Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (panax ginseng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM PANAX G

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI – 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

HD1: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG HD2: PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG, PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ và ThS CAO CÔNG KHÁNH đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia và các anh chị, các bạn công tác tại Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia

sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia

sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC

Association of Official Analytical Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

PDA Photodiode Array Mảng diod quang

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

TLC Thin layer chromatography Lớp mỏng hiện năng cao

USP United States Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid 7

Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol 9

Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol 10

Bảng 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic 11

Bảng 3.1 Chương trình gradient 1, 2 26

Bảng 3.2 Chương trình gradient 3, 4 27

Bảng 3.3 Danh mục các pha động HPTLC khảo sát 29

Bảng 3.4 Kết quả định lượng ginsenosid trong mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết bằng n-butanol khác nhau 34

Bảng 3.5 Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất 37

Bảng 3.6 Độ lặp lại hệ số lưu giữ Rf 38

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn Rg1, Rg1 41

Bảng 3.8 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1, Rb1 43

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1 trên HPTLC 43

Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1 44

Bảng 3.11 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1 46

Bảng 3.12 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng 47

Bảng 3.13 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm 48

Bảng 3.14 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu nước sâm 49

Bảng 3.15 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột 50

Bảng 3.16 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu viên nang mềm trên HPTLC 51

Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng 52

Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm 53

Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu dung dịch 54

Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng trên HPTLC 55

Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm trên HPTLC 56

Bảng 3.32 Kết quả phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 trong các TPCN 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng 8

Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol 9

Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol 10

Hình 1.4 Cấu trúc Saponin với aglycon là acid oleanolic 10

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1 11

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1 11

Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 1 27

Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 2 27

Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 3 28

Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 4 28

Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 1 29

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng MeOH ở nồng độ khác nhau

31

Hình 3.7 Sắc đồ sử dụng với dung môi chiết MeOH 70% 31

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng EtOH ở nồng độ khác nhau

32

Hình 3.9 Đồ thị biểu thị hiệu quả chiết mẫu với các dung môi hữu cơ loại lipid 33

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37

Hình 3.11 Sắc đồ của mẫu trắng 39

Hình 3.12 Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 Hình 3.13 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 39

Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rg1 40

Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rb1 40

Hình 3.16 Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid 41

Hình 3.17 Đồ thị đường chuẩn Rg1, Rb1 phân tích trên HPLC 42

Hình 3.18 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm 42

Hình 3.19 Đồ thị đường chuẩn Rg1, Rb1 trên HPTLC 44

Hình 3.20 Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tích trên HPTLC 45

Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịch mẫu trắng 45

Hình 3.22 Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần 5 của viên nang cứng 47

Hình 3.23 Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 1 48

Hình 3.24 Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nước sâm lần 1 49

Hình 3.25 So sánh độ lặp lại của sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm dạng bột 50

Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, RB1 trong mẫu viên nang mềm trên HPTLC 51

Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang cứng lần 1

52

Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang mềm lần 1

53

Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong dung dịch lần 1 54

Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 57

Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 57

1

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm 5

1.1.1 Giới thiệu chung về nhân sâm 5

1.1.2 Tác dụng đặc trưng của nhân sâm 6

1.1.3 Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid 7

1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1 11

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích ginsenosid 12

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu 16

1.4 Tổng quan về kỹ thuật HPTLC 17

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng 17

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 19

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.4 Phương pháp nghiên cứu 21

2.4.1 Khảo sát các điều kiện HPLC 22

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPTLC 22

2.4.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 23

2.4.4 Thẩm định quy trình 24

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị 24

2.6.1 Thiết bị và dụng cụ 24

2.6.2 Hóa chất, thuốc thử 25

2

2.6.3 Dung dịch chuẩn 25

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPLC 26

3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPTLC 29

3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 30

3.4 Thẩm định phương pháp 37

3.4.1 Tính thích hợp hệ thống 37

3.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu 38

3.4.3 Khoảng tuyến tính 41

3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng 45

3.4.5 Độ lặp lại của phương pháp 46

3.4.6 Độ thu hồi của phương pháp 51

3.4.7 Kết quả áp dụng phương pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 trong một số sản phẩm 55

KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 63

Phụ lục 1: Sắc đồ đường chuẩn 63

Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại 64

Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi 65

3

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã được xem là thảo dược quý hiếm Hoạt chất chính tạo nên tác dụng kỳ diệu của nhân sâm là thành phần ginsenosid Hợp chất này được phân thành hai nhóm chính là nhóm Rb1 và nhóm Rg1 Vài năm gần đây nhiều nhà khoa học hướng tới sự quan tâm đặc biệt tới nhân sâm với rất nhiều nghiên cứu được công bố Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, nhân sâm được biết đến không chỉ là nguồn dinh dưỡng quý báu mà còn là một vị thuốc vô cùng quan trọng Theo nghiên cứu khoa học và sách đông y thì nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao Nguồn nguyên liệu này chủ yếu được nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giả mạo, sản phẩm nhập về chất lượng không đáp ứng được chất lượng Vì vậy việc kiểm soát tính đúng và chất lượng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu nhân sâm và thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng người dân sử dụng nhầm dược liệu hoặc mua phải dược liệu đã bị chiết hết hoạt chất, kém chất lượng Điều này không những gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh, quyền lợi người tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi người khi sử dụng thuốc từ dược liệu nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nước

