũ Thị Thu Hiền và cộng

sự (2009) đã sử dụng chỉ thi RAPD và cpDNA để nghiên cứu đa dạng di truyền của

20 mẫu Bách xanh thu được Hà Nội, Lâm Đồng, Quảng Bình Kết quả phân tích đã chỉ ra các mẫu phân tích có hệ số di truyền dao động từ 0,75 đến 1, kết quả thu được còn cho thấy tính bảo thủ di truyền rất cao trong hệ gen lục lạp ở loài Bách xanh [5]

Xuất phát từ các cơ sở khoa học trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu

đa dạng di truyền quần thể Bách xanh tự nhiên (Calocedrus macrolepis Kurz) ở

Tây Nguyên” với mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau:

- Xác định mức độ đa dạng nguồn gen di truyền cho 3 quần thể Bách xanh tự nhiên thu tại 3 tỉnh Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai ở Tây Nguyên bằng chỉ thị ISSR và SSR làm cơ sở cho nghiên cứu giải pháp khai thác, bảo tồn và tái tạo nguồn gen

- Xây dựng cây phát sinh chủng loại quần thể loài Bách xanh trên cơ sở phân tích chỉ thị ISSR và SSR

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quát về loài Bách xanh

1.1.1 Vị trí phân loại Bách xanh

Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây thân gỗ, thân thẳng,

phân cành sớm và phân tán rộng Bách xanh phân bố ở vùng núi đá vôi phía Bắc và vùng núi đất phía Nam, trong các cánh rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp và ở độ cao 800 - 1500m trên mặt biển Theo phân loại khoa học, Bách xanh thuộc:

Giới (regnum): Plantae

Ngành (phylum): Pinophyta

Lớp (class): Pinopsida

Bộ (order): Pinales

Họ (familia): Cupressaceae

Chi (genus): Calocedrus

Loài (species): macrolepis

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính và giá trị bảo tồn loài Bách xanh

Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) là loài cây gỗ lớn, thường xanh,

chiều cao từ 20 – 25m có khi trên 30m, đường kính 0,6 – 0,8m [8] Vỏ màu nâu sẫm, nứt dọc sau bong mảng, vết vỏ đẽo màu hồng dày 4 – 10mm có nhiều sợi dài Cành lớn xoè rộng, cành non dẹt, mọc cách, xếp thành mặt phẳng Lá hình vảy mọc đôi, từng đôi xếp lợp lên nhau, đôi ở giữa lớn hơn, dài 5mm, đôi ở mép gấp nếp, dài 2mm Mặt trên màu xanh thẫm mặt dưới có nhiều phấn trắng Nón đơn tính cùng gốc, mọc lẻ đầu cành Nón đực hình trứng dài, mang 6 – 8 đôi nhị Nón cái hình trứng trái xoan, dài 12 – 15mm, rộng 4mm mang 3 đôi vảy nón Thường chỉ đôi vảy

ở giữa mang 2 noãn Khi chín vảy nón hoá gỗ, hạt có 2 cánh, cánh lớn hình trứng, cánh nhỏ hình dải Hạt rụng tháng 10 – 12 (hình 1.1) Tái sinh bằng hạt tốt, đặc biệt

ở nơi có nhiều ánh sáng Cây con mọc nhiều như mạ nhưng chỉ một số rất ít phát triển thành cây trưởng thành Ở Việt Nam, Bách xanh được phân bố tự nhiên ở nhiều tỉnh thành trên cả nước, thường mọc thành đám nhỏ hoặc rải rác trên độ cao

900 – 1100m vùng Ba Vì (Hà Tây) và Đà Lạt (Lâm Đồng) Trên thế giới, loài Bách xanh được phân bố ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ và Thái Lan

Bách xanh là loài có giá trị kinh tế cao, gỗ thường dùng trong xây dựng nhà cửa, đóng đồ gỗ cao cấp, tiện đồ mỹ nghệ và làm đồ dùng văn phòng Hơn nữa gỗ Bách xanh có mùi thơm dịu nên còn được dùng làm bột hương Ngoài ra cây có dáng đẹp, có thể trồng làm cảnh

Hình 1.1 Cây Bách xanh ở Vườn quốc gia Chư Yang Sin, Đắk Lắk

(A: Cây trưởng thành, B: tiêu bản của loài) (Ảnh: Nguyễn Tiến Hiệp, 2013) Hiện nay, môi trường sống của Bách xanh đang bị thu hẹp dần do nạn phá rừng và nạn nương rẫy Bách xanh tái sinh bằng hạt tốt nhưng tỷ lệ cây con sống sót rất thấp Những cá thể Bách xanh hiện nay nếu còn trong tự nhiên với độ tuổi rất cổ, hơn 400 năm tuổi Vì thế số lượng cây con không đủ thay thế cho lớp cây trưởng

