Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus penta e d18s51 d21s11 TH01 và d3s1358 phục vụ giám định

Có thể kể đến những ứng dụng đầu tiên để phân biệt cá thể được tiến hành tại Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và cộng sự khi nghiên cứu các đoạn gen mã h

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Nguyên Hải

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG THANG ALEN CHỈ THI ̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Bùi Nguyên Hải

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG THANG ALEN CHỈ THI ̣ HUỲNH QUANG CHO 05 LOCUS PENTA E, D18S51, D21S11, TH01 VÀ D3S1358 PHỤC VỤ GIÁM ĐỊNH

Chuyên ngành: Di truyền ho ̣c Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Đinh Đoàn Long

Hà Nội, năm 2012

BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ/ chữ

ADN Acid Deoxyribonucleic

APS Amonium persulfate

LD Allelic ladder Thang alen chỉ thi ̣ chuẩn

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

PBS Phosphate buffer saline

RFLP Restriction fragment length

polymophism

Đa hình theo chiều dài các đoạn

bị cắt bằng enzyme giới hạn

STR Short Tandem Repeat Các đoạn lặp lại ngắn

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Boric acid-EDTA

MỤC LỤC

1.1 Phương pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN 3

1.1.1 Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể 3 1.1.2 Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN 5

1.2.3 Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người 8

1.4 Đại cương các về chất huỳnh quang và ứng dụng trong phân

tớch ADN

15

1.4.2 Ứng dụng chất huỳnh quang trong phõn tớch ADN 17

1.5 Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang 18

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.2.5 Phương pháp phát hiện ADN sau điện di 29 2.2.5.1 Phát hiện băng ADN bằng Ethidium bromide 29 2.2.5.2 Phát hiện băng ADN bằng kỹ thuật soi gel huỳnh quang 30 2.2.6 Phương pháp chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang 31

3.2 Kết quả kiểm tra sản phẩm nhõn bội trờn gel agarose 36 3.3 Kết quả điện di khảo sát mẫu trên gel poly acrylamide 39 3.4 Kết quả lựa chọn mẫu và tinh sạch sản phẩm nhõn bội 44

3.6 Kết quả chế tạo thang alen dạng phức hợp 05 locus 50

4.2 Kiến nghị 55

PHỤ LỤC (Bảng và Hỡnh ảnh)

MỞ ĐẦU

Những năm cuối thế kỷ XX đã chứng kiến sự phát triển nhanh chóng của kỹ thuật di truyền kể từ khi James Watson và Francis Cric phát hiện ra cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN (năm 1953), và Kary Mullis phát minh ra phương pháp nhân bội ADN từ một lượng ADN rất nhỏ ban đầu trong ống nghiệm (năm 1985) Những thành tựu này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về y, sinh học và trong khoa học hình sự nhằm mục đích xác định đặc trưng cá thể người

Có thể kể đến những ứng dụng đầu tiên để phân biệt cá thể được tiến hành tại Anh vào năm 1985 với công trình nghiên cứu của Alec Jeffreys và cộng sự khi nghiên cứu các đoạn gen mã hóa protein Myoglobin trong máu người Họ đã phát hiện trên đoạn gen có một trình tự bao gồm những bazơ nitơ được lặp lại một số lần, điều đáng chú ý là các đoạn lặp này ở các cá thể khác nhau thì có số lượng đoạn lặp khác nhau Jeffreys coi đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể

Với sự phát triển của kỹ thuật gen, nhiều đoạn lặp lại đa hình khác lần lượt được phát hiện sau đó Từ việc phát hiện các đoạn đa hình có trình tự lặp lại bằng phương pháp sử dụng enzyme giới hạn (RFLP) đến phương pháp lai đầu dò (ADN probe), các đoạn lặp lại ngẫu nhiên có độ dài đơn vị lặp lại trung bình (VNTR) hoặc các đoạn có đơn vị lặp lại ngắn, chỉ từ 2-4 đôi bazơ nitơ (STR) kết hợp kỹ thuật PCR, các phương pháp nhận dạng và phân biệt cá thể đã phát triển lên một tầm cao mới Cũng từ đây, giám định tư pháp về gen

ra đời Giám định gen đã khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học trước đây, giúp các nhà điều tra truy nguyên được đến

cá thể người, xác định được quan hệ huyết thống cha-con, mẹ-con, xác định được hài cốt, xây dựng cơ sở dữ liệu và tàng thư gen tội phạm

Nghiên cứu tìm kiếm các trình tự gen đa hình để phân biệt cá thể người đồng thời nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phục vụ cho mục đích này được nhiều công ty Công nghệ sinh học để ý bởi tiềm năng ứng dụng lớn Ngay từ giữa những năm 90 của thế kỷ trước, hai hãng sản xuất các chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã cho xuất xưởng nhiều bộ KIT khác nhau, các bộ KIT đơn locus, 3 locus, 9 locus, 12 locus và 16 locus đã lần lượt

ra đời Mỗi bộ KIT phân tích ADN bao giờ cũng có kèm thang alen chuẩn, một thành phần quan trọng không thể thiếu

Thang alen là một hỗn hợp bao gồm tất cả các alen có thể xuất hiện trong một quần thể người nhất định Sự có mặt của thang alen cho phép xác định được chính xác kiểu gen của mẫu phân tích Bất kỳ một thí nghiệm phân tích xác định cá thể người nào đều cần sử dụng thang alen Tuy nhiên, các bộ KIT được thương mại hóa của các hãng kể trên có giá thành rất cao, thủ tục nhập khẩu đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam

Do đó, để chủ động về công nghệ, đồng thời phục vụ cho các thí nghiệm phân tích gen người Việt Nam nói chung, trong lĩnh vực khoa học hình sự nói riêng, tiến tới có thể triển khai rộng công nghệ phân tích gen tới các phòng thí nghiệm địa phương chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 phục vụ giám định

Mục tiêu chính của đề tài là chế tạo được thang alen chỉ thị gắn huỳnh quang cho 05 locus gen đa hỡnh STR nờu trờn ở dạng đơn lẻ và ở dạng phức hợp để cú thể sử dụng phõn tớch trờn thiết bị scan gel huỳnh quang phục vụ

công tác giám định cá thể

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Phương pháp xác định cá thể dựa trên chỉ thị ADN

1.1.1 Cơ sở khoa học của phân tích ADN xác định cá thể

Với sự nghiên cứu của các nhà khoa học, con người đã phát hiện ra bản chất di truyền nằm trên cấu trúc phân tử ADN ADN (axit deoxyribonucleic)là một chuỗi nucleotide gồm 4 loại bazơ nitơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, sự khác nhau trong trình tự của 4 loại nucleotide trong phân tử ADN của 23 đôi nhiễm sắc thể có trong mỗi tế bào của mỗi cá thể là cơ sở cho giám định gen để xác định

sự khác nhau với mục đích phân biệt cá thể người này với cá thể người khác Một trong những phương pháp đó là dựa các dạng đa hình trong trình tự của phân tử ADN [21]

Trình tự các nucleotide trên sợi kép ADN có hai dạng đa hình [1, 2, 23]:

 Đa hình theo trình tự: các gốc nucleotide ngẫu nhiên trong đoạn ADN không theo một trình tự nào:

- ATAT ATAT ATAT ATAT ATAT -  5 đoạn lặp ATAT

Trong quá trình hình thành và phát triển của loài và của cá thể, sự biến đổi trình tự nucleotide trên sợi kép ADN đã xảy ra, do vậy mà con người đã ghi nhận được rất nhiều sự biến đổi đó Khái niệm alen được thống nhất để chỉ những trạng thái khác nhau của mỗi gen hoặc mỗi locus Như vậy, với mỗi gen hay locus, con người đã ghi nhận được rất nhiều những alen khác nhau

Chính sự khác nhau trong trình tự nucleotide của các alen trong cùng locus của các phân tử ADN trên các nhiễm sắc thể là cơ sở cho giám định gen hình sự để truy nguyên cá thể và giám định huyết thống

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Bên cạnh đó, khi nghiên cứu về cấu trúc gen, người ta phát hiện thấy nhiều gen của sinh vật nhân chuẩn và một số sinh vật nhân sơ mang các đoạn không mã hóa sản phẩm (protein) xen giữa các đoạn mã hóa Đoạn mã hóa được gọi là exon, đoạn không mã hóa gọi là intron Thông thường, các đoạn intron có chứa các trình tự lặp lại, các trình tự này được chia làm 2 loại:

- Các trình tự lặp lại nhiều lần chiếm 10-15% bộ gen động vật có vú

Đó là những trình tự lặp lại khoảng 10-20kb, không mã hóa, thường tập trung ở vùng tâm động hoặc ở đầu nhiễm sắc thể

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình chiếm khoảng 25-40% bộ gen người Chúng có kích thước lớn hơn (100-1000kb) và đa dạng hơn những trình tự lặp lại nhiều lần, các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ hệ gen

1.1.2 Các kỹ thuật xác định tính đa hình của ADN

xạ, chất phát quang hóa liên kết enzyme Phương pháp lai ADN đã được sử dụng thành công lần đầu ở Anh năm 1983 để phân tích ADN tinh dịch của tội phạm [19]

Tuy nhiên phương pháp này có nhiều bất lợi trong thực tiễn của công tác giám định hình sự vì những lý do sau:

1 Phân tích RFLP đòi hỏi mẫu ADN phải nguyên vẹn với một lượng đủ lớn (ít nhất là 50ng)

2 Các mẫu dò có gắn đồng vị phóng xạ phải có độ nhạy cao mới có thể xác định được băng ADN Hơn nữa, việc sử dụng phóng xạ không có lợi cho sức khỏe người nghiên cứu

3 Phân tích RFLP đòi hỏi kỹ thuật viên phải có tay nghề cao và mất nhiều thời gian

4 Kỹ thuật phân tích RFLP khó tự động hóa bằng các thiết bị tin học 1.1.2.2 Các kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR)

Kỹ thuật PCR do Karry Mullis phát minh vào năm 1985 đã đánh dấu một bước đột phá, có tính cách mạng trong sinh học phân tử bởi khả năng áp dụng có hiệu quả trong phân tích gen mà các phương pháp trước đó chưa có được Nhờ có PCR người ta có thể nhân một đoạn ADN đích ban đầu lên hàng triệu bản sau 30 chu kì chỉ trong vài giờ Lượng ADN này đủ lớn để có thể phát hiện bằng các phương pháp thông thường khác [24] Với những ưu điểm nổi bật của mình, PCR đã nhanh chóng được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phân tích ADN, kể cả lĩnh vực sinh học hình sự Kỹ thuật này đã thay thế

kỹ thuật RFLP vì những lý do sau:

- Độ nhạy và tính đặc hiệu cao,

- Tiết kiệm thời gian và giảm bớt khó khăn cho công tác giám định,

- Có thể xác định được đối với những mẫu ADN bị biến tính một phần,

- Có thể đồng thời xác định nhiều locus khác nhau và tự động hóa được quy trình phân tích