Thông thường các phương pháp được sử dụng để phân tích hàm ginsenosid Rg1 và Rb1 bao gồm: các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ở Việt Nam phương pháp được sử dụng chủ yếu là phương pháp HPLC Phương pháp HPLC được áp dụng tại viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính và định lượng ginsenosid trong thực phẩm chức năng có chứa nhân sâm Tuy nhiên chưa có tiêu chuẩn về việc định lượng ban hành ở Việt Nam Do vậy việc áp dụng phụ thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm cụ thể Ngoài ra, phương pháp HPTLC cho thấy tiềm năng áp dụng để kiểm tra nhanh chất lượng của nhân sâm và các sản phẩm từ

4

sâm Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng một phương pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phương pháp phân tích Xuất phát từ

những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu phương pháp xác

định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax

Ginseng)”

Mục tiêu nghiên cứu:

 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng kỹ thuật HPTLC và HPLC

 Thẩm định phương pháp đã đã xây dựng theo các tiêu chí của thế giới

 Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm trên thị trường Hà Nội

5

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm

1.1.1 Giới thiệu chung về nhân sâm

Bộ phận thường sử dụng là rễ củ đã được phơi hay sấy khô của Nhân sâm

(Panax ginseng C.A Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Họ Nhân sâm

(Araliaceae Juss.) còn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì Hầu như tất cả các loài trong họ nhân sâm (Araliaceae) đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền

ở nhiều nước Á-Âu; đặc biệt là ở các nước Đông-Bắc Á Sâm trồng gọi là viên sâm, sâm mọc hoang gọi là sơn sâm

Viên sâm: Sâm trồng, phơi hoặc sấy khô, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ

tròn, dài khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, phần trên hoặc toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác và nông phần dưới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài, thường

có mấu dạng củ nhỏ không rõ Thân rễ (Lô đầu) sát ở đầu rễ, dài 1 - 4 cm, đường kính 0,3 - 1,5 cm, thường cong và co lại, có rễ phụ (gọi là Đinh) và có vết sẹo thân, tròn, lõm, thưa (gọi là Lô uyển) Chất tương đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơi vàng,

có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa, dạng điểm, màu vàng nâu và những kẽ nứt dạng xuyên tâm Mùi thơm đặc trưng, vị hơi đắng và ngọt

Hồng sâm: Hấp, sấy và phơi khô rễ viên sâm thu được Hồng sâm; Hồng sâm

có dạng rễ cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2 cm, mặt ngoài trong mờ, màu nâu hơi đỏ, đôi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàng thẫm, có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vòng tròn gián đoạn, không rõ nét, phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau

và nhiều rễ con cong queo, hoặc chỉ mang những vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển); một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh) Chất cứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa như sừng Mùi thơm đặc trưng, vị ngọt và hơi đắng

6

Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô Dược liệu là rễ cái, dài

bằng hoặc ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vòng vân ngang, trũng sâu, dày đặc, thường có 2 rễ nhánh, các rễ con trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ sắp xếp có thứ tự; có mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu” Thân rễ mảnh dẻ, nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tương đối dày đặc, trông tựa như hình hạt táo

Nhân sâm mọc hoang và được trồng ở đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên

xô cũ Việc trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch Đất phải tốt Cây ưa bóng râm Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ được rửa sạch, phơi nắng nhẹ, hoặc sấy nhẹ đến khô Người ta cho rằng loại mọc hoang có giá trị hơn loại trồng Hiện nay nước ta chưa trồng được, còn phải nhập nhân sâm của nước ngoài

Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe

1.1.2 Tác dụng đặc trưng của nhân sâm

Theo y học cổ truyền nhân sâm có công dụng: Đại bổ nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ ích phế, sinh tân, an thần ích trí Chủ trị: Khí hư muốn thoát, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hư, kém ăn, phế hư ho suyễn; tân dịch thương tổn, miệng khát nước, nội nhiệt tiêu khát, đái tháo, bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay choáng ngất Thành phần hoạt chất của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc trưng khác nhau được tóm tắt trong bảng 1.1

7

Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid

Ro Phân giải rượu, chống viêm gan và phục hồi hư tổn gan

Rb1 Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ương

làm dịu cơn đau, bảo vệ tế bào gan

Rb2 Ngăn ngừa, hạn chế bệnh tiểu đường, phòng chống xơ cứng

gan, đẩy nhanh khả năng hấp thụ của tế bào gan

Rc Làm dịu cơn đau, tăng tốc độ tổng hợp protein

Ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư, ngăn cản hoặc hạn chế sự phát triển của ung thư vú

