Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt recombinase polymerase amplification phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò

tsutsugamushi đã được nghiên cứu và phát triển nhằm cải thiện những hạn chế về độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể đặc hiệu hiện có trong chẩn đoán

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT

RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC

NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Lê Thị Thúy

NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP QUY TRÌNH ĐẲNG NHIỆT

RECOMBINASE POLYMERASE AMPLIFICATION PHÁT HIỆN TÁC

NHÂN GÂY BỆNH SỐT MÒ

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã số : 8420101.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.BS HỒ HỮU THỌ

TS MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội - 2019

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Hồ Hữu Thọ - Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học Viện Quân Y người thầy đã tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn, và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới TS Mai Thị Đàm Linh – Trường ĐHKHTN, ĐHQGHN người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt kiến thức và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn đồng nghiệp tại Phòng Công nghệ gen và

Di truyền tế bào đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn toàn thể các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học và Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp

đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, 29 tháng 11 năm 2019 Học viên

Lê Thị Thúy

MỤC LỤC

MỤC LỤC 4

DANH MỤC HÌNH 7

DANH MỤC BẢNG 9

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT 10

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh sốt mò 3

1.1.1 Dịch tễ học 3

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng 7

1.1.3 Điều trị 9

1.1.4 Phòng bệnh sốt mò 10

1.2 Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi 10

1.2.1 Đặc điểm sinh học 10

1.2.2 Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò 14

1.2.3 Cơ chế gây bệnh sốt mò 18

1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò 22

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học 22

1.3.2 Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR 24

1.3.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) 24

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 Sơ đồ nghiên cứu 34

2.2 Thiết kế mồi và probe cho phản ứng RPA 34

2.2 Tổng hợp chứng dương nhân tạo 35

2.3 Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa do nhóm nghiên cứu thiết kế 35

2.4 Tối ưu quy trình RPA đã thiết lập 37

2.4.1 Tối ưu điều kiện phản ứng 37

2.4.2 Tối ưu thành phần phản ứng 38

2.5 Kỹ thuật Realtime PCR (kit thương mại) 39

2.6 Đánh giá ngưỡng phát hiện 40

2.7 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và so sánh với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường 41

2.7.1 Đánh giá độ nhạy 41

2.7.2 Đánh giá độ đặc hiệu 41

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

3.1 Thiết kế mồi và probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 43

3.2 Kiểm tra khả năng khuếch đại mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa 44

3.3 Kết quả tối ưu quy trình RPA 45

3.4 Quy trình RPA phát hiện O tsutsugamushi 52

3.5 Ngưỡng phát hiện quy trình RPA 55

3.6 Đánh giá và so sánh độ nhạy với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường (PrimerDesign) 57

3.7 Đánh giá và so sánh độ đặc hiệu với bộ kit thương mại hiện có trên thị trường 59

KẾT LUẬN 64

KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 84

Phụ lục 1: Danh sách các mẫu âm tính với Orientia tsutsugamushi 84

Phụ lục 2: Kết quả tách chiết các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt mò 85

Phụ lục 3: Chứng nhận kiểm định chất lượng bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo 86

Phụ lục 4: Hình ảnh bộ kit khuếch đại đẳng nhiệt phát hiện O tsutsugamushi (Orientia tsutsugamushi RPA minikit) do nhóm nghiên cứu chế tạo 87

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141] 4

Hình 1.2 Hình ảnh nốt loét do mò đốt 8

Hình 1.3 Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh trong tế bào nội mô mạch máu 11

Hình 1.4 Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense 16

Hình 1.5 Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O tsutsugamushi [62] 21

Hình 1.6 Chu trình phản ứng RPA [53] 29

Hình 1.7 Sơ đồ mô tả cấu trúc của exo probe [53] 31

Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 34

Hình 2.2: Trình tự gen đích 47-kDa tổng hợp nhân tạo 35

Hình 2.3: Hình ảnh thiết bị Genie® II sử dụng trong nghiên cứu 37

Hình 3.1 Kết quả so sánh mức độ tương đồng của các trình tự gen 47-kDa của O tsutsugamushi ở Đông Nam Á với mồi xuôi (A), probe (B) và mồi ngược (C) trong nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và trong nghiên cứu công bố bởi Chao và cs [38] 44

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra khả năng khuếch đại đặc hiệu gen đích 47-kDa của trình mồi và probe trong nghiên cứu 45

Hình 3.3 Kết quả tối ưu nhiệt độ phản ứng RPA phát hiện O tsutsugamushi 47

Hình 3.4 Kết quả tối ưu nồng độ mồi trong phản ứng RPA phát hiện O tsutsugamushi 49

Hình 3.5 Kết quả tối ưu nồng độ probe phản ứng RPA khuếch đại DNA O tsutsugamushi 50

Hình 3.6 Kết quả tối ưu nồng độ MgOAc phản ứng RPA khuếch đại DNA O

Hình 3.9 Đánh giá độ nhạy quy trình RPA và quy trình realtime PCR trên các mẫu

dương tính giả định với O tsutsugamushi (tp1-tp10) 59

Hình 3.10 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR (PrimerDesign) trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn đoán phân biệt sốt

mò 60

Hình 3.11 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu kỹ thuật RPA khuếch đại DNA Orientia

tsutsugamushi trên các mẫu âm tính và các chủng vi sinh vật thường gặp trong chẩn

đoán phân biệt 62

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99] 4

Bảng 1.2: Tóm tắt các thành phần, nồng độ và vai trò các thành phần trong phản ứng RPA 26

Bảng 1.3: Bảng so sánh một số kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt 32

Bảng 2.1: Nồng độ và thành phần ban đầu sử dụng trong phản ứng RPA 36

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng realtime PCR 39

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt 40

Bảng 3.1: Trình tự mồi/ probe đặc hiệu gen đích 47-kDa phát hiện O tsutsugamushi 43

Bảng 3.2: Bảng kết quả tối ưu thành phần phản ứng RPA 52

Bảng 3.3: Chuẩn bị master mix 52

Bảng 3.4: So sánh thời gian phát hiện tương ứng các nồng độ của từng quy trình phát hiện O tsutsugamushi 57

Bảng 3.5: So sánh độ đặc hiệu của từng quy trình 62

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

2 DNA : Deoxyribonucleic acid

4 LAMP : Loop-mediated isothermal amplification

5 NAT : Nucleic acid test

6 PCR : Polymerase chain reaction

7 RNA : Ribonucleic acid

8 RPA : Recombinase polymerase amplification

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sốt mò là một vấn đề sức khỏe cộng đồng nghiêm trọng ở khu vực châu Thái Bình Dương, trong đó có Việt Nam Theo thống kê của của Cục Y tế dự phòng, bệnh sốt mò có mặt ở hầu hết 24 tỉnh phía Bắc chiếm 38,51% số bệnh nhân sốt nhập

Á-viện, không rõ căn nguyên Bệnh do tác nhân Orientia tsutsugamushi gây nên; trung gian truyền bệnh là ấu trùng mò Leptotrombidium Nếu không được điều trị sớm với

loại kháng sinh phù hợp có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong cao Trong khi đó, các triệu chứng của bệnh sốt mò thường không đặc hiệu và có thể lẫn với nhiều loại mầm bệnh khác với các phác đồ điều trị khác nhau (sốt xuyết huyết, sốt xoắn khuẩn vàng da …) Để có thể bắt đầu phác đồ điều trị phù hợp kịp thời, việc

chẩn đoán sớm nhiễm O tsutsugamushi đóng vai trò quyết định

Hiện nay, các phương pháp sinh học phân tử như PCR/realtime PCR phát hiện

O tsutsugamushi đã được nghiên cứu và phát triển nhằm cải thiện những hạn chế về

độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp huyết thanh học phát hiện kháng thể đặc hiệu hiện có trong chẩn đoán sốt mò Tuy nhiên, để ứng dụng các phương pháp này vào chẩn đoán đòi hỏi phải đào tạo vận hành máy luân nhiệt PCR, và trong điều kiện với nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định là rất khó khăn Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR/realtime PCR truyền thống trong kỷ nguyên khuếch đại acid nucleic dùng trong chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt

Recombinase polymerase amplification (RPA) là một trong những phương pháp khuếch đại acid nuclecic đẳng nhiệt với nhiều ưu điểm nổi bật Khác với PCR truyền thống, công nghệ sử dụng hỗn hợp các recombinase của sinh vật tiền nhân

