Luận văn tốt nghiệp: Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hydrophthamus) bị bệnh xuất huyết - ĐH Cần Thơ

Luận văn tốt nghiệp: Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hydrophthamus) bị bệnh xuất huyết nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Aeromonas hydrophila, đồng thời cũng so sánh với kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống,...Mời bạn đọc cùng tham khảo.

TRƯỜNG ĐẠI HOC CAN THO

KHOA THUY SAN

BO MON SINH HOC VA BENH THUY SAN

TRƯỜNG ĐẠI HOC CAN THO

KHOA THUY SAN

BO MON SINH HOC VA BENH THUY SAN

LOI CAM ON

Được làm và hoàn thành tốt luận văn tết nghiệp là mong muốn của các sinh

viên Để hoàn thành tốt luận văn này là cả một quá trình học tập, phấn đấu

cùng với sự hướng dẫn nhiệt tình của các thầy cô và anh chị

Đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến các quý thầy cô khoa Thủy sản trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Sinh học và Bệnh

Thủy sản đã truyền đạt những kiến thức quý báo trong suốt quá trình học và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Đặng Thị Hoàng Oanh đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báo trong suốt thời gian thực hiện để tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Xin gởi lời cảm ơn đến cô Bùi Thị Bích Hằng đã nhiệt tinh quan tâm động viên trong suốt thời gian làm cé van học tập

Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Thu Hằng, cô Trần Thị Tuyết Hoa, chị Nguyễn Trúc Phương, chị Nguyễn Hà Giang và anh Lê Hữu

Thôi cùng các bạn lớp bệnh học thủy sản K31, đặc biệt là bạn Mai Thị Loan

lớp BHTS-K31 đã nhiệt tình quan tâm giúp đỡ và động viên trong suốt thời

gian thực hiện đề tài

TOM TAT

Đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR phát hiện vi khudn Aeromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthabmus) bị bệnh xuất huyết? được thực hiện nhằm chuẩn hóa phương pháp PCR phát hiện A

hydrophila Đồng thời cũng so sánh với kết quá định đanh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit API 20E, Đề tài được thực hiện trên 7 chủng vi khuan A hydrophila phan lập trực tiếp từ cá tra bị bệnh xuất huyết ở các cơ quan (gan, thận và tỳ tang) của 3 tỉnh (Cần Thơ, Vĩnh Long, Đồng Tháp), A hydrophila được định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và kit

API 20E sau đó trữ trong glycerol (50%) ở -20°C Sau khi phục hồi trên môi trường đặc trưng (Aeromonas agar + Ampicillin) tách sang NA và nuôi tăng

sinh trong NB, DNA được chiết tách theo Bartie et al (2006), chiét tach bằng 2 cách (chiết tách từ vi khuẩn nuôi trong NB và vi khuẩn trên đĩa NA pha loãng với nước muối sinh lý) Phản ứng PCR được khuếch đại DNA theo Panangala

er ai (2007) có chỉnh sữa bởi Đặng Hoàng Oanh và c¡y (2008)

Kết quả điện đi sản phẩm PCR của 7 mẫu DNA chiết tách từ NB và 7 mẫu DNA chiết tách bằng cách pha loãng với nước muối sinh lý, có sự hiện điện của vi khuẩn A bydrophila, tất cả đều hiện vạch ở vị trí 209 bp

Điện di sản phẩm PCR cia 7 ching A hydrophila ma khong qua bước chiết tách DNA, do không chiết tách nên phản ứng PCR không khuếch đại được DNA của A hydrophila, kết quả cả 7 mẫu đều không hiện vạch khi điện di Phán ứng PCR xác định độ nhạy giới hạn thấp nhất có thể phát hiện A

hydrophila la Ing/ul (hàm lượng DNA) Phương pháp PCR với hàm lượng thành phần hóa chất tham gia phản ứng và đoạn mồi đặc trưng chỉ cho phép phát hiện A zydrophiia hiện vạch ở (209 bp), khi thử tính đặc hiệu với các

chung (Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi, E ictaluri, Pseudomonas putida, Eschericchia coli)

ii

MUC LUC

9809.) 00 08a i

¡"v2 ii 18/959 01157 o iii DANH SACH BANG

D920) \0:8.in/ 0n i Churong 1: GIGI THIBU cccccssessssessscsssesssecsnesssesessessseessecsvecssecsusssseesaeessnesase 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 52-55 525<2xtvzxvrvrrrreerre 3

2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam ó- 6 HH ngư, 3

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản -555-+- 3 2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh + 5s+ 22+ 22121112121 12112cz.xee 4 2.4 Sơ lược về bệnh ở cá tra + sx2 v2 2112111211112 111121121111.111 1211 tr 5 2.5 Sơ lược về vi khuẩn A ydrophila gây bệnh trên cá tra 7

2.6 Phương pháp PC - 2H HH HH HH nành 9

2.6.1 Khái niệm về PCR -t 2h ưn0 201110111201111021121112211 9 2.6.2 Các nhân tô ảnh hướng tới phản ứng PCR - - 11

2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản c55c5Sc 12

2.6.4 Đối chứng 2< St ke 2 1102111110711 T11 11 TH 1g giết 13 2.6.5 Hạn chế của PCR - s2 t2 2 1112171121111202111111120111 0211 1111 re 13 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - se c2xcverreecrxrrrreerxee 15

3.1.2 Dia GIS nh ẽố ẽ 15

3.1.3 Nội dung thực hiện . cà HH HH HH Hàng ng ket 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu s 25+¿ 2x22 2E111212111271121111 17112111221 0, 15