Rd Đẩy nhanh hoạt động của vỏ tuyến thượng thận

Re Bảo vệ gan, làm tăng tốc độ tổng hợp của các tế bào tủy

Rf Làm dịu cơn đau trong các tế bào não

Rg1 Khả năng gây hưng phấn thần kinh trung ương, chống và phục

hồi mỏi mệt, cải thiện trí nhớ, tạo DNA, RNA, kích hoạt protease

Rg2 Hạn chế sự gắn kết các tiểu cầu máu, phục hồi trí nhớ, tăng

khả năng lưu thông máu lên não, kéo dài thời gian sống của tế bào

Rh1 Bảo vệ gan, hạn chế khối u, ngăn chặn gắn kết tiểu cầu máu Rh2 Ức chế các tế bào ưng thư, hạn chế khối u phát triển

1.1.3 Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid

Thành phần chủ yếu trong rễ sâm là saponin triterpen Khi thuỷ phân các saponin này thu được 3 loại sapogenin là: acid oleanolic, 20 (s) protopanaxadiol và

20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc damaran Các Saponin trong Nhân sâm gọi là ginsenosid được phân loại dựa vào cấu trúc của ba sapogenin trên Saponin còn gọi là saponosid là một nhóm glycosid gặp rộng rãi trong thực vật, đôi khi trong động vật (Hải sâm, cá sao) Tuy nhiên Saponin ở Nhân sâm có cấu tạo hoá

Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng

Chất lượng và thành phần của ginsenosid trong cây nhân sâm bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: loài, tuổi, bộ phận của cây, phương pháp canh tác, mùa thu hoạch và phương pháp bảo quản Tổng hàm lượng Saponin trong nhân sâm là tỷ lệ thuận với độ tuổi của nó, đạt tới mức đỉnh điểm vào khoảng sáu tuổi

Hợp chất Saponin thường được cấu tạo từ hai phần:

 Phần đường : glycol, phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose, acid galactunoic, acid D-glucuronic

27 20S

A

3

8 10

11 12

7

5

Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol

glc = glucose; ara(p) = arabinose trong dạng pyranose;

ara(f)= arabinose trong dạng furanose;

18 1

27 20S

12

15 14

1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1

a Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1

Chất này có tên theo IUPAC: glucopyranosyl]oxy}-12-hydroxydammar-24-en-3-yl 2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranoside Cấu tạo chi tiết đƣợc biểu diễn trong hình 1.5

(3β,12β)-20-{[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1

b Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1

Chất này có tên theo IUPAC: dihydroxydammar-24-en-6-yl β-D-glucopyranoside Công thức cấu tạo đƣợc biểu diễn chi tiết trong hình 1.6

1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích ginsenosid

Ginsenosid là đối tượng phân tích có thành phần nền phức tạp Thông thường, trong ginsenosid không chỉ có một chất, một hỗn hợp chất có tính chất khác nhau,

mà thường chứa một nhóm các chất có tính chất tương đối giống nhau Các chất trong cùng một nhóm chất đều giống nhau về khung cơ bản, khác nhau một vài nhóm thế hoặc các thành phần khác, tức là khác nhau không nhiều về tính chất vật

lý, tính chất hoá học Chính vì vậy, việc sử dụng các phương pháp quang phổ VIS, IR, huỳnh quang,…) để phân tích định lượng một thành phần trong dược liệu

(UV-gặp nhiều khó khăn và hầu như là không thể thực hiện được

Sắc ký là một trong những phương pháp xác định hàm lượng các chất thông dụng nhất hiện nay trong phân tích hiện đại Khác với các phép định lượng hoá học, các phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng từng chất cụ thể trong một hỗn hợp, phù hợp với quá trình phân tích các mẫu dược liệu Người ta có thể định lượng một chất hay định lượng đồng thời nhiều chất trong một lần định lượng nếu chọn được điều kiện thích hợp Các phương pháp sắc ký thường dùng là: sắc ký khí (GC), sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao

13

(HPLC), sắc kí bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Trong đó, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là phương pháp có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu các hợp chất tự nhiên nói chung và nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là có thể phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, nên khả năng phân tích rộng hơn nhiều so với sắc ký khí (thường dùng với các đối tượng dễ bay hơi) Với pha tĩnh ngày càng được hoàn thiện và đổi mới để nâng cao hiệu năng tách, detector ngày càng nhạy, ngày nay có thể dễ dàng phân tích các chất trong hỗn hợp ở mức ppm tới ppb, thậm chí ppt để phân tích các chất từ phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi tới các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly,…Trong lĩnh vực dược liệu, HPLC thường được sử dụng nhất trong định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu bằng việc so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao có nhiều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để phân tích ginsenosid Rg1 và Rb1 trong dịch sinh học [17][30][34]