1.2 Đại cương về các locus STR được sử dụng trong nhận dạng cá thể người

Khi nghiên cứu cấu trúc các trình tự lặp lại, các nhà khoa học đã tìm ra trong hệ gen người có những đoạn ADN được lặp lại liên tiếp nhau Các đoạn cấu trúc này được gọi là VNTR (Variable number of tandem repeats) hay còn gọi là các minisatellite DNA do cấu trúc này phần lớn phân bố theo kiểu “vệ tinh” so với ADN genom Trong số các đoạn VNTR, có những đoạn có cấu trúc với các đơn vị lặp lại từ 2-6bp được gọi là các đoạn lặp lại ngắn (hay STR) Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể Đó là nền tảng cho giám định gen Ngày nay, hầu hết các cơ sở giám định gen trên thế giới đều ứng dụng phân tích các đoạn STR với mỗi đơn vị lặp lại 4 nucleotide vì đặc tính ưu việt của chúng [22]

Theo cỏc cụng trỡnh nghiờn cứu đó được công bố của cỏc tỏc giả

Edwards et al (1991) [26], Beckman et al (1992), có xấp xỉ khoảng 200,000

vị trí trên genome người có các trỡnh tự STR với cỏc nhõn lặp kớch thước 3,

4 base với kích thước mỗi trỡnh tự khoảng 15kb, cỏc trỡnh tự này nằm rải rỏc tại cỏc vựng intron (vựng khụng mó húa gene) hoặc gần tõm động của 23 cặp NST [28,33]

Một locus STR được sử dụng cho mục đích xác định cá thể người phải thỏa mãn một số yêu cầu nhất định nên không phải đoạn lặp nào cũng có thể

sử dụng được Thứ nhất, locus STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử

cao Điều này giúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus tối thiểu đã đạt

được sự phân biệt cá thể một cách tốt nhất Thứ hai, các STR có độ dài ngắn,

trung bình từ 100 - 400 bp so với các đoạn đa hình ngẫu nhiên khác (VNTR) Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bị đứt gãy trong quá trình tác động của điều kiện bên ngoài, do vậy phản ứng PCR thực hiện sẽ hiệu quả

hơn Thứ ba, các locus STR sử dụng tốt nhất được di truyền độc lập, do vậy

chúng phải nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau, điều này đảm bảo cho tính độc lập của từng locus Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài của các alen thông thường khác nhau một số đôi bazơ nitơ, do vậy, việc sử dụng các STR có độ dài dưới 400bp phải dễ dàng phân tích bằng phương pháp điện

di trong gel poly acrylamide là yêu cầu cần thiết trong quá trình lựa chọn Những locus STR có nhân lặp kích thước lặp lại 4 base được nghiên cứu và sử dụng rộng rói nhất trong lĩnh vực khoa học hỡnh sự vỡ chỳng mang bốn đặc tính tiêu biểu sau:

 Tính đa hỡnh và mức độ dị hợp tử cao, nằm trên các NST khác nhau

 Dễ dàng phối hợp thành các bộ KIT phân tích đồng thời (multiplex PCR)

 Đột biến gen thấp

 Kích thước ngắn, khó bị phân hủy bởi các tác động cơ học và hóa học nên có thể thu được từ những mẫu đó bị phõn hủy một phần Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp từ 4 nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phân tích cá thể người

1.2.1 Các locus STR ứng dụng trong phân tích cá thể người

Những locus STR đang được sử dụng thông dụng hiện nay để nhận dạng cá thể người lần đầu tiên được thực hiện tại phòng thí nghiệm của TS Thomas Caskey tại học viện y Baylor [26] và tại cơ sở dịch vụ khoa học pháp

lý tại Anh [27] vào đầu những năm 1990 Sau đó Hãng Promega của Mỹ đã mua lại bản quyền một số locus được coi là những đoạn đánh dấu, trong khi

đó hãng Perkin Elmer (PE) đồng thời tìm kiếm những locus STR và phát triển một số locus đánh dấu khác

Bộ STR đầu tiên được nghiên cứu phát triển phục vụ cho ngành pháp lý là bộ STR 4 đoạn STR đánh dấu : TH01, FES/FPS, vWA và F13A1 [29] Đây là bộ đánh dấu thế hệ thứ nhất Xác suất hai cá thể trùng nhau khi sử dụng bộ KIT bốn gen này khoảng 1/10000 Bộ KIT thế hệ thứ hai gồm 6 locus là TH01, vWA, FGA, D8S1179, D18S51 và D21S11 với xác suất hai cá thể trùng nhau là 1/50.000.000 Những locus nêu trên đều sử dụng các phương pháp huỳnh quang để phát hiện

Từ năm 1996 phòng thí nghiệm của FBI đã đỡ đầu cho việc nghiên cứu và xây dựng cơ sở dữ liệu từ 13 đoạn FGA, TH01, TPOX, vWA, D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317, D16S539, D18S51, CSF1PO, D8S1179 và D21S11 13 locus đánh dấu này được chia thành 4 nhóm chính [18]:

- Nhóm thứ nhất: trình tự lặp lại chứa các trình tự giống nhau: TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317, D16S539

- Nhóm thứ hai: Một vài trình tự có những alen không đồng nhất: TH01, D18S51, D7S820

- Nhóm thứ ba: Cấu trúc kép với các alen khác nhau:vWA, FGA, D3S1358, D8S1179

- Nhóm thứ tư: Cấu trúc dạng lặp dạng phức: D21S11

1.2.2 Cỏc locus sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 1 Thông tin về các locus trong nghiên cứu

Kích thước sản phẩm PCR

TC IV - Bộ Công an)