(Escherichia coli RecA recombinase hoặc T4 UvsX protein) giúp các mồi gắn đặc

hiệu vào gen đích và enzyme DNA polymerase với hoạt tính thay thế sợi cho phép tổng hợp liên tục DNA mà không cần biến tính sợi kép DNA ở nhiệt độ cao, do vậy không cần đến thiết bị luân nhiệt được thiết kế tinh vi với giá thành cao Phản ứng

ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế

về nguồn lực

Hiện nay, trên thế giới mới chỉ có rất ít nghiên cứu thiết lập các quy trình RPA

nhằm phát hiện nhanh và chính xác tác nhân gây bệnh sốt mò -O tsutsugamushi Các

quy trình được thiết lập vẫn còn nhiều hạn chế về độ nhạy, đặc biệt là khi đánh giá trên các mẫu bệnh phẩm lâm sàng được thu thấp tại khu vực Đông Nam Á Qua phân tích tính đa hình nhận thấy trình tự mồi xuôi và probe thiết kế trong nghiên cứu đã công bố có đến 03 vị trí chưa bổ sung hoàn toàn với trình tự gen đích 47-kDa của hầu

hết các chủng O tsutsugamushi ở khu vực Đông Nam Á, dẫn đến hiệu suất chẩn đoán

bệnh sốt mò bị hạn chế khi áp dụng tại Việt Nam và các nước trong khu vực

Với những lý do thực tiễn trên, nhóm nghiên cứu tiến hành thực hiện đề tài

“Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt Recombinase polymerase amplification (RPA) phát hiện tác nhân gây bệnh sốt mò” với hai mục tiêu chính:

1) Nghiên cứu thiết lập quy trình đẳng nhiệt RPA cho phép phát hiện nhanh

và chính xác O tsutsugamushi với độ nhạy, độ đặc hiệu cao

2) Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình RPA được thiết lập

3

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh sốt mò

Bệnh sốt mò hay phát ban, còn được biết đến với tên gọi là bệnh

tsutsugamushi, gây ra bởi trực khuẩn gram âm Orientia tsutsugamushi ký sinh nội

bào bắt buộc [112, 135] Khoảng 5 đến 14 ngày sau khi bị cắn bởi tác nhân mang

bệnh – mò Leptotrombidium, người bệnh bắt đầu có những biểu hiện của nhiễm trùng

như các triệu chứng giống cúm như sốt, phát ban, sẩn ở vết cắn, đau đầu, đau cơ, ho, nổi hạch, buồn nôn, nôn và đau bụng [74, 75, 101] Sốt và đau đầu là những đặc điểm phổ biến nhất ở bệnh nhân sốt phát ban, chiếm tỷ lệ 95% đến 100% các trường hợp [74]

1.1.1 Dịch tễ học

 Dịch tễ học bệnh sốt mò trên thế giới

Bệnh sốt mò lưu hành rộng trên thế giới, gặp ở khu vực Châu Á - Thái Bình Dương, Đông Nam Á [82], phía bắc Liên bang Nga, phía bắc bang Queensland tới phía đông Australia, Hàn Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn

Độ, Indonesia, Thái Lan, Sri Lanka, Philippines [98, 124, 141] Trước đây, bệnh

được xác định vùng dịch tễ là tam giác lưu hành Orientia tsutsugamushi từ bắc Nhật

Bản đến phía đông của Liên bang Nga, phía bắc của nước Úc và phía tây của Pakistan, Afghanistan [75, 99, 138] Tuy nhiên, các báo cáo gần đây về bệnh sốt mò cho thấy bệnh đã vượt quá giới hạn của “Tam giác Tsutsugamushi” khi được phát hiện ở Chile, Peru, bán đảo Ả rập, một số khu vực Châu Phi [92, 139]

4

Hình 1.1 Bản đồ phân bố bệnh sốt mò trên thế giới [141]

Bệnh là vấn đề y tế công cộng nghiêm trọng và là một trong những bệnh truyền nhiễm bị lãng quên Ước tính mỗi năm có khoảng một triệu ca nhiễm bệnh sốt mò và hơn một tỷ người trên thế giới có nguy cơ mắc bệnh hàng năm Trong những năm vừa qua, bệnh sốt mò đã gây dịch ở nhiều nước với số mắc và tử vong cao ở nhiều khu vực [77, 99, 107]

Bảng 1.1: Dịch sốt mò tại một số quốc gia từ năm 2007 – 2017 [99]

TT

Quốc gia Khu vực Thời gian

Số ca mắc

Số ca tử vong

 Phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bệnh sốt mò đã được phát hiện từ đầu thế kỷ XX Một nghiên cứu thực hiện ở cả miền Nam và miền Bắc năm 1964 cho thấy bệnh đã được ghi nhận

6

lưu hành ở ít nhất 11 tỉnh, thành Tuy nhiên, trong một thời gian dài, bệnh ít được phát hiện do việc sử dụng rộng rãi chloramphenicol và tetracycline trong thực hành

y khoa và thiếu các xét nghiệm chẩn đoán bệnh đặc hiệu cần thiết [108, 25] Sau năm

1990, hàng nghìn người mắc và hàng trăm người chết do bệnh sốt mò được ghi nhận tại các tỉnh Sơn La, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Quảng Trị, Bình Phước, [11] Sau thời gian dài bệnh tạm lắng, gần đây bệnh lẻ tẻ xuất hiện ở nhiều nơi và có xu hướng ngày càng tăng cao

Tại Bắc Giang từ năm 1998-2000 ghi nhận 71 trường hợp mắc bệnh sốt mò Năm 2011, số bệnh nhân đến bệnh viện điều trị sốt mò là 18 trường hợp từ các huyện: Lạng Giang, Lục Nam, Yên Dũng, Tân Yên và Lục Ngạn Trong đó có 6 bệnh nhân nam (33,3%) và 12 bệnh nhân nữ (66,7%) [20]

Theo kết quả điều tra của Nguyễn Duy Quyền (2002), tại đảo Thanh Lân và

Cô Tô (Quảng Ninh) tỷ lệ người dân bị mắc bệnh sốt mò là 0,14/1.000 dân [24]

Năm 2000-2002, tại Bệnh viện Uông Bí (Quảng Ninh) có 449 bệnh nhân sốt

mò vào điều trị Bệnh nhân sốt mò được phát hiện rải rác quanh năm, tập trung nhiều

từ tháng 5-10 Các dấu hiệu lâm sàng: Có nốt mò đốt (94,2%); có sốt (100%); có nổi hạch (98,7%) và phát ban (52,2%) Điều trị bằng chloramphenicol và tetracyclin sau 5-7 ngày hết sốt [18]

Trong thời gian từ 2001-2003, Viện Y học lâm sàng các bệnh nhiệt đới đã thống kê được 251 ca bệnh sốt mò (trong đó nam chiếm 50,6% và nữ chiếm 49,4%)

từ 225 xã thuộc 125 huyện của 24 tỉnh thuộc Bắc bộ và Bắc Trung bộ nhập viện điều trị, chiếm 35,3% số các trường hợp sốt không rõ nguyên nhân [5, 25]

Từ năm 1998 đến năm 2005, tại Bệnh viện 110 đã điều trị 168 ca sốt mò Từ năm 2010 đến nay, bệnh tiếp tục lưu hành ở nhiều vùng trung du và rừng núi của Việt Nam, đặc biệt số ca báo cáo nhiều ở các tỉnh Khánh Hòa, Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Quảng Bình, Quảng Ninh, Hòa Bình, Yên Bái, Lai Châu, Điện Biên, với số

ca bệnh lên đến hàng trăm ca mỗi năm [7, 13, 21]

7

Theo tác giả Đoàn Trọng Tuyên và cộng sự (2008-2010), kết quả điều tra sơ

bộ huyết thanh học và xác định một số yếu tố nguy cơ phơi nhiễm Orientia

tsutsugamushi

trong cộng đồng dân cư tại các khu vực nghiên cứu thuộc khu vực Nam Trung

bộ và Tây Nguyên cho thấy: Tỷ lệ người mang kháng thể kháng Orientia

tsutsugamushi ở khu vực Khánh Hòa 21,04%, Gia Lai 10,58% (huyện Chư Prông

13,99% và huyện Krông Pa 7,14%), và Kon Tum 5,21% [11]