Năm 1996, Trong một nghiên cứu William A.Court và cộng sự [17] đã nghiên

cứu xác định đồng thời (Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Ro, Rg1) ginsenosids trong Panax quinquefolium bằng phương pháp sắc ký lỏng pha đảo RP-HPLC Thể tích bơm mẫu 5 µl, cột Waters Symmetry C18 (150mm×3,9 mm, 5µm), tiền cột C18 tương ứng Tốc độ dòng 1,15 ml/phút và bước sóng hấp thụ 203 nm Pha động là dung dịch đệm phốt phát (A), dung dịch acetonitrile (dung dịch B) và H2O (dung dịch C), Chương trình gradient pha động như sau: 0-15 phút: 81%-79% A, 19% - 21% B; 15-24,5 phút: 79% - 73,7% A, 21% - 26,3% B; 24,5-29 phút: 73,7% - 73% A, 26,3% - 27% B; 29-43phút: 73% - 66% A, 27% - 34% B; 43-47 phút, 66 -64%A, 34-36%B; 47-54 phút : 54-57 %A, 36-43% B; 54-55 phút: 57-0%A, 43-85%B, 0-15%C; 55-59 phút 85%B, 15%; 81%A, 19%B Cách 2: Nhóm tác giả sử dụng vòi phun tự động 1040A, detecter diode array, cột tách carbohydrate cartridge(250 x 4,6mm) và cột bảo vệ cùng loại Với cùng bước sóng và thể tích bơm cột như trên Tốc độ dòng 1,5ml/phút Pha động là dung dịch H2O (A) và acetonitril (B)

14

Chương trình gradient pha động như sau: 0-28 phút, 9-19%A, 91-81%B; 28-30 phút, 19%A, 81%B; 30-35 phút, 19-22%A, 81-78%B; 35-40 phút, 22-25%A, 78-75%B; 40 – 41 phút, 25-9%A, 75-91%B Độ đúng của Rg1 1,2%, Rb1 là 3,8%

Năm 2003, trong một nghiên cứu khác Aik-jiang Lau cùng cộng sự [24] đã

phân tích các saponin trong Tam thất thô và hấp chín sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng pha đảo với detector diode array định lượng đồng thời (Rg1, Re, R1, Rb1, Rc, Rd) Hệ sử dụng bơm 1100 , van bơm mẫu (20 µl) , cột pha đảo Waters Symmetry C18 (250x4,6 mm, 5µm) Phân tích pha động chế độ gradient, nước (A) và acetonitril (B) Dung dịch B từ 20% đến 100% trong thời gian 80 phút Tốc độ dòng của pha động 1ml/phút, thể tích bơm mẫu 5µl và duy trì nhiệt độ cột ở 350C Detector diode array quét trong khoảng 190nm - 400nm, bước sóng hấp thụ là 203nm Độ đúng trong ngày, khác ngày RSD <4%; Hiệu suất thu hồi 97-102%; Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lượt là 0,011mg/ml; 0,010mg/ml Giới hạn định lượng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lượt là 0,036mg/ml; 0,033mg/ml

Năm 2007, Su Na Kim và cùng cộng sự [22] đã nghiên cứu định lượng đồng

thời 14 Ginsenosid trong nhân sâm Hàn Quốc bằng phương pháp HPLC - ELSD

Hệ sử dụng bơm L-62020 (Hitachi), cột tách Zorbax SB-Aq C18 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm), bằng dung dịch rửa giải nước (A), dung dịch acetonitril (B) của MeOH

và 200 mM axit phosphoric với diethyl amin 0,1M và sodium 1-heptane sulphonate

12 mM (1:4, v/v) Tốc độ dòng của pha động 1 ml/phút Phân tích pha động chế độ gradient, dung dịch B từ 21% đến 100% trong thời gian 61 phút Rửa cột 100%

B với thời gian 10 phút ELSD đã được giữ ở nhiệt độ 700C và máy phun khí nitơ

đã được điều chỉnh để 2,5bar Detector diode array quét trong khoảng 190nm - 203nm, bước sóng hấp thụ là 203nm Độ đúng trong ngày Rg1 2,62%, Rb1

3,94%, độ đúng khác ngày Rg1 2,19%, Rb1 3,71%; Hiệu suất thu hồi Rg1

100,46%, Rb1 là 104,88% Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lượt là 0,2µg, 0,15µg Giới hạn định lượng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lượt là 0,40µg, 0,3µg