1.3 Các phương pháp phát hiện ADN

Từ khi bắt đầu phát triển các xét nghiệm này đến nay, có ba phương pháp

chính phát hiện các phân tử ADN sau điện di là:

 Nhuộm Ethidium Bromide;

 Đánh dấu phóng xạ - phóng xạ tự ghi;

 Nhuộm bạc;

 Đánh dấu huỳnh quang

Bảng 4 đánh giá phương pháp và các thiết bị khác nhau được sử dụng

để phát hiện chỉ thị ADN trong các xét nghiệm dựa trên kĩ thuật PCR từ trước đến nay (sắp xếp theo năm áp dụng)[21]

Bảng 2 Các phương pháp/thiết bị phát hiện ADN

Kỹ thuật/

Năm áp dụng

Gắn huỳnh quang/

ABI 373 hoăc 377 Sản phẩm PCR được đánh dấu với 04 màu huỳnh quang khác nhau Các băng ADN

được đọc tự động trong quá trình điện di khi chúng đi qua nguồn laze quét qua gel, kết quả được đọc và phân tích nhờ phần mềm

Edwards et al (1991) Frazier et al (1996)

Điện di lai trực tiếp Gắn bản gel đã điện di lên màng nilon, cố

định bằng sánh sáng UV và xác định bằng digoxygenin

Berschick et al (1993)

Đánh dấu đồng vị

phóng xạ tự ghi dCTP được đánh dấu bằng P

32 , kết hợp vào các sản phẩm PCR

Hammond et al

(1994) Gắn huỳnh quang/

Bechman CE

Sản phẩm PCR được đánh dấu với thuốc nhuộm xen vào giữa các sản phẩm PCR trong suốt quá trình phân tách CE để phát hiện màu đơn

Butler et al(1994)

Nhuộm bạc Bản gel sau điện di được nhuộm trong dung

dịch bạc và hiện băng ADN bằng dung dịch Formaldehyde

Morin ADN Smith (1995)

Gắn huỳnh quang/

mao quản Quét laze qua nhiều mao quản để phát hiện sản phẩm PCR đã được đánh dấu huỳnh

quang

Wang et al (1995) Mansfield et al (1998)

Gắn huỳnh quang/

LICOR

Sản phẩm PCR được đánh dấu bằng thuốc nhuộm near-IR và kết quả đọc tự động trên máy ABI 377

Roy et al (1996)

Gắn huỳnh quang/

ALF Sequencer

Đọc kết quả tự động bằng máy ABI 377 với

01 mao quản màu đơn

Decorte ADN Cassiman (1996) Gắn huỳnh quang/

FMBIO Scaner

Quét bản gel đã điện di với bước sóng 532nm Sử dụng 03 màu huỳnh quang khác nhau cùng với bộ KIT powerplex STR

Schumm et al (1995) Lins et al (1998)

Gắn huỳnh quang/

ABI 310

Sản phẩm PCR được đánh dấu với 04 màu huỳnh quang, điện di sản phẩm PCR bằng mao quản Kết quả đọc tự động trên máy ABI 377

Buel et al (1998) Lazaruk et al (1998)

tự động

Sgueglia et al (2003) Butler et al (2004)

Dưới đây chúng tôi sẽ trình bày kĩ hơn về các phương pháp phát hiện phân tử này

1.3.1 Phương pháp nhuộm Ethidum bromide

Ethidium bromide được sử dụng để phát hiện băng ADN trên gel agarose và gel poly acrylamide, chất này có khả năng xen kẽ vào ADN sợi kép Nó có độ nhạy khoảng 1 ng/ băng ADN Sau khi nhuộm băng, ADN được phát hiện bằng tia UV Phương pháp này thao tác đơn giản, nhanh chóng, thuận lợi và ít tốn kém nên được sử dụng phổ biến Tuy nhiên, Ethidium bromide là hóa chất gây ung thư do đó phải thận trọng trong quá trình bảo quản, sử dụng và cần phải được xử lý khi loại bỏ Mặt khác, bản gel sau khi nhuộm Ethidium Bromide không giữ được lâu, cần phải chụp ảnh ngay[36]

1.3.2 Phương pháp đánh dấu phóng xạ

Các chất đồng vị phóng xạ thường dùng để đánh dấu mẫu dò là P32

, S35và H3 Trong đó thì P32

được sử dụng nhiều nhất, nó phát tia β- có năng lượng rất cao nên tín hiệu nhận được rõ và thời gian phơi sáng ngắn Một số phương pháp đánh dấu phóng xạ phổ biến [22, 25]:

 Đánh dấu ở đuôi

 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt

 Đánh dấu bằng kéo dài đoạn mồi

Nhìn chung, ưu điểm của phương pháp này là có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phơi sáng ngắn Nhưng chúng lại có nhược điểm là rất hại cho sức khỏe người thao tác, đặc biệt là P32

phát tia có độ xuyên sâu, đòi hỏi phải có nhiều biện pháp bảo đảm an toàn và gây tốn kém trong các thao tác cũng như xử lý chất thải

1.3.3 Phương pháp nhuộm bạc

Phương pháp nhuộm bạc được sử dụng cho bản gel poly acrylamide đã điện di để phát hiện các băng ADN Quá trình nhuộm bạc thường được thực hiện trên máy lắc (ngang hoặc xoay), bản gel đã điện di được lắc liên tục trong khay nhuộm với các dung dịch khác nhau để làm hiện băng ADN Đầu tiên là dung dịch nhuộm chứa nitrat bạc để bạc gắn vào các phân tử ADN trong gel, bạc sau đó kết hợp với formaldehyde có trong dung dịch hiện tạo thành lớp bạc kim loại, hiện rõ các băng ADN Bản gel sau đó được để khô và chụp (hoặc scan) lưu giữ bản kết quả, hoặc có thể được bảo quản lâu dài[36] Được sử dụng đầu tiên ở bộ KIT thương mại phân tích STR của hãng Promega và hiện các bộ KIT này vẫn được bán trên thị trường mặc dù các bộ KIT phân tích chỉ thị huỳnh quang đang được sử dụng phổ biến Tuy nhiên,

do các thao tác chủ yếu phải thực hiện bằng tay, khó tự động hóa được các bước, nên phương pháp này không thuận lợi bằng phương pháp sử dụng mồi đánh dấu huỳnh quang

1.3.4 Phương pháp đánh dấu huỳnh quang

Phát hiện huỳnh quang dựa trên các chất đánh dấu phát quang đã được

sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm pháp y do chúng cho phép giảm thiểu các thao tác kĩ thuật, có thể đọc kết quả tự động với các thiết bị - phần mềm chuyên dụng, cho phép phân tích nhiều locus trên cùng một phản ứng (với nhiều màu đánh dấu huỳnh quang) nên giảm thiểu thời gian phân tích

Đánh dấu huỳnh quang sản phẩm PCR có thể thực hiện bằng ba

cách, mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng [21,25]:

 Kết hợp một thuốc nhuộm huỳnh quang vào sản phẩm nhân bội bằng mồi đã được đánh dấu huỳnh quang

 Sử dụng các dNTPs có đánh dấu huỳnh quang khi thực hiện PCR

 Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang xen vào giữa để gắn vào ADN

Sử dụng thuốc nhuộm xen vào giữa sản phẩm PCR có thể được thực hiện sau khi tiến hành PCR và ít tốn kém so với hai phương pháp còn lại Tuy nhiên nó chỉ cho kết quả các trình tự ADN có một màu duy nhất, vì thế chỉ có thể phân biệt các trình tự ADN dựa vào kích thước Mặt khác, việc bổ sung thuốc nhuộm huỳnh quang vào đoạn phân tử ADN sẽ tác động đến tính di động của đoạn ADN đó trong trường điện di (điều này gây ra do kích thước và hình dạng vật lý của thuốc nhuộm sẽ làm thay đổi kích thước tổng thể của phân tử lai giữa thuốc nhuộm và trình tự ADN, đồng thời điện tích ion có trong thuốc nhuộm cũng làm thay đổi tỉ lệ kích thước giữa liên kết của các acid nucleic)

Sử dụng mồi PCR được đánh dấu huỳnh quang sẽ khắc phục các nhược điểm trên, trong phương pháp này, chỉ một sợi đơn của sản phẩm PCR được đánh dấu, điều đó sẽ đơn giản hóa việc xử lý dữ liệu, mồi đánh dấu huỳnh quang cũng cho phép nhân bội nhiều locus đồng thời trong cùng một phản ứng nhưng kết quả vẫn được đọc độc lập Tuy việc gắn xen huỳnh quang vào mồi cũng ảnh hưởng đến tính di chuyển của sản phẩm PCR trong gel hoặc mao quản, vấn đề này có thể khắc phục bằng các phần mềm, hơn nữa kiểu gen của mẫu luôn luôn liên quan đến bộ thang alen chỉ thị đi kèm, bộ thang và mẫu được nhân bội với cùng mồi thiết kế đặc hiệu nên việc đọc thang alen không bị ảnh hưởng bởi các tác động của việc gắn thuốc nhuộm vào trình tự ADN

Sự phát hiện huỳnh quang: Nguồn laser được chiếu vào thuốc nhuộm

huỳnh quang (Fluorophore) được gắn ở cuối trình tự ADN Phân tử này hấp thụ năng lượng từ nguồn laser và sau đó phát ánh sáng có mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) Phin lọc được sử dụng để ghi nhận ánh sáng phát ra tại một bước sóng cụ thể hoặc một dãy các bước sóng Ống quang tử hoặc một thiết bị tích điện sẽ thu thập và khuyếch đại tín hiệu từ các phân tử

phát huỳnh quang và chuyển nó thành tín hiệu điện tử Những tín hiệu này biểu hiện mối liên quan và tính chất các đỉnh cộng hưởng (peak) quan sát thấy trong trường điện di mao quản hoặc là các băng trên bản gel đã điện di

Mặc dù trở ngại lớn nhất khi áp dụng phương pháp phân tích này là trang thiết bị đồng bộ khá tốn kém, đòi hỏi phải có mồi đánh dấu huỳnh quang nhưng với những ưu điểm trên, hiện nay phương pháp này được dùng phổ biến trong các phân tích chỉ thị ADN

1.4 Đại cương các về chất huỳnh quang và ứng dụng trong phân tích ADN

1.4.1 Khái niệm về chất huỳnh quang

Huỳnh quang là hiện tượng phát xạ ánh sáng bức xạ điện từ của một chất có hấp thụ bức xạ của bước sóng khác nhau Trong hầu hết trường hợp, hấp thụ ánh sáng của một bước sóng nhất định gây ra sự phát xạ của ánh sáng với bước sóng dài hơn (và năng lượng thấp hơn) Tuy nhiên, tại điều kiện bức

xạ cao đang được hấp thụ, có thể cho một điện tử hấp thụ hai photon (hấp thụ nhiều photon) và có thể dẫn đến sự phát xạ của bức xạ có bước sóng nhỏ hơn

so với các nguồn kích thích Sự khác biệt giữa năng lượng được hấp thụ và phát ra lượng tử ánh sáng do tổn thất nhiệt Ứng dụng thực tế của hiệu ứng này được tìm thấy trong khoáng vật, cảm biến hóa học, đánh dấu huỳnh quang, thuốc nhuộm, máy dò sinh học… Thuật ngữ “huỳnh quang” – fluorescent, được đặt bởi George Gabriel Stokes trong bài báo năm 1852, tên chính nó được bắt nguồn từ fluorit khoáng (canxi difluoride) Vậy chất huỳnh quang được hiểu là những chất mà phân tử của nó có khả năng phát huỳnh quang

Các phép đo sự phát quang bắt nguồn từ sự kích thích một phân tử thuốc nhuộm, sau đó thuốc nhuộm được kích thích phát sáng và được đọc dưới thiết bị chuyên dụng Một phân tử có khả năng phát huỳnh quang được

gọi là một Fluorophore Các Fluorophore khác nhau về hình dạng, kích thước và khả năng phát quang, các Fluorophore được sử dụng chủ yếu trong đánh dấu ADN là nó có khả năng phát quang trong vùng quan sát của quang phổ (phạm vi phát sáng khoảng 400nm – 600nm)

Quá trình phát quang miêu tả rõ trong hình 4 Bước đầu tiên, một photon (Hvex) từ nguồn laser kích thích điện tử từ vùng năng lượng cơ sở (S0) đến vùng dịch chuyển kích thích (S’1) Điện tử này sau đó thay đổi hình dạng và tương tác với môi trường của nó dẫn đến trạng thái kích thích (S1) Bước cuối cùng, một photon (Hvem) được phát sáng tại mức năng lượng thấp hơn khi các điện tử được kích thích trở lại trạng thái cơ sở Vì năng lượng và bước sóng có quan hệ thuận nghịch với nhau, photon phát sáng có bước sóng cao hơn photon kích thích Sự khác biệt giữa các đỉnh hấp thụ và quang phổ phát

xạ gọi là dịch chuyển Stokes [9, 25] Thay đổi này cho phép sử dụng các bộ lọc quang học phù hợp để phân chia ánh sáng từ nguồn ánh sáng phát ra Đặc tính hấp thụ ánh sáng và phát quang của Fluorophore phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của nó và điều kiện môi trường, nên nếu chọn lọc cẩn thận các bộ lọc quang học khác nhau, có thể lựa chọn được phổ phát sáng của các Fluorophore với các phin lọc khác nhau

Hình 2 Quá trình phát huỳnh quang

a) Các bước chuyển năng lượng b) Bước chuyển phát huỳnh quang

Ưu điểm lớn nhất của phương pháp đánh dấu huỳnh quang đó là khả năng sử dụng nhiều Fluorophore để đọc nhiều trình tự ADN khác nhau trong cùng một phản ứng, tỉ lệ đọc mẫu của phức hợp nhiều loại Fluorophore cao hơn nhiều so với việc phân tích sử dụng đơn Fluorophores Có một số yếu tố ảnh hưởng đến mức phát huỳnh quang của các Fluorophores cần lưu ý là:

 Phân tử gam hệ số dập tắt: khả năng thuốc nhuộm hấp thụ ánh sáng

 Năng suất lượng tử: hiệu suất Fluorophores được kích thích chuyển đổi hấp thu ánh sáng phát sáng

 Ổn định ánh sáng: khả năng tồn tại lâu bền trong trường kích thích khi thuốc nhuộm trải qua các chu kì kích thích và phát sáng mà không bị phá hủy, hoặc trải qua tẩy trắng ảnh

 Môi trường nhuộm: các yếu tố có ảnh hưởng đến mức độ phát huỳnh quang bao gồm độ pH, nhiệt độ, dung môi, và sự hiện diện của một số chất ức chế như hemoglobin

Hiệu quả phát huỳnh quang tổng thể của một phân tử thuốc nhuộm phụ thuộc vào sự kết hợp của bốn yếu tố trên Thực tế cho thấy độ sáng của một Fluorophore tỉ lệ thuận với hệ số dập tắt và năng suất lượng tử[21]

1.4.2 Ứng dụng chất huỳnh quang trong phân tích ADN

Hiện nay, hầu như tất cả các bộ KIT STR thương mại đều có sử dụng mồi đánh dấu huỳnh quang Bảng 5 tổng kết một số thuốc nhuộm huỳnh quang thường được sử dụng để đánh dấu sản phẩm PCR Các tên hóa chất đối với thuốc nhuộm được sắp xếp theo bước sóng kích thích và phát xạ của chúng

Bảng 3 Đặc trưng của một số thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng trong

các bộ KIT phân tích STR thương mại

(nm)

Ánh sáng phát

ra cực đại (nm)

JOE 6- carboxy-2’,7’-dim eoxy-4’,5’-

Mỗi bộ thuốc nhuộm huỳnh quang được sử dụng phải phù hợp với các thiết bị quang học, nguồn kích thích đi kèm Vì vậy, không linh động như phương pháp nhuộm bạc, các bộ KIT phân tích STR sử dụng mồi gắn huỳnh quang có yêu cầu chặt chẽ về các thiết bị sử dụng đi kèm hơn

1.5 Tình hình nghiên cứu chế tạo thang alen chỉ thị huỳnh quang

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Budowle et al (1991) là nhóm tác giả đầu tiên công bố bản miêu tả

thang alen Phương pháp này mô tả sự trộn lẫn các alen đã được nhân bội của locus D1S80 từ một số cá thể nhằm tạo một maker kích thước đơn giản để phân tích mẫu nhân bội cùng locus, mẫu và maker được nhận biết bằng kỹ

thuật điện di và sử dụng phương pháp nhuộm bạc Sau đó, các tác giả khác cũng công bố các quy trình chế tạo thang alen tương tự Budowle, nhưng sử dụng kỹ thuật điện di phân tách trên gel poly acrylamide và nhận biết các alen phân tách bằng mồi huỳnh quang sử dụng các đầu đọc huỳnh quang để ghi nhận hình ảnh [20, 33]

Từ những năm đầu thập niên 90 thế kỷ XX, hai hãng thương mại nổi tiếng sản xuất chế phẩm sinh học là Perkin Elmer và Promega (Mỹ) đã sản xuất nhiều bộ KIT phân tích ADN khác nhau Các bộ KIT thương phẩm như trên thường được gắn một số chất huỳnh quang, sản phẩm PCR (là các đoạn ADN tương ứng với loại alen) được phát hiện bằng các máy giải trình tự như: ABI prism 377 DNA Sequencer, ABI prism 310 DNA Sequencer… Mỗi bộ KIT phân tích ADN đối với từng locus bao gồm:

- PCR mix bao gồm các thành phần để thực hiện PCR với cặp mồi tương ứng đặc hiệu đã thiết kế (PCR mix có thể cho 1 locus hoặc nhiều locus trong

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, trong khoảng 10 năm trở lại đây việc ứng dụng các kỹ thuật phân tích chỉ thị ADN trong xác định cá thể người và huyết thống đã có nhiều bước phát triển và thành tựu Tại trung tâm công nghệ Sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội [13, 17], các tác giả đã nghiên cứu việc sử dụng xét nghiệm chỉ thị phân tử dựa trên PCR để nghiên cứu tần suất alen của hai locus D1S80 và D17S5, đồng thời với các nghiên cứu về locus gen đa hình nằm trên NST giới tính Y Các nghiên cứu của trường Đại học Y Hà Nội tập trung vào việc xác định giới tính thai nhi, xác định các bệnh di truyền liên quan đến giới tính

Năm 1999, Viện khoa học hình sự - Bộ Công an đã ứng dụng và xây dựng được bảng tần suất alen của 9 locus gen[11, 14] Các công trình nghiên cứu này đến nay vẫn được tiếp tục theo hướng hoàn thiện công nghệ từ tách chiết, định lượng ADN, PCR để tìm ra những đặc thù của hệ gen người Việt và các dân tộc khác phục vụ cho công tác giám định

Theo hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích gen phục vụ chẩn đoán hình sự, Viện kỹ thuật Hoá sinh và Tài liệu nghiệp vụ - Bộ Công an đã nghiên cứu chế tạo các bộ KIT phân tích gen để thay thế các sản phẩm nhập ngoại, mục đích chủ động được công nghệ, hạ giá thành phân tích và có thể chuyển giao kỹ thuật cho các địa phương

Tuy nhiên, việc nghiên cứu công nghệ phân tích STR sử dụng các cặp mồi huỳnh quang trong chế tạo thang alen chỉ thị tại Việt Nam chưa có một

cơ sở nghiên cứu nào tiến hành Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xây dựng thang alen chỉ thị huỳnh quang với mục đích nâng cao năng lực phân tích cho các phòng thí nghiệm ở địa phương có nhu cầu Nội dung nghiên cứu gồm có:

1 Tách chiết, định lượng ADN trong các mẫu nghiên cứu

2 Nhân bội và kiểm tra sản phẩm PCR để thu nhận mẫu sử dụng cho chế tạo thang alen

3 Chế tạo thang alen đơn cho mỗi locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358

4 Chế tạo thang alen phức hợp 05 locus trong cùng một phản ứng PCR

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu sử dụng trong đề tài bao gồm các mẫu máu (khoảng 50 mẫu), 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358

Mẫu máu được thu bằng cách sử dụng xilanh hút và bơm lên trên bề mặt lớp giấy thấm có tẩm sẵn hóa chất bảo quản (EDTA, Tris-base )

Chúng tôi sử dụng mẫu khuôn chuẩn K562 của hãng Promega để làm mẫu đối chứng dương trong các thí nghiệm và để xác định các alen của thang alen sau khi chế tạo hoàn chỉnh Mẫu khuôn K562 có hàm lượng 10ng/µl, có độ tính sạch cao, có kiểu gen đã được xác định ở tất cả các locus, kể cả 05 locus sử dụng trong nghiên cứu

2.1.2 Thiết bị, vật tư nghiên cứu

- Các máy móc cần thiết cho pha hóa chất, Tách chiết, PCR và điện di

- Hệ thống điện di Sequi-Gen GT Nucleic Acid Electrophoresis Cell

- Đầu tip các loại: 10 l, 200 l, 1000 l và đầu tip có lọc 200 l

2.1.3 Mồi cho ca ́ c locus nghiên cứu

Trong đề tài , chúng tôi sử dụng các bộ mồi cho 05 locus Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 đã được nghiên cứu áp dụng tại Phòng thí nghiệm Công nghê ̣ Gen và Vi sinh (P3 - Viện H57 - Tổng cục IV - Bộ

Công an) và được tổng hợp gắn chất huỳnh quang Fluorescein (FL) bở i mô ̣t hãng IDT (Mỹ)

B¶ng 4 Trình tự mồi trong nghiên cứu

 Hoá chất dùng cho điện di

- Đệm TBE 5X: Hòa tan 54g Tris-base trong 500ml, bổ sung 27,4g acid boric và 20ml EDTA 0,5M, pH8 Sau khi các hóa chất tan hoàn toàn, định mức bằng nước khử ion đến 1000ml Bảo quản dung dịch ở 4o

C

- Agarose 1,5%: Cân 1,5g agarose, định mức bằng TBE 1X đến 100ml

- Dung dịch gel poly acrylamide 6%, Urea 7M: Cân 420g urea, hòa tan trong 300ml nước khử ion Bổ sung 57g acrylamide và 3g bis-acrylamide, hòa tan hoàn toàn và định mức đến 1000ml Bảo quản dung dịch ở 4o

C

- Đệm trộn mẫu Glycerol: Chuẩn bị 30ml Glycerol, bổ sung 0,05 g Bromophenol Blue và 0,05 g Cylen Xyanol FF và định mức đến 100ml bằng nước khử ion Lắc đều cho các hóa chất tan hoàn toàn và bảo quản ở

4oC

- Ethidium Bromide 1 mg/ml: Bổ sung 5ml nước khử ion vào lọ Ethidium Bromide 1g (Merck) Lắc tan hoá chất Lấy 1ml pha trong 199ml đệm TBE 1X Bảo quản dung dịch trong chai thủy tinh tối màu và tránh ánh sáng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Chọn mẫu thẻ FTA đã được lưu giữ và bảo quản

Mồi huỳnh quang đã được

Chọn sản phẩm PCR mang alen

Tinh sạch sản phẩm PCR

Phối trộn tạo thang alen đơn

Phối trộn tạo thang alen phức

Nhân bội thang alen nhiều cấp

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn

Kiểm tra tỷ lệ phối trộn

Đị nh lượng sản phẩm PCR

2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN

Quá trình tách chiết ADN từ cỏc mẫu mỏu thu được trên thẻ bảo quản bằng Chelex bao gồm cỏc bước:

 Lấy 1/4 vòng tròn vết máu trên thẻ cắt nhỏ cho vào ống eppendorf 1,5

ml vô trùng;

 Bổ sung 1ml đệm PBS hoặc nước khử ion vô trùng;

 Vortex mạnh; ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút;

 Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch và thu phần cặn giấy;

 Lặp lại 2 lần để loại bỏ hết huyết sắc tố của hồng cầu, các protein đã biến tính và các tạp chất;

 Bổ sung 200 l dung dịch chelex 5%;

 ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 560C khoảng 30 phút;

 Vortex mạnh 10 giây và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 1000

C trong 8 phút;

 Vortex mạnh 30 giây Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút;

 Hút phần dịch trên chứa ADN cho sang ống eppendorf 0,5 ml mới;

 Bảo quản ở -200C hoặc có thể sử dụng ngay cho các phản ứng PCR

2.2.2 Phương pháp định lượng ADN

Tại phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng máy quang phổ kế NanoDrop cña h·ng ThermoScientific để định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của khuôn ADN sau tách chiết Các bước tiến hành đo như sau:

 Bật máy, chờ máy khởi động

 Lựa chọn chế độ đo ssDNA (single strain DNA)

 Hiệu chỉnh: Hút 2l nuclease free water hoặc nước khử ion vô trùng hoặc đệm pha loãng khuôn ADN bơm lên mắt đọc, đóng cánh tay của máy xuống, nhấn nút hiệu chỉnh (nút Blank)

 Sau khi hiệu chỉnh bằng mẫu nước hoặc đệm, tiến hành đo đo mẫu:

- Dùng giấy mềm lau mắt đọc, hút 2l mẫu khuôn ADN cần định lượng và bơm lên mắt đọc, đóng canh tay của máy xuống, nhấn nút đo mẫu (Measure)

- Kết quả được hiển thị trong bảng với các thông số: Tên mẫu - Hàm lượng ADN (ng/l) - Chỉ số A260nm - Chỉ số A280nm - Chỉ

số A260nm/280nm (OD)

- Lưu kết quả đo vào dữ liệu phân tích

2.2.3 Phương pháp nhân bội ADN

Dựa trên yêu cầu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các cặp mồi đã được

sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ Gen và Vi sinh (P3 – Viện H57 – Tổng cục IV – Bộ Công an) Bộ mồi 05 locus STR Penta E, D18S51, D21S11, TH01 và D3S1358 đáp ứng các yêu cầu tương thích, có hiệu suất cao, cho phép nhân bội đồng thời cả năm locus trong cùng một phản ứng PCR

Chất huỳnh quang Fluorescein được lựa chọn cho nghiên cứu vì đây là chất huỳnh quang được sử dụng ở hầu hết các máy scanner và thiết bị giải trình tự tự động khác như FMBIO (Hitachi), Pharos FX plus (Bio-rad), ABI PRISMđ Genetic Analyzer (Applied Bio System), ngoài ra còn được sử dụng trong các bộ KIT thương mại khác hiện đang được bán trên thị trường như bộ KIT Power Plex 16 của Promega

Kỹ thuật PCR nhân bội ADN được thực hiện với các điều kiện đã được tối ưu tại phòng thí nghiệm, sử dụng chung cho 05 locus trong nghiên cứu như sau:

Bảng 5 Thành phần phản ứng nhân bội đơn locus

Chu trình nhiệt sử dụng cho nhân bội các mẫu đơn locus như sau:

Bảng 6 Chu trình nhiệt nhân bội đơn locus

2.2.4 Kỹ thuật điện di ADN

Đề tài sử dụng phương pháp điện di trên gel agarose và gel poly acrylamide

Điện di trên gel agarose

 Chuẩn bị gel agarose:

- Pha agarose 2% trong 1X TBE và đựng trong bình nón chịu nhiệt

- Đun nóng cho agarose tan hoàn toàn

- Để nguội đến 60OC, đổ gel vào khay đã được lắp lược