3.2.2 Hoa chat thi nghiQm .scecssesssesssesesvesssessvecssessnesssceseessseessecseesssecssees 16

3.3 Phương pháp nghiên CỨU - 2s SH HH HH Hà hy 16

3.3.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển 5 55-5+c2c<czeevrrrrrreee 16

iii

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http:/Awww.fineprint.com

3.3.2 Ngudm vi KWAN o cccssessssesssssseeessesssecssscssessosssavsessecavecssscsuesssecsnssesseease 16

3.3.3 Phương pháp phân lập vi Kwan .ceeccsccsesssessssssssessessscessessseessessaseense 17

3.3.4 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuân 18

3.3.5 Phương pháp PC -ó HH HH Hàng tt 18

3.3.6 Thí nghiệm xác định độ nhạy của qui trình PCR ‹ 20

3.3.7 Thí nghiệm xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR 21 Chương 4: KẾT QUÁ VÀ THẢO LUẬN - 5-52 cccccxrerceecre 22 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn A hy/rophiia trên cá tra bị bệnh xuất huyết 22 4.2 Kết quả phục hồi vi khuẩn - + 5c 25Sccrxecrxeckxerrkrrxrrrreeree 23 4.3 Phát hiện vi khuẩn A byđrophiia bằng phương pháp PCR 24

4.4 Độ nhạy của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila 26 4.5 Tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hyđrophila 27

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤTT +-ccc sec crrcrkkerrrerrrrrre 30

iv

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version http:/Awww.fineprint.com

DANH SACH BANG

Bang 3.1: Trinh tự 2 doan mdi sit dung trong qui trinh PCR (Panangala et al., 2007) HH“ HH kh TT Tà TH ng TH TH T101 12 16 Bang 3.2: Nguén géc cdc ching vi khuẩn sử đụng cho đề tài 17

Bảng 3.3: Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của qui trình PCR phát hiện A ñydroplil4 SH re 19

Bang 4.1: Bang két quá thu mẫu cá tra bị bệnh -. 5c©555c 555 22

DANH SACH HINH

Hình 2.1 Nguyên lý kY thudt PCRou sccccsssccssssecsssssessesssesessseesesssecssssecesssneess 10

Hình 4.1 Cá tra bị bệnh xuất huyết (xoang bụng, hậu môn, nắp mang xuất huyết và mắt lồi đục) 5s s22 c2 2111 1111011 T1 Tra ngà tre rey 22

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc của A hyẩrophila trên môi trường Aeromonas ägar + AImpiCiÌÏÌT sọ HT TH HH cuc TH Hàn Tà 23 Hình 4.3Hình khuẩn lạc của A byđrophila trên môi trường NA 23 Hình 4.4 Hình nhuộm gram vi khuẩn A hydrophila cccccccc 24 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng A hyẩrophila 25 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR, không qua chiết tách DNA của chủng A byđrophiÏAd ch HH HH ng TH nh ch ng 26 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện A hydrophila x4c định độ nhạy của phương phấp sa cà nh HH TH TH HH cư gi 27 Hình 4.8 Kết quá điện di sản phẩm PCR xác định tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện A #ydrophild HH HH HH ng ng cư 28

vì

Chuong 1 GIOI THIEU

Ngày nay nghề nuôi thủy sản đặc biệt là cá tra ở đồng bằng sông Cửu Long

(ĐBSCL) là một thế mạnh hàng đầu được nuôi ở các tỉnh như: Đồng Tháp, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Xuất phát từ những nhu cầu về kinh tế, về thị

trường trong và ngoài nước, đòi hỏi phải đáp ứng một sản lượng cá thịt lớn Nên mật độ và diện tích nuôi cá tra ngày càng tăng đáng kể Năm 2006, sản

lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tan, xuất khẩu được 292.800 tấn, thu

về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu thủy

sản của cả nước Trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích nuôi cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra

dat 380.489 tan, khối lượng cá tra xuất khâu được 173.100 tắn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với cùng kỳ năm 2006 (Báo Cần Thơ, 2007)

Hiện nay nghề nuôi cá tra chủ yếu được nuôi thâm canh trong ao đất, đo chỉ

phí đầu tư thấp hơn nghề nuôi cá tra bè, mức độ thâm canh cao có thể lên đến (50-60 con/m” ao), đã làm nẫy sinh nhiều vấn đề dịch bệnh do khó quán ly tốt môi trường nước ao nuôi Ở Việt Nam, đầu năm 2006 các tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết do bệnh mủ gan lên đến 60% (Tài nguyên và môi trường

Việt Nam, 2006; trích lược bởi Lương Trần Thục Đoan, 2006) Cá tra là một

loài cá kinh tế và khi có địch bệnh đã gây tỉ lệ chết cao, nên có nhiều nghiên cứu về bệnh trên cá tra đã được triển khai như: nghiên cứu về bệnh đốm trắng

ở nội tạng (Lê Thị Bé Năm, 2002), bệnh mủ gan (Lương Trần Thục Đoan,

2006), bệnh trùng quả dưa ( Lê Thành Đen, 2006), bệnh vàng đa (Phạm Thanh

Hương, 2006), nghiên cứu khá năng gây bệnh của Edwardsiella ictaluri va Aeromonas hydrophila (Ngé Minh Dung, 2007), bệnh trắng gan, trắng mang

(Phan Khắc Huy, 2008),

Bệnh xảy ra trên cá tra đo nhiều tác nhân như ký sinh trùng, vi khuẩn, nấm,

dinh đưỡng, Trong đó vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh

nghiêm trọng, khó điều trị và gây tỷ lệ hao hụt cao ở cá tra Các loại bệnh do

tác nhân vi khuẩn gây ra như bệnh đỏ mỏ, đỏ vây, xuất huyết đường ruột,

trắng gan trắng mang, trắng đa trắng đuôi, Bệnh xuất huyết (còn gọi là bệnh

đốm đỏ) đo vi khuẩn Aeromonas là một trong những bệnh phô biến và xuất hiện hầu như quanh năm ở cá tra (Ngô Minh Dung, 2007)

Hiện nay phương pháp chuẩn đoán vi khuẩn nói chung và A byđrophiia nói riêng, gây bệnh trên cá tra ở nước ta dựa vào dấu hiệu bên ngoài và phương

pháp sinh hóa truyền thống hoặc sử dụng bộ kit API 20E, không cho phép phát

hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh Cũng như Ngô Minh Dung (2007) gây cảm nhiễm vi khuẩn A hyđrophila và E ictaluri trên cá tra, sau đó tái

định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1

tuần để đọc kết quả, hàng loạt các để tài nghiên cứu của Lương Trần Thục

Đoan (2006), Tiết Ngọc Trân (2007), Lê Minh Đương (2007) cũng đã sử dụng

kit API 20E để kiểm tra vi khuẩn mất khoảng 2 ngày để có kết quả Cụ thể

Nguyễn Trúc Phương (2008) đã ứng dụng phương pháp PCR kiểm tra kết quả

định danh vi khuẩn sau khi đùng phương pháp sinh hóa truyền thống va kit API 20E để định danh EÈ ictaluri trén cá tra, đã kết luận phương pháp PCR cho phép phát hiện sớm và chính xác vi khuẩn chỉ cần l ngày, Nguyễn Hà

Giang (2008) cũng đã ứng dụng phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

sau khi đã định danh nhưng chưa cho kết quả tốt Do đó để chân đoán nhanh

va chinh xdc vi khuan A hydrophila trén cd giúp cho người nuôi phát hiện kip

thời, hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do vi khuẩn này gây ra, thì ứng dụng

phương pháp PCR Nén dé tai “Ung dụng phương pháp PCR phát hiện vỉ khuẩn Acromonas hydrophila phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthaimus) bị bệnh xuất huyết" được thực hiện nhằm góp phần vào việc chuân hóa phương pháp phát hiện vi khuẩn A hydrophila gây bệnh ở cá tra Mục tiêu nghiên cứu

Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hién A hydrophila phan lap

từ cá tra bị bệnh xuất huyết

Nội dung nghiên cứu

- Thực hiện và chuẩn hóa phương pháp PCR phát hién A hydrophila phan

lập từ cá tra bị bệnh xuất huyết

- Xác định độ nhạy của phương pháp PCR phat hién A hydrophila

- Xác định tính đặc hiệu của phương pháp PCR phát hiện A hydrophila

2

Chuong 2

LUQC KHAO TAI LIEU

2.1 Tình hình nuôi thủy sản ở Việt Nam

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), cho biết

7 tháng đầu năm 2008 xuất khẩu thủy sản cả nước đạt khoảng 2,388 tỷ USD,

tăng 20% so cùng kỳ năm ngoái Trong đó, sán phẩm tôm đông lạnh chiếm

32,8%; cá tra-ba sa chiếm 31,0%; còn lại là các loại thủy sản khác Theo Thứ

trưởng Bộ NN-PTNT Lương Lê Phương, 5 doanh nghiệp ở ĐBSCL gồm:

Nam Việt, Agifish, Hùng Vương, Vĩnh Hoàn và Cafatex thống nhất sẽ liên kết với nhau để nâng giá xuất khẩu cá tra, ba sa lên 5% trên thị trường thế giới nhằm đây giá nguyên liệu tăng lên Đây có thể xem là mức giá sàn để áp dụng

cho các đoanh nghiệp xuất sản phẩm ra bên ngoài, tránh tình trạng cạnh tranh bán giá thấp (Huỳnh Phú Trọng, 2008)

Tình hình nuôi thủy sản ¿ ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có khoảng 400.000 ha mặt nước nuôi

thủy sản với tổng sản lượng hằng năm lên đến hơn 1,5 triệu tấn, chiếm hơn 70% sản lượng thủy sản nuôi của cả nước (riêng cá tra, basa điện tích nuôi

toàn vùng gần 5.000 ha, tổng sản lượng năm 2007 khoảng 1 triệu tấn) Diện

tích mặt nước NTTS ở khu vực ĐBSCL tăng nhanh trong những năm gần đây Năm 2000 là 445.300 ha với tổng sản lượng NTTS là 365.141 tần; năm 2002

là 570.300 ha, sản lượng 518.743 tấn; năm 2004 là 658.500 ha, sản lượng

773.294 tấn; năm 2005 là 685.800 ha với sản lượng khoảng 983.384 tấn Quy

hoạch NTTS đến năm 2010 ở khu vực ĐBSCL đối với nuôi thủy sản nước

mặn-lợ là 649.430 ha, NTTS nước ngọt là 366.590 ha cho thấy NTTS ngày càng chiếm vị trí quan trọng trong phát triển kinh tế - xã hội khu vực ĐBSCL (Pham Đình Đôn, 2006) Song song với việc tăng điện tích và năng suất NTTS

thì vấn đề địch bệnh thủy sản ngày càng diễn biến phức tạp và đa đạng do

nhiều tác nhân

2.2 Nguyên nhân và tình hình dịch bệnh thủy sản Diện tích và mật độ nuôi thủy sản ngày càng tăng, làm cho môi trường nước

càng bị ô nhiễm đo chất thải từ các ao nuôi Cùng với sự ô nhiễm do chất thải

từ con người góp phần làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm nặng hơn Đối

với nuôi cá nước ngọt, lượng thải ít nhiều còn phụ thuộc vào thức ăn đưa vào

chăn nuôi (thông thường 1,5-2 kg thức ăn/1 kg sản phẩm), ngoài ra còn lượng thức ăn dư thừa lắng xuống tạo ra nguồn chất thải rất đễ phân hủy hữu cơ gây

ô nhiễm môi trường là nguy cơ phát sinh và lây lan dịch bệnh Cùng với tác

động môi trường do chất thải trong sản xuất chế biến công nghiệp, cũng góp phần tác động đến chất lượng môi trường nước ảnh hưởng đến cả kinh tế và môi trường sinh thái (Phạm Đình Đôn, 2006)

Mặt khác do nước ta nằm trong khu vực diễn biến thời tiết ngày càng phức tạp, ánh hưởng đến môi trường nuôi thủy sản làm cho động vật thủy sản dễ bị

sốc Cuối năm 2007, chương trình phát triển của Liên Hiệp Quốc đã xác định: Việt Nam là 1 trong 5 vùng bị tác hại của biến đổi khí hậu nặng nề nhất thế giới ĐBSCL là vùng đất thấp ven biển Đông của Việt Nam nên sẽ là khu vực

bị tác hại nặng nề nhất đo biến đổi khí hậu (Lệ Thu, 2008)

Theo các nhà khoa học, 10 năm qua, diện tích NTTS ở ĐBSCL đã tăng hơn

2,37 lần, sản lượng tăng vọt lên 3,68 lần nhưng cũng làm cho nguồn nước bị ô

nhiễm nặng, đe dọa sự mắt cân đối trong chiến lược qui hoạch thủy lợi hiện

nay Ước tính mỗi năm, hoạt động NTTS đã thải ra môi trường nước xấp xỉ 4

triệu tấn bùn ở đạng chất thai hữu cơ gần như chưa được xử lý Mầm bệnh từ

các ao nuôi cũng đã đi theo nguồn chat thai nay ra hệ thống sông rạch làm chất lượng nhiều vùng nước suy giảm nặng nề Thực tế cho thấy nuôi cá tra, cá ba

sa trong ao hầm, chỉ có khoảng 17% thức ăn được cá hấp thụ, phần còn lại khoáng 83% hòa lẫn, lắng đọng trong môi trường nước thành chất hữu cơ phân hủy đã làm cho môi trường bị suy thoái (Trần Khánh Linh, 2007)

2.3 Các thời kỳ phát triển của bệnh Theo Từ Thanh Dung (2005)

Thời kỳ ủ bệnh: Đây là thời kỳ từ khi nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào

cơ thê đến lần thứ nhất xuất hiện triệu chứng bệnh, lúc này triệu chứng bệnh

bình thường của cá bị thay đổi Trong thời kỳ ủ bệnh sinh vật ký sinh tìm cách tích lũy dinh dương để tăng cường độ sinh sản và hoạt động, ký chủ tạo ra

những yếu tố miễn dịch phòng vệ

Thời kỳ dự phát: Là thời kỳ chuyển tiếp từ lúc xuất hiện bệnh đầu tiên đến

bệnh lý rõ ràng, thời kỳ này tác nhân gây bệnh tác động đến cơ quan của cá

Thời kỳ thịnh vượng: Thời kỳ bệnh phát triển cao nhất, dấu hiệu bệnh lý rõ

Tràng, quá trình trao đổi chất, hình thái cấu tạo, các tổ chức cơ quan bên trong

2.4 Sơ lược về bệnh ớ cá tra

Theo nông nghiệp, nông sản, thủy sản Việt Nam (2007)

Cá tra cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, đễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến Các tác nhân gây bệnh cho cá gềm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuân và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi

trường, dinh dưỡng hoặc do các vi sinh vật gây ra

Bệnh do giáp xác ký sinh Bệnh trùng mô reo Trùng gây bệnh có tên Lernaea, có dạng giống Thỏ neo, cơ thể có chiều dai 8- 16mm, giống như cái que, đầu có mẫu cứng giống mỏ neo cắm sâu vào cơ thé

cá Trùng thường ký sinh ở đa, mang, vây và mắt cá

Bệnh rận cá (Argulosis) Trùng gây bệnh thuộc giống Arguius, có hình dạng giống con rệp nên còn gọi

là rận cá hay bọ cá, bọ ve, nhìn thấy được bằng mắt thường

Bệnh nắm thúy mi ( Saprolegiosis)

Do 2 giống nấm $aprolegnia và Achiya gây ra gồm có Saprolegnia

parasitica, S ferox, Achlya spp Cá bị bệnh có dấu hiệu trên đa cá xuất hiện những vùng trắng xám, giống đám bông mềm Nhiệt độ nước 18-25°C thích

hợp cho nắm phát triển

Bệnh Ký Sinh Trùng Bệnh trùng bánh xe ( Tríchodinosis)

Dấu hiệu: thân cá có lớp nhớt màu trắng hơi đục, mang cá đầy nhớt Cá

thường nôi đầu và tập trung nơi có nước chảy, đôi khi nhô đầu lên mặt nước lắc mạnh đâu Cá bệnh nặng thường lờ đờ, đảo lộn vài vòng, chìm xuông đáy roi chét

Bénh tring qua dua (Ichthyopthisiosis) Trùng quả đưa ký sinh trên da, mang và vây Trùng bám thành các hạt lắm tắm

rất nhỏ, có thể thấy được bằng mắt thường Biểu hiện là da và mang cá có nhiều nhớt, màn sắc nhợt nhạt Cá nổi đầu từng đàn trên mặt nước, bơi lờ đờ

do trùng bám nhiều ở mang, phá hoại biểu mô mang làm cá ngạt thở Ngoài ra nghành trùng bào tử sợi Myxosporidia, sán 16 móc Dactylogyrus, sán 18 móc

Gyrodactylus, cũng có thê là tác nhân gây bệnh cho cá tra Trần Văn Tếch

(2008) đã phân tích mẫu cá tra bị bệnh vàng da phát hiện có (2ac?ylogyrus, Trichodina, Myxobolus, Bucephalopsis, ) nhưng chưa xác định ký sinh trùng

là tác nhân gây bệnh vàng da trên cá tra

Nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Aeromonas

Nhóm vi khuẩn gây bệnh chủ yếu thuộc giống Aeromonas gồm có A

hyrophila, A caviae và A sobria Vi khuẩn có mặt trong nước có nhiều chất

hữu cơ Cá con đễ mẫn cảm hơn cá trưởng thành, có thê gây chết đến 80%

Nhiễm khuẩn do Pseudomonas (Bệnh đốm đỏ)

Tác nhân gây bénh do Pseudomonas fluorescens, P anguilliseptica, P

Chiororaphis Cá bị bệnh này có đấu hiệu xuất huyết từng đốm nhỏ trên đa,

xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng, bề mặt cơ thê chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn

Nhiễm khuẩn huyết do Eđwardsiella

Bệnh do vi khuẩn E /zrda gây ra Xuất hiện những vết thương nhỏ trên đa

(phía mặt lưng) Những vết thương này sẽ phát triển thành những khối u rỗng

bên trong cơ và đa bị mất sắc tế Cá mắc bệnh sẽ mất chức năng vận động do

vây đuôi bị rách, gay Có thé xuất hiện những vết thương bên dưới biểu bì, cơ, khi Ấn vào sẽ phát ra khí có mùi hôi Các vết thương này sẽ gây hoại tử vùng

cơ xung quanh Ngoài ra, Trần Thị Ngọc Hân (2006) thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá tra bằng 2 phương pháp ngâm và tiêm E.ictaluri két quả đến

ngày thứ 10 bên ngoài cá có hiện tượng xuất huyết vây đuôi, trên thận có đốm

trắng

Vi khuẩn là một trong những nhóm tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản

mà chủ yếu thường gặp nhất là nhóm vỉ khuân gram âm, tác nhân vi khuẩn

được coi là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp gây bệnh cho các loài thủy

san (Inglish et al., 1993) Mặc khác theo Buler (2004) vi khuẩn không chỉ tồn

tại trên vật chủ mà còn tồn tại ngay trong môi trường nước với mật độ tùy theo

chất lượng nước (trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008) Vi khuẩn 4 hydrophila là một trong những loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm và thường

gặp trên cá tra hiện nay

6

2.5 Sơ lược về vi khuẩn A hydrophila gay bénh trén cé tra Tac nhan gay bénh

Theo Bùi Quang Té (2005) giédng vi khudn Aeromonas thudc ho

Aeromonadaceae, b6 Aeromonadales, \6p Gammaproteobacteria, nganh

Proteobacteria Trong giéng Aeromonas cé 2 nhém, (1) loài vi khudn không

đi động (A salmonicida) thường gây bệnh ở cá nước lạnh, (2) các loài vi

khuẩn di động bao gồm (A hydrophila, A caviae, A sobria), đặc tính chung

của 3 loài vi khuẩn này là đi động nhờ có Í tiêm mao, vi khuẩn gram âm, hình

que ngắn, hai đầu tròn, phản ứng oxidase dương tính, khử nitrat, không mẫn

cảm với thuốc thử O/129 Các loài vi khuẩn Aeromonas di động đều được

phân lập từ cá nước ngọt nhiễm bệnh, thường gặp nhất là A hydrophila (trích

dẫn bởi Huỳnh Thị Phượng Quyên, 2008)

Theo Bergey (1957), vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, bao

gồm 3 loài A hydrophila, A caviae, A sobria Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễm trùng máu, bệnh sởi, là bệnh do vi khuẩn A hydrophila Vi khuẩn A hydrophila phát triển trên môi trường thạch có khuẩn lạc tròn, mầu vàng rất nhạt, rìa đều hơi lồi, ướt, nhẫn bóng Vi khuẩn đi động

(có 1 tiêm mao), gram âm, oxidase đương tính, kháng với O/129, hiếu khí và

hiếm khí không bắt buộc, có khả năng lên men, hình que ngắn đài 2-3 ym, hai

đầu hơi tròn Nuôi cấy chúng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28-30°C, sinh

trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1-7,2 (trích dẫn bởi Từ Thanh

Dung, 2008)

Theo Lewis & Plumb (1979) cho rằng trong các chủng vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thi A hydrophila được xem là chủng gây bệnh cho cá nước ngọt

quan trọng nhất, gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết ở những loài cá nuôi

và cá tự nhiên, theo Angka (1990) A hyđrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java-Indonesia và gây tỉ lệ chết từ 80-90% (trích dẫn bởi Ngô Minh Dung,

2007)

Bên cạnh đó trong báo cáo của Saitanu e/ zi., (1982) đã tìm thấy vi khuẩn A hyảrophila gây bệnh xuất huyết do bệnh nhiễm trùng máu trên cá chép

Dấu hiệu bệnh lý

Cá bị nhiễm A hydrophila có biểu hiện chung là đa thường đổi màu tối, không

có ánh bạc, cá mất nhớt, khô ráp, xuất hiện các đốm xuất huyết đỏ trên (thân, các gốc vây, quanh miệng), hậu môn xuất huyết, mắt lồi đục Ở cá tra và cá

basa xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái nhợt, mật sưng

to, thận sưng, ruột đạ đày bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng chứa nhiều

địch nhờn có mùi hôi thối, cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và treo râu

(Bui Quang Té, 2006)

Theo Từ Thanh Dung (2008) cá bị bệnh sam mau từng vùng ở bụng, xuất hiện

từng máng đỏ trên co thé, đuôi và vây bị hoại tử, xuất hiện các vết thương trên

lưng, các khối u trên bề mặt cơ thể, vay dé roi rung, mắt lồi mờ đục, xoang bụng chứa dịch nội tạng hoại tử

Bệnh đốm đỏ, xuất hiện vào lúc giao mùa, nhiễm trên cả cá tra, basa và nhiều loài cá khác Bệnh gây ra do một số loài vi khuẩn như A #yđrophila và

Pseudomonas fluorescens Cá bị bệnh thường bơi lờ đờ trên mặt nước, trên

thân xuất hiện điểm xuất huyết nhỏ li tỉ, nếu bệnh nặng thì các gốc vây cũng

xuất huyết Bụng cá trương to, thành ruột xuất huyết, cá ít ăn hoặc bỏ ăn Các

tia vây lưng, hậu môn và vây đuôi bị rách xơ xác (Bộ thủy sản, 2008)

A hydrophila, A caviae va A sobria cả 3 loài phân lập được trên cá khi có

dấu hiệu bệnh nhiễm khuẩn huyết, mặt dù A hydrophilz là loài thường gặp

nhất Thỉnh thoảng cũng phân lập được vi khuẩn gram âm khác như

Pseudomonas fluorescens (theo Roberts & Horne 1978, Schaperclaus 1926)

hoặc Profeus refigeri trên cá bị nhiễm khuẩn huyết (theo Bejerano et al

1976), có thể phân lập được đĩa cấy thuần của một chủng, hoặc kết hợp nhiều

chúng thì gây anh hưởng cao hơn (trích dẫn bởi Inglis et al, 1993)

Phân bố và lan truyền bệnh

Đỗ Thị Hoda va ctv (2004) bénh nhiém tring do A hydrophila thuéng gặp ở nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt ở nhiều nước khác nhau như Trung

Quốc, Nhật Bán, Đài Loan, Thái Lan, Úc, Ở Việt Nam, các loài cá nuôi

lồng, bè và ao hồ nước ngọt đều có thể bị bệnh như: cá trắm cỏ, tra, basa, trôi,

chép, mè, trê, Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30-70% Bệnh có

thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau từ cá giống, cá thịt và cá bố mẹ Ở Việt Nam bệnh do A byđrophila có thể xuất hiện quanh năm, nhưng thường tập trung vào mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh xuắt hiện nhiều

vào đầu mùa mưa, mùa có nhiệt độ 25-28°C

Ở Châu Âu, bệnh do A hyđrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa

xuân-hè, nhiệt độ nước khoảng 17-22°C, đây là khoảng nhiệt độ cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993 trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Chẵn đoán bệnh

Theo Từ Thanh Dung (2008), chan đoán bệnh do Aeromonas là dựa vào các

dấu hiệu bệnh lý, mùa vụ xuất hiện bệnh, kết quả phân lập bằng phương pháp truyền thống Để phát hiện bệnh nhanh và ở giai đoạn sớm của bệnh cần áp

§

dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), hodc ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Một số nghiên cứu về A hydrophila

Groberg (1978) khi gay cam nhiém A hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận

tỷ lệ chết thường cao ở 20,5°C va 17°C, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15°C và 12°C,

còn ở 9°C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and

Stevenson, 1988; trích dẫn bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thf nghiém gây cảm nhiễm A

hydrophila trén c4 vang (Carassius auratus) bang 4 cach: tiém 6 bung (mat

a6 vi khudn 3x10*-3x10® CFU/ml), tiêm dudi da (8,5x10*-8,5x10° CFU/ml), tiêm ở co (8x10*-8x10® CFU/ml), va ngim vi khuẩn (4,6x10!-4,6x10”

CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới

da độc lực của vi khuân mạnh nhất với giá trị LDsạ là 105“ CFU/ml (trích dẫn

bởi Ngô Minh Dung, 2007)

Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng

A hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 107 đến 10” CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LDạo lần luge 1a 3,68x10° CFU/ml, 2,64x10° đến 4,52x10° CFU/ml và 1,96x10° dén 1,45x10’ CFU/ml

2.6 Phương pháp PCR

2.6.1 Khái niệm về PCR

Kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) do Karl Mullis e? ai phát mỉnh năm 1985 Thực chất đây là một phương pháp tạo

dong DNA invitro khéng can có sự hiện điện của tế bào (trích dẫn bởi Đặng

Thị Hoàng Oanh, 2007) Nguyên tắc của phản ứng PCR (xem hình 2.1)