15

Năm 2009, Ying Shi và cộng sự [30] đã xác định đồng thời chín (Rg1, Re, Rf,

Rb1, Rb3, Rg3, 20(S)-F1, 20(S)-F2, 20(S)-Rh2) ginsenosids trong thực phẩm chức năng sử dụng hệ thống HPLC, sử dụng cột tách C18 với chiều dài 250mm, 150mm kết quả cho thấy khi sử dụng cột tách cột Gemini 110A (250 mm × 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm) thời gian phân tích ít nhất 1giờ trong khi cột tách Inertsil ODS2 (150 mm × 4,6 mm, kích thước hạt 5 µm) có thể đạt được một sự tách biệt cơ bản trong thời hạn 30phút Cột bảo vệ (4 mm × 3,0 mm, kích thước hạt 5 µm) Thể tích bơm mẫu 5 µl Pha động là hỗn hợp dung dịch acetonitrile (dung dịch A) và nước (dung dịch B), tốc độ dòng 1ml/phút Phân tích pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 21% đến 70% trong thời gian 30 phút Nhiệt độ cột tách là 100C, detector diode array quét trong khoảng 190nm - 203nm, bước sóng hấp thụ là 203nm Độ đúng trong ngày Rg1 0,96%, Rb1 1,4%, độ đúng khác ngày Rg1 2,7%, Rb1 6,9% Giới hạn phát hiện LOD của Rb1, Rg1 lần lượt là 7,0ng; 14ng Giới hạn định lượng LOQ của Rb1 và Rg1 lần lượt là 120mg/kg; 230mg/kg

Renée J Vanhaelen-Fastré và cộng sự [32] đã sử dụng phương pháp HPTLC

Bảng mỏng Silica gel 60 F254 ( 20 mm x 20mm) Pha động sử dụng là hỗ hợp dung môi:1,2-dicloetan : etanol : MeOH : nước (56,8:19,2:19,2:4,8) Quét ở bước sóng 275mm với tốc độ 5mm/giây Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ ginsenosid Rg1, Rb1 từ 0,1 - 5µg với Rb1 (r =1), Rg1 (r=0,999) Giới hạn phát hiện 10ng/10mm, giới hạn định lượng LOQ từ 30 – 50ng/10mm

Nhận xét: Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu sử dụng kỹ thuật HPLC đã được dùng để phân tích các chất thuộc nhóm Ginsenosid như: HPLC – ESI – MS/MS, UPLC,… các kỹ thuật này cho kết quả tốt tuy nhiên các kỹ thuật này đều hiện đại, đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và vận hành phức tạp Ở Việt Nam hiện nay trang thiết bị cũng như điều kiện còn khó khăn nên khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm và sản xuất Kỹ thuật HPLC, HPTLC khắc phục được những nhược điểm trên vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để phân tích các thành phần hóa học ginsenosid trong các thực phẩm chức năng chứa nhân sâm

16

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu

Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định lượng

đó là phương pháp xử lý mẫu

J.B Wan cùng cộng sự [33] đã nghiên cứu quá trình xử lý mẫu bột nguyên liệu

khô theo cách: cân 0,5g mẫu bột khô cho vào ống ly tâm 50ml, thêm 30 ml MeOH lắc đều trong 30 giây trước khi rung siêu âm 2 giờ tại nhiệt độ phòng, để trong bồn siêu âm Sau khi ly tâm với tốc độ 2000 vòng/5 phút, dung dịch được gạn được định mức vào bình 50ml, lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm trước khi đưa vào hệ thống HPLC

Ngoài ra nhóm tác giả [11,19,33] sử dụng hệ thống chiết áp suất lỏng Dionex ASE 200 (Dionex Corp, Sunnyvale, CA, USA) trong điều kiện tối ưu Cân 0,5g mẫu bột đặt vào cột chiết 11ml làm bằng thép không gỉ Điều kiện tối ưu: kích thước hạt 0,3 -0,45µm, dung môi MeOH, nhiệt đô 1500C, áp suất 6,895 × 103 Mpa, thời gian

là 15 phút và một quá trình khép kín Dung dịch chiết chuyển vào bình định mức 50ml [19,33] hoặc định mức 25ml [15], định mức bằng MeOH Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45µm[33]; 0,22µm [15,19] trước khi bơm vào hệ thống HPLC

Trong một nghiên cứu khác Aik-Jiang Lau [24] cùng cộng sự đã nghiên cứu

xử lý 1g mẫu bột, thêm 10ml MeOH 70%, rung siêu âm 230V, trong 20 phút, lọc Quá trình chiết được lặp lại 2 lần Gạn lấy dung dịch cô quay ở 400C Phần cặn thu được được hòa tan trong 5ml MeOH 70% và được lọc qua màng 0,45µm trước khi mang đi phân tích

Dirk Steinmann, Markus Ganzera [31] tiến hành xử lý loại dầu viên nang mềm

trước khi phân tích: cân 6g viên nang cho vào bình Thêm 25 ml dung môi MeOH 40% và 25 ml hexan, lắc trong 30 phút Chiết lấy phần nước lọc bên dưới bằng bình chiết và được lọc qua màng lọc 0,45µm

Lie Li cùng cộng sự [26] xử lý 3g bột khô chiết bằng dung dịch 5ml MeOH

80% thêm 1ml dung dịch nội chuẩn 2,5mg/ml, rung siêu âm ở các thời gian khác nhau 30, 60, 90 và 120 phút Kết quả cho thấy chiết siêu âm 120 phút tốt nhất và gần như không có saponin nào còn thấy lại trong phần thải