A B

thành già cỗi và những cây bị khai thác vì mục đích thương mại Bách xanh đang có nguy cơ tuyệt chủng trên phạm vi toàn cầu Vùng suối Đatanla (Đà Lạt) chỉ còn những cây nhỏ đường kính dưới 10cm, ven thác Darơcao (Đà Lạt) chỉ còn hơn 50 cây có đường kính trên 5cm, ước tính cả nước ta hiện tại không còn quá 500 cây Bách xanh có đường kính trên 10cm Cần gấp rút khoanh vùng bảo vệ và đưa vào gieo trồng ở một số nơi quanh Đà Lạt và trên đỉnh núi Ba Vì [2] Theo Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2014, Bách xanh được xếp vào bậc bị đe dọa (VU A2cd) [6] Vì vậy, việc bảo tồn hiệu quả nguồn gen Bách xanh là nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho các nhà nghiên cứu

1.1.3 Tình hình phân bố Bách xanh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, Bách xanh được ghi nhận có cả ở các vùng núi đá vôi phía Bắc

và các núi đất phía Nam Các quần thể phía Nam Việt Nam phân bố ở Đắk Lắk, Lâm Đồng, Khánh Hòa và Ninh Thuận) Những cây trên các vùng núi đá vôi ở phía Bắc (Sơn La, Hà Giang, Cao Bằng, Bắc Kạn, Hòa Bình và Nghệ An) cho thấy sự khác nhau về hình thái của các bộ phận sinh dưỡng Đó có thể là điều kiện môi

trường khắc nghiệt hơn hoặc là một loài khác Trên thế giới Bách xanh (C

macrolepis) gặp ở Đông Bắc Myanma, Thái Lan, Lào và Đông Nam Trung Quốc

[6]

Bách xanh gặp thành từng đám nhỏ trong các rừng nguyên sinh rậm thường xanh hỗn giao nhiệt đới gió mùa núi thấp (nhiệt độ trung bình năm 15 - 200C, lượng mưa trên 1500mm) ở độ cao 800 – 1500m trên mặt biển, ở các loại đất sét

Mối đe dọa chính đối với loài Bách xanh là việc khai thác quá mức để lấy gỗ trên toàn bộ vùng phân bố của loài Ở phía Nam Việt Nam, đặc biệt là ở Tây Nguyên, Bách xanh còn bị đe dọa tuyệt chủng do các khu rừng bị chia cắt, lửa rừng

và do chuyển đổi nơi sống của cây thành đất nông nghiệp Bách xanh đã được xếp vào nhóm IIA của Danh mục các loài động vật và thực vật quí hiếm [6] nên việc khai thác bị luật pháp hạn chế Để bảo tồn loài Bách xanh, Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Lâm Đồng đã giao cho xí nghiệp giống Lâm nghiệp vùng Tây Nguyên và

Dự án giống Lâm nghiệp Việt Nam có nhiệm vụ nhân giống một số loài cây lâm

nghiệp trong đó có Bách xanh để cung cấp cây con phục vụ cho việc trồng bổ sung cho rừng nguyên sinh Các quần thể Bách xanh chính được xác định nằm ngoài các khu bảo tồn nhưng vẫn thuộc diện rừng phòng hộ như ở khu vực Thượng Đa Nhim (Lâm Đồng), Tân Tiến (Ninh Thuận), Khánh Sơn (Khánh Hòa) Vì việc khai thác loài cây này bị luật pháp hạn chế nên cần nâng cao nhận thức về bảo tồn tại các khu vực này [6], [8]

1.2 Tính đa dạng di truyền giữa các quần thể thực vật

1.2.1 Khái niệm về quần thể thực vật

Quần thể là tập hợp các cá thể trong cùng một loài, cùng sinh sống trong một khoảng không gian xác định, vào một thời gian nhất định, có khả năng sinh sản và tạo thành những thế hệ mới [1] Quần thể là một tổ chức sinh học ở mức cao, được đặc trưng bởi những tính chất mà cá thể không bao giờ có như cấu trúc về giới tính,

về tuổi, mức sinh sản, mức tử vong – sống sót và sự dao động số lượng cá thể của quần thể Do là một nhóm cá thể của loài nên những loài nào có vùng phân bố hẹp, điều kiện môi trường khá đồng nhất thường hình thành một quần thể

Những quần thể nội phối điển hình là các quần thể thực vật tự thụ phấn, động vật tự thụ tinh Các quần thể thực vật tự thụ phấn gồm những dòng có kiểu gen khác nhau Tự phối hay giao phối gần gọi chung là nội phối làm cho quần thể dần dần bị phân thành những dòng thuần có kiểu gen khác nhau Trải qua nhiều thế hệ nội phối, các gen ở trạng thái dị hợp chuyển sang trạng thái đồng hợp Số thể dị hợp giảm dần, số thể đồng hợp tăng dần Quần thể thực vật sinh sản bằng thụ phấn cận noãn sẽ dẫn đến sự khác nhau về di truyền giữa các quần thể là lớn, mất tính đa dạng di truyền và tăng tần số gen đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ

Giao phối ngẫu nhiên (ngẫu phối) giữa các cá thể trong quần thể là nét đặc trưng của quần thể giao phối Trong quần thể ngẫu phối nổi lên mối quan hệ phụ thuộc lẫn nhau giữa các cá thể về mặt sinh sản Vì vậy quần thể giao phối được xem

là đơn vị sinh sản, đơn vị tồn tại của loài trong tự nhiên Chính mối quan hệ về sinh sản là cơ sở đảm bảo cho quần thể tồn tại trong không gian và qua thời gian Quần thể giao phối nổi bật ở đặc điểm đa hình Quá trình giao phối là nguyên nhân làm

cho quần thể đa hình về kiểu gen, do đó đa hình về kiểu hình Thụ phấn chéo có thể sản sinh những cá thể lai đa dạng Cấu trúc di truyền của những cá thể này có nhiều

cơ hội đóng góp vào tính đa dạng trong quần thể và duy trì khả năng thích nghi cao trong hoàn cảnh môi trường sống

Tác động của con người đến môi trường sống làm phá vỡ cấu trúc quần thể, mất tính đa dạng, số cá thể còn lại ít sẽ không đủ sức hỗ trợ cho sự tồn tại của một quần thể, quần thể dễ bị tiêu diệt, tuyệt chủng vì những thay đổi bất thường Tính đa dạng di truyền của những quần thể này thấp nên khó thích nghi với các biến động khí hậu

1.2.2 Tính đa dạng di truyền của quần thể thực vật

Đa dạng sinh học là sự phong phú về gen, loài sinh vật và hệ sinh thái trong

tự nhiên Đa dạng loài là số lượng và sự đa dạng của các loài được tìm thấy tại một khu vực nhất định của một vùng nào đó Đa dạng loài là tất cả sự khác biệt trong một hay nhiều quần thể của một loài cũng như đối với quần thể của các loài khác nhau Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình

tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền

Đa dạng di truyền cho phép cá thể và loài xử lý những biến đổi bất lợi của môi trường sống và có khả năng tự phục hồi trong môi trường sống của chúng [1] Như vậy, đa dạng di truyền được đề cập đến như là mức độ đa hình của mỗi cá thể trong suốt thời gian sống của nó, hoặc được phản ánh bởi số alen của quần thể tại một nơi và thời gian cụ thể hoặc số alen của một loài trong phạm vi phân bố địa lý

này được Hunter và Market đưa ra từ năm 1957, được Harris hoàn thiện vào năm

1966 và bắt đầu được sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến nay Di truyền quần thể cần thiết phải nghiên cứu nguyên nhân và hậu quả của sự biến đổi di truyền trong/giữa các quần thể Kỹ thuật isozyme được sử dụng như dấu phân tử cho mục tiêu này Mặc dù hiện nay đã có nhiều kỹ thuật DNA phát triển nhưng kỹ thuật isozyme vẫn được sử dụng vì cách thức thực hiện tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho các nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền ở cấp độ thấp Ngoài ra việc kết hợp kỹ thuật isozyme với các kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh những đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác nhau của môi trường [11]

1.3.2 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA - Đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991 Phương pháp này sử dụng cùng một số mồi ngẫu nhiên (mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotide gồm khoảng 8 đến 20 nucleotide) để thực hiện phản ứng PCR nhằm nhân các đoạn DNA đặc trưng của các mẫu nghiên cứu Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn DNA hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR sẽ nhân được các đoạn khác biệt nhau [4], [11]

 Ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật, kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch quá cao, thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.Về mặt kinh tế, chi phí thực hiện cho kỹ thuật này thấp Trong nghiên cứu, kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [12]

 Nhược điểm của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức

độ lặp lại giống nhau thấp) Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao [11], [12]

1.3.3 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP (Restriction fragment length Polymorphism – đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt bởi các enzyme giới hạn) Kỹ thuật này dựa trên đặc điểm của các enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt DNA khác nhau phân biệt được bằng điện di đồ, các đoạn cắt còn được gọi là các “dấu vân tay” đặc trưng cho từng phân tử DNA Bản đồ di truyền kết quả RFLP có tính chính xác cao, thường được

sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc mức độ tiến hóa giữa của các loài sinh vật [4], [11]

Kỹ thuật này được dùng phổ biến từ đầu thập niên 80 đến nay Kỹ thuật RFLP được sử dụng để kiểm tra sự phân ly di truyền của một số tính trạng theo qui luật Mendel, hoặc ứng dụng trong chọn giống động vật, chọn giống thực vật hoặc so sánh

sự khác nhau giữa các cá thể, các loài sinh vật Kỹ thuật RFLP được thực hiện trên nguyên lý cắt enzyme giới hạn DNA của mẫu nghiên cứu sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được cắt với cùng 1 số loại enzyme giới hạn Mỗi enzyme giới hạn sẽ nhận biết và cắt đặc hiệu DNA ở những vị trí xác định, do đó các bộ gen có cấu trúc khác nhau sẽ cho ra số lượng và kích thước các đoạn cắt DNA khác nhau, những bộ gen giống nhau thì sẽ cho ra số lượng, kích thước các đoạn cắt giống nhau, kích thước

và số lượng các đoạn cắt này sẽ quan sát được trên điện di đồ

1.3.4 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), được hiểu là

sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 RE,

sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại (PCR) Kỹ thuật này được Vos và cộng sự phát triển vào năm 1995 và ngay lập tức trở thành 1 công cụ hữu ích để nhận biết nhiều locus trong sự đa hình DNA mà không cần biết

trước thông tin về trình tự DNA của chúng Phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau

1.3.5 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat), còn được gọi là microsaterlite (vi

vệ tinh) là kỹ thuật nghiên cứu dựa trên trình tự lặp các đoạn đơn giản, đây là những trình tự ngắn (từ 2 đến 6 cặp bazơ) có thứ tự lặp lại liên tiếp dao động từ 2 đến 40 đơn vị Các trình tự lặp đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật và thực vật, mật độ các trình tự dao động rất lớn Chúng được phân bố trong hệ gen và có tính đặc trưng cho từng loài [11]

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên

là nhận dạng các trình tự lặp lại đơn giản Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận dạng, bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế mồi Các trình tự gần kề và các trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR Chỉ thị SSR sau đó được sử dụng tương tự như các mồi RAPD Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được sự sai khác mà không xác định được bằng các mồi khác như RAPD và RFLP Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hoá chất Mồi sử dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng và vì thế đáng tin cậy khi phát hiện cùng một locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen Chỉ thị SSR là các locus đặc trưng, nên cung cấp nhiều thông tin rất có ích cho việc phát hiện sự thay đổi các trình tự hiếm SSR là loại chỉ thị đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD và trở thành công cụ hữu hiệu trong các ứng dụng chọn giống thực vật và nghiên cứu di truyền

Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại chỉ thị chỉ đặc trưng cho mỗi locus đa hình Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA của genome có chứa SSR Hiện nay, số lượng mồi thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR trong việc lập bản đồ gen Một vấn đề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR là việc xác định quan hệ giữa các alen với các chỉ thị phân tử là rất khó SSR có

thể được phân bố ngẫu nhiên trong genome nhưng cũng có khi tập trung lại ở tâm động hay eo thứ cấp của nhiễm sắc thể Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể [11]

1.3.6 Kỹ thuật ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)

Kỹ thuật do Zietkiewicz và cộng sự phát hiện năm 1994 [60] Trong cấu trúc

hệ gen của sinh vật nhân thật tồn tại một loại các trình tự nucleotide lặp lại, chúng thường đặc trưng cho loài Trình tự này gồm từ 2 đến 5 nucleotide lặp lại nhiều lần,

ví dụ: (AT)n, (AG)n, (AGTC)n và nằm rải rác trong hệ genome của thực vật bậc cao Kỹ thuật ISSR dựa trên kỹ thuật PCR và dùng một mồi đơn có độ dài từ 20 đến

30 nucleotide để nhân bản các trình tự đơn giản ở giữa các trình tự lặp lại cho loài Đoạn mồi được thiết kế là đoạn oligonucletide có trình tự bổ sung với trình tự lặp Khoảng cách giữa các trình tự lặp khác nhau làm cho các phân đoạn DNA được nhân có độ dài ngắn khác nhau và đặc trưng cho mỗi cá thể Nhiều kết quả nghiên cứu đã chỉ ra chỉ thị ISSR phản ánh mức độ phân nhóm di truyền của quy luật Mendel [51] Mồi này cũng được sử dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu đa dạng DNA ở một số đối tượng cây trồng [25], [31], [38], [41]

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về đa dạng di truyền ở thực vật

thể Bách xanh ở Tây Nam Trung Quốc Kết quả chỉ ra tỉ lệ locus đa hình P = 26,9%

và giá trị dị hợp tử mong đợi của các quần thể Bách xanh nghiên cứu là 0,114, không có sự tương quan giữa khoảng cách di truyền và số lượng cá thể trong quần thể, sự đa dạng di truyền của các quần thể Bách xanh là thấp [56]

Năm 2010, Xiliao và cộng sự [54] đã sử dụng chỉ thị SSR để đánh giá đa dạng di truyền của 9 quần thể Bách xanh ở Trung Quốc Kết quả phân tích 34 mẫu Bách xanh từ 9 quần thể sử dụng 13 chỉ thị SSR cho thấy số alen trên một locus dao động từ 2 đến 9 với giá trị trung bình là 6,08 Giá trị của hệ số gen dị hợp tử quan

sát (Ho) khác nhau giữa các quần thể trung bình 0,668 dao động từ 0 đến 1,000 Giá

trị tần số gen dị hợp tử mong đợi dao động từ 0,154 đến 0,891 với mức trung bình 0,681 Những chỉ thị SSR đa hình sẽ là công cụ hữu ích trong việc xác định đa dạng

di truyền để xây dựng chiến lược bảo tồn các loài Bách xanh này

Ngoài ra còn có nhiều nhóm tác giả khác trên thế giới cũng đã quan tâm và nghiên cứu về vấn đề này như năm 2010, Wang và Hao đã sử dụng chỉ thị ISSR

để đánh giá đa dạng di truyền của 13 quần thể thông tự nhiên ở Trung Quốc

(Pinus tabulaeformis Carr.) [55] Kết quả chỉ ra rằng tổng số biến đổi di truyền

trong quần thể Thông ở Trung Quốc chủ yếu duy trì bên trong quần thể Sự đa dạng di tuyền có xu hướng giảm từ quần thể trung tâm đến quần thể trung gian và quần thể biên Cả hai yếu tố phân bố tự nhiên và hoạt động của con người đều ảnh hưởng đến sự hình thành cấu trúc di truyền của loài này Madhav và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể của 13 quần thể của

loài Thuja occidentalis (Cupressaceae) ở Canada, Scotia và Island [34], Chung và cộng sự (2004) nghiên cứu trên loài Cunninghamia konishii – một loài đặc hữu ở

Đài Loan [20], Man và cộng sự (2000) nghiên cứu đa dạng di truyền trên loài

Juniperus rigida (Cupressaceae) và Juniperus coreana [35] Đặc biệt thông qua

việc phân tích cấu trúc di truyền sử dụng chỉ thị ISSR, AFLP, của một số loài lá kim bị đe doạ tuyệt chủng cho thấy mức độ đa dạng di truyền bị suy giảm rất cao liên quan đến khả năng tăng hệ số đồng hợp tử trong các quần thể nhỏ và hẹp Những nghiên cứu đó cũng chỉ ra mức độ đa dạng giữa các quần thể là rất lớn và đồng thời đưa ra một số biện pháp hiệu quả để phục hồi nguồn gen một số loài lá kim bị đe dọa tuyệt chủng [57]

1.4.2 Trong nước

Việt Nam hiện được xếp vào một trong 10 điểm nóng nhất trên thế giới về

bảo tồn Thông, vì thế việc nghiên cứu bảo tồn các loài lá kim cần được coi trọng [6], [8] Đến nay, ở Việt nam hầu hết các loài mới chỉ tập trung vào việc nghiên cứu phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và nơi phân bố, trong khi đó các nghiên cứu

về phân tử cũng như thành hóa học còn ít được chú ý Công ước quốc tế về Đa dạng sinh học (1994) đã xác định Đa dạng sinh học bao gồm 3 cấp: (i) đa dạng trong loài (đa dạng di truyền hay đa dạng nguồn gen), (ii) đa dạng giữa các loài (đa dạng về thành phần loài hay đa dạng loài) và (iii) đa dạng hệ sinh thái Vì những lý do trên,

việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài có giá trị khoa học, kinh tế, các loài

đặc hữu, quý hiếm đang bị đe dọa tuyệt chủng ở Việt Nam nói chung, đặc biệt các loài lá kim là hết sức cần thiết Hiện nay ở Việt Nam có nhóm nghiên cứu của Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (BTTNVN) là một trong những đơn vị đã và đang có những nghiên cứu sâu về đa dạng di truyền nguồn gen một số loài lá kim trên cơ sở phân tích phân

tử Chẳng hạn như Vũ Đình Duy và cộng sự (2010) đã đánh giá đa dạng di truyền

của 4 loài thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae) là Pơ mu (Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii), Hoàng đàn Hữu liên (Cupressus

tonkinesis) và Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) bằng sử dụng chỉ thị ISSR, SSR và

giải mã vùng gen 18S đã chỉ ra hai loài Pơ mu và Sa mộc dầu có mức độ suy giảm cao hơn Thủy tùng và Hoàng đàn Hữu liên [3] Sự suy giảm đều liên quan đến hoạt động của con người, đặc biệt nơi sống bị phân cắt Kết quả giải mã trình tự gen 18S

còn cho phép giải quyết vấn đề tồn tại về taxon của Sa mộc dầu (Cunninghamia

lanceolata var konishii); hay Nguyễn Minh Tâm và cộng sự (2010) đã giải mã vùng

gen rpoC, gen rbcL và gen matK để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 15 loài lá

kim thuộc lớp Thông (Thủy tùng, Thông đỏ bắc, Bách xanh núi đá, Bách xanh núi đất, Hồng tùng, Thông Pà cò, Thông tre lá dài, Thông đà lạt, Thông nàng, Thông tre

lá ngắn, Thông ba lá, Kim giao nam, Kim giao bắc, Dẻ tùng vân nam và Thông đỏ nam) và đã chỉ ra mối quan hệ gần gũi của các loài [13]

Để nghiên cứu mối quan hệ họ hàng giữa các taxon trong thực vật, Tam và Trang (2012) đã sử dụng vùng gen 18S để xác định mối quan hệ tiến hoá của 6 chi

thuộc họ Hoàng đàn (Cupressaceae) ở Việt Nam [50] Kết quả chỉ ra 2 nhánh tiến

hoá có quan hệ mật thiết với nhau, Xanthocyparis vietnamesis/Cupressus

tonkinensis và Fokienia hodginsii/Cupressus rupestris/C formasana Xanthocyparis noothatensis có quan hệ gần gũi với loài thuộc chi Cupressus Fokienia hodginsii

cùng nhánh tiến hoá với chi Calocedrus Tương tự, Đinh Thị Phòng và cộng sự

(2009), Vũ Thi Thu Hiền và cộng sự (2009) cũng đã sử dụng chỉ thị RAPD, và cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền quần thể tự nhiên loài Pơ mu và Bách xanh phục vụ cho cho công tác bảo tồn Kết quả phân tích đã chỉ ra: đối với loài Pơ

mu khi phân tích 25 mẫu từ các xuất xứ Lâm Đồng, Khánh Hòa, Lào Cai và Hòa Bình phân làm 2 nhánh chính có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,876 đến

1, tính đa dạng di truyền giữa các xuất xứ Pơ mu rất thấp và có thể đe dọa sự tồn vong của loài này [9] Đối với loài Bách xanh, hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu Bách xanh thu được ở 3 địa phương Hà Tây, Lâm Đồng, Quảng Bình dao động

từ 0,75 đến 1 Kết quả phân tích với 15 mồi RAPD và 6 mồi cpSSR cho thấy có sự bảo thủ di truyền rất cao trong hệ genome lục lạp của cây Bách xanh [5]

Mới đây nhất, Đinh Thị Phòng và cộng sự (2015) cũng đã sử dụng chỉ thị ISSR và SSR để phân tích tính đa dạng di truyền của quần thể tự nhiên loài Thông

lá dẹt (Pinus krempfij Lecomte) và Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferre‟) và đã chỉ

ra rằng tính đa dạng di truyền trong quần thể loài Thông lá dẹt là tương đối thấp Cụ thể, khi sử dụng 17 cặp mồi SSR để phân tích 70 cá thể cho thấy mức độ tương đồng di truyền của loài Thông lá dẹt ở Tây Nguyên dao động từ 59 đến 100% [10] Tương tự, khi sử dụng 26 mồi ISSR để phân tích tính đa dạng di truyền và cấu trúc quần thể Thông lá dẹt ở Tây Nguyên cho thấy mức độ tương đồng di truyền của loài dao động trong khoảng từ 65,7 đến 79,82% [7] Với các kết quả này cho thấy cần

phải bảo tồn cả ở mức cá thể và quần thể Với loài Thông đà lạt (Pinus datatenis

Ferre‟), nhóm nghiên cứu đã sử dụng 26 mồi ISSR để phân tích đa dạng di truyền 6 quần thể tự nhiên loài này thu ở: Xa Hiếu, Dak Glei, Ngọc Linh (Kon Tum), Đa Chais (Lâm Đồng), Hòa Sơn (Đắk Lắk), A Yun (Gia Lai) kết quả đã nhân bản được

95 phân đoạn DNA trong đó có 48 phân đoạn DNA đa hình (chiếm 50,52%) Tính

đa dạng di truyền thể hiện cao nhất ở quần thể Đa Chais, tinh Lâm Đồng (I = 0,130;

h = 0,077; PPB = 25,26%) và thấp nhất ở quần thể Xa Hiếu, tỉnh Kon Tum (I =

0,06; h = 0,037; PPB = 11,58%) Tổng mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) giữa

các cá thể trong quần thể là 58,01% và giữa các quần thể là 41,09% [22]

Đến nay có thể nói, các dẫn liệu về đa dạng di truyền, các trình tự nucleotide đặc trƣng cho một số loài lá kim đặc hữu, có giá trị kinh tế cao và có nguy cơ tuyệt chủng hầu nhƣ chƣa đƣợc nghiên cứu hoặc rất hạn chế nên cần đƣợc quan tâm nghiên cứu để có kế hoạch bảo tồn cũng nhƣ khai thác nguồn tài nguyên quý giá này

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Là các mẫu lá hoặc gỗ của bảy mươi cá thể (mỗi cá thể là một mẫu) thuộc 3

quần thể tự nhiên loài Bách xanh (Calocedrus macrolepis Kurz) thu tại 3 tỉnh: Lâm

Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai Các mẫu do TS Nguyễn Tiến Hiệp, cộng tác viên của Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam cung cấp Mẫu được bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng Thông tin chi tiết các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong bảng 2.1 và hình 2.2

Bảng 2.1 Thông tin của các mẫu thu nghiên cứu phân tử Tên

Vị trí địa lí Độ cao so

mặt nước biển (m)

Vĩ độ bắc (◦N)

Kinh độ đông (◦E)

Đatanla Đà Lạt,

Lâm Đồng 32 Cm1-Cm32 11o54‟2.5” 108o26‟56.8” 1315 Hòa

Các mồi và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu:

Ba mươi mồi ISSR và 17 cặp mồi SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền quần thể Bách xanh thu được ở Tây Nguyên Các mồi và cặp mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technology, Mỹ), có ký hiệu và trình tự nucleotide như trong bảng 2.2 và bảng 2.3

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 30 mồi ISSR sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên mồi Tình tự Nhiệt độ bắt

cặp ( o C) Tài liệu tham khảo

Bảng 2.3 Trình tự nucleotide của 17 cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên mồi Trình tự lặp Trình tự nucleotide Tham

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

Hóa chất tách chiết và tinh sạch DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch genomic, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, poly acrylamide, TE, Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR: Đệm PCR, MgCl2, dNTP, Taq polymerase; hóa chất tinh sạch cản

phẩm PCR và xác định trình tự nucleotide: Quick Gel Extraction Kit QIAGEN, Dye Teminator Cycle Sequencing Kit,…Các hóa chất sử dụng đều là của các hãng

Fermentas, Biobasis, QIAGEN,

t t v ụng cụ:

Máy PCR System 9700 (Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức) máy ổn nhiệt (Memmert, Đức)…

Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn các loại,…của các hãng Canada, Mỹ, Trung Quốc và Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định mức độ đa dạng di truyền của 3 quần thể Bách xanh thu ở 3 tỉnh Lâm Đồng, Đắk Lắk và Gia Lai

- Xây dựng cây phát sinh chủng loại quần thể loài Bách xanh trên cơ sở phân tích chỉ thị ISSR và SSR

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen – Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ 70 mẫu Bách xanh

DNA tổng số được tách chiết từ lá hoặc vỏ cây bằng phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) [44] Kiểm tra độ sạch trên gel agarose 0,9% và đo nồng độ DNA tổng số trên máy UVS 2700, Labomed, Hoa Kỳ

2.4.2 Phương pháp nhân bản PCR

Phản ứng PCR-ISSR: Phản ứng nhân gen được thực hiện trên máy PCR system

9700, trong thể tích là 25µl với các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM mồi, 50ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu

kỳ nối tiếp nhau với các bước: biến tính 94oC trong 1 phút, gắn mồi 45 - 50oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72oC trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72o

C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC Sau khi kết thúc phản ứng, sản phẩm PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5% cùng với thang DNA chuẩn 1 kb Gel agarose được nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV

Phản ứng PCR-SSR: Phản ứng nhân gen được thực hiện trong thể tích 25µl

gồm các thành phần: 1X dung dịch đệm PCR, 2,5 mM MgCl2, 2mM dNTPs, 100nM

mỗi mồi xuôi và ngược, 50 ng DNA khuôn và 0,5 đơn vị Taq polymerase Các phản

ứng được thực hiện trên máy PCR system 9700 với chu trình nhiệt: biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: biến tính 94o

C trong

1 phút, gắn mồi 50 - 55oC (tùy từng mồi) trong 1 phút, kéo dài mồi 72o

C trong 1 phút và kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 4oC Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 5% cùng với thang marker DNA chuẩn 100 bp sau đó nhuộm ethidium bromide 15 phút và quan sát dưới tia UV

2.5 Phương pháp phân tích số liệu

Số liệu PCR-ISSR: Phân tích số liệu theo quy ước: 1 - phân đoạn DNA xuất

hiện và 0 - phân đoạn DNA không xuất hiện khi phân tích sản phẩm PCR-ISSR với phần mềm NTSYS 2.0 [45] Các thông số đa dạng di truyền của mỗi quần thể như giá

trị alen tổng số (Na), alen hiệu quả (Ne), phần trăm phân đoạn đa hình (PPB), chỉ số

đa dạng di truyền Shannon (I) [47], hệ số gen dị hợp tử mong đợi (He) và mức độ

thay đổi phân tử (AMOVA) giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể được tính toán sử dụng phần mền GENALEX 6.3 [43] Chỉ số đa dạng di truyền tính theo

Nei (h) (1973) của mỗi quần thể được tính theo công thức h = ∑pi2 (trong đó pi là tần

số của alen thứ i tại locus đó) [39] Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của mỗi chỉ

thị ISSR được xác định theo công thức: PIC i = 1 - ∑Pij2 Trong đó Pij là tần số alen

thứ j của kiểu gen i được kiểm tra Thiết lập ma trận khoảng cách di truyền để phân

tích thành phần tọa độ (PCA) giữa các cá thể Lập biểu đồ hình cây theo phương pháp của Nei và Li (1972) trong phần mền NTSYS 2.0 [45] và giá trị bootstrap được hỗ trợ bởi phần mền Win-Boot [59] với 1000 lần lặp lại

Số liệu PCR-SSR: Số lượng alen tổng số và thành phần alen được xác định cho

mỗi locus Các thông số đa dạng di truyền của mỗi quần thể như phần trăm số phân

đoạn đa hình (PPB), chỉ số đa dạng di truyền theo Shannon (I) (Shannon và Weaver, 1949) [47] và theo Nei (h) (1973) [39], hệ số gen di hợp tử mong đợi (He),

hệ số gen di hợp tử quan sát (Ho), hệ số tự thụ phấn (Fis) được tính toán sử dụng phần mền GENALEX 6.3 [43] và FSTAT [28] Hệ số khác biệt di truyền (Fst) và

sự trôi dạt gen (Nm) cho mỗi locus được tính theo công thức: Fst = (Ht - mean He)/

1-∑(tpi)2 (pi là tần số của alen thứ i, tpi là tần số của alen thứ i trong tổng số alen

Khoảng cách di truyền và hệ số tương đồng di truyền giữa các cặp quần thể được tính toán dựa trên phần mềm GENALEX 6.3 Phân tích mức độ thay đổi phân tử (AMOVA) cũng được tiến hành để tính toán mức độ khác biệt đáng kể giữa các quần thể và giữa các cá thể trong quần thể sử dụng phần mềm GENALEX 6.3 Ma trận khoảng cách di truyền được thiết lập để phân tích thành phần tọa độ (PCA) giữa các quần thể Lập biểu đồ hình cây và biểu đồ tọa độ (PCA) theo phương pháp của Nei và Li (1972) trong phần mền NTSYS 2.0 [45], giá trị bootstrap được hỗ trợ bởi phần mền Win-Boot với số lần lặp lại 1000 lần [59]

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số loài Bách xanh

DNA tổng số của 70 cá thể từ 3 quần thể Bách xanh (Calocedrus macrolepis

Kurz) được tách chiết theo phương pháp của Porebski và cộng sự (1997) có cải tiến một số bước cho phù hợp với phòng thí nghiệm [23] Kết quả kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9% (hình 3.1) cho thấy mỗi giếng chỉ cho một băng vạch duy nhất, các băng đều đậm, sắc nét, thể hiện DNA tách chiết được có độ tinh sạch cao,

không bị đứt gãy

Kết quả kiểm tra hàm lượng và độ sạch DNA tổng số bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm và 280nm cho thấy, nồng độ DNA của 70 mẫu Bách xanh dao động từ 640 đến 1000 ng/µl Tỷ lệ OD260/OD280 thể hiện độ tinh sạch của các mẫu DNA dao động từ 1,732 đến 2 (số liệu không chỉ ra ở đây) Kết quả trên khẳng định các mẫu DNA tách chiết được hoàn toàn đủ tiêu chuẩn cho những phân tích tiếp theo

Hình 3.1 DNA tổng số tách từ lá đại diện của một số mẫu Bách xanh điện di trên

gel agarose 0,9%

3.2 Tính đa dạng di truyền quần thể loài Bách xanh ở Tây Nguyên phân tích với chỉ thị ISSR

3.2.1 Tính đa hình DNA của 70 mẫu Bách xanh với chỉ thị ISSR

Ba mươi mồi ISSR đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền của 70 mẫu Bách xanh thuộc 3 quần thể thu ở Đatanla (Lâm Đồng), Hòa Sơn (Đắk Lắk) và

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

Kon Chư Răng (Gia Lai) Trong đó 25/30 mồi chỉ ra tính đa hình giữa các mẫu nghiên cứu Tổng số nhân bản được 129 phân đoạn DNA với kích thước dao động trong khoảng 250 – 2000 bp, trong đó có 65 phân đoạn đa hình (chiếm 50,39%), giá

trị đa dạng gen trung bình trong một locus (Hj) là 0,112 Hàm lượng thông tin đa hình (PIC) của các mồi dao động từ 0 (mồi UBC841, A17899, ISSR1, ISSR5 và

ISSR61) đến 0,326 (mồi ISSR49) Các chỉ thị ISSR cho tỷ lệ đa hình thấp giữa các mẫu nghiên cứu, chỉ có 18 mồi có số phân đoạn đa hình trên 50%, trong đó có duy nhất mồi ISSR3 có 100% số phân đoạn đa hình (bảng 3.1) So sánh với kết quả nghiên cứu của Vũ Thị Thu Hiền và cộng sự (2009) khi phân tích mồi RAPD cho thấy, loài Bách xanh thu ở Tây Nguyên có hàm lượng thông tin đa hình thấp hơn

(PIC = 0,101) so với loài Bách xanh thu ở Hà Nội, Quảng Bình và Lâm Đồng (PIC

= 0,109) nhưng lại có tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình (PPB) lại cao hơn (50,39%

so với 39,29%, tương ứng) [5]

Bảng 3.1 Giá trị PIC và tỉ lệ phân đoạn đa hình của 70 mẫu Bách xanh phân tích

với 30 mồi ISSR

STT Mồi

Kích thước phân đoạn (bp)

PIC

Tổng phân đoạn

Phân đoạn

đa hình

Phân đoạn đồng hình

% Phân đoạn đa hình

Đa dạng gen trong một locus