Xác định hàm lượng phenol và một số clophenol trong mẫu sinh vật bằng phương pháp GC ECD

Vì những lí do này, việc xác lập một phương pháp đáng tin cậy, có độ nhạy cao và dễ dàng thực hiện để phân tích các hợp chất CPs trong môi trường là vô cùng cần thiết.. Đây là phương phá

I HỌ QU GI H N I TRƯỜNG I HỌ HO HỌ TỰ NHI N

-

HU THỊ HUỆ

XÁ ỊNH H M LƯỢNG PHENOL V M T S CLOPHENOL TRONG MẪU SINH VẬT BẰNG

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 104.04-2017.310

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp cao học này Tôi xin chân thành cảm ơn thầy

hướng dẫn PGS.TS Từ Bình Minh, thầy đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành sớm luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy TS hu ình Bính, Viện Kĩ thuật Hóa học,

Đại học Bách khoa Hà Nội đã giúp đỡ và cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong quá trình tôi làm thực nghiệm

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, các cô trong bộ môn Hóa Phân tích đã động viên và tạo mọi điều kiện về thời gian, giảng dạy giúp tôi sớm hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn nhóm nghiên cứu gồm em CN.Lan Anh và các em

SV Hiển, SV Dung đã tham gia nghiên cứu và làm thực nghiệm

Tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp khoa Hóa đã động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu tại khoa

Chu Thị Huệ

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về clophenol 2

1.1.1.Cấu trúc và phân loại các CPs 2

1.1.2 Tính chất của CPs 3

1.1.3 Độc tính của CPs 4

1.1.4 Tình hình sản xuất và sử dụng các sản phẩm chứa CPs 6

1.1.5 Các quy định hiện có về CPs 8

1.2.2 Phương pháp phân tích CPs trên hệ thống sắc kí khí GC-ECD 10

1.2.3 Phương pháp phân tích CPs trên hệ thống GC-MS 11

1.2.4 Một số phương pháp phân tích CPs khác 11

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 13

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 13

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 13

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2 Thiết bị , dụng cụ và hóa chất 15

2.2.1 Thiết bị 15

2.2.2 Dụng cụ 16

2.2.3 Hóa chất 16

2.2.4 Chất chuẩn và cách pha chế các dung dịch chất chuẩn 17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19

3.1 Kết quả nghiên cứu các CPs trên thiết bị GC-ECD 19

3.1.1 Sắc đồ tách và thời gian lưu của các CPs trên hệ thống GC-EC 19

3.1.2 So sánh với điều kiện chất phân tích được dẫn xuất hóa và chất phân tích không được dẫn xuất hóa 20 3.1.3.Kết quả khảo sát điều kiện dẫn xuất hóa 20 3.1.4 Phương trình hồi quy 22

3.1.5 Độ ổn định của tín hiệu phân tích Error! Bookmark not defined 3.1.6 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị Error! Bookmark not defined

3.1.7 Kiểm tra độ đúng và độ lặp của phương pháp Error! Bookmark not defined

3.2 Kết quả nghiên cứu các CPs trên thiết bị GC-MS 24

3.2.1 Kết quả khảo sát định tính các CPs trên GC-MSError! Bookmark not defined

3.2.2 Xây dựng đường chuẩn trên thiết bị GC-MS 24

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng các CPs trên thiết bị Error! Bookmark not defined

3.3 So sánh kết quả phân tích mẫu thực trên thiết bị GC-ECD và GC-MS 24 KẾT LUẬN 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined

IS Internal standard Chất nội chuẩn

LC50 Lethal concentration to kill 50% of

test organisms

Nồng độ gây chết 50% cá thể thí nghiệm

LD50 Lethal does to kill 50% of test

animals

Liều lượng gây chết 50% cá thể thí nghiệm

LOAEL Lowest observed adverse effect level Liều lượng thấp nhất gây tác

động xấu có thể quan sát được

LOD Limit of detection, a lowest quantity

of tagert analyte that can be detected reliably

Giới hạn phát hiện của thiết bị

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng của thiết

bị NOAEL No observed adverse effect level Liều lượng không gây ảnh

hưởng xấu có thể quan sát được

ppb Part per billion Nồng độ/hàm lượng phần tỉ ppm Part per million Nồng độ/hàm lượng phần triệu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại CPs theo số nguyên tử Clo trong phân tử 2

Bảng 1.2: Công thức, tên gọi, khối lượng phân tử và kí hiệu của một số CPs 3

Bảng 1.3: Tính chất của một số CPs Error! Bookmark not defined Bảng 1.4: Một số liều lượng và nồng độ gây độc của CPsError! Bookmark not defined Bảng 1.5: Sản lượng của các CPs tại một số khu vực trên thế giới 6

Bảng 1.6: Ứng dụng của một số CPs 7

Bảng 1.7: Giá trị ngưỡng liều lượng của một số CPs gây rủi ro cho con người 9

Bảng 1.8: Một số loại cột và điều kiện làm sạch CPs trên cột chiết pha rắn Error! Bookmark not defined Bảng 1.9: Một số phản ứng dẫn xuất hóa CPs Error! Bookmark not defined Bảng 1.10: Tổng quan một số điều kiện dẫn xuất hóa các CPsError! Bookmark not defined Bảng 1.11: Điều kiện tách các CPs bằng GC-ECD Error! Bookmark not defined Bảng 2.1: Điều kiện tách và phân tích CPs trên thiết bị GC-ECDError! Bookmark not defined và thiết bị GC-MS Error! Bookmark not defined Bảng 2.2: Thông tin chất chuẩn gốc sử dụng để phân tích các CPs 17

Bảng 2.3: Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn 17

Bảng 2.4 : Cách chuẩn bị các dung dịch làm việc 18

Bảng 2.5: Nồng độ các CPs trong dung dịch chuẩn 18

Bảng 3.1: Thời gian lưu của các CPs và chất nội chuẩn phân tích 19

trên hệ thống GC-ECD 19 Bảng 3.2: Giá trị trung bình của tỷ số diện tích pic giữa chất phân tích so với chất nội chuẩn và độ lệch chuẩn tương đối khi phân tích lặp 3 lần dung dịch chuẩn C3 trên hệ

thống GC-ECD Error! Bookmark not defined

Bảng 3.4: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích CPs

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.5: Độ thu hồi và độ lặp lại của quy trình phân tích trên mẫu thêm chuẩn Error! Bookmark not defined

Bảng 3.6: Kết quả phân tích mẫu CRM Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Các mảnh phổ đặc trưng của CPs trên thiết bị GC-MSError! Bookmark not defined

Bảng 3.8: Thông số của đường chuẩn CPs đo trên thiết bị GC-MS 24

Bảng 3.9: Kết quả LOD và LOQ trên thiết bị GC-MS… 40

Bảng 3.10: Kết quả phân tích PCP trên hai thiết bị GC-MS và GC-ECD 24

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của CPs 2

Hình 2.1: Phản ứng axetyl hóa của CPs với anhydric axetic trong môi trường kiềm 14

Hình 3.1: Sắc đồ tách các CPs và chất nội chuẩn trên hệ thống GC-ECD 19

Hình 3.2: Sắc đồ tách các CPs và chất nội chuẩn khi dẫn xuất và không dẫn xuất trên hệ thống GC-ECD 20

Hình 3.3: Độ bền của sản phẩm dẫn xuất hóa theo thời gian 21

Hình 3.4: Mối quan hệ giữa diện tích của chất phân tích với thể tích dung dịch 21

anhydric axetic 21

Hình 3.5: Mối quan hệ giữa diện tích pic của chất phân tích với thể tích 22

dung dịch K2CO3 0,2M 22

Hình 3.6: Đường chuẩn của các CPs 23

Hình 3.7: Độ thu hồi của quy trình phân tích trên mẫu thêm chuẩnError! Bookmark not defined

Hình 3.8: Kết quả phân tích mẫu CRM Error! Bookmark not defined

Hình 3.9: Tương quan kết quả phân tích PCP trong mẫu sinh vật bằng hai phương

pháp GC-ECD và GC-MS Error! Bookmark not defined

MỞ ẦU

Trong một vài năm trở lại đây, vấn đề ô nhiễm môi trường đang dần trở thành một vấn đề nghiêm trọng, gây nên những tác hại cả trực tiếp và gián tiếp đến con người cũng như sinh vật Sự ô nhiễm chủ yếu bị gây ra bởi sự dò rỉ của các chất gây ô nhiễm (thường là các chất hoá học) ra môi trường Trong bài báo cáo này, chúng ta quan tâm đến các hợp chất của phenol nói chung và chlorophenol nói riêng

Clophenol (CPs) là một nhóm hợp chấthữu cơ bao gồm 19 đồng loại, được sản xuất và sử dụng rộng rãi từ những năm 1970 Đây là những chất gây ô nhiễm nghiêm trọng xuất hiện nhiều trong nguồn nước và đất [1] CPs chủ yếu được thải ra từ những ngành công nghiệp như sản xuất giấy hay thuốc trừ sâu [2] Các hợp chất CPs đã được chứng minh là có thể gây ra những ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người, ví dụ như làm suy giảm chức năng nội tạng (như gan và thận); gây rối loạn hệ thần kinh,viêm da, viêm đường hô hấp hay có thể dẫn đến ung thư Do mang độc tính cao và có nguy cơ gây ung thư, đa số các hợp chất CPs đều nằm trong danh sách ưu tiên về các chất gây

ô nhiễm của Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (US Environmental Protection Agency) [3] Hơn nữa, Liên minh Châu Âu (European Union) đã thiết lập mức cho phép tối đa của CPs trong nước uống là 0.5 Vì những lí do này, việc xác lập một phương pháp đáng tin cậy, có độ nhạy cao và dễ dàng thực hiện để phân tích các hợp chất CPs trong môi trường là vô cùng cần thiết

Tại Việt Nam hiện tại chưa có quy định, tiêu chuẩn, quy chuẩn nào về CPs, sự thiếu thốn về cơ sở dữ liệu và công cụ pháp lí là một khó khăn cơ bản để chúng ta thực hiện được mục tiêu quản lí an toàn tiến tới giảm thiểu và loại bỏ các chất gây ô nhiễm nói chung và các CPs nói riêng

Trong bản luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu quy trình tối ưu nhằm phân tích các CPs trong đối tượng mẫu sinh vật Đây là đối tượng phân tích tương đối mới và chưa được quan tâm nhiều trong các nghiên cứu trước đây tại Việt Nam Phương pháp phân tích sử dụng là sắc kí khí dùng detector bắt giữ điện tử (GC-ECD)

và GC-MS, định lượng bằng phương pháp nội chuẩn Đây là phương pháp có độ nhạy

và độ chính xác cao dùng cho phân tích lượng vết và siêu vết các chất hữu cơ trong nền mẫu phức tạp và là phương pháp tiêu chuẩn được quy định bởi các tổ chức quốc tế

như Cục Bảo vệ Môi trường Mỹ (US EPA)

HƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về clophenol

1.1.1 Cấu trúc và phân loại các CPs

Clophenol (CPs) là các hợp chất hữu cơ được tạo thành bằng cách thay thế một hay nhiều nguyên tử hidro trên vòng thơm của phân tử phenol bằng các nguyên tử clo [4]

Các clophenol lập thành dãy 19 hợp chất có công thức phân tử tổng quát C6H

6-nClnO (0<n<6) và công thức cấu tạo tổng quát như sau:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của CPs

Các phân tử CPs được chia làm 5 nhóm từ monoclophenol đến pentaclophenol tương ứng với số nguyên tử clo có chứa trong phân tử Số chất tương ứng với mỗi nhóm được đưa ra trong bảng 1.1 [4]:

Bảng 1.1: Phân loại CPs theo số nguyên tử Clo trong phân tử

Bảng 1.2: Công thức, tên gọi, khối lượng phân tử và kí hiệu của một số CPs

bố trong khoảng rộng phụ thuộc vào phân tử khối, chúng có nhiệt độ sôi cao (trên

1750C) Hệ số phân bố của các CPs giữa n-octanol/nước (logKow) khá cao (từ 2 đến 5) chứng tỏ chúng có ái lực mạnh đối với pha hữu cơ và tan kém hơn trong nước, CPs tan tốt trong các dung môi hữu cơ như etanol, benzen, ete…Hệ số logKow tăng theo số lượng clo có chứa trong phân tử chính vì vậy các CPs có số nguyên tử clo càng cao thì

độ tan trong nước càng giảm [4] Áp suất bay hơi và hằng số định luật Henry của các

CPs nhìn chung thấp nên trong điều kiện thường hầu hết các chất này khó bay hơi, áp suất bay hơi giảm khi số lượng nguyên tử clo tăng [6]

Liên kết O-H của các CPs phân cực về phía O và trên nguyên tử O còn có cặp electron chưa tham gia liên kết, cặp electron này cùng với các electron của nhân thơm tạo lên hệ liên hợp Nhân thơm hút electron rất mạnh nhờ hiệu ứng liên hợp làm cho độ phân cực của liên kết O-H tăng lên do đó hidro của nhóm OH rất linh động và các CPs biểu hiện tính axit yếu Nhóm thế clo cũng là nhóm hút electron mạnh chính

vì vậy khi số lượng clo thế trong vòng benzen tăng lên thì pKa của các CPs sẽ giảm đi

và tính axit sẽ tăng lên [6]

1.1.3 Độc tính của CPs

Con người thường bị nhiễm độc CPs thông qua hai phương thức: tiếp xúc nghề nghiệp (xâm nhập chủ yếu qua da và đường hô hấp) và tiếp xúc môi trường (chủ yếu qua đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống đã bị nhiễm độc) Những nghiên cứu về ảnh hưởng của CPs đến sức khỏe con người đặt trọng tâm vào hai khía cạnh: độc tính cấp tính là kết quả của việc phơi nhiễm trong thời gian ngắn và độc tính mãn tính là kết quả của việc phơi nhiễm kéo dài Tuy nhiên các CPs chủ yếu tồn tại ở mức dư lượng nên mối quan tâm chủ yếu với CPs là khả năng gây các ảnh hưởng mãn tính đến sức khỏe con người như suy giảm chức năng của các cơ quan trong cơ thể (gan, thận), rối loạn hệ thần kinh, viêm da, viêm đường hô hấp hoặc gây ung thư [4] Các ảnh hưởng

cụ thể của CPs đến sức khỏe do sự phơi nhiễm tùy thuộc vào nồng độ, khả năng hấp thụ của cơ thể, thời gian đồng hóa, đào thải ra khỏi cơ thể và một số yếu tố khác

Cơ quan Nghiên cứu về Ung thư Quốc tế (IARC) đã xếp PCP; 2,4,6-T3CP và 2,4-DCP vào nhóm 2B (các chất gây ung thư tiềm năng cho con người) trong khi tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã phân loại một số CPs như 2,4,6-T3CP; PCP vào nhóm các hợp chất nghi ngờ có đặc tính gây ung thư [8] Cục Bảo vệ Môi trường Mỹ (US EPA) và Bộ y tế và các dịch vụ con người của Mỹ đã xác định 2,4,6-T3CP là chất có khả năng gây ung thư [6]

Các CPs với số lượng nguyên tử clo khác nhau có mức độ độc hại khác nhau đối với các loài động thực vật Nhiều thí nghiệm đã chỉ ra rằng độ độc hại của CPs đối

với các loài sinh vật tăng theo mức độ clo hóa vòng thơm và độc tính của chúng cũng thay đổi theo pH của môi trường Ở pH thấp, các CPs duy trì ở trạng thái phân tử và dễ dàng đi qua màng tế bào Khi pH tăng độc tính của CPs giảm rõ rệt, ảnh hưởng này đặc biệt quan trọng khi số lượng các nguyên tử clo có trong vòng benzen khác nhau Các CPs có ít nguyên tử clo gây ra các rối loạn còn các CPs có nhiều nguyên tử clo sẽ ảnh hưởng tới quá trình phốt phát hóa trong cơ thể sinh vật Farquahanrsen và cộng sự

đã nghiên cứu tác động của các CPs trên chuột cho thấy khi tiêm 2,6-DCP và

2,4,6-T3CP làm chuột bị rối loạn như run rẩy, mất phản xạ tự nhiên thậm chí bị rối loạn trầm trọng và kèm theo sự thay đổi nhiệt độ cơ thể Khi tiêm T4CP và PCP thì dẫn đến tình trạng ngạt thở và chết trong thời gian ngắn do thiếu oxi Khi tiêm PCP với hàm lượng

10 đến 20ppm cho thấy 90% chất độc được thải ra khỏi cơ thể chuột, còn lại chủ yếu tích lũy trong gan, thận và máu Thận bị tổn thương trong khoảng từ 20 đến 40 giờ, gan bị tổn thương sau 3 đến 5 ngày Nghiên cứu đã chỉ ra rằng MCP, DCP và T3CP có độc tính vừa phải khoảng 23-400 µg/kg trọng lượng, trong khi T4CP và PCP có độc tính mạnh hơn khoảng 10-40 mg/kg trọng lượng

Một số liều lượng và nồng độ gây độc của CPs được đưa ra trong bảng 1.4:

1.1.4 Tình hình sản xuất và sử dụng các sản phẩm chứa CPs

Các sản phẩm thương mại chính của CPs bao gồm 2-monoclophenol MCP);4-monoclophenol (4-MCP); 2,4-diclophenol (2,4-DCP); 2,4,5-T3CP và pentaclophenol (PCP) [8].Trong công nghiệp, CPs được tổng hợp theo hai con đường [4]:

(2- Clo hóa trực tiếp phenol để tạo ra các clophenol hoặc policlophenol ở nhiệt

độ cao Các hợp chất 2-MCP; 4-MCP; 2,4-DCP; 2,6-DCP; 2,4,6-T3CP; 2,3,4,6-T4CP

và PCP được sản xuất theo con đường này Tuy nhiên việc sản xuất T4CP và PCP còn yêu cầu sử dụng thêm một chất xúc tác như iot, nhôm clorua (AlCl3), sắt clorua (FeCl3), hoặc antimon clorua (SbCl3)

 Thủy phân các clobenzen trong dung môi metanol, etylenglycol và các dung môi khác Các hợp chất 2,5-DCP; 3,4-DCP; 2,4,5-T3CP; 2,3,4,5-T4CP; 2,3,5,6- T4CP

và PCP được sản xuất theo con đường này

Sản lượng của một số khu vực trên thế giới được đưa ra trong bảng 1.5:

Bảng 1.5: Sản lượng của các CPs tại một số khu vực trên thế giới

Các CPs thườngđược sử dụng để làm hoá chất nông nghiệp, dược phẩm, chất

bảo quản và thuốc nhuộm [7]:

Hóa chất nông nghiệp: 80-90% sản lƣợng của CPs đƣợc sử dụng để làm hóa

chất nông nghiệp nhƣ thuốc diệt cỏ diclophenoxyaxetic axit (D); diclophenoxy-4-butyric axit và 3,6-diclo-2-methoxybenzoic axit

2,4-Dƣợc phẩm: dƣợc phẩm có nguồn gốc từ CPs bao gồm clofibrate,

etyl-2-(4-clophenoxy)-2-metylpropionat (ICI) đƣợc sử dụng để điều trị hàm lƣợng cholesterol trong máu cao, Mervan và Aldofene là thuốc kháng viêm và thuốc giảm đau

Chất bảo quản:PCP là chất đƣợc sử dụng phổ biến nhất, PCP đƣợc dùng để

làm chất bảo quản cho các vật liệu hữu cơ nhƣ gỗ, da, lông thú

Thuốc nhuộm: CPs đƣợc sử dụng để tổng hợp thuốc nhuộm anthraquinon,

quinizarin, 1,4-dihydroxy-9,10-anthracenedion Đây là những loại thuốc nhuộm đƣợc

 Tiền chất để tạo ra các CPs có số lƣợng clo lớn hơn

 Thành phần của thuốc sát trùng, vật liệu chống thấm

3 2,4,6-T3CP

 Tiền chất để tạo ra các CPs cao hơn đặc biệt là 2,3,4,6-T4CP và PCP

 Thành phần của thuốc sát trùng

 Chất bảo quản gỗ, đồ da, hàng dệt

 Là chất trung gian để sản xuất thuốc trừ sâu, xà phòng

4 PCP  Là thành phần của thuốc sát trùng, thuốc diệt cỏ,

1.1.5 Các quy định hiện có về CPs

Sự có mặt của các CPs trong môi trường do sử dụng với nhiều mục đích khác nhau đã và đang gây ảnh hưởng xấu tới hệ sinh thái và sức khỏe con người Để đánh giá mức dộ rủi ro của các chất ô nhiễm này và tạo điều kiện vững chắc cho việc xây dựng chính sách môi trường, các cơ quan chính phủ trên toàn cầu đã ban hành một sốquy định nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng và môi trường sống Năm 1976, liên minh Châu Âu (EU) đã phân loại ra 132 chất gây nguy hiểm cần loại bỏ (dựa trên tính độc, mức độ bền vững và khả năng tích lũy sinh học của chúng), trong số đó bao gồm một số hợp chất CPs và các chất có khả năng chuyển hóa thành CPs [8]

Một số các quốc gia trên thế giới cũng đưa ra lệnh cấm đối với CPs: tại Thụy Điển CPs bị cấm sử dụng từ năm 1978 và Phần Lan cấm sử dụng CPs từ năm 1984 [6]

Hiện tại chưa có quy định nào về ngưỡng nồng độ của CPs trong cá hoặc sinh vật mà chỉ có ngưỡng liều lượng CPs gây rủi ro cho con người (RfD), từ giá trị này ta

có thể xác định mức độ rủi ro dựa vào công thức sau:

RQ=

Trong đó:

 RQ: Giá trị hệ số rủi ro

 ID: Liều lượng CPs cơ thể người hấp thụ (ng/kg/ngày)

 RfD: Giá trị ngưỡng liều lượng CPs gây rủi ro cho con người (ng/kg/ngày)

Giá trị RQ sẽ được so sánh với 1 Nếu RQ ≥ 1 chứng tỏ có khả năng rủi ro đáng kể, nếu RQ < 1 thì hầu như không có rủi ro [6]

Giá trị ngưỡng liều lượng của một số CPs gây rủi ro cho con người được đưa ra trong bảng 1.7 [6]:

Bảng1.7: Giá trị ngưỡng liều lượng của một số CPs gây rủi ro cho con người

1.2 Tổng quan về phương pháp phân tích CPs trong mẫu sinh vật

Mẫu sinh vật chứa hàm lượng CPs không quá cao và nền mẫu khá phức tạp, chính vì vậy mà yêu cầu đối với việc xử lí mẫu rất nghiêm ngặt và phải trải qua nhiều bước Qua tham khảo các tài liệu, chúng tôi nhận thấy về các phương pháp phân tích CPs trong mẫu sinh vật có các điểm đáng lưu ý như sau:

Lượng nước trong mẫu sinh vật cao dẫn đến sự không đồng đều về hàm lượng CPs ở từng bộ phận đồng thời có hiện tượng mẫu bị co lại trong quá trình chiết gây ảnh hưởng đến hiệu quả chiết, chính vì vậy để khắc phục điều này thường tiến hành đông khô mẫu trước khi phân tích.Ưu điểm của kĩ thuật đông khô mẫu là đảm bảo độ đồng đều về mặt hàm lượng phân tích, tăng hiệu lực chiết và bảo quản mẫu phân tích được trong thời gian dài

Các phương pháp điển hình để tách chiết CPs ra khỏi nền mẫu bao gồm: chiết siêu âm, chiết Soxhlet, chiết gia tốc dung môi (ASE) Tùy thuộc vào mục đích và điều kiện phòng thí nghiệm mà áp dụng các kĩ thuật chiết phù hợp Phương pháp chiết Soxhlet là phương pháp chiết cổ điển với hiệu suất khá cao nhưng lại có nhược điểm là tốn thời gian và sử dụng nhiều dung môi nên không thân thiện với môi trường.Phương pháp chiết siêu âm và chiết gia tốc dung môi được sử dụng trong nhiều nghiên cứu vì những ưu điểm nổi bật của nó như thời gian chiết nhanh, tốn ít dung môi và hiệu lực chiết cao.Các dung môi thường được sử dụng để chiết CPs trong mẫu sinh vật là

thêm một lượng axit vào trong metanol sẽ cho hiệu quả chiết tốt hơn do axit có khả năng phá hủy cấu trúc tế bào của sinh vật, tăng khả năng xâm nhập và đưa chất phân tích ra khỏi nền mẫu [18-20]

Sau khi các CPs được chiết tách ra khỏi nền mẫu, các bước làm sạch rất cần thiết để loại bỏ các hợp chất có thể cản trở trong quá trình phân tích Đối với mẫu sinh vật, hàm lượng chất béo chứa trong mẫu cao sẽ ảnh hưởng tới quá trình phân tích sắc

kí Thông thường để giải quyết vấn đề này, chất béo chứa trong mẫu sẽ được loại bỏ bằng kĩ thuật đông đặc ở nhiệt độ thấp [21]

Phương pháp chiết pha rắn(Soild phase extraction-SPE) đang được sử dụng rất rộng rãi trong phân tích CPs do có ưu điểm nổi bật là tiêu tốn một lượng nhỏ dung môi, làm giàu, làm sạch tốt, tự động hóa, tiết kiệm thời gian và đặc biệt cho độ thu hồi cao Có rất nhiều loại cột SPE được sử dụng như: cột chiết pha rắn pha tĩnh silica, pha tĩnh là chất hấp phụ polime không phân cực như polystyren–divinylbenzen (PS-DVB), pha tĩnh là cacbon…Trong đó loại cột được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu là cột chiết pha rắn có pha tĩnh là chất hấp phụ polime không phân cực Đối với loại cột chiết pha rắn này, sự lưu giữ của CPs là kết quả của cơ chế pha đảo và tương tác π-π giữa các điện tử trong nhân thơm của chất hấp phụ và trong phân tử CPs, muốn vậy CPs phải tồn tại ở trạng thái không bị ion hóa Kiểm soát pH của mẫu là điều rất cần thiết

để quá trình chiết pha rắn cho hiệu suất thu hồi cao Thông thường trước khi mẫu được đưa lên cột chiết pha rắn, phải điều chỉnh pH nhỏ hơn pKa của chất phân tích ít nhất 2 đơn vị để tránh sự ion hóa Các dung môi thường dùng để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột chiết pha rắn thường là: metanol, axetonitril metanol-axetonitril, etylaxetat hoặc tert-butylmetyl ete [22-24]

1.2.2 Phương pháp phân tích CPs trên hệ thống sắc kí khí GC-ECD

Các yếu tố cơ bản quyết định phép tách sắc kí các CPs bao gồm: khí mang (loại khí mang, tốc độ khí mang), cột tách (thành phần pha tĩnh, độ phân cực của pha tĩnh, bề dày lớp phim pha tĩnh, chiều dài của cột tách) và chương trình nhiệt độ cho lò cột Khí mang được sử dụng phổ biến để tách các CPs là khí nitơ với độ tinh khiết 99,999% Các CPs được tách trên các loại cột mao quản hở phủ pha tĩnh silica biến tính (FS-WCOT), pha tĩnh nhìn chung có độ phân cực rất thấp, chủ yếu là loại pha tĩnh