17

Wei Shi cùng cộng sự [29] chiết kết hợp với lò vi sóng Cân 5g bột sâm cho

vào bình, thêm vào 50ml MeOH 70% ở áp suất 500kPa, thời gian 15 phút Mẫu được để nguội ở nhiệt độ phòng Gạn dung dịch chuyển vào bình cô quay 100ml

Cô quay chân không ở 600C Phần còn lại hòa tan trong 30ml nước Dung dịch đầu chiết lặp hai lần với 25 ml ether, các lớp nước sau đó được chiết lặp ba lần với 20

ml nước bão hòa n-butanol Sau đó, cô quay chân không cho bay hơi hết n-butanol

và phần cặn được hòa tan trong 10 ml MeOH Các dung dịch mẫu được lọc qua một màng lọc 0,45 µm trước khi phân tích

Ngoài ra các tác giả [33] đã xử lý mẫu bằng cách chiết solhet

có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm về phương pháp này

Trong sắc kí mặt phẳng, quá trình sắc kí được tiến hành trên một tờ giấy hay một lớp bột rải đều và được giữ trên mặt một tấm kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhôm Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang để giữ pha tĩnh trên đó Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác dụng của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực và điện thế

a Nguyên tắc của SKLM

Cũng như tất cả các phương pháp sắc ký khác, quá trình tách hỗn hợp các chất bằng SKLM xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh Trong SKLM, pha tĩnh được rải thành một lớp mỏng trên một giá đỡ phẳng Dưới tác dụng của lực mao quản, pha động thấm theo lớp mỏng đi qua điểm xuất phát – nơi hỗn hợp chất cần phân tích đã được đưa lên bản mỏng Trong quá trình di chuyển của pha động qua lớp mỏng chất hấp thụ (pha tĩnh), nhờ các quá trình hấp thụ và giải hấp thụ được lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhau mà những chất khác nhau di chuyển theo hướng chuyển động của pha động với các tốc độ khác nhau Kết quả là

18

mỗi chất trong hỗn hợp phân tích có thể sẽ được tách riêng ra ở các vị trí khác nhau trên bản mỏng Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký nhờ lực mao dẫn tách dung dịch thí nghiệm dựa trên độ phân cực của các thành phần trong dung dịch

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

Rf

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động( đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Pha động dùng cho TLC rất thay đổi, tùy thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường rửa giải thường dùng 2 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân

bố giữa 2 pha Tuy nhiên, lựa chọn tối ưu hóa sắc ký chủ yếu dựa vào kinh nghiệm

b Kỹ thuật TLC

 Đưa chất phân tích lên bản mỏng:

Lượng hỗn hợp các chất được đưa lên bản mỏng có ý nghĩa rất quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký, ảnh hưởng đến giá trị Rf, lượng mẫu đưa lên bản mỏng khoảng 0,1 - 50µg được pha trong dung môi thích hợp Thể tích dung dịch chấm 1 – 5 µL đối với với sắc ký phân tích và 0,1 – 0,2µL đối với sắc ký điều chế

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tân tiến nhất của công cụ TLC HPTLC với dụng cụ tinh vi được điều khiển bởi một phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng, độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra Trong phân tích HPTLC, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ, do đó lặp lại được độ lặp lại cao Các bước của quá trình phân tích bao gồm phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bán tự động, giảm thiếu tối đa các sai số có thể gặp phải Quá trình phun mẫu được tiến hành bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, tốc độ phun và không có nguy cơ hỏng

cơ học bản mỏng Trong quá trình khai triển, điều kiện khai triển về nhiệt độ và độ

ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta đưa vào thị trường bản mỏng hiệu năng cao (high – performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn (dày khoảng 100 µm) với bột mịn có kích thước hạt 5 µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, độ nhạy và độ phân tích được tăng lên bởi vì: Vết sắc ký nhỏ hơn, thời gian sắc ký ngắn hơn, lượng dung môi dùng ít hơn Pha tĩnh dùng silica và pha liên kết siloxan cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) có sẵn trên thị trường Tuy vậy trong kỹ thuật này kể cả HPTLC sai số của phương pháp dao động trong khoảng 5 – 10%

Ưu điểm của HPTLC:

+ Phù hợp với cả phân tích định tính và phân tích định lượng

+ Trong một lần triển khai sắc ký có thể phân tích đồng thời rất nhiều mẫu một lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

+ Các mẫu phân tích và các dung dịch chuẩn được chấm trên cùng 1 bản mỏng sắc ký, khai triển cùng trong một điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

Do bởi các ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC để nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng ginsenosid Rg1 và Rb1trong thực phẩm chức năng

21

CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là xây dựng quy trình xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng phương pháp HPTLC và HPLC Qua đó đánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp HPLC và HPTLC trong việc phân tích và kiểm nghiệm chất lượng nhân sâm

