Mục tiêu của luận án là sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản.
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
(Vibrio parahaemolyticus)
TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG
(Penaeus vannamei)
Cần Thơ, 2018
Trang 2CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn chính: PGS.TS Trương Quốc Phú
Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường
Họp tại: Vào lúc … giờ … ngày … tháng … năm …
Phản biện 1: Phản biện 2:
Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trang 3DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
1 Isolation and selection of lactic acid bacteria
that can antagonize Vibrio parahaemolyticus causing
acute hepatopancreatic necrosis disease in whiteleg
shrimp (Penaeus vannamei) Tạp chí Khoa học
Trường Đại học Cần Thơ Vol 7 (74-81)
2 Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic
vào thức ăn lên khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy
cấp tính trên tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần
Thơ 52b:122-130
Trang 4Chương I GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu
Tôm biển được xem là một trong những sản phẩm
có giá trị kinh tế cao và đã trở thành nguồn xuất khẩu chính của nhiều nước trên thê giới như Thailand, Indo, Vietnam, Malaysia, (FAO, 2013) Tuy nhiên, người nuôi hiện nay
đã nuôi tôm với mật số cao nên họ phải đối mặt với rất nhiều rủi ro Đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) Bệnh đã gây tác hại rất lớn đối với nhiều ao nuôi ở phía Nam Châu Á (FAO, 2013) Tổng số thiệt hại hàng năm hơn 1 tỷ USD (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015) Bệnh lần đầu tiên xuất hiện ở Trung Quốc năm 2009, sau đó lan truyền đến Việt Nam năm 2010, Malaysia và Thailand năm 2011, và lan truyền
đến Mexico năm 2013 (Tran Loc et al., 2014) Bệnh
AHPND xãy ra khoảng 30 ngày sau khi thả giống, tỷ lệ chết lên đến 70% (Zorriehzahra and Banaederakhshan, 2015) Hiện nay, có một số biện pháp để ngăn ngừa bệnh AHPND như dùng hóa chất, kháng sinh và chế phẩm sinh học Tuy nhiên, dùng hóa chất, kháng sinh thì hiệu quả không cao dễ gây ô nhiễm môi trường và tồn lưu hóa chất
và kháng sinh trong cơ thể thịt tôm Vì thế, cách tốt nhất
Trang 5Lactobacillus sp kháng lại vi khuẩn Vibrio sp (Trịnh Hùng Cường, 2011); Lactobacillus suntoryeus LII1 có khả năng kháng mạnh đối với Escherichia coli và Bacillus cereus (Hồ Lê Huỳnh Châu và ctv., 2010) Trong quá trình
lên men, vi khuẩn lactic sinh ra acid hữu cơ, chúng ức chế
vi khuẩn gây bệnh do sự tác động lên tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hưởng đến chức năng bảo vệ của màng tế bào
(Fooks et al., 1999; Jay, 2000; Gerald, 1999; Kuipers et al., 2000) Các nghiên cứu vừa nêu đã chỉ ra rằng LAB có
khả năng tiết ra chất ức chế vi khuẩn gây bệnh Việc nghiên cứu khả năng phòng trị bệnh của các chủng vi khuẩn là rất khả thi và đặc biệt là việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường Vi thế, nghiên cứu này được thực hiện nhằm
mục đích sử dụng LAB đối kháng với V parahaemolyticus, gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên
tôm
1.2 Mục tiêu tổng quát
Sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ao nuôi tôm cá nước mặn nhằm tạo nguồn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho
nuôi trồng thủy sản
1.3 Mục tiêu cụ thể
Sưu tập và chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic từ ruột tôm thẻ, ruột cá rô phi và bùn đáy ao nuôi tôm đối kháng
mạnh với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh
hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm he, từ đó sử dụng chúng để phòng bệnh AHPND trên đàn tôm nuôi
1.4 Ý nghĩa nghiên cứu
Luận án đã sưu tập và chọn lọc bộ chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ ruột cá rô phi và ruột tôm thẻ nhằm góp phần tạo nguồn vi khuẩn hữu ích có khả năng ngăn
Trang 6ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm nước lợ nói chung và tôm thẻ nói riêng Đồng thời, các chủng LAB này có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho nuôi trồng thủy sản, đóng góp vào sự phát triển nông
nghiệp theo hướng bền vững
Luận án đã góp phần mở rộng cơ hội cho người nuôi tôm giảm thiểu việc sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi tôm vùng ven biển, đồng thời tạo ra sản phẩm sạch
và giảm thiểu ảnh hưởng tiêu cực của nghề nuôi đến môi trường xung quanh
1.5 Điểm mới của luận án
Luận án đã sàng lọc được 12 chủng LAB có khả
năng kháng tốt với V parahaemolyticus với đường kính
vòng vô khuẩn từ 16,5-18,5mm Trong đó có 05 chủng có
khả năng kháng V parahaemolyticus rất tốt, đường kính
vòng vô khuẩn là 17,5-18,5mm
Luận án đã định danh được chủng LAB có khả năng làm giảm thiểu đáng kể bệnh hoại tử gan tụy cấp tính
trong nuôi tôm thẻ là chủng Lactobacillus plantarum khi
trộn vào thức ăn Chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng
để sản xuất chế phẩm sinh học
Luận án đã xác định được khi bổ sung các thành phần acid glutamic, KH2PO4, K2HPO4, và đường trehalose theo tỷ lệ C, N, và P theo tỷ lệ 15, 1 và 0,1 đã làm tăng sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh hoại tử cấp tính, đồng thời làm tăng khả năng gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ
Trang 7CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phân lập LAB từ nhiều nguồn khác nhau
a) Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu tôm thẻ được thu ở 3 tỉnh Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng, ở mỗi tỉnh thu 6 ao và mỗi ao thu 5 con tôm Tôm được lựa chọn thí nghiệm phải khỏe mạnh và có kích cỡ khoảng 20g/con
Mẫu cá rô phi được thu ở các ao lắng và các ao nuôi tôm kết hợp với kích cỡ khoảng 100 gam/con Địa điểm, cách thu mẫu cá rô phi cũng được thực hiện giống như thu mẫu tôm
Mẫu bùn được thu ở các ao thu mẫu tôm thí nghiệm
(Somiri et al., 2006) Trong mỗi ao, mẫu được thu 3 vị trí
(đầu ao, giữa ao, và cuối ao) và lượng bùn thu tại mỗi vị trí khoảng 100 g Mẫu thu tại 3 vị trí của cùng 1 ao được trộn lại với nhau (mẫu hổn hợp), giữ lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và chuyển về phòng thí nghiệm
b) Phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm, ruột cá rô
phi và bùn đáy ao nuôi tôm (Nirunya et al., 2008)
Mẫu tôm và cá rô phi được rửa sạch bằng nước cất
vô trùng và khử trùng bên ngoài bằng ethanol 70o, tiếp theo dùng dụng cụ giải phẫu để tách lấy toàn bộ ruột tôm và ruột trước của cá rô phi cho vào lần lượt từng ống nghiệm chứa 5 mL nước muối sinh lý đã được khử trùng Sau đó, dùng que thủy tinh nghiền cho đến khi mẫu đã đồng nhất với nước muối sinh lý, để lắng khoảng 5 phút sau đó hút 1
Trang 8mL lấy dịch trong cho vào 5 mL môi trường MRS broth
có bổ sung 1,5% NaCl
Đối với mẫu bùn, cân 1 gam mẫu hỗn hợp cho vào ống nghiệm chứa 9 mL nước muối sinh lý đã tiệt trùng, lắc đều mẫu bằng máy trộn, để lắng, sau đó hút 1 mL phần dịch trong cho vào ống nghiệm có chứa 5 mL môi trường MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl
Các ống nghiệm nuôi cấy LAB được ủ ở 28o C trong
48 giờ Sau khi ủ, dịch nuôi được pha loãng thành 10-1, 10
-2, 10-3 trong muối sinh lý Kế đến, hút lần lượt 50 µL từ các ống nghiệm có độ pha loãng nêu trên trải lên môi trường MRS agar (có bổ sung 1,5% NaCl và CaCO3 1%) rồi đem ủ ở 280 C trong 48 giờ Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc có màu trắng đục hoặc không màu và có khả năng làm tan CaCO3, cấy ria ra các đĩa petri có chứa môi trường MRS agar để tách ròng
3.3.2 Xác định tính đối kháng của chủng vi khuẩn
phân lập được với vi khuẩn V parahaemolyticus trong điều kiện in vitro (Sivakumar et al., 2012)
Vi khuẩn V paraheamolyticus được nuôi sinh khối
trong môi trường TSB có bổ sung 1,5% NaCl trong 24 giờ Sau đó sử dụng tăm bông tiệt trùng nhúng vào ống nghiệm