Từ 2008 đến 2010, tại miền Trung và Tây nguyên có 471 bệnh nhân sốt mò, trong đó ở M’ Drăk (Đăk Lăk) chỉ có 2 bệnh nhân, còn lại 469 bệnh nhân ở địa bàn tỉnh Khánh Hòa, chủ yếu tập trung ở Ninh Hòa (55,01%), Thành Phố Nha Trang (27,93%), Diên Khánh (7,46%), Cam Lâm (3,62%), Vạn Ninh (2,99%) [11]

Tại tỉnh Yên Bái, trong 2 năm từ 2014 - 2015 số bệnh nhân sốt mò tăng đột biến, đã có 397 bệnh nhân (năm 2014: 136 trường hợp, năm 2015: 261 trường hợp) đến điều trị sốt mò Trong số đó có 7 ca tử vong Các bệnh nhân đến từ các huyện: Văn Chấn 99 bệnh nhân (24,9%); Trạm Tấu 53 bệnh nhân (13,3%); Mù Cang Chải

157 bệnh nhân (39,5%); thị xã Nghĩa Lộ 57 bệnh nhân (14,3%); Văn Yên 30 bệnh nhân (7,6%); huyện Trấn Yên 1 bệnh nhân (0,4%) Bệnh nhân gặp ở nữ (61,25%) nhiều hơn nam (38,75%) Bệnh gặp ở tất cả các lứa tuổi trong đó bệnh nhân trong độ tuổi lao động nhiều nhất (51%) Bệnh nhân làm nhiều nghề khác nhau trong đó gặp nhiều nhất là làm ruộng, nương rẫy (51,3%) [13, 22]

Các thông tin trên cho thấy phạm vi phân bố bệnh sốt mò ở Việt Nam có xu hướng ngày càng mở rộng, bệnh xuất hiện rải rác ở nhiều khu vực với số bệnh nhân ngày càng tăng lên

1.1.2 Đặc điểm lâm sàng

Ca bệnh lâm sàng: Ủ bệnh, trung bình 8 - 12 ngày (6 đến 21 ngày) [1] Lúc đầu tại nơi ấu trùng mò đốt có một nốt phỏng nước kích thước khoảng 2 - 5mm, không đau, bệnh nhân thường không chú ý; sau thời gian ủ bệnh, bệnh phát ra với những triệu chứng sau:

8

Sốt ≥ 38 - 400C, liên tục, kéo dài 15 - 20 ngày, có trường hợp sốt tới 27 ngày nếu không điều trị; Có khi rét run 1 - 2 ngày đầu, kèm theo sốt thường có nhức đầu nặng, đau mỏi cơ

Nốt loét đặc trưng (điển hình của sốt mò): Thường ở vùng da mềm, ẩm, như

bộ phận sinh dục, vùng hậu môn, bẹn, nách, cổ…, đôi khi ở vị trí bất ngờ trong vành tai, rốn, mi mắt (dễ nhầm với lẹo mắt); đặc điểm của nốt loét: Không đau, không ngứa; người bệnh thường chỉ có một nốt, hiếm khi có nhiều hơn; nốt hình tròn hoặc bầu dục đường kính từ 1mm đến 20mm; nốt phỏng ban đầu phát triển dần thành dịch đục trên một nền sẩn đỏ, sau 4 - 5 ngày vỡ thành một nốt có vẩy nâu nhạt hoặc đen tùy vào vùng da mềm hay cứng và độ non hay già của nốt loét; sau một thời gian, vẩy bong để lộ nốt loét lõm đáy nông, hồng nhạt, không mủ, không tiết dịch, bờ viền hồng

đỏ hoặc thâm tùy theo bệnh đang phát triển hay đã lui; từ khi hết sốt nốt loét liền dần; nốt loét gặp ở 65 - 80% các trường hợp [1, 15, 26]

Hình 1.2 Hình ảnh nốt loét do mò đốt

Hạch và ban dát sẩn: Hạch khu vực nốt loét thường sưng và đau, không đỏ, vẫn di động, xuất hiện cùng với sốt hoặc sau 2 - 3 ngày, là chỉ điểm tìm nốt loét; Hạch toàn thân sưng đau nhẹ hơn, trừ những ca nặng Ban dát sẩn mọc cuối tuần thứ nhất đầu tuần thứ hai, mọc khắp người, trừ lòng bàn tay bàn chân, tồn tại vài giờ đến 1 tuần, thưa hơn so với sốt Dengue cổ điển, khoảng 35 - 70% số bệnh nhân xuất hiện

9

ban, tùy thời điểm bệnh nhân được khám; đôi khi có đốm xuất huyết (dưới 10%) Trong những ngày đầu, da và niêm mạc xung huyết ở đa số các trường hợp (khoảng 88%), khác với sốt rét và thương hàn [67, 113, 26]

Ở bệnh nhân nặng hay gặp tiếng tim mờ, huyết áp thấp, mạch chậm so với nhiệt độ, chảy máu cam, xuất huyết tiêu hóa, viêm phế quản, viêm phổi không điển hình [2, 143]

Ngoài ra, sốt mò còn có thể ẩn và thể không điển hình (không có nốt loét) Nếu được điều trị bằng kháng sinh thích hợp, sẽ cắt sốt nhanh Nếu can thiệp muộn hoặc không hiệu quả, có thể có biến chứng như viêm cơ tim, sốc nhiễm khuẩn, viêm phổi, suy hô hấp, viêm não - màng não dẫn đến tử vong [6, 102]

Tỷ lệ tử vong do Orientia tsutsugamushi khác nhau ở từng nước, từng vùng,

phụ thuộc vào chủng lưu hành ở địa phương Ở Việt Nam, tỷ lệ tử vong khoảng 1%, Indonesia và Đài Loan 5-20%, Malaysia 15 - 20%, Nhật Bản 20 - 60% [132, 26]

1.1.3 Điều trị

Kháng sinh đặc hiệu điều trị bệnh sốt mò là chloramphenicol, doxycycline và tetracycline Các bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu sẽ hết sốt sau 1 -

2 ngày Tuy nhiên, do các kháng sinh này không có tác dụng diệt vi khuẩn mà chỉ có

tác dụng hãm khuẩn nên vi khuẩn Orientia tsutsugamushi vẫn sống và tồn tại trong

hạch bạch huyết, ở hệ võng nội mô trong nhiều ngày, nhiều tháng và dễ tái phát bệnh [12, 25, 26]

- Doxycycline là thuốc được lựa chọn hàng đầu Liều thường dùng là viên 100mg uống hai lần trong một ngày, kéo dài 7 ngày

- Tetracycline được sử dụng ở liều 2g/24 giờ chia 4 lần, cách nhau 6 giờ

- Chloramphenicol được sử dụng bằng đường uống hoặc đường tiêm, liều khuyến cáo là 2g một ngày chia 4 lần, đến khi hết sốt 2-3 ngày

- Các thuốc macrolide cũng có tác dụng với sốt mò, tốt nhất là azithromycin và

Điều tra cơ bản phát hiện ổ dịch ở địa bàn nghi ngờ và có người ở để xử lý

(bắt thú nhỏ gặm nhấm, bắt mò, phân loại, phân lập O tsutsugamushi , tìm kháng thể,

phát hiện bệnh nhân)

Tại ổ dịch đã xác định hoặc nghi ngờ:

- Biện pháp ngăn ngừa mò đốt:

+ Tránh ngồi nằm phơi quần áo đặt balô trên bãi cỏ, gần bờ bụi, gốc cây; khi

đi phát nương làm rẫy, hành quân dã ngoại, trinh sát vào rừng cần mang giầy và tất, chít ống quần

+ Tối ưu tẩm quần áo bằng thuốc diệt mò (permethrine và benzyl benzoat) hoặc xoa chân, tay, cổ bằng các thuốc xua mò (diethyltoluamid, DEET, )

- Diệt mò ở môi trường: phun tồn lưu vào đất ẩm, bờ bụi cây cỏ cao dưới

20 cm quanh nhà nơi dâm mát thuốc diazinon, fenthion, malathion, lindane, dieldrin, chlordan

- Diệt chuột theo mùa, chú ý rắc thuốc diệt mò trước

- Phát quang thảm thực vật quanh nhà chọn lọc các đám thực vật có nhiều

ấu trùng mò (đảo mò)

1.2 Tác nhân gây bệnh sốt mò: Orientia tsutsugamushi

1.2.1 Đặc điểm sinh học

Orientia gây bệnh Scrub Typhus Group (STG) hay còn gọi là bệnh sốt mò ở

Việt Nam Orientia tsutsugamushi (còn có tên Rickettsia orientalis, hoặc Rickettsia

tsutsugamushi) là một loài trong nhóm Rickettsia thuộc Giới Bacteria, Ngành

Proteobacteria, Lớp Alphaproteobacteria, Bộ Rickettsiales, Họ Rickettsiaceae, Giống