PCR : Polymerase Chain Reaction

30 - 40 cycles of 3 steps :

mhmrm mm " 1 minut 94 °C

SMM TTT TTT TT tte TTT TT TT TT ; Step 2 : annealHỆNN Š ,

3 Woy HHU dụ # » $y 3 ry 45 seconds 54 °C

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR (Khuất Hữu Thanh, 2003) PCR là kỹ thuật khuếch đại trình tự DNA chuyên biệt trong ống nghiệm từ

một đoạn DNA với sự hiện diện của một hoặc hai đoạn môi

(oligonucleotides), enzyme tổng hợp DNA, các nucleotide tự đo và dung dịch

đệm (buffer) theo các chu kỳ nhiệt PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chống, thậm chí với một tiểu phần virus Hiện nay PCR được ứng dụng

rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu để chân đoán và phát hiện mầm bệnh

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh ( 2007) phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn là:

Giai đoạn 1 (bién tinh — denaturation): Trong một đung dịch phản ứng bao

gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép DNA, phân tử DNA được biến

tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) cuả phân tử, thường là 94-

95°C trong 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn mạch đôi tách thành 2 mạch đơn

Giai đoạn 2 (lai -hybridization): Trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn

Tm của các mỗi cho phép mỗi bắt cặp với khuôn Trong thực nghiệm, nhiệt độ này đao động trong khoảng 40-70°C Tùy thuộc vào Tm của các đoạn mỗi sử

10

dụng mà thời gian bắc cặp khác nhau và kéo đài từ 30 giây đến 1 phút Đây là giai đoạn quyết định tính đặc hiệu của phản ứng

Giai đoạn 3 (tổng hợp —extension): Nhiệt độ được tăng lên 72°C, đó là điều

kiện tốt nhất để cho Taq polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài mạch theo nguyên tắc bố sung từ hai đầu sợi khuôn ban đầu giúp cho DNA polymerase

hoạt động Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau một chu kỳ gồm ba giai đoạn như trên, một phân tứ DNA khuôn được

nhân lên thành hai, các đoạn DNA vừa được nhân lên trong chu kỳ lại làm

khuôn cho chu kỳ nhân bản tiếp theo Do đó san mỗi chu kỳ số lượng DNA

được tông hợp sẽ tăng lên gấp đôi và như vậy sau (n) chu kỳ nhân bản sẽ tao

ra 2" bản DNA từ một khuôn ban đầu

PCR có nhiều ứng dụng vào các mục đích khác nhau, như phân tích hệ gen

của động vật và thực vật vì nó cho phép tạo ra một lượng lớn các đoạn trình tự đặc hiệu, xác định trình tự của DNA được nhân bản PCR cũng được dùng để

phân tích tiến hóa, phân tích sự đa dạng đi truyền ở mức độ DNA trong và giữa các quan thể PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phát hiện mầm bệnh

vi khuẩn, vi rút, ký sinh trùng và nắm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng

ở trên tôm hiện nay được chân đoán bằng PCR như virus đốm trắng (WSSV),

virus đầu vàng (YHV), virus gây hội chứng Taura (TSV), virus gây hoại tử cơ

quan tạo máu và cơ quan tạo lập biểu mô (THHNV) (Đặng Thị Hoàng Oanh,

2.6.2 Các nhân tố ảnh hướng tới phản ứng PCR

DNA khuôn: Khuất Hữu Thanh (2003) khuôn DNA có vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả PCR Phản ứng tối ưu với các đoạn khuôn hoàn

toàn tính sạch, nhưng khi các đoạn khuôn không sạch có lẫn các protein thì hiệu quả giảm theo tỉ lệ thuận với độ tỉnh sạch của DNA khuôn

Enzyme: DNA polymerase cang manh, phan tng PCR cang triệt để Tùy các đặc tính của DNA polymerase, tùy thuộc nguồn gốc tách chiết enzyme mà hiệu quả phản ứng khác nhau

Mỗi và nhiệt độ gắn mỗi: Môi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản img PCR Chọn mỗi cần tính toán để bảo đảm Tm của mỗi xuôi và mỗi ngược

không chênh lệch nhau quá lớn, thông thường trong khoảng 4-5°C và nhiệt độ

nóng chảy của mỗi khoảng 72°C Độ dài mỗi cần chọn khoảng 18-30 nucleotide, néu mdi nhé hon 10 nucleotide mỗi bám không đặc hiệu Còn mỗi đài hơn 30 nucleotide sẽ ảnh hưởng đến cơ chế tổng hợp ở bước 3 (Trần Thị

Xô và Nguyễn Thị Lan, 2005) Các mỗi phải có trình tự nucleotide chỉ có thể

bat cặp bé sung ở hai đầu của các mạch khuôn, nếu mỗi bắt cặp ở giữa khuôn

PCR không thành công Tỷ lệ G-C giữa các mỗi thường chiếm khoảng 40- 75% để đảm bảo liên kết gắn mỗi với khuôn bền vững Tuy nhiên trình tự G-C

không lặp lại quá nhiều lần trong một mỗi Các mỗi chọn phải đặc trưng cho

trình tự DNA cần khuếch đại Trình tự DNA cần khuếch đại là trình tự nằm giữa hai mỗi không quá lớn 1 kb Sợi DNA được tổng hợp khi đầu 3° của mỗi

đã liên kết với khuôn mặc đầu đầu 5° có thé tự đo Do đó đầu 5° của mỗi có

thể được gắn thêm linker, hoặc đoạn nucleotide điều khiển (promoter) Thể

tích mỗi khoảng 0,1 mM đến 0,5 mM Thể tích mỗi thường được xác định đựa

vào giá trị OD đo ở 260 nm (Võ Thị Thương Lan, 2006)

Nong độ các loại nucleotide tự đo: Nong độ các loại nucleotide (dATP, dGTP,

dCTP, dTTP) khoang 20-200 uM/ mỗi loại, khi nồng độ nucleotide quá thấp

sẽ giảm hiệu quả PCR, ngược lại nồng độ nucleotide quá cao đễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” (Khuất Hữu Thanh, 2003)

Nong 46 Mg”*: Theo Tran Thi X6 va Nguyén Thi Lan (2005) ion Mg”* 1a thành phần không thé thiéu duge cia phan ing PCR, ndng d6 Mg”* t6i ưu dé

thực hiện phản ứng PCR từ 150-200 HM Nước sử dụng cho phản ứng phải

tỉnh khiết, không chứa bất kỳ ion lạ nào Không chứa các enzyme cắt hạn chế

và các enzyme phân hủy acid nucleic Môi trường dung dịch đệm phải én

định Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 29-50 pl

Chu kỳ phản ứng: Theo Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) số lượng chu kỳ PCR

thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng Sở dĩ như vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua 2 giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng

theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: (1) sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của

phản ứng, (2) sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, (3) các bản sao

vừa được tông hợp không kết hợp với mỗi mà bắt cặp với nhan,

2.6.3 Ứng dụng của kỹ thuật PCR trong thủy sản

Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2004) thì ứng đụng của PCR là: Phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh ở đạng tiềm ấn, giúp cho quá trình chọn lọc cá thể thủy sản

12

có chất lượng tốt trong chọn giống và ương nuôi như: (1) Giúp chân đoán

bệnh: điều tra nguyên nhân bùng nỗ bệnh và cách giải quyết (2) Phòng bệnh:

kiểm tra tôm bố mẹ và tôm giống ở trại sản xuất giống (3) Kiểm soát bệnh: theo đối kiểm tra theo khu vực và kiểm tra tôm giống nhập khẩu

Ứng dụng trong đánh giá an toàn hàng thủy sản xuất khẩu - Sự nhiễm khuẩn hàng thủy sản bởi Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli

Góp phần vào quy trình xác định trình tự nucleotide đột biến của tác nhân gây

bệnh, hay có thể là các loài đông vật thủy sản

Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) ở các lĩnh vực khác kể cả thủy sản, PCR

là một công cụ hữu hiệu trong việc phát hiện mằm bệnh vi khuẩn, virus, ký

sinh trùng và nắm Một số mầm bệnh thủy sản quan trọng ở tôm nuôi hiện nay được chân đoán bằng PCR bao gồm: virus đếm trắng (WSSV), virus đầu vàng

(YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV),

virus gây hội chứng Taura (TSV)

2.6.4 Đối chứng

Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần có những đối chứng sau

- Không có DNA/RNA: phản ứng PCR không có mạch khuôn DNA để

kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm

- DNA/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được

khuếch đại và mỗi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ

2.6.5 Hạn chế của PCR

Phương pháp PCR thường không hoạt động với những đoạn DNA có

chiều đài lớn hơn 3kb ( kết quả tốt với những đoạn DNA có chiều đài nhỏ hơn 1,5 kb)

Dễ bị nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước, dé bị tạp nhiễm do tính nhạy cảm và lỗi thao tác

Các sai sót gây ra do Taq DNA polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzyme gắn sai một nucleotic)

Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết, do vậy có thể dẫn tới trường hợp dương tính giá do DNA từ tế bào chết gây

ra Bên cạnh đó việc phát hiện mầm bệnh riêng lẽ bằng PCR thường gây tốn kém, do đó các nhà nghiên cứu tìm cách làm giảm chỉ phí bằng cách

sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi trong một phán ứng PCR để phát hiện

cùng lúc nhiều vi sinh vật gây bệnh khác nhau (Trần Linh Phước, 2003; trích dẫn bởi Phạm Thị Thu Trang, 2005)

14

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

3.1.1 Thời gian Thời gian nghiên cứu từ tháng 12/2008 — 05/2009

3.1.2 Địa điểm

- Thu mâu: Cân Thơ, Vĩnh Long và Đông Tháp

- Nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản —

Khoa Thủy sản, trường Đại học Cân thơ

3.1.3 Nội dung thực hiện

- Thu mẫu cá tra bệnh

Phân lập vi khuẩn ở các cơ quan (gan, thận, tỳ tạng) của cá tra bị bệnh

xuất huyết

Phục hồi vi khuẩn đã được định đanh và trữ trong glycerol 50% Cấy vi

khuẩn trực tiếp lên môi trường thạch đặc trưng Aeromonas agar + Ampicillin

Tách vi khuẩn sang môi trường NA, nuôi tăng sinh vi khuẩn trong NB Dùng phương pháp PCR phat hién A hydrophila

Xác định độ nhạy và tính chuyên biệt của phương pháp PCR

3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Thiết bị - Dụng cụ

- Máy chu kỳ nhiệt, máy so màu quang phổ, máy ủ, máy li tâm, máy

vortex, may lắc, máy PCR, lò viba, bộ điện di, bàn đọc UV, bộ chụp ảnh

gel, máy vi tính

-_ Cân điện tử, pipet tự động, tủ lạnh, tủ đông, tú sấy, nồi autoclave

- Ống eppendorf 1,5 ml và 0,5 ml

Đầu col pipet các loại

Ống nghiệm, đĩa Petri, cốc thủy tính, ống đong, chai nấu môi trường

Đèn côn, bình xịt cồn, que cấy, hộp quet

Hộp đá lạnh, giấy vệ sinh, găng tay, bọc nylon và viết lông đầu