đã nuôi vi khuẩn và tán đều trên các đĩa petri chứa môi trường NA có bổ sung 1,5% NaCl, đặt vào tủ mát 40 C khoảng 1 giờ Sau khi làm mát, mỗi đĩa petri được đục 4
lỗ để tạo các giếng có đường kính 6 mm
Các chủng LAB (94 chủng) dùng trong thí nghiệm xác định tính đối kháng được nuôi trong ống nghiệm có chứa 5 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl, ủ ở 280C trong 48 giờ Tiếp theo hút 1mL dịch nuôi cấy cho vào ống tuýp (1,5 mL), ly tâm 10000 rpm trong 20 phút ở 40 C để
Trang 9lấy phần dịch trong Sau đó hút 50 µL phần dịch trong bơm vào mỗi giếng Trên mỗi đĩa petri, bơm dịch trong vào 3 giếng, giếng còn lại được bơm vào nước cất vô trùng Các đĩa petri này sau đó được ủ ở 28o C trong 24 giờ
Sau khi ủ, khả năng kháng V parahaemolyticus của
LAB được xác định thông qua sự hình thành vòng vô
trùng Mức độ kháng khẩn V parahaemolyticus của LAB
được đánh giá dựa trên đường kính của vòng vô trùng
(Sivakumar et al., 2012)
3.3.3 Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp khi bổ sung các chủng LAB vào thức ăn
Thí nghiệm được tiến hành trong bể kính có thể tích
30 L, bể thí nghiệm được rửa bằng nước sạch sau đó khử trùng trước khi sử dụng
Nguồn nước được xữ lý và loãng với nước ngọt để
có độ mặn 20‰
Tôm thẻ chân trắng kích cỡ trung bình khoảng 1g/con thì tiến hành bố trí thí nghiệm Trước khi bố trí, tôm được kiểm tra bằng phương pháp PCR, những mẻ tôm không mang mầm bệnh WSSV và AHPND Sau khi bố trí vào các bể thí nghiệm, tôm được thuần dưỡng 3 ngày cho quen với điều kiện môi trường
Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính (Nguyễn Trọng Nghĩa và ctv., 2015)
được phục hồi trong môi trường nutrient broth (NB, Merck) có bổ sung 1,5% NaCl (NB+), sau đó ủ ở 280C trong 18 giờ Ghi nhận màu sắc và hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram để kiểm tra tính thuần của vi khuẩn Khuẩn lạc vi khuẩn thuần được nuôi tăng sinh trong môi trường
Trang 10NB+ ở 280C trong 18 – 24 giờ sau đó xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm
Năm chủng LAB (T3.1, RP5.4.1, T4.2, RP5.5.1, RP6.5) đã xác định có khả năng kháng mạnh nhất với vi
khuẩn V parahaemolyticus được nuôi sinh khối trong môi
trường 100 mL MRS broth có bổ sung 1,5% NaCl trong
48 giờ Điều chỉnh để đạt mật số 109 CFU/mL Tiếp đến, đem ly tâm LAB với tốc độ 7000 vòng trong 5 phút, rửa lại 3 lần bằng nước muối sinh lý đã tiệt trùng, sau đó từng chủng LAB sẽ được hòa đều vào 10 mL nước muối sinh
lý và trộn đều vào 100g thức ăn và áo bằng 1mL dầu mực bên ngoài Thức ăn được cho vào túi ni lon, dán nhãn bảo quản ở 40C cho đến khi sử dụng
Phương pháp cảm nhiễm được thực hiện theo
phương pháp Loc Tran et al (2013) Tôm được ngâm trong dung dịch vi khuẩn V parahaemolyticus mật độ 2 x
107 CFU/mL trong 15 phút sau đó vớt và bố trí vào bể thí
nghiệm đã được bổ sung vi khuẩn V parahaemolyticus với
mật độ vi khuẩn của nước trong bể ở 106 CFU/mL Đối với nghiệm thức đối chứng âm tiến hành ngâm tôm trong môi trường TSB (có bổ sung 1,5% NaCl) tiệt trùng và cho vào bể không bổ sung vi khuẩn
Mẫu gan tụy tôm dùng trong phân tích mô bệnh học được thu khi tôm có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, ruột rỗng
sau 3 ngày cảm nhiễm với V parahaemolyticus Ngoài ra,
mẫu còn được thu (3 con/bể) khi kết thúc thí nghiệm
Trang 11a) Ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic
vào thức ăn lên tỷ lệ sống và khả năng kháng bệnh hoại
tử gan tụy cấp tính trên tôm thẻ chân trắng
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm
12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần (36 lô thí nghiệm) Các nghiệm thức thí nghiệm gồm:
1 ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không
gây cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus
2 LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1 và không gây cảm nhiễm
3 LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.4.1
và không gây cảm nhiễm
4 LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T4.2 và không gây cảm nhiễm
5 LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP5.5.1
và không gây cảm nhiễm
6 LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng RP6.5
và không gây cảm nhiễm
7 ĐCD: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và gây cảm
nhiễm V parahaemolyticus
8 VP-LAB1: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng T3.1
và gây cảm nhiễm V parahaemolyticus
9 VP-LAB2: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.4.1, gây cảm nhiễm V parahaemolyticus
10 VP-LAB3: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
T4.2 và gây cảm nhiễm V parahaemolyticus
11 VP-LAB4: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP5.5.1, gây cảm nhiễm V parahaemolyticus
Trang 1212 VP-LAB5: Tôm ăn thức ăn có bổ sung LAB, chủng
RP6.5, gây cảm nhiễm V parahaemolyticus
Thí nghiệm được tiến hành trên bể kính chứa 20 L nước có độ mặn 20‰, sục khí liên tục trong thời gian thí nghiệm Mỗi bể thí nghiệm bố trí 30 con tôm khỏe với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức thí nghiệm, kích cỡ trung bình 1g/con Ở nghiệm thức ĐCA và ĐCD, tôm được cho
ăn bằng thức ăn viên CP chứa 40% đạm Ở các nghiệm thức còn lại, tôm được cho ăn thức ăn cùng loại nhưng có
bổ sung các chủng LAB với mật số 109CFU/g trong suốt thời gian thí nghiệm Tôm được cho ăn 3 lần mỗi ngày vào lúc 7, 13, và 17 giờ, cho ăn theo nhu cầu Bảy ngày sau khi được bổ sung LAB ở các nghiệm thức thí nghiệm bao gồm nghiệm thức 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, và 12, tôm được gây
cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus, sau đó thí
nghiệm được tiếp tục theo dõi trong thời gian là 14 ngày Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm bao gồm:
- Tỷ lệ sống của tôm sau khi cảm nhiễm vi khuẩn V parahaemolyticus 14 ngày
- Theo dõi và ghi nhận dấu hiệu bệnh lý và khả năng kháng bệnh ở tôm bằng cách tiến hành thu mẫu và phân tích mô bệnh học sau khi cảm nhiễm
b) Thử nghiệm khả năng kháng bệnh hoại tử gan tụy cấp của các chủng LAB trong điều kiện có bổ sung các thành phần C, N, P (acid glutamic, KH 2 PO 4 ,
K 2 HPO 4 , và đường trehalose)
Thí nghiệm sử dụng acid glutamic (C5H9NO4) là nguồn cung cấp C và N Đường trehalose cũng là nguồn cung cấp C KH2PO4 và K2HPO4 là nguồn cung cấp P với
tỷ lệ C, N, P là 15, 1, 0,1 Nhịp bổ sung là 7 ngày/lần
Trang 13Các chủng LAB và vi khuẩn V parahaemolyticus
dùng trong thí nghiệm này cũng chính là các chủng đã được sử dụng ở thí nghiệm ở Mục 3.3.3a Tuy nhiên, trong thí nghiệm này chỉ chọn 3 chủng có khả năng phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính là chủng LAB1, LAB2 và LAB5
để thực hiện Thí nghiệm được bố trí với 10 nghiệm thức Các bước thí nghiệm cũng được thực hiện tương tự như thí nghiệm ở mục 3.3.3a với 10 nghiệm thức:
1 ĐCA: Tôm ăn thức ăn không bổ sung LAB và không
gây cảm nhiễm V parahaemolyticus, không bổ sung C, N,
P
2 ĐCA+CNP: không cảm nhiễm V parahaemolyticus,
cho ăn thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P
3 ĐCD: có cảm nhiễm V parahaemolyticus, cho ăn thức
ăn không chứa LAB, không bổ sung C, N, P
4 ĐCD+CNP: có cảm nhiễm V parahaemolyticus, cho ăn
thức ăn không chứa LAB, có bổ sung C, N, P
5 LAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, không
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
6 VPLAB1+CNP: cho ăn thức ăn có bổ sung LAB1, có
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
7 LAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, không
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
8 VPLAB2+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB2, có
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
9 LAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, không
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P
10 VPLAB5+CNP: Cho ăn thức ăn có bổ sung LAB5, có
cảm nhiễm V parahaemolyticus, có bổ sung C, N, P