11

Orientia (Pinkerton, 1936) [129, 26] Theo nghiên cứu của Bechah và cộng sự (2008), chi Rickettsia có 24 loài gây bệnh và chi Orientia chỉ có một loài duy nhất là Orientia

tsutsugamushi (Rickettsia tsutsugamushi)

Vi khuẩn O tsutsugamushi có hệ hô hấp độc lập, có hệ thống men nhưng

không hoàn chỉnh nên phải sống ký sinh trong tế bào vật chủ, vì vậy chúng lệ thuộc hoàn toàn vào carbohydrate của tế bào vật chủ để lấy năng lượng chuyển hoá Nhuộm giemsa bắt màu tím xanh, có hình cầu, hình que ngắn hoặc hình sợi, kích thước dài

1,2-3 µm, rộng 0,5-0,8 µm [128, 26] Hiện nay, Orientia tsutsugamushi được xếp vào

lớp vi khuẩn gram âm (pleomorphis) [113, 129]

Hình 1.3 Hình ảnh vi khuẩn Orientia tsutsugamushi xâm nhập và ký sinh

trong tế bào nội mô mạch máu

Orientia tsutsugamushi có sức đề kháng yếu, dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng

thông thường và nhiệt độ cao, trong môi trường bên ngoài và thuốc sát trùng thông thường, dung dịch 0,1% formalehyde diệt trong vài giờ, sống lâu ở dạng đông khô

trong bảo quản lạnh -70℃ Sức đề kháng của Orientia tsutsugamushi là quá trình ức

chế tổng hợp peptidoglycan, kháng sinh nhóm betalactam, điều này có thể giải thích

sự thiếu hụt peptidoglycan trên thành tế bào vi khuẩn [29, 30, 112]

12

Nghiên cứu ở bệnh nhân sốt mò hoặc trên động vật thử nghiệm đều chỉ ra rằng

Orientia tsutsugamushi thường gây nhiễm vào các tế bào biểu mô, đại thực bào và

bạch cầu đa nhân trung tính Sử dụng kỹ thuật đánh dấu miễn dịch đối với Orientia

tsutsugamushi đã phát hiện sự suy giảm chất đánh dấu sau mỗi lần cấy chuyển trên

một dòng tế bào cảm nhiễm và sau 10 lần cấy chuyển liên tục thì không còn phát hiện

được chất đánh dấu Tuy nhiên, khi Orientia tsutsugamushi được tiêm vào mặt sau

noãn của phôi gà, sau đó thu hồi lại cho thấy vẫn còn chất đánh dấu Điều này cho

thấy Orientia tsutsugamushi phù hợp trong môi trường nuôi cấy invitro nhưng cấy

chuyển nhiều lần dẫn đến giảm bớt những kháng nguyên có khả năng sinh miễn dịch

Orientia tsutsugamushi xâm nhập tế bào vật chủ nhờ quá trình thực bào của tế bào

bạch cầu [40] Orientia tsutsugamushi bị bất hoạt bởi tia cực tím giúp chúng bám lên

màng tế bào, lúc này không có vai trò của quá trình thực bào Sau khi bị thực bào thì

Orientia tsutsugamushi không bị tổn thương và được lưu giữ trong tế bào bạch cầu

Trong trường hợp bạch cầu đa nhân trung tính, Orientia tsutsugamushi bị thực bào

một cách thụ động, bị hút vào tế bào bạch cầu đa nhân trung tính Yếu tố độc lực liên quan tới sự ly giải màng tế bào vi khuẩn của thể thực bào vẫn chưa được xác định,

cấu trúc vi khuẩn trong suốt quá trình thực bào không bị thay đổi, Orientia

tsutsugamushi không bị ảnh hưởng và trốn thoát khỏi thể thực bào và đặc biệt đi vào

trong vùng giàu glycogen trong tế bào chất của tế bào vật chủ Tuy nhiên không thể

xác định rõ chức năng thực bào diễn ra như thế nào Thời gian nhân đôi của Orientia

tsutsugamushi là khoảng 8 - 9 giờ Orientia tsutsugamushi được giải phóng nhờ sự

bảo vệ của màng tế bào vật chủ ký sinh Nó có thể xâm nhập trực tiếp vào tế bào hoặc ngoài màng tế bào vật chủ ký sinh, từ đó xâm lấn vào các tế bào khác Một số nghiên

cứu đã chứng minh sự tồn tại dai dẳng của Orientia tsutsugamushi ở mô trong thời

gian dài sau điều trị [119, 123]

Cấu trúc kháng nguyên có 2 loại:

Kháng nguyên đặc hiệu: Đặc hiệu cho từng typ riêng biệt, có nhiều typ kháng nguyên khác nhau đại diện cho một địa phương hoặc một khu vực nào đó, giữa các

Vì vậy, các nhà khoa học đã sử dụng kháng nguyên OX-K của Proteus mirabilis để

phát hiện kháng thể ở bệnh nhân bị sốt mò (phản ứng Weil-Felix) Phản ứng này tuy không đặc hiệu, độ hạy không cao nhưng thông dụng, dễ sản xuất, giá thành rẻ phù hợp cho việc xét nghiệm sàng lọc phát hiện bệnh sốt mò tại tuyến cơ sở [56]

Ba kiểu gene (genotype) Orientia tsutsugamushi cổ điển là Karp, Kato và

Gilliam Hiện nay có hơn 30 chủng huyết thanh khác đã được xác định Các chủng

Orientia tsutsugamushi có tính chất kháng nguyên rất đa dạng, do có sự khác biệt

trong cấu trúc của các protein vỏ Sự khác biệt về mặt kháng nguyên của các chủng orientia có thể xác định bằng các phương pháp huyết thanh học và kỹ thuật sinh học

phân tử Độc lực rất khác nhau tùy chủng: các chủng Orientia tsutsugamushi ở Nhật

Bản và Trung Quốc thường có độc lực cao và gây bệnh nặng hơn [84, 138]

Các nghiên cứu cho thấy Orientia tsutsugamushi chỉ có một đơn vị cấu trúc

hệ gene, với các trình tự gene lặp lại tỷ lệ rất cao, đây là sự khác biệt của vi sinh vật

ký sinh nội bào bắt buộc với các loại vi sinh vật khác Những thông tin về hệ gene

liên quan tới sự hình thành cấu trúc tế bào Rickettsia và phương thức chuyển hóa của

Orientia tsutsugamushi là cơ sở phân tích sự khác biệt của Orientia tsutsugamushi

với các loài Rickettsia khác trong họ Mặc dù, Orientia tsutsugamushi có kích thước

hệ gene lớn so với các loại rickettsia khác trong họ, nhưng phần lớn đó là các trình tự

lặp lại của các đoạn gene Phương thức và con đường chuyển hóa của Orientia

tsutsugamushi tương tự như các loài rickettsia khác, nhưng đáng chú ý có sự khác

nhau trong một vài phương thức như: Chu trình chuyển hóa carbohydrate, chu trình axit tricarboxylic và tổng hợp thành tế bào bằng hệ thống vận chuyển Điều này liên quan tới yếu tố độc lực và đặc điểm sinh lý của tác nhân vi sinh vật ký sinh nội bào Phân tích các loài rickettsia trên cơ sở kiểu hình (phenotype) và kiểu gene (genotype)

14

khác nhau cho thấy Orientia tsutsugamushi khác với các loài rickettsia khác trong

cấu trúc thành tế bào, kháng nguyên và kích cỡ của hệ gene Trên cơ sở giải trình tự

hệ gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có trình tự gene lặp lại rất cao (khoảng

40% tổng số nucleotide của hệ gene) [61, 72]

Trên cơ sở dữ liệu giải trình tự gene của Orientia tsutsugamushi cho thấy có trình tự hệ gene lặp lại cao tới 200 lần Hơn nữa hệ gene của Orientia tsutsugamushi

có trên 400 gene vận chuyển, 60 phần gene DNA ngoại lai và 70 gene đóng vai trò phiên mã ngược Phân tích so sánh gene chuyển đổi trong hệ gene và dọc theo giải trình tự gene cho thấy tính đồng nhất và gene chuyển đổi có tính đa dạng đó là: sự tạo chuỗi xoắn, xóa bỏ và hợp thành trong cùng đoạn gene Sự tương tác qua lại của các gene với việc lặp của các đoạn gene dẫn đến sự thay đổi kích thước hệ gene của

các chủng Orientia tsutsugamushi khác nhau [45]

1.2.2 Cơ chế lây truyền bệnh sốt mò

1.2.2.1 Nguồn lây bệnh

Vi khuẩn Orientia tsutsugamushi có 2 ổ chứa trong tự nhiên là mò và các loài

gặm nhấm (chủ yếu là chuột), thỏ, lợn, gà, các loài chim, [1, 14, 23, 25] Ổ chứa

nguồn truyền nhiễm chủ yếu là mò nhiễm Orientia tsutsugamushi, mò có khả năng

truyền mầm bệnh cho các loài gặm nhấm và thú nhỏ, hoặc truyền dọc mầm bệnh qua trứng sang các đời sau Mò truyền ngẫu nhiên mầm bệnh sang người qua vết cắn của

ấu trùng mò khi đốt người [25]

Mò Trombiculidae thuộc họ ve bét (Acariformes), lớp nhện (Arachnida), ngành chân đốt (Arthropoda); kích thước bé dưới 1 mm, mầu sắc từ vàng đến da cam; phát triển qua 4 giai đoạn: trứng ấu trùng, nhộng và mò trưởng thành; ấu trùng là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở động vật có xương sống (chuột và thú nhỏ); thời gian đốt kéo dài trung bình 48-72 giờ; đốt xong ấu trùng trở về mặt đất, trưởng thành,và sinh sản ra thế hệ sau; chu kỳ sinh trưởng của mò dài 2-3 tháng (vùng ấm)

và trên 8 tháng (vùng lạnh); mò trưởng thành sống trung bình 15 tháng; ấu trùng chưa đốt động vật có thể sống 30 ngày và có tầm di chuyển rất hạn chế cho nên ổ dịch sốt

15

mò thường có tính chất khư trú [8, 16]

Mò và ấu trùng mò ưa sống ở nơi đất xốp, ẩm mát trong các khe hang, ven bờ sông suối, nơi dâm mát có bụi rậm và cây thấp có quả hạt để chờ thú nhỏ - gặm nhấm tới ăn Người có thể bị đốt khi sinh hoạt, lao động trong ổ dịch; Phát rẫy làm nương;

Bộ đội đi dã ngoại; Ngồi, nằm nghỉ, trên bãi cỏ, để mũ nón buộc võng vào gốc cây…

Hiện nay, đã xác định được trên 45 loài mò có thể mang tác nhân Orientia

tsutsugamushi truyền bệnh trong tự nhiên, nhưng chỉ có loài Leptotrombidium pallidum, L akamushi, L scutellare, L deliense, L arenicola, L imphalum, L chiangraiensis, L fletcheri, L gaohuensis, và L pavlovsky đã được chứng minh là

véc tơ truyền bệnh sốt mò [42] Các loài véc tơ chính phân bố theo các vùng dịch tễ

khác nhau: L akamushi, L pallidum, và L scutellare là véc tơ truyền bệnh sốt mò ở vùng ôn đới, như Nhật Bản và Hàn Quốc, trong khi L deliense và L arenicola là các

véc tơ chính ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới hay Đông Nam Á và Tây Nam Thái Bình Dương [46]

Ở Việt Nam, đã thống kê được 106 loài mò thuộc 23 giống, 2 phân họ của

họ Trombiculidae Có 17 loài đặc hữu cho khu hệ mò Việt Nam Số lượng và giống

loài của khu hệ mò ở Việt Nam phong phú nhưng tập trung chủ yếu ở phân

họ Trombiculidae có 101 loài, chiếm 95,2% và giống Leptotrombilidium có 28 loài chiếm 26,41%, giống Gahrliepia có 20 loài chiếm 18,81%, 21 giống còn lại chỉ 1-8

loài [9, 10]

Khu hệ mò ở Việt Nam chủ yếu tập trung ở cảnh quan đồi núi có 102 loài, ở đồng bằng có 21 loài Có 17 loài phát hiện ở cả cảnh quan đồng bằng và đồi núi

Trong đó, có 5 loài mò được xác định truyền bệnh sốt mò, đó là Leptotrombidium

denliense, Leptotrombidium akamushi, Leptotrombidium scutellare, Ascoschoenggastia audyi, Ascoschoenggastia indica Tuy nhiên, chỉ có

loài Leptotrombidium denliense phân lập được mầm bệnh [8]

16

Hình 1.4 Hình ảnh Leptotrombidium (Lep.) deliense

Ổ chứa nguồn truyền nhiễm thứ yếu có vai trò không đáng kể: Là các loài gặm nhấm, thú nhỏ: Khả năng nhiễm mầm bệnh từ các loài gặm nhấm, thú nhỏ vào ấu trùng mò thường thấp, mầm bệnh nhiễm vào thường không nhân lên được và sau đó không được truyền sang người hoặc thú nhỏ khác vì ấu trùng mò chỉ đốt hút máu 1 lần trong đời [121]

Những loài gặm nhấm, thú nhỏ là ổ chứa mầm bệnh thứ yếu: chuột, sóc, chồn, nhím, cầy, cáo, thỏ, chim; một số gia súc (gà, chó, lợn ) cũng có thể bị mò đốt và chứa mầm bệnh Các loài chuột thường gặp ở điều kiện sinh cảnh savan cây bụi gần

người ở Việt Nam là chuột nhà (R flavipectus), chuột nhắt (Rattus exulans), chuột rừng (R rattus), chuột đất bé (Bandicota salivei), chuột mốc R (Berylmus) bowersi, chuột bóng (R nitidus), chuột núi (R sabanus) [4, 70, 27]

1.2.2.2 Trung gian truyền bệnh sốt mò

Sốt mò là bệnh truyền sang người qua trung gian là ấu trùng mò; như vậy mò vừa là vật chủ vừa là vectơ truyền bệnh; người bị nhiễm bệnh khi bị ấu trùng mò đốt Người bệnh không có khả năng truyền bệnh sang người khác Phương thức lây truyền

bệnh từ động vật sang người là từ họ mò trombiculid trong giai đoạn ấu trùng hút

máu và ký sinh trên các loài vật chủ phù hợp mang mầm bệnh, lúc này mò trở thành

vector mang mầm bệnh và truyền Orientia tsutsugamushi cho người qua vết đốt của

17

ấu trùng mò Orientia tsutsugamushi tồn tại trong tất cả các giai đoạn phát triển của

mò, nhưng chỉ trong giai đoạn ấu trùng mò mới ký sinh và truyền bệnh Giai đoạn trưởng thành mò sống tự do nên khó thu thập Do vậy, việc điều tra nghiên cứu về

mò chủ yếu thu thập được ấu trùng sống ký sinh trên các loài động vật Ấu trùng mò

là giai đoạn phát triển duy nhất của mò ký sinh ở các động vật có xương sống và chỉ hút máu một lần trong đời Ấu trùng mò thường bám vào thân cây, ngọn cỏ hoặc ở mặt đất, khi động vật hay con người đi qua đó, chúng bám vào và hút máu, trong máu

của ấu trùng mò có vi khuẩn Orientia tsutsugamushi, vì vậy sẽ truyền mầm bệnh khi

hút máu và gây bệnh sốt mò cho người Ấu trùng bám vào da vật chủ để kiếm ăn trong thời gian từ 2 ngày đến 1 tháng, tùy theo từng loài Sau đó chúng rơi xuống chui vào đất nằm im và không hoạt động trong 2-3 ngày, phát triển thành nhộng thanh trùng sau 2 hoặc 3 ngày Sau 6-7 ngày, nhộng thanh trùng nở ra thanh trùng có 8 chân, thanh trùng giống như mò trưởng thành về hình dạng ngoài, nhưng nhỏ hơn, đồng thời chưa phân biệt đực và cái Giai đoạn thanh trùng chiếm 20-26 ngày, sau 2-3 ngày nữa thì phát triển thành thanh trùng giai đoạn 3 Sau 10 ngày, thanh trùng giai đoạn

3 lột xác thành mò trưởng thành, mò trưởng thành lớn hơn ấu trùng, có màu đỏ sáng hay nâu đỏ Thanh trùng và mò trưởng thành, trên cơ thể có hình số 8, phủ nhiều lông phân nhánh, có 4 đôi chân và sống tự do trong đất, rác và các chất nền khác, thức ăn của chúng là nhộng và ấu trùng của các chân đốt khác Ấu trùng có hình ô van, phủ

ít lông, 3 đôi chân, sống ký sinh trên vật chủ [17, 19]

1.2.2.3 Các yếu tố liên quan

Bệnh sốt mò là một bệnh truyền nhiễm cấp tính lây đường máu do ấu trùng

mò đốt Vector chủ yếu truyền bệnh cho người là mò Leptotrombidium deliensis, L

akamushi và các loài có họ gần Bệnh sốt mò thường gặp ở những vùng rừng núi, cây

cối rậm rạp, có nhiều cỏ dại, đặc biệt là những khu vực như bờ suối, hang hốc, rừng mới phá hoặc mới trồng, vùng giáp ranh, nơi nhiều cây con bụi rậm, các bãi cỏ ven sông suối, trên nương rẫy, những nơi có bóng dâm và đất mùn ẩm ướt, Đây là những khu vực thường có nhiều loài thú nhỏ loài gặm nhấm sinh sống, có nhiều mò và con người dễ tiếp xúc với ấu trùng mò và bị đốt gây nhiễm bệnh [4, 27]

18

Trong môi trường hoang dã, ấu trùng mò trombiculid sống ở đất ẩm ướt hoặc cát sỏi Ở những khu vực có dạng sinh cảnh rừng nhiệt đới, cây bụi, dạng cây gai, cánh đồng và rừng cỏ rậm rạp chạy dọc sông và cánh đồng lúa liên quan tới sự tồn

tại của Orientia tsutsugamushi Vecor truyền bệnh có thể tìm thấy ở nơi động vật gặm

nhấm phát triển cùng với độ ẩm phù hợp Người nhiễm bệnh qua vết đốt của ấu trùng

mò họ trombiculidmites, mùa phát bệnh sốt mò được xác định là thời gian ấu trùng

9 - 10, đỉnh cao vào những tháng 6 - 7 Bệnh thường tản phát nhưng dịch có thể bùng

phát khi có nhiều người chưa có miễn dịch với Orientia tsutsugamushi đi vào vùng

có bệnh lưu hành (người dân đi khai hoang, bộ đội hành quân tập luyện, dã ngoại ) [5]

1.2.3 Cơ chế gây bệnh sốt mò

 Đặc điểm thụ thể tế bào chủ và ligand của vi khuẩn

Để có thể bắt đầu xâm nhập vào tế bào chủ, O tsutsugamushi cần tương tác

với các thụ thể đặc hiệu có trên bề mặt của tế bào chủ

Cho đến nay, các nghiên cứu về các thụ thể của tế bào vật chủ tương tác với

O tsutsugamushi thường tập trung vào các phân tử có trên bề mặt tế bào như heparan

sulfate proteoglycans (HSPGs) và integrins Đối với nhiều mầm bệnh nội bào, HSPG

ở bề mặt tế bào đóng vai trò là đồng thụ thể, chúng tạo điều kiện cho sự gắn kết ban đầu của vi sinh vật với các thụ thể thứ cấp, giúp vi sinh vật xâm nhập vào tế bào chủ

[43] Đối với quá trình xâm nhiễm của O.tsutsugamushi, HSPG là đồng thụ thể, góp

phần hỗ trợ tương tác của tế bào vi khuẩn với các tế bào L929 [71]

HSPG là các protein được glycosyl hóa mạnh bao gồm một coreprotein được

19

liên kết cộng hóa trị với một hoặc nhiều chuỗi heparan sulfate (HS) glycosaminoglycan (GAG), là các sulfated disaccharide polymers Chúng được biểu hiện ở khắp nơi trên bề mặt tế bào cũng như trong chất nền ngoại bào (ECM) [43]

Việc tiền xử lý với heparan sulfate ức chế sự lây nhiễm O tsutsugamushi vào các

nguyên bào sợi L929 ở chuột [71] Nhiều nghiên cứu về các cơ chế tương tác chỉ ra

rằng O tsutsugamushi có thể tương tác với nhóm HS của HSPGs [71]

Syndecans là các HSPG xuyên màng chính được biểu hiện trên bề mặt của hầu hết các loại tế bào động vật có vú [140] Trong số bốn thành viên họ syndecan ở động vật có xương sống, syndecan-4 thể hiện sự phân bố rộng nhất trong các loại tế bào [140] Syndecan-4 đóng một vai trò quan trọng trong nhiễm trùng định hướng [86]

Sự lây nhiễm của O tsutsugamushi trong các tế bào HeLa, REF hoặc REFSyn4 bị giảm đáng kể khi O tsutsugamushi được xử lý trước với protein lõi tái tổ hợp của

4 [86] Do đó, bên cạnh heparin/ heparan sulfate, protein lõi của

syndecan-4 cũng có thể liên quan đến việc định hướng trung gian gắn ligand vào tế bào chủ [86] Bên cạnh khả năng hoạt động như các đồng thụ thể phối hợp với các thụ thể tín hiệu, syndecans có khả năng truyền tín hiệu độc lập, như tương tác với protein liên kết với actin,…

O tsutsugamushi liên kết với fibronectin của tế bào chủ thông qua kháng

nguyên đặc hiệu 56-kDa (TSA56) cũng như kháng nguyên bề mặt tế bào C (ScaC)

[66, 79] O tsutsugamushi có thể liên kết với fibronectin cố định trong ống nghiệm,

và fibronectin ngoại sinh tạo điều kiện cho sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào L929 [79] TSA56, một protein màng ngoài chính, đã được chứng minh là một phối tử góp phần vào sự tương tác định hướng của vi khuẩn với fibronectin

Vùng liên kết với fibronectin được đánh giá là hiệu quả là từ vị trí axit amin

312 đến axut amin 341 trong vùng ngoại bào của TSA56 [44] Ngoài TSA56, gần đây

các nghiên cứu đã chứng minh rằng ScaC cũng đóng vai trò trung gian gắn kết O

tsutsugamushi vào các tế bào nhưng không xâm lấn các tế bào động vật có vú không

thực bào, ví dụ như các tế bào HeLa, Vero và ECV304 [66]; và fibronectin đã được

20

xác định là một trong những thụ thể tế bào chủ tiềm năng cho ScaC ScaC thuộc họ autotransporter protein, có tính bảo tồn cao trong họ Rickettsiaceae [33, 66] Một số thành viên khác trong họ protein Sca, ví dụ, Sca1, Sca2 và rOmpB (Sca5) của Rickettsia conorii cũng đã được chứng minh là trung gian định hướng gắn rickettsial với tế bào chủ [37, 38, 103, 120]

Fibronectin là một trong những thành phần chính của chất nền ngoại bào, là một glycoprotein được tiết ra dưới dạng disulfide-bonded dimer [94] Fibronectin có liên quan đến sự kết dính và xâm nhập vào tế bào chủ của một số vi khuẩn khác,

chẳng hạn như R conorii [103], N gonorrhoeae [73] và Bartonella henselae [52]

Fibronectin chứa một số vùng chức năng (functional domain), chẳng hạn như vùng liên kết với heparin, mô típ để tương tác với syndecans và mô típ Arg-Gly-Asp (RGD) cần thiết cho tương tác với integrins [94]

Các integrins là một họ các glycoprotein xuyên màng tạo thành các covalent heterodimers [105] Các domain ngoại bào của integrins tương tác với các phối tử khác nhau, bao gồm ECM glycoprotein và các protein bề mặt, và domain tế bào chất của chúng tương tác với các thành phần của actin cytoskeleton [105] Gần

non-đây, người ta đã chứng minh được rằng O tsutsugamushi đồng cứ trú với integrin

a5b1 trong các tế bào HeLa và các yếu tố truyền tín hiệu integrin, bao gồm adhesion

kinase, Src kinase và RhoA GTPase, có thể được kích hoạt bởi việc nhiễm O

tsutsugamushi [44] O tsutsugamushi ưu tiên kích hoạt RhoA GTPase thay vì Cdc42

/ Rac1 [44]

Các nghiên cứu gợi ý rằng sự tương tác giữa TSA56 của O tsutsugamushi và

fibronectin của tế bào chủ có thể làm trung gian cho sự tham gia của các integrin, sau

đó có thể kích hoạt các phân tử tín hiệu xuôi dòng và tạo ra sự xâm nhập của vi khuẩn vào các tế bào không thực bào [44]

Mối liên quan về sự tương tác giữa fibronectin và syndecan có liên quan đến

sự gắn kết và sự hấp thu tế bào của O tsutsugamushi hay không đến nay vẫn chưa được làm rõ Như vậy, O tsutsugamushi sẽ tương tác đặc hiệu với các thụ thể

21

fibronectin và integrin, cũng như cả HS và protein cốt lõi của syndecans để giúp vi

khuẩn bám và xâm nhập vào tế bào chủ [44, 86, 91] Bên cạnh đó, O tsutsugamushi

cũng có khả năng phá vỡ tổ hợp truyền tín hiệu bằng cách tác động vào các integrins

và syndecans để xâm chiếm một cách hiệu quả nhiều loại tế bào chủ

Hình 1.5 Mô hình về quá trình hấp thu và vận chuyển nội bào của O

tsutsugamushi [62]

 Chu trình phát triển

Sau khi gắn vào bề mặt tế bào chủ và liên kết với các thụ thể đặc hiệu nhờ các

protein đặc hiệu (TSA56 và ScaC), O tsutsugamushi thâm nhập vào bên trong tế bào

nhờ trung gian clathrin, hiện tượng nhập bào xảy ra trong các tế bào ECV304, dòng

tế bào nội mô ở người [47]

Các adapter nhận tín hiệu, chẳng hạn như Talin và paxillin sau đó sẽ có mặt

tại vị trí nhiễm trùng [26] Các sự kiện tín hiệu này gây ra sự xâm nhập của O

tsutsugamushi vào các tế bào không thực bào, liên quan đến con đường nhập bào qua

22

trung gian clathrin [47] O tsutsugamushi đồng liên kết với các marker nội sinh sớm

EEA1 và marker nội sinh muộn LAMP2 [47] Có giả thuyết cho rằng Hemolysin,

TlyC và phospholipase D (PLD) của O tsutsugamushi đóng vai trò kích hoạt giúp vi

khuẩn thoát khỏi sự thực bào Các phân tử kháng nguyên polysacarit NT19 được giải

phóng bởi O tsutsugamushi và đóng vai trò trong hình thành nhóm khuẩn lạc các vi

khuẩn [93]

 Nảy chồi từ màng tế bào vật chủ

Các vi khuẩn O tsutsugamushi sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ và nhân

lên trong tế bào chất Chúng thoát ra bằng cách nảy chồi từ màng tế bào vật chủ và xâm nhập vào các tế bào liền kề Quá trình nảy chồi này được chứng minh là phụ thuộc vào màng lipit giàu cholesterol (protein HtrA) [87], giống với sự hình thành vỏ bọc của virus Sự hình thành của vi khuẩn ngoại bào từ màng tế bào có tác động đến

cơ chế lây nhiễm tiếp theo vào các tế bào chủ xung quanh, cũng như đưa ra một chiến lược khả thi cho vi khuẩn có thể lẩn trốn khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ

1.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh sốt mò

1.3.1 Phương pháp huyết thanh học

 Phương pháp Weil – Felix

Phương pháp Weil – Felix được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 bởi

Edmund Weil và Arthur Felix áp dụng để chẩn đoán Rickettsiaceae trong một khoảng

thời gian dài trên toàn thế giới [12] Phương pháp này đơn giản dựa trên sự phản ứng

chéo xảy ra giữa các kháng thể được tạo ra trong giai đoạn nhiễm O tsutsugamushi cấp tính với các kháng nguyên dòng OXK của loài P mirabilis Có 2 cách để thực

hiện phương pháp này

Cách thứ nhất: Chuẩn bị một lam kính, nhỏ một giọt (50-100 μl) huyết thanh bệnh nhân lên bề mặt lam kính Bổ sung 1 giọt kháng nguyên muốn kiểm tra, trộn lẫn hỗn hợp trong 1 phút Kết quả dương tính khi có xuất hiện sự kết dính, tương ứng ngưỡng khảng 1:20

23

Cách thứ hai: Sử dụng 0,25% phenol làm chất pha loãng, pha loãng một dãy các ống 1ml có nồng độ huyết thanh bệnh nhân hơn kém nhau hai lần Một giọt dung dịch kháng nguyên được thêm vào mỗi ống, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 50-55oC trong 4-6 giờ Các ống xuất hiện sựa kết tủa hay tạo hạt được cho là dương tính, với nồng

độ ngưỡng phát hiện khoảng 1:320

Ưu điểm của phương pháp là không tốn kém, dễ thực hiện và thời gian có kết quả thường là sau một đêm Tuy nhiên phương pháp hạn chế về độ đặc hiệu và độ nhạy không cao [81] Chính vì thế phương pháp Weil – Felix dần bị thay thế bằng các phương pháp huyết thanh học khác, bao gồm xét nghiệm miễn dịch miễn dịch huỳnh quang (IFA)

 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent Antibody)

Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (Indirect Fluorescent

Antibody – IFA) lần đầu tiên được Bozeman và cộng sự mô tả vào năm 1963 [35]

Sau đó đã được thay đổi để cho phép sử dụng lượng huyết thanh và kháng nguyên nhỏ hơn Hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến nhằm chẩn đoán nhanh

chóng bệnh nhân nhiễm O tsutsugamushi

Xét nghiệm kháng thể miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA) có độ nhạy cao hơn phản ứng Weil-Felix và kết quả xét nghiệm thường có sau vài giờ; tuy nhiên, giá thành xét nghiệm cao và đòi hỏi người thực hiện có chuyên môn cao IFA sử dụng kháng thể fluorescent anti-human để phát hiện kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh bệnh nhân có gắn với kháng nguyên của bệnh sốt mò và hiện đang được đánh giá là phương pháp tiêu chuẩn vàng [88]

Mặc dù được sử dụng rộng rãi các xét nghiệm huyết thanh học đặc hiệu kháng thể có thể không phù hợp để chẩn đoán bệnh trong giai đoạn cấp vì nồng độ kháng thể có thể dưới ngưỡng phát hiện lúc bệnh khởi phát

24

1.3.2 Phương pháp PCR, realtime PCR, Nested PCR

Hầu hết các xét nghiệm phát hiện kháng nguyên/ mầm bệnh hiện nay dựa vào phương pháp PCR, realtime PCR định lượng hay nested PCR nhắm vào các gen đích

khác nhau bao gồm 56 kDa, 47 kDa, groEL của O tsutsugamushi [85, 127, 130] Ưu

điểm của các phương pháp này là độ nhạy, độ đặc hiệu khá cao:

Nghiên cứu khác của Prakash và cộng sự (năm 2011), thiết lập quy trình nested

PCR trên vùng gen 56kDa phát hiện O tsutsugamushi, kết quả cho thấy độ đặc hiệu của

kĩ thuật này là 100% cao hơn so với hai phương pháp ELISA và Weil-Felix với độ đặc hiệu lần lượt là 73% và 94% [118]

Năm 2009, Kramme và cộng sự đã sử dụng kĩ thuật real-time PCR trên vùng gen

56kDa để phát hiện O tsutsugamushi trong các bệnh nhân sốt mò ở Việt Nam Độ nhạy

phân tích của quy trình đạt được của quy trình là 1062 bản sao/ml, độ đặc hiệu 100% khi đánh giá trên 50 mẫu máu của người khỏe mạnh và các chủng vi sinh vật khác (bao gồm

cả các loài Rickettsia spp khác) [89]

Trong một nghiên cứu mới đây năm 2017, kỹ thuật realtime PCR cũng được

Nhiem và cộng sự áp dụng để chẩn đoán O tsutsugamushi trên mẫu bệnh phẩm vết loét

tại Việt Nam [70] Trong số 20 bệnh nhân đã lấy được cả vết loét và mẫu máu toàn phần,

17 mẫu vết loét (85%) và 5 mẫu máu toàn phần (25%) cho kết quả dương tính với O

tsutsugamushi [90]

Tuy nhiên, tất cả các xét nghiệm đòi hỏi phải đào tạo người dùng để vận hành máy luân nhiệt PCR và trong các môi trường với nguồn lực hạn chế thì việc trang bị, bảo dưỡng, căn chỉnh máy luân nhiệt đảm bảo hoạt động ổn định là rất khó khăn

1.3.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt Recombinase polymerase

amplification (RPA)

Để khắc phục những giới hạn của phương pháp PCR truyền thống dùng trong chẩn đoán phân tử tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại acid nucleic đẳng nhiệt Các phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt sử dụng các enzyme hay cấu trúc DNA dạng vòng để thực hiện bước tách sợi,

25

khác với phương pháp PCR truyền thống buộc phải sử dụng nhiệt độ cao Những kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt này là công cụ rất mạnh mẽ để phát triển các mô hình chẩn đoán tại thực địa có khả năng khuếch đại acid nucleic mà không cần các bước luân nhiệt và các cơ chế điều khiển liên quan

Một trong những phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt đáng chú ý dựa vào các cấu trúc DNA dạng vòng (Loop-mediated isothermal amplification – LAMP) đã được phát triển thành một phương pháp rất triển vọng có khả năng thay thế cho PCR Ngoài

gen đích groEL [111], Hubber và cs đã mô tả việc sử dụng vùng gen bảo tồn 47 kDa

làm gen đích của xét nghiệm LAMP và đạt được độ nhạy tương đương với realtime PCR [57] Tuy nhiên, điều kiện nhiệt độ để thực hiện kỹ thuật LAMP là khoảng 60-65℃, chưa phải là điều kiện dễ dàng thiết lập và đảm bảo ở các khu vực hạn chế về nguồn lực Thời gian phát hiện của LAMP là khoảng 60 phút, nếu có thể cải thiện hơn nữa thời gian phát hiện, xét nghiệm sẽ có ý nghĩa thực địa cao hơn trong chẩn đoán lâm sàng

Được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 2006, kỹ thuật recombinase polymerase amplification (RPA) khá được quan tâm phát triển bởi nhiều ưu điểm nổi bật; bằng chứng là đã có 75 công bố trên thế giới tính từ năm 2006 đến tháng 10 năm 2015 [53] RPA đang trở thành một công cụ phân tử được lựa chọn để xác định mầm bệnh một cách nhanh chóng, đặc hiệu và hiệu quả cũng như tiết kiệm chi phí Yêu cầu chuẩn bị mẫu tối thiểu, nhiệt độ vận hành thấp (25 - 42°C), phương pháp này đã được

áp dụng bên ngoài các phòng thí nghiệm, ở những vùng sâu vùng xa, trên các thiết bị

ủ nhiệt đơn giản Những ưu điểm này gợi ý rằng RPA có thể là lựa chọn tối ưu để áp dụng phát hiện acid nucleic chẩn đoán bệnh tại thực địa và khu vực hạn chế về nguồn lực

 Thành phần phản ứng RPA

Chìa khóa dẫn đến thành công của phản ứng RPA cơ bản gồm 3 loại protein (recombinase, recombinase loading factor và single-stranded binding protein), và các thành phần phụ khác như DNA polymerase, crowding agent, các thành phần năng

26

lượng (adenosine triphosphatem, ATP) và các phân tử muối Thành phần phản ứng chi tiết, nồng độ thường được sử dụng và chức năng của các thành phần được trình bày cụ thể ở bảng sau:

[31, 65]

T4 UvsY protein 60 ng/µl Yếu tố tải tái tổ hợp

(recombinase loading factor) được phân loại protein trung gian tái tổ hợp kích thích hoạt động ATPase phụ thuộc DNA sợi đơn của T4 UvsX và có nồng độ thấp hơn nồng độ cần thiết cho hoạt động của T4 UvsX

[34]

T4 gp32 600 ng/µl Protein liên kết đơn (SSB)

liên quan đến quá trình sao chép, sửa chữa, tái tổ hợp DNA và liên kết tốt với DNA sợi đơn Các protein T4 UvsX, T4 UvsY và T4

[28, 126]

27

gp32 hoạt động phối hợp

để bắt đầu phản ứng RPA thông qua việc tháo gỡ, hình thành cấu trúc D-loop

µg

DNA polymerase tổng hợp khuôn DNA mới tương đồng với trình tự đích

Mồi xuôi và mồi

ngược

420nM mỗi mồi, (dải nồng độ tối

ưu 150nM đến 600nM)

Sau khi bám vào trình tự gen đích nhờ ở vị trí tương đồng, đầu 3′-OH của các mồi là vị trí nhận viết cho DNA polymerase kép dài

và tổng hợp sợi DNA mới

[39, 116, 125]

Dithiothreitol 2mM Ổn định các enzyme bằng

cách thêm các nhóm sulfhydryl tự do

[60]

Phosphocreatine 50mM Ba thành phần tạo nên hệ

thống cung cấp năng lượng cho các hoạt động của recombinase và DNA polymerase

[50] Creatine kinase 100 ng/ µL

[122]

 Nguyên lý:

Trong phản ứng RPA, các recombinase (Escherichia coli RecA recombinase

hoặc T4 UvsX protein) với sự hỗ trợ bởi các loading factor sẽ hình thành các sợi nucleoprotein với các mồi và probe có trong phản ứng Các sợi nucleoprotein này có khả năng trượt trên DNA sợi kép (dsDNA) để tìm kiếm các trình tự tương đồng để

29

bắt cặp bổ sung với trình tự trên dsDNA, hình thành cấu trúc vòng D, dẫn đến phân tách các chuỗi DNA cục bộ trong đó chuỗi bổ sung được ổn định bởi SSB protein và trình tự gen đích được lai với mồi Sự phân tách Recombinase từ sợi nucleoprotein được gây ra bởi quá trình thủy phân ATP của protein RecA, cho phép kéo dài bằng DNA polymerase có hoạt tính thay thế sợi Các chuỗi DNA mới được tạo ra được sử dụng cho một vòng RPA khác [53] Do đó, sự khuếch đại theo cấp số nhân được thực hiện bằng cách lặp lại chu trình RPA, phản ứng được thực hiện cho đến khi cạn kiệt nhóm phosphocreatine (Hình 1.6)

Hình 1.6 Chu trình phản ứng RPA [53]

 Mồi và probe trong kỹ thuật RPA

Không giống như PCR, mồi sử dụng trong kỹ thuật RPA thường có chiều dài khoảng 30-35 nucleotide Với chiều dài mồi như vậy sẽ làm tăng khả năng kích hoạt

30

và gắn/ tái tổ hợp của các recombinase protein với oligonucleotide trong môi trường phản ứng Không có quy định nào để dự đoán một mồi khuếch đại tốt/ không tốt; nhất định sẽ làm việc hiệu quả nếu dựa trên thứ tự và thành phần các nucleotide Tuy nhiên, một số hướng dẫn đã được xây dựng dựa trên những quan sát thực nghiệm (khuyến cáo của nhà sản xuất TwistAmp):

- Khi thiết kế mồi cho phản ứng RPA, các guanines ở đầu 5’ (3-5 nucleotide đầu tiên) nên tránh, trong khi cytidines (và có lẽ là các pyrimidine nói chung) có thể

có lợi, vì chúng khuyến khích sự hình thành của các sợi recombinase

- Ngoài ra, guanines và cytidines ở đầu 3' của mồi (3 nucleotide cuối cùng) có

xu hướng cải thiện hiệu suất (có thể như vậy sẽ cung cấp độ ổn định hơn cho polymerase khi gắn vào gen đích)

- Nếu có thể, tốt nhất là tránh các yếu tố trình tự bất thường trong đoạn mồi, chẳng hạn như các đoạn dài của một nucleotide nào đó

- Hàm lượng GC quá cao (> 70%) hoặc thấp (<30%) có thể gây bất lợi Vì các tương tác gắn giữa các base trong trình tự mồi và giữa các mồi có thể góp phần tạo

ra các sản phẩm không đặc hiệu (mồi bắt cặp)

Để phát hiện real-time có hai loại probe được sử dụng là RPA-exo hoặc fpg Probe thông thường như Taq-man không thể sử dụng trong phản ứng RPA, và Taq polymerase sử dụng trong PCR không tương thích với hệ thống khuếch đại của RPA Hoạt tính exonuclease 5-3’ của Taq polymerase sẽ cắt các mạch được thay thế trong suốt quá trình thay thế sợi, do đó ức chế khuếch đại DNA Do vậy, phản ứng RPA sử dụng các polymerase với hoạt tính đẩy sợi và không có hoạt tính exonuclease 5’-3’ (Ví dụ: Bsu DNA polymerase,…)

Exo probe là một trình tự oligonucleotide dài (46-52 base) có chứa một internal base analog (tetrahydrofuran (THF)) nằm ở giữa chất phát huỳnh quang (fluorophore (Fam hoặc TAMRA)) và chất thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ fluorophore (quencher (Black Hole Quencher 1 hoặc Black Hole Quencher 2)) với đầu khóa (block) ở đầu 3’ (3’ phosphate group hoặc dideoxynucleotide) THF đóng vai trò là