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hóa điều kiện để phân tích, xác định đồng hai ginsenosid (Rb1 và Rg1) bằng phương pháp HPLC và phương pháp HPTLC

- Đánh giá phương pháp phân tích xác định đồng thời ginsenosid Rb1 và Rg1 dựa trên: khảo sát khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn, đánh giá phương pháp phân tích, xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ), đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích, tính chọn lọc, tính đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống, đánh giá độ đúng của thiết bị và của phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích hàm lượng của ginsenosid Rg1 và Rb1 trong một số mẫu nhân sâm, sản phẩm nhân sâm đang lưu hành được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng mẫu phân tích là các mẫu nhân sâm tươi, khô và các mẫu sản phẩm được chế biến tứ nhân sâm: Viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén và dạng lỏng Các mẫu phân tích được lấy ngẫu nhiên trên thị trường Hà Nội có nguồn gốc

từ các công ty sản xuất khác nhau

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hai phương pháp phân tích chính trong nghiên cứu là phương pháp HPLC và HPTLC trong đó hầu hết các điều kiện tối ưu sẽ lựa chọn dựa tài liệu đã công bố liên quan và khảo sát một số điều kiện đặc biệt là dung môi triết mẫu và thành phần pha động

22

2.4.1 Khảo sát các điều kiện HPLC

Tham khảo tài liệu [17,22,24], chúng tôi khảo sát lại một thành phần pha động, giữ nguyên một số thông số nhằm tìm được điều kiện phân tích tối ưu nhất

- Pha động được lựa chọn khảo sát: nước và acetonitril ở những tỉ lệ khác nhau

- Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters( 250mm x 4,6mm; 5µm ) và tiền cột

cùng loại

- Tốc độ dòng: Tốc độ pha động cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký vì

nó liên quan đến quá trình thiết lập cân bằng của chất tan trong hai pha tĩnh và pha động Khi tốc độ dòng nhỏ chất phân tích ra muộn, gây doãng pic và mất nhiều thời gian phân tích Khi tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp mẫu chưa kịp tách ra khỏi nhau, dẫn đến hiện tượng chồng pic Khi hệ thống HPLC vận hành với tốc độ dòng cao sẽ dễ gây áp suất lớn, ảnh hưởng không tốt tới bộ phận của máy, đặc biệt là bộ phận bơm trộn sắc ký và cột tách sắc ký Dựa trên nhiều bài

báo nghiên cứu, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng 1,0 mL/phút

- Thể tích bơm mẫu: 50 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190nm đến 400nm

- Bước sóng phát hiện: 203 nm

- Nhiệt độ cột: 300C

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPTLC

Tham khảo tài liệu [13,32] chúng tôi khảo sát điều kiện phân tích HPTLC như sau:

- Pha tĩnh: HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm)

- Pha động: được lựa chọn để khảo sát với các pha động khác nhau để lựa chọn hệ pha động cho phân tích tốt nhất

23

- Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

- Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 80 mm

2.4.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Phương pháp xử lí mẫu sử dụng các kĩ thuật đơn giản nhằm hướng tới quy trình phân tích nhanh, hiệu quả Dựa trên tính chất chất cần phân tích và tham khảo tài liệu [11,19,24,26,31, 33] chúng tôi lựa chọn dung môi chiết: Hỗn hợp dung môi

để chiết mẫu là MeOH hoặc EtOH với nước Dung môi dietyl ete để loại béo đối với mẫu chứa chất béo, dung môi n-butanol để loại đường đối mẫu chứa đường trước khi tiến hành chiết mẫu Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng nhiệt độ thường (30oC) để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu

a) Quy trình xử lí mẫu dự kiến đối với mẫu viên nén, viên nang cứng (dạng bột):

- Mẫu được đồng nhất kỹ

- Cân 2-3g mẫu vào ống ly tâm, với nền mẫu chứa nhiều chất béo (loại chất béo trước khi phân tích

- Thêm 10ml dung môi chiết mẫu vào ống ly tâm trên

- Lắc vortex để mẫu và dung môi được đảo trộn đều

- Tiến hành chiết siêu âm ở 300C để tăng khả năng hòa tan của chất phân tích

- Để nguội đến nhiệt độ phòng

- Ly tâm với tốc độ cao 6000 vòng/ phút, phân tách phần dung dịch

- Lọc gạn phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml, phần cặn được chiết lặp

2 lần với dung môi chiết

- Định mức đến vạch bằng dung môi chiết, lọc rồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPLC, HPTLC

b) Quy trình chiết ginsenosid cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng dung dịch dự kiến gồm các bước sau: tương tự các bước đối với thực phẩm chức năng dạng viên nén, nang mềm và nang cứng nhưng thêm bước cuối làm sạch

và làm giầu mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE C18) như sau:

- Hoạt hóa cột: Lần lượt bằng các dung môi 6ml MeOH, 6ml nước cất

24

- Nạp dịch lên cột: tốc độ không quá 2 ml/phút

- Rửa, loại tạp chất: 6ml nước cất

- Rửa lấy dịch: 2 ml MeOH/lần × 2 lần

- Bơm mẫu vào hệ thống HPTLC, HPLC (pha loãng nếu cần)

2.4.4 Thẩm định quy trình

Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPLC và HPTLC được thẩm định về các tiêu chí:

- Độ chọn lọc, độ đặc hiệu của phương pháp

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của phương pháp

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

- Độ lặp lại, độ thu hồi của phương pháp

- So sánh với các yêu cầu của AOAC và các nghiên cứu khác

số biến thiên, độ thu hồi khi xử lý các kết quả thực nghiệm và đánh giá thẩm định phương pháp

2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.6.1 Thiết bị và dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu 20A gồm: bơm dung

môi, bộ loại khí, bơm mẫu tự động, buồng cột, detector PDA

- Cột sắc ký C18 Symmetry Waters (250mm x 4,6mm; 5µm) và tiền cột

25

- Bản mỏng HPTLC Silicagel GF254 (Merck, Đức)

- Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01g (XT1200c, Thụy Sĩ);

- Cân phân tích có độ chính xác 0,0001g (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Máy lắc vortex (VELP, Ý )

- Thiết bị đồng nhất mẫu, thiết bị ly tâm (Hermle, Đức)

- Máy rung siêu âm có chế độ gia nhiệt (Elma, Đức)

- Và các thiết bị dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm: ông ly tâm, ống đong,

pietman, phễu lọc, màng lọc,

2.6.2 Hóa chất, thuốc thử

Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Chất chuẩn :

 Chuẩn ginsenosid Rb1, Rb1 từ Sigma Aldrich độ tinh khiết ≥ 99%

 Các loại hóa chất, dung môi khác: MeOH (Merck 99,9%), dietyl ete (Merck 99,9%), n-Butanol (Merck – HPLC grade), nước cất được lọc qua màng 0,45µm và rung siêu âm loại khí, một số hóa chất khác

2.6.3 Dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc 500ppm: Cân 5,0 mg từng lượng chất chuẩn trên cân phân tích vào cốc có mỏ 50ml, hòa tan bằng MeOH và chuyển vào bình định mức 10ml, định mức bằng MeOH ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ Bảo quản trong điều kiện

lạnh

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 10ml và định mức bằng MeOH ta được dung dịch chuẩn

làm việc 100ppm

- Các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm

việc, được sử dụng trong ngày

26

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPLC

Tham khảo tài liệu [17,22,24,30] và khảo sát sơ bộ chúng tôi lựa chọn các điều kiện phân tích ginsenosid (Rb1, Rg1) bằng phương pháp HPLC bao gồm các điều kiện dưới đây trong toàn bộ quá trình nghiên cứu:

- Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; 5 µm) và tiền cột cùng loại

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút Thể tích bơm mẫu: 50 µL

- Detector: PDA quét dải phổ từ bước sóng 190 nm đến 400 nm

- Bước sóng phát hiện: 203 nm Nhiệt độ buồng cột: 300C

Để đạt được kết quả tín hiệu và độ phân giải tốt giữa hai chất phân tích việc khảo sát và lựa chọn thành phần pha động là rất cần thiết Qua khảo sát sơ bộ cho thấy phân tích ở chế độ đẳng dòng cho kết quả phân tách Rg1 và Rb1 không tốt do

đó sử dụng chương trình dung môi (gradient) được sử dụng để có được độ phân giải như mong muốn

Pha động nước – acetonitril được lựa chọn khảo sát ở những tỉ lệ khác nhau được biểu diễn trong bảng từ 3.1, 3.2 và hình tương ứng từ 3.1 đến 3.4

27

Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với chế độ gradient 1

Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với chế độ gradient 2

28

Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với chế độ gradient 3

Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với chế độ gradient 4

Như vậy, trong 4 chương trình gradient đã khảo sát, chương trình gradient 4 cho pic ginsenosid Rg1, Rb1 sắc ký gọn và cân xứng hơn cả Từ kết quả tối ưu hóa pha động, chúng tôi lựa chọn quy trình phân tích ginsenosidRg1, Rb1 bằng HPLC với điều kiện cụ thể như sau:

29

3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPTLC

Tham khảo tài liệu [13, 32] chúng tôi khảo sát các pha động như bảng 3.3, hình 3.5

Bảng 3.3 Danh mục các pha động HPTLC khảo sát

Thành phần và tỷ lệ pha động

Pha động 1 Cloroform - ethyl acetat - MeOH - nước (15: 40: 22: 10)

Pha động 2 Butanol: nước: ethyl acetat (10:5:2,5)

- Pha tĩnh HPTLC Silica gel 60 F254 (10mm × 20mm)

- Các thông số của bộ phận chấm mẫu bán tự động Linomat 5: