Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích auramin o trong thức ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ

2 dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứu phương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có báo cáo

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS NGUYỄN VĂN RI PGS.TS TẠ THỊ THẢO

Hà Nội - Năm 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi.Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào trước đó

Lê Thị Nhƣ Thủy

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Tạ Thị Thảo, chủ nhiệm Bộ môn Hóa Phân tích - Khoa Hóa - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà nội đã tận tình hướng dẫn về chuyên môn, phương pháp nghiên cứu và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Xin gửi lời trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học và các thầy, cô giáo Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nội dung học tập và thực hiện đề tài thuận lợi

Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đ ạo công ty, Phụ trách quản lý Phòng Thử

Nghiệm 1- Công ty CP Chứng nhận và Giám định VinaCert đã tạo điều kiê ̣n , giúp

đỡ tôi trong quá trình triển khai nghiên cứu đề tài

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp và các bạn cùng lớp Cao học Hóa phân tích K26(2015-2017) đã giúp đỡ và động viên tôi trong hai năm học tập và quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2017

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH VẼ

BẢNG CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam 3

1.2 Tổng quan về Auramin O 4

1.3 Các phương pháp xác định 6

1.3.1 Phương pháp quang phổ 6

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 7

1.3.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 9

1.4 Phương pháp tách Auramin O ra khỏi nền mẫu 14

1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết lỏng-lỏng 14

1.4.2 Chiết pha rắn 15

1.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay 15

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Thiết bị 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 20

2.3.2 Phương pháp phân tích mẫu 20

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm và xử lý kết quả 22

3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS 23

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS/MS 23

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC 25

3.2 Khảo sát giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và khoảng tuyến tính xác định sự phụ thuộc tín hiệu đo vào nồng độ chất phân tích 31

3.2.1 Giới hạn phát hiện thiết bị 31

3.2.2 Khoảng tuyến tính 32

3.3 Tối ưu hóa phương pháp chiết Auramin O ra khỏi nền mẫu 33

3.3.1 Khảo sát đơn biến để chọn các thông số ảnh hưởng và khoảng biến thiên 33

3.3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu vớipp mặt mục tiêu tâm xoay (RSM) 36

3.4 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 45

3.4.1 Tính đặc hiệu/chọn lọc 45

3.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 47

3.4.3 Xây dựng đường chuẩn 48

3.4.4 Độ chính xác của phương pháp phân tích 52

3.4.5 Ước lượng độ không đảm bảo đo 55

3.5 Phân tích mẫu thực tế 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 69

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn Ion hóa ESI + 23

Bảng 3.2 Điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS 24

Bảng 3.3 Chương trình đẳng dòng pha động 26

Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động 27

Bảng 3.5 Diện tích pic khi thay đổi tốc độ dòng 29

Bảng 3.6 Kết quả tiêm lặp lại 6 lẫn mẫu chuẩn tại nồng độ 0,02 µg/kg 31

Bảng 3.7 Hiệu suất thu hồi khi sử dụng ba loại dung môi chiết 33

Bảng 3.8 Hiệu suất thu hồi khảo sát trên cột chiết pha rắn 35

Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi ở các tỉ lệ dung môi rửa giải khác nhau 36

Bảng 3.10 Khoảng biến thiên của các yếu tố cần khảo sát 37

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm tiến hành theo mô hình bậc 2 tâm xoay 38

Bảng 3.12 Bảng hệ số thực của phương trình hồi quy 39

Bảng 3.13 Phân tích phương sai của hiệu suất thu hồi AO 40

Bảng 3.14 Sai số giữa kết quả thực nghiệm với kết quả tính từ mô hình 40

Bảng 3.15 Kết quả phân tích 6 lần lặp lại tại điều kiện tối ưu 43

Bảng 3.16 Ion mẹ và 2 ion con của AO 47

Bảng 3.17 Tỉ lệ S/N phân tích 6 lần lặp lại tại nồng độ 10 µg/kg 47

Bảng 3.18 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ Auramin O 48

Bảng 3.19 Sự phụ thuộc giữa diện tích píc và nồng độ AO 50

Bảng 3.20 Kết quả phê duyệt độ chính xác 53

Bảng 3.21 Bảng tính kết quả độ không đảm bảo đo của phương pháp 57

Bảng 3.22 Kết quả phân tích mẫu thực tế 58

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô hình hệ thống LC-MS/MS 10

Hình 1.2 Tứ cực 11

Hình 3.1 Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS 24

Hình 3.2 Cơ chế phân mảnh phổ khối của AO 25

Hình 3.3 Sắc đồ chương trình đẳng dòng pha động 1 và 2 26

Hình 3.4 Sắc đồ các chương trình 3,4,5 chạy gradient 28

Hình 3.5 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,1 ml/phút 29

Hình 3.6 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 30

Hình 3.7 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 30

Hình 3.8 Sắc đồ tại nồng độ 0,02 µg/kg 32

Hình 3.9 Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ Auramin O 32

Hình 3.10 Công thức cấu tạo của chất tạo hạt nhồi trong cột HLB 35

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mặt mục tiêu phụ thuộc thuộc tỉ lệ dung môi chiết và khối lượng mẫu và thể tích rửa giải 42

Hình 3.12 Các đường đồng mức biểu diễn hiệu suất thu hồi AO phụ thuộc tỉ lệ dung môi chiết trên khối lượng mẫu và thể tích rửa giải 42

Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn 46

Hình 3.14 Sắc đồ tại nồng độ 10 µg/kg 48

Hình 3.15 Đường chuẩn AO trong dung môi MeOH 49

Hình 3.16 Đường chuẩn Auramin O trong nền mẫu 51

Hình 3.17 Đường chuẩn AO trên nền mẫu và dung môi MeOH 51

Hình 3.18 Sắc đồ không phát hiện pic của các mẫu phân tích thực tế 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official Analytical

Communities

Hiệp hội các cộng đồng phân

tích chính thức

APCI Atmospheric pressure chemical

ionization

Chế độ ion hóa hóa học ở áp

suất khí quyển

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent

Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử HLB Hydrophilic – lipophilic Balance Cân bằng ưa nước-ưa dầu IARC International Agency for

Reasearch on Cancer

Cơ quan nghiên cứu Ung thư

quốc tế IDL Instrumental detection limit Giới hạn phát hiện của thiết bị

MRM Multiple Reaction Monitoring Kiểm soát đa phản ứng LC-MS/MS Liquid chromatography tandem

mass spectrometry

Sắc ký lỏng ghép khối phổ 2

lần

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCX Strong Cation Exchange Nhựa trao đổi cation mạnh

UPLC Ultra Performance Liquid

Chromatography Siêu sắc ký lỏng hiệu năng cao WAX Weak Anion Exchange Nhựa trao đổi anion axit yếu

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, công nghệ chế biến thức ăn chăn nuôi (TĂCN) tại Việt Nam có xu hướng tăng tuy nhiên vẫn không đáp ứng được nhu cầu trong nước Cùng với việc phát triển mạnh mẽ về quy mô, sản lượng, chủng loại thì chất lượng của sản phẩm cũng còn khá nhiều bất cập như công bố chất lượng không đúngtrên bao bì, nguyên liệu không đạt chuẩn, tỷ lệ các chất phụ gia quá cao, lạm dụng kháng sinh, chất cấm nhằm mục đích tạo nạc, đặc biệt việc sử dụng chất tạo màu công nghiệp trong TĂCNđang gây bức xúc dư luận, được người tiêu dùng, các

cơ quan quản lý, phương tiện thông tin đại chúng rất quan tâm

Những năm gần đây, cục cảnh sát phòng chống tội phạm về môi trường đã phát hiện hàng trăm tấn thức ăn chăn nuôi tại các cơ sở sản xuất ở Việt Nam đã sử dụng chất tạo màu công nghiệp, chủ yếu là Auramin O (AO), để tạo màu vàng cho thức ăn chăn nuôi Auramin O là chất tạo màu công nghiệp, căn cứ vào cấu tạo hóa học, tính chất vật lý hóa học và độc tính của AO, Viện Ung thư quốc gia NCI Hoa

Kỳ, Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế IRAC của Tổ chức Y tế thế giới WHO xếp các thuốc nhuộm vat yellow trong đó có AO thuộc nhóm 3 các chất gây ung thư[52].Ngoài ra còn nhiều thí nghiệm trên chuột cho thấy chất AO còn gây hại các

tế bào gan, thận và tủy xương [18].Vì vậy khi vật nuôi ăn phải thức ăn có chứa AO

sẽ gây tổn hại trực tiếp đến sức khỏe gia súc, gia cầm Tồn dư của loại hóa chất này

trong thực phẩm sẽ dẫn đến nguy cơ gây ung thư cho con người

Hầu hết các nhà nghiên cứu đều chú ý nhiều hơn đến việc xác định hàm lượng thuốc nhuộm trong thực phẩm vì mối liên hệ trực tiếp đối với sức khoẻ con người Tuy nhiên, như chúng ta đã biết, có rất nhiều chất tạo màu độc hại được thêm vào thức ăn cho động vật, những chất này sẽ chuyển hoá và tồn dư trong cơ thể vật nuôi và chính những vật nuôi này lại là nguồn thực phẩm cho con người Vì vậy việc phát hiện sớm các chất độc hại này trong TĂCN là để ngăn ngừa chúng bước vào chuỗi thức ăn của con người, đồng thời tăng chất lượng vật nuôi, đảm bảo một nguồn thực phẩm sạch cung cấp trong nước và xuất khẩu nước ngoài.Ở nước

ta, kể từ khi các cơ quan chức năng phát hiện AO được các cơ sở sản xuất TĂCN sử

2

dụng làm chất tạo màu, đã có rất nhiều phòng thử nghiệm Việt Nam nghiên cứu phương pháp phân tích loại chất này bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có báo cáo nghiên cứu chính thức nào về việc đánh giá các yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa phương pháp xác định Auramin O bằng LC-MS/MS Từ những yêu cầu cấp thiết trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu phát triển phương pháp phân tích Auramin O trong thức

ăn chăn nuôi bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS)”

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài: Nghiên cứu đã áp dụng kỹ thuật

phân tích hiện đại sắc ký lỏng khối phổi 2 lần (LC-MS/MS) để phân tích nhằm đưa

ra những kết quả đáng tin cậy Việc sử dụng phương pháp mặt mục tiêu tâm xoay

để tối ưu hóa các điều kiện phân tích giúp tránh lãng phí thời gian phân tích, hóa chất sử dụng nhưng vẫn đạt được hệ số thu hồi cao nhất Quy trình phân tích đã được ứng dụng để xác định AO trong mẫu thực tế tại phòng thí nghiệm

3

1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sử dụng chất tạo màu trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam

Thức ăn chăn nuôi là những sản phẩm mà vật nuôi ăn, uống ở dạng tươi sống hoặc đã qua chế biến, bảo quản, bao gồm: nguyên liệu TĂCN hay thức ăn đơn, thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh, thức ăn đậm đặc, thức ăn bổ sung, phụ gia TĂCN, premix, hoạt chất và chất mang [8]

Thức ăn chăn nuôi hoàn chỉnh là hỗn hợp của nhiều nguyên liệu thức ăn được phối chế theo công thức nhất định đảm bảo có đủ các chất dinh dưỡng để duy trì đời sống và khả năng sản xuất vật nuôi theo từng giai đoạn sinh trưởng của chu

kỳ sản xuất mà không cần thêm bất kỳ loại thức ăn nào khác ngoài nước uống [8]

Chất lượng của thực phẩm thường được đánh giá thông qua màu sắc của nó Tạo màu trong thực phẩm nói chung, hay tạo màu trong TĂCN nói riêng đều nhằm mục đích: phục hồi lại màu sắc cho sản phẩm do những biến đổi trong tự nhiên, bảo quản, chế biến, đóng gói, phân phối…; làm tăng độ đồng nhất cho sản phẩm; giúp duy trì những tính chất đặc chung của sản phẩm; tăng cường màu sắc, làm tăng tính hấp dẫn của sản phẩm Việc sử dụng phụ gia tạo màu có những yêu cầu bắt buộc như: không dùng để che đậy khuyết điểm của thực phẩm, không độc tính, chất màu

sử dụng là những chất không gây ung thư, những sản phẩm chuyển hóa của những chất màu trong quá trình chế biến và bảo quản không gây độc hại… [42]

Thức ăn chăn nuôi được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: cám gạo, khoai lang, ngô, đỗ tương, bột thịt xương, bột đầu tôm…tùy thuộc vào mỗi nguồn nguyên liệu, các cơ sở sản xuất sẽ tạo cho sản phẩm có màu đặc trưng theo từng nguyên liệu bằng cách trộn với các chất phẩm màu tự nhiên hoặc tổng hợp Tuy nhiên, nhằm tính toán đến lợi nhuận, một số cơ sở sản xuất đã không

sử dụng những phụ gia tạo màu được phép [3] như vàng curcumin, vàng Riboflavin, tartrazin, sunset FCF với hàm lượng được phép mà sử dụng chất tạo màu công nghiệp, rẻ tiền và vô cùng độc hại như AO.Điều đáng lo ngại, dù trên thùng sản phẩm hóa chất công nghiệp đều khuyến cáo chỉ sử dụng trong công nghiệp không

sử dụng trong TĂCNvà thực phẩm nhưng các công ty sản xuất TĂCN vẫn cố tình

và các dẫn xuất của Auramin hay còn được gọi là màu vàng cơ bản 2, sử dụng trong công nghệ dệt nhuộm Tuy nhiên, hiện nay vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất lén sử dụng AO để tạo màu vàng cho thức ăn gia súc gia cầm vì vậy việc định lượng chính xác hàm lượng chất này trong TĂCN là vấn đề cần được quan tâm trong công tác kiểm tra chất lượng sản phẩm Đồng thời cũng rất cần thiết về mặt quản lý để đánh giá tình hình mức độ sử dụng AO trong chăn nuôi và đưa ra những cảnh báo về vệ sinh an toàn thực phẩm nếu có,nhằm kiểm soát việc sử dụng chất cấm cũng như đảm bảo cung cấp một nguồn thực phẩm sạch trong nội địa và xuất khẩu

1.2 Tổng quan về Auramin O

Auramine O thuộc nhóm thuốc nhuộm Diphenylmethane, trong nhóm này

có hai loại thuốc nhuộm quan trọng có tính thương mại là Auramin O và Auramine

G Ở dạng tinh khiết, tinh thể Auramin có màu vàng, tan tốt trong nước và ethanol [24], [33]

Công thức cấu tạo của Auramin O [44]:

Công thức phân tử: C17H21N3.HCl

Tên đầy đủ của AO:

5

4,4’-Carbonimidoylbis[N,N-dimethylbenzenamine]hydrochlorid

Tên thương mại: Auramin O, Vàng Ô, basic yellow 2

Auramin và muối của nó có thể được tạo ra bằng cách nung nóng đimethylaminođiphenyl với hỗn hợp urê, axit sufamic, và sulfur trong amoni tại 175

oC Muối của Auramin được tạo thành trong phản ứng có thể sử dụng trực tiếp trong quá trình nhuộm hoặc có thể chuyển đổi thành Auramin cơ bản hay Auramin

Auramin được dùng trong công nghiệp nhuộm sợi như lụa và sợi bông; ngoài ra còn để nhuộm da, giấy.Nó cũng được sử dụng trong việc in ấn, tạo màu trong các loại mực.Ngoài ra, AO còn được áp dụng trong các nghiên cứu về y tế như sử dụng AOnhư một chất huỳnh quang để phát hiện nhiễm trùng vi khuẩn lao không điển hình (ví dụ như Mycobacterium) trong mô tế bào[29], [39] hoặc nó được kết hợp với Rhodamine B tạo thành chất auramine-rhodamine được sử dụng như chất khử trùng[45].Ngoài ra các thuốc nhuộm huỳnh quang như Rhodamine và

AO còn được áp dụng trong nghiên cứu hóa học, sinh học, y tế [19,[45]

Thuốc nhuộm tổng hợp đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp cũng như thực phẩm vì so với hầu hết các thuốc nhuộm tự nhiên, chúng có độ ổn định cao hơn và giảm được chi phí sản xuất.Tuy nhiên, cấu trúc hóa học của một số thuốc nhuộm tổng hợp có thể gây tác động xấu đến sức khỏe con người.Vì những lý

do này, việc sử dụng các thuốc nhuộm tổng hợp trong các sản phẩm thực phẩm hiện nay bị cấm ở Châu Âu và nhiều nước trên thế giới.Quy định EC số 1333/2008 phụ lục II đưa ra danh sách các phụ gia thực phẩm của Liên minh Châu Âu để sử dụng trong thực phẩm và các điều kiện của chúng, bao gồm một danh sách các chất tạo màu cho phép và AO không nằm trong danh sách[20].Tại Việt Nam, cấm nhập

6

khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong chế biến TĂCN các loại chất tạo màu

công nghiệp trong đó có AO

Theo quyết định số 846/QĐ-CN-TĂCN ngày 17/112015 của Cục trưởng Cục chăn nuôi về việc mở rộng phạm vi chỉ định phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm thì giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích AO phải đạt được 1 mg/kg [2]

1.3 Các phương pháp xác định

Các nghiên cứu phân tích về Auramin bắt đầu vào những năm 1970 và tiếp tục đến năm 1980, các phương pháp chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng và sắc ký bản mỏng

để xác định Auramin trong mô tôm và thuốc nhuộm sinh học[38], [54]

Hiện nay, các công trình nghiên cứu sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để xác định các nhóm thuốc nhuộm trên nhiều nền mẫu thực phẩm và thức ăn chăn nuôi trong đó phải kể đến một số phương pháp như phương phápđiện hóa, phương pháp hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme ELISA [57],tuy nhiên, hiện nay phương pháp phổ biến để xác định AO, đặc biệt để ứng dụng phân tích tại phòng thí nghiệm

là quang phổ và sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.3.1 Phương pháp quang phổ

Cơ sở của phương pháp quang phổ là dựa trên bức xạ điện từ được phát ra hay hấp thụ từ mẫu phân tích, từ các cường độ phát xạ hay hấp thụ này có thể định tính hoặc định lượng thành phần có trong mẫu

Nhóm nghiên cứu người Nhật, Jingjing Yan và cộng sự [27] đã nghiên cứu phương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ huỳnh quang trong thuốc thảo mộc dựa trên sự tương tác gắn kết với Albumine huyết thanh bò (BSA) Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ chế là tắt huỳnh quang Khi ở trong môi trường đệm axit acetic pH 7 AO có khả năng làm tắt huỳnh quang của BSA (do sự

va chạm giữa các phân tử, không biến đổi về mặt hóa học, quá trình tỏa nhiệt) Nghiên cứu cho thấy, tại bước sóng 339 nm, độ nhạy cũng như cường độ huỳnh quang của BSA giảm mạnh khi tăng dần nồng độ AO từ 0- 5.10-5mol/l, màu sắc của dung dịch chuyển đổi rõ rệt từ màu vàng sang màu vàng đậm có nghĩa có thể sử

7

dụng BSA để định lượng AO Phương pháp bị ảnh hưởng của 3 yếu tố là pH, nồng

độ BSA và thời gian phản ứng Khoảng tuyến tính của phương pháp khoảng từ 0,16 đến 50 µmol/l và giới hạn phát hiện 0,05 µmol/l Nghiên cứu đã xác nhận phương pháp trên một số nền mẫu thuốc với hiệu suất thu hồi cao từ 96-101 % và độ lệch chuẩn tương đối từ 0,15-2,6 %

Năm 2017, Hou ZHANG, Zhi LI [25] cùng các cộng sự đã nghiên cứu thành công phương pháp xác định AO bằng phương pháp quang phổ tetrahertz trong thuốc thảo dược Mẫu được nghiền thành dạng bột, sau đó ép thành viên tròn bằng máy ép thủy lực dưới áp suất 12 MPa Độ dày của viên chỉkhoảng 1,50 mm Mẫu được phân tích trên máy đo phổ miền thời gian tetrahezt (THz-TDs) Phổ hấp thụ AO được đo trong khoảng 0,2-1,6 THz sau đó chuyển đổi phổ miền thời gian thành phổ tần số bằng phương pháp chuyển đổi nhanh Fouier Kết quả cho thấy, AO hấp thụ tại 0,43 THz; 1,21 THz; 1,32 THz, có thể sử dụng các tín hiệu hấp thụ này

để phân tích định lượng AO Phương pháp được đánh giá là nhanh chóng, đơn giản, chính xác để định lượng AO trong dược thảo Phương pháp có ưu điểm là tiết kiệm

và thân thiện với môi trường vì không sử dụng thuốc thử, không có dư lượng hóa học trong quá trình thí nghiệm

1.3.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động

và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [4]

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong việc xác định hàm lượng các chất tạo màu bị cấm với độ tin cậy cao

Một nhóm tác giả người Anh, đã nghiên cứu xác định 19 loại thuốc nhuộm trong đó có AO trong các nền mẫu thực phẩm như bột ớt, thì là; cá, thịt gà đóng hộp

8

bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu dò UV[30].Tác giả đã sử dụng hỗn hợp dung môi axetonitril: axeton tỉ lệ thể tích 90:10 để chiết chất cần phân tích ra khỏi nền mẫu ở nhiệt độ 40oC Dịch chiết được lọc và định lượng AO trên hệ thống HPLC-

UV tại bước sóng 436 nm Khoảng tuyến tính từ 1-20 mg/l, hiệu suất thu hồi đối với

AO trong khoảng từ 73-103 % và độ lệch chuẩn tương đối lần lượt tại các nồng độ 5 mg/l; 10 mg/l; 20 mg/l là 4,1%; 1,4 %; 1,9 % tương ứng

Tác giả Tan Enling, Xiao Jian [46] cũng đã phát triển phương pháp xác định đồng thồi ba chất Orange II cơ bản, Axit Orange II và AuraminO trong các sản phẩm làm từ đậu bằng HPLC-UV Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng, độ đúng và độ chụm cao Giới hạn phát hiện của Auramin O đạt 0,05 mg/kg

Tại Nhật Bản, việc kiểm soát hàm lượng các chất cấm tạo màu trong thực phẩm chế biến là vấn đề rất được quan tâm Tác giả người Nhật Chiye Tatebe và cộng sự[17] đã phát triển một phương pháp nhanh và đơn giản để xác định đồng thời3 chất Rhodamine B, Auramin O và pararosanilin bằng HPLC-PDA trong nhiều nền mẫu khác nhau như: cà ri, sốt ớt, bột tôm, sốt gà, súp bột.Nghiên cứu đã tối ưu hóa các điều kiện trên HPLC với cột pha tĩnh là octadecylsilan ODS (4,6x150mm, 5 µm), nhiệt độ cột là 40oC Pha động gồm hai kênh A là amoni acetate 20 mM pH=4,5 và kênh B là axetonitril, gradient pha đông pH của dung dịch pha động được đánh giá là yếu tố ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp, qua khảo sát tại

ba giá trị pH khác nhau: 3,5; 4,5; 6,5 kết quả cho thấy tại pH 4,5 thì cả ba chất phân tích đều có độ nhạy cao nhất

Nhóm tác giả Yang Shuang, Yu ZiXuan, Wang YongFang, Ge BaoKun [56]

đã định lượng Chrysoidin II và Auramin O trong nền mẫu đậu khô bằng phương pháp HPLC-PDA Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đối với Auramin là 0,02 mg/kg và 0,05 mg/kg Hiệu suất thu hồi trong khoảng nồng độ khảo sát 0,05; 2,0 và 10 mg/kg đạt từ 95-103,1 % Độ lệch chuẩn phương pháp dưới

5 % Phương pháp được đánh giá là đơn giản, nhanh chóng, chi phí thấp phù hợp để ứng dụng phân tích trong phòng thử nghiệm

9

Auramin O đã được phát hiện trong mẫu thuốc làm từ vỏ cây Hoàng Bá (loại cây được sử dụng làm thuốc đông y chữa bệnh) bằng phương pháp HPLC-DAD Nhóm tác giả LI Yun cùng cộng sự [35] đã tối ưu hóa các điều kiện phân tích trên

hệ thống sắc ký bằng phương pháp sàng lọc nhanh Cột pha tĩnh ZORBAX SB-C18 (4,6 mmx250 mm, 5µm) đã được sử dụng để tách AO, nhiệt độ cột là 30 oC Pha động gồm hỗn hợp dung dịch axetonitril và KH2PO4 0,025M pH=3 tỉ lệ 35:65 Tốc

độ dòng là 1,0 ml/phút AO được phát hiện tại bước sóng 432 nm Nghiên cứu đã phân tích 30 mẫu thuốc, kết quả cho thấy có 6 mẫu dương tính với Auramin O Các kết quả được xác nhận lại bằng phương pháp HPLC-MS/MS, đánh giá kết quả là phù hợp

1.3.3 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

Sắc ký lỏng khối phổ là một phương pháp phân tích công cụ kỹ thuật hiện đại với những tính năng vượt trội được ứng dụng rộng rãi trên nhiều lĩnh vực như dược phẩm, môi trường, đặc biệt là xác định hàm lượng chất cấm trong thực phẩm dành cho người và động vật

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (M/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ

số M/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [4]

Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

Bộ phân tích tứ cực dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi trường di chuyển của nó

Bộ tứ cực gồm 4 thanh cực ghép song song nối với nhau từng đôi một đối diện nhau, tạo thành hai cặp, sau đó chúng nối với điện áp một chiều tạo thành 2 cặp dương và âm Ngoài điện áp một chiều, hai cặp điện cực còn được nối với điện áp xoay chiều Tổ hợp điện áp này đặc biệt là điện áp xoay chiều sẽ thay đổi theo chu

kỳ để quét khối lượng các ion

11

Hình 1.2 Tứ cực

Một số ion có tỷ số M/z xác định cộng hưởng với thế xoay chiều xác định có thể đi thẳng qua khoảng không đến detector Trong khi đó các ion khác không sẽ có quỹ đạo không ổn định va chạm với các cực và bị giữ lại ở đó Tuy nhiên để thu được tất cả các ion ta quét điện áp theo chu kỳ từ zero đến một điện áp nhất định tăng dần sau đó lại trở lại zero, lần lượt các ion sẽ vượt qua được tứ cực cũng có khối lượng từ nhỏ đến lớn để đến detector

Kỹthuật MS một lần có một số nhược điểm như: không nghiên cứu được cơ chế phân mảnh, sự khác biệt giữa các đồng phân, xác định thêm chi tiết cấu trúc hoá học, chịu ảnh hưởng rõ rệt nền mẫu chất phân tích, do kỹ thuật ion hoá êm dịu nên khối phổ đồ chỉ cho thấy ion phân tử…

Kỹ thuật MS/MS (2 lần) khắc phục được những điểm này đồng thời tăng thêm độ nhạy, tăng độ chính xác kết quả loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu

Máy khối phổ MS/MS hay máy đo khối phổ hai lần liên tiếp gồm hai hệ khối phổ riêng biệt độc lập nhau được nối liền với nhau cách nhau bởi một buồng va chạm (collision cell).Bộ tứ cực thứ nhất (tứ cực Q1), có nhiệm vụ tách các ion Lựa chọn ion mẹ với M/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến buồng va chạm Tại buồng

va chạm, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân li do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He,ion này liền ngay sau đó sẽ bị phân mảnh tạo ra các ion con (daughter ions).Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tứ cực Q3.Bộ tứ cực

Ưu điểm chung của phương pháp là có độ nhạy cao, đặc biệt phương pháp sắc

ký lỏng khối phổ có độ nhạy đạt đến mức µg/kg , độ chọn lọc tốt, thời gian phân tích nhanh, tuy nhiên chi phí đầu tư thiết bị cao

Ở Trung Quốc, chất tạo màu trong thực phẩm cũng rất được quan tâm Trong một tạp chí khoa học, tác giảPeng Cao và cộng sự[40] đã sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để nghiên cứu xác định 6 loại chất tạo màu công nghiệp(Chrysoidin

II, Rhodamin B, Auramin O, Rhodamin 6G and Safranin T,Orange II)trong thực phẩm Mẫu được chiết bằng dung dịch amoniacetate 50 mmol trong 50 % methanol

và 1 % axit fomic và làm sạch bằng cột chiết pha rắn WAX, định lượng trên hệ thống UPLC-MS/MS theo chế độ MRM Giới hạn phát hiện của AO là 1,6 µg/kg và giới hạn định lượng là 6 µg/kg Khoảng tuyến tính trong khoảng từ 1-100 µg/kg với

hệ số tương quan R2=0,999 Hiệu suất thu hồi từ 70,3 %-109,2 % và độ lệch chuẩn tương đối từ 2,6 %-14,1 % Phương pháp được đánh giá là đơn giản, có độ nhạy và chọn lọc tốt, có thể xác định đồng thời 6 loại chất tạo màu trong thực phẩm

Trong một nghiên cứu khác tại Trung Quốc tác giả Zheng Xiao-yanđã báo cáo nghiên cứu xác định đồng thời Chrysoidin, Auramin O, Safranin T trong thực phẩm bằng UPLC-MS/MS[60] Mẫu được chiết bằng MeOH và làm sạch bằng n-hexan

Sử dụng UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng cả ba thuốc nhuộm Khoảng tuyến tính nằm trong khoảng từ 0,01 -0,05 µg/ml ( R= 0,995) Hệ số thu hồi khoảng

từ 74,3% đến 91,1 % và độ lệch chuẩn là 2,4 %-9,4 % (n=6).Giới hạn phát hiện lần lượt là 0,3;0,6;0,7 µg/kg đối với Chrysoidin, Auramin O, Safranin T

13

Dựa trên độ nhạy và độ chính xác cao của phương pháp LC-MS/MS nhóm tác giả Juan Li, Xiao-Ming Ding, Dan-Dan Liu…[28] đã tối ưu hóa phương pháp xác định đồng thời tám chất nhuộm (Sudan (I-IV), Para Red, Rhodamin, Chrysoidin and Auramin O) bị cấm sử dụng trong các sản phẩm chứa ớt (bột ớt, nước tương, ) Nghiên cứu đã khảo sát bốn loại hỗn hợp pha động khác nhau để tách tám chất phân tích trên HPLC, kết quả cho thấy hỗn hợp pha động methanol và amoni acetate 5mM với chế độ chay gradient cho tín hiệu pic cao nhất và pic cân đối nhất Phương pháp định lượng trên hệ thống MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ Các điều kiện trên MS/MS được tối ưu như sau: mảnh ion m/z=268,1được lựa chọn là ion mẹ với thế phân mảnh là 35V, hai mảnh ion con dùng để định tính và định lượng là m/z=147,1và m/z= 252,1 với năng lượng va chạm là 28V Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp đối với AO lần lượt là 0,05 µg/kg và 0,3 µg/kg Các thông số xác nhận phương pháp như độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chụm, độ thu hồi đều đạt yêu cầu của AOAC

Nhóm tác giả LI Jing-Qing, QI Yan, LIAO Gui-Fu, CHEN Man-Ying, đã tối

ưu hóa các điều kiện xác định Auramin O và dimethyl yellow [31] trong các sản phẩm được làm từ đậu trên hệ thống LC-MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ và chế độ quét phổ MRM Các thông số tối ưu đối với nguồn ion hóa ESI+ như sau: nhiệt độ nguồn 150oC, điện thế mao quản 2,82 kV, nhiệt độ sấy khô 500oC, lưu lượng khí (Argon) 800L/h Mảnh ion mẹ là m/z=268,2, hai mảnh ion con dùng để định tính và định lượng lần lượt là 107,0 và 147,0 Hiệu suất thu hồi của phương pháp đối với AO trong các khoảng nồng độ khảo sát 6; 10; 50 µg/kg đạt từ 89,1%-100,7 % Độ lệch chuẩn nhỏ hơn 12 % (n=6)

Năm loại chất tạo màu vàng công nghiệp (Chrysoidin G, chất màu vàng dạng bazo 2, Axit Orange I, Axit Orange II and chất màu vàng dạng xxit) đã được phát hiện đồng thời trên hệ thống sắc ký lỏng khối phổ HPLC-MS/MS [34] Sự tách chất được thực hiện với cột Agilent ODS C18, tốc độ dòng chảy 0,3 mL / phút Hỗn hợp pha động được lựa chọn là amoniacetat 5mM và axetonitril tỉ lệ 3:2 Phân tích dưới các điều kiện đã tối ưu, các kết quả cho thấy khoảng tuyến tính cho Chrysoidin G và

14

Basic Yellow 2 là 5,0-80,0 mg/L, và đối với Axit Orange I, Axit OrangeII và Axit Yellow 36 là 10,0-160,0 μg / L Giới hạn định lượng cho Chrysoidin G, Basic Yellow 2, Axit Orange I, Axit Orange II và Axit Yellow 36 lần lượt là 20, 20, 40,

40 và 40 ng/g.Phương pháp này được áp dụng để xác định hiệu suất thu hồi của năm loại thuốc nhuộm trên các nền mẫu thịt gà, các sản phẩm đậu và cà tím vàng, kết quả hiệu suất thu hồi đạt từ 79,8% -95,2%

Tác giả Yu Xin-qi và cộng sự [58] đã nghiên cứu phát triển phương pháp phát hiện và định lượng Auramin O trong nền mẫu thuốc bằng phương pháp HPLC-MS/MS với chế độ ion hóa dương ESI+ và mảnh m/z=268,1 được chọn làm mảnh

mẹ Điều kiện trên HPLC được tối ưu ở điều kiện cột pha tĩnh C18 (250mmx4,6mm; 5µm), hỗn hợp pha động axetonitril và amoniacetate 0,05M tỉ lệ 30:70.Kết quả xác nhận phương pháp cho thấy hiệu suất thu hồi cao đạt từ 95-99 % đối với 3 mức nồng độ thấp, trung bình, cao Phương pháp được đánh giá là đáng tin cậy và có độ chính xác cao, có thể sử dụng để xác định AO trong nền mẫu thuốc

1.4 Phương pháp tách Auramin O ra khỏi nền mẫu

1.4.1 Lựa chọn dung môi chiết

Đối với một phương pháp định lượng thì bước xử lý mẫu là quan trọng nhất, sao cho chất phân tích được chiết hoàn toàn ra khỏi nền mẫu và tạp chất phải được loại bỏ Phương pháp chiết tách Auramin O ra khỏi các nền mẫu chủ yếu là phương pháp chiết lỏng-rắn Auramin O là chất phân cực vì vậy sẽ tan tốt trong các dung môi hữu cơ phân cực Đối với các nền mẫu như thực phẩm, thuốc, thức ăn chăn nuôi, Auramin O thường được chiết bởi các loại dung môi chính như Acetonitril [23],[28], [43], [50], Methanol [23], [36], [55], [60] và Ethanol [56]…Tuy nhiên, với mỗi loại nền mẫu khác nhau cần phải lựa chọn tỷ lệ dung môi chiết phù hợp, việc sử dụng tỷ lệ 100 % dung môi hữu cơ thường cho hiệu suất chiết không cao, vì vậy để tăng hiệu suất chiết các nghiên cứu thường khảo sát tỷ lệ chiết giữa dung môi hữu cơ và nước hoặc với axit hữu cơ như axit acetic, axit formic [28],[40],[43]

15

Một số nền mẫu thực phẩm nói chung hay nền thức ăn chăn nuôi nói riêng thì hàm lượng protein tồn tại trong mẫu rất lớn, đây cũng là một yếu tố gây cản trở cho quá trình phân tích trên hệ thống LC-MS/MS Theo một số tài liệu tham khảo [43], [56] thì protein sẽ bị kết tủa sau khi mẫu được chiết bằng dung môi hữu cơ như Methanol, Ethanol, Acetonitril và ly tâm lạnh tại nhiệt độ thấp, loại bỏ protein bằng cách lọc qua giấy lọc

1.4.2 Chiết pha rắn

Khi phân tích trên hệ thống LC-MS/MS đối với nền mẫu có thành phần phức tạp có thể ảnh hưởng bất lợi đến quá trình phân tích như làm tăng hoặc ngăn cản quá trình ion hóa Nền mẫu TĂCN chứa một lượng lớn các thành phần khác nhau như muối vô cơ, ion kim loại, carbohydrat, protein, các chất phụ gia khác…Để giảm thiểu những ảnh hưởng này các nghiên cứu thường sử dụng phương pháp chiết pha rắn để làm sạch Chiết pha rắn (SPE) là phương pháp được sử dụng để loại bỏ hầu hết các chất ảnh hưởng ra khỏi nền mẫu

Trong các tài liệu tham khảo có rất nhiều loại cột SPE được dùng trong phân tích xác định các chất tạo màu công nghiệp như cột WAX (Weak Anion Exchange) [23], [40],cột SCX (Strong Cation Exchange)[37], cột HLB (Hydrophilic – lipophilic Balance)[16],[17] Nhóm tác giả người Nhật Hiye Tatebe và cộng sự [16] đã nhận định cột chiết pha rắn có chứa hạt chất nhồistyrene-divinylbenzene polymeric có khả năng lưu giữ tốt các chất cần phân tích AO trong báo cáo xác định nhóm chất cấm tạo màu trong chế biến thực phẩm (rhodamine B, Auramin O, pararosaniline)

1.4.3 Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu bằng phương pháp mặt mục tiêu

tâm xoay

Hiện tại, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước, để tách chiết AO

ra khỏi nền mẫu đa phần được khảo sát theo phương pháp đơn biến Phương pháp này chỉ đánh giá được sự ảnh hưởng của các yếu tố riêng rẽ nhưng không đánh giá được sự ảnh hưởng tương hỗ giữa các yếu tố Để khắc phục những nhược điểm của

Có nhiều phương pháp tìm phương trình hồi quy bậc 2 nhưng phổ biến nhất

là 2 phương pháp: ma trận trực giao và ma trận tâm xoay Trong phương trình hồi quy bậc 2 có bao nhiêu số hạng thì ít nhất có bấy nhiêu phương trình để tìm được các hệ số hồi quy tương ứng cho mỗi số hạng

Hàm mục tiêu được biểu diễn bằng một phương trình hồi quy dạng đa thức:

𝑌 = 𝑏0 𝑥0 + 𝑏𝑖 𝑥𝑖 + 𝑏𝑖𝑗 𝑥𝑖 𝑥𝑗 + 𝑏𝑖𝑖 𝑥𝑖2Phương trình hồi quy bậc 2 mô tả một mặt mục tiêu trong không gian n chiều, có lồi lõm tương ứng với các giá trị cực trị của hàm mục tiêu Các cực trị này chính là điều kiện thực nghiệm tối ưu tìm được

Ở đây, chúng ta nghiên cứu mô hình hóa thực nghiệm bậc 2 tâm xoay:

Số thí nghiệm của ma trận bậc 2 tâm xoay:

17

Để đánh giá tính có nghĩa của hệ số trong phương trình hồi quy bậc hai tâm xoay ta sử dụng chuẩn Student Nếu t tính> t bảng thì hệ số hồi quy mới có nghĩa hay trị số Pvalue<0,05 thì hệ số hồi quy mới có nghĩa

Để đánh giá tính phù hợp của mô hình ta sử dụng chuẩn Fisher

𝐹𝑡í𝑛ℎ= 𝑆𝑝ℎ2𝑆𝑜2

Nếu F tính< F bảng (P, fph, f0) thì mô hình thống kê mô tả đúng thực nghiệm

Trong đó:

S2ph là phương sai của thí nghiệm lặp lại ở điều kiện tối ưu

S02 là phương sai của thí nghiệm lặp lại ở tâm của mô hình

fph bậc tự do của phương sai phù hợp

f0 bậc tự do của thí nghiệm lặp lại ở tâm

Hiện nay, phương pháp RSM được sử dụng phổ biến để xác định các điều kiện chiết tách các chất cần phân tích trong nhều nền mẫu khác nhau như [14], [41], [44], [58] nhưng chưa có nghiên cứu nào ứng dụng phương pháp này để tối ưu hóa các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết AO

18

2 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu đã tiến hành phân tích trên đối tượng thức ăn chăn nuôi hoàn chỉnh được mua từ các đại lý phân phối là sản phẩm của các công ty sản xuất thức

ăn chăn nuôi lớn ở Việt Nam

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa các điều kiện chiết tách và xác định Auramin O trong thức ăn chăn nuôi bằng LC-MS/MS Sau đó xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp với các thông số gồm:Độ đặc hiệu/chọn lọc , đường chuẩn, giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ, độ chính xác của phương pháp (độ đúng và độ chụm) Từ các kết quả phê duyệt nghiên cứu đã tính toánđộ không đảm bảo đo của phương pháp Cuối cùng, áp dụng phương pháp phân tích để xác định một số mẫu TĂCN đang bán trên thị trường

2.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1 Hóa chất

Hóa chất gốc

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Chất chuẩn Auramin hydrochloric (Auramin O),(Sigma), độ tinh khiết 85 %

- Methanol (MeOH),(Merck) dùng cho phân tích sắc ký

- Axetonitril (ACN), (Merck); 99,8% dùng cho phân tích sắc ký

- Axit fomic (CH3COOH), (Merck), độ tinh khiết 99,8 %

- Nước cất được lọc qua thiết bị deion, đạt độ dẫn điện 4,3µS (điện trở 18,2 MΩ)

- Cột SPE Oasis® HLB, (Waters),đường kính hạt nhồi 30 µm, 60mg

Hóa chất pha

- Dung môi pha động A: Dung dịch 1 % axit fomic trong axetonitril

Lấy 990 ml Axetonitril cho vào bình chứa pha động 1000 ml Thêm 10 ml dung dịch Axit Fomic Đậy nắp.Lọc và lắc siêu âm đuổi khí

19

- Dung môi pha động B: Dung dịch 1 % Axit Fomic trong nước:

Lấy 990 ml nước cất cho vào bình chứa pha động 1000ml Thêm 10 ml dung dịch axit formic Đậy nắp Lọc và lắc siêu âm đuổi khí

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc AO 1000ppm:

Cân chính xác 11,76 mg chất chuẩn AO.HCl (độ tinh khiết 85 %) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng methanol.Lưu trữ ở nhiệt độ từ 2-8

oC, trong tối đa 1 tháng

Các dung dịch chuẩn trung gian được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc trong dung môi MeOH Sử dụng hằng ngày

2.2.2 Thiết bị

Các thiết bị sử dụng đều được hiệu chuẩn theo ISO 17025

- Hệ thống UPLC-MS/MS-Waters Xevo TQ MS (Waters, Mỹ) với kỹ thuật ion hóa

tại áp suất khí quyển (API) và 2 kiểu hình thành ion: ion hóa tia điện (ESI), ion hóa học tại áp suất khí quyển (APCI) Đầu dò khối phổ tứ cực (tandem quadrupole) Phần mềm xử lý số liệu: Mass Lynh 4.1

- Cột pha tĩnh ACQUITY UPLC ® BEH C18 (2,1x50 mm; 1,7µm) (Waters)

Các thiết bị và dụng cụ khác:

- Cân phân tích 5 số KERN ABT 100-5M

- Cân phân tích 4số Sartorius ENTRIS2241-ES

- Máy ly tâm Mikro 220R

20

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

- Thu thập mẫu: Mẫu được mua tại các đại lý thức ăn chăn nuôi gia súc gia cầm với

0,5 kilogam/mẫu

- Chuẩn bị mẫu: Đối với mẫu dạng rắn, thực hiện quá trình nghiền để đồng nhất,

đảm bảo mẫu thử đại diện trung thực cho mẫu phòng thí nghiệm, mẫu thử phải lọt qua lỗ sàng 1 mm [9].Bảo quản mẫu: Nhiệt độ 25oC±5oC

- Chuẩn bị mẫu trắng: Lựa chọn một mẫu TĂCN bất kỳ được mua, phân tích lặp lại 6 lần Mẫu trắng được chọn là mẫu không phát hiện AO

2.3.2 Phương pháp phân tích mẫu

2.3.2.1 Chuẩn bị mẫu

- Đối với mẫu trắng

Cân khoảng 1g mẫu trắng đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống ly tâm nhựa 50 ml Mẫu trắng được tiến hành như mẫu thử Thực hiện tối thiểu 1 mẫu trắng trong một lô mẫu

- Đối với mẫu thử

Cân khoảng 1g mẫu thử đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống ly tâm nhựa 50 ml Mỗi mẫu thử lặp lại ít nhất 2 lần

- Đối với mẫu trắng thêm chuẩn ở nồng độ 100 µg/kg (mẫu kiểm soát)

Cân khoảng 1g mẫu trắng đã đồng nhất trên cân phân tích (± 0,0001 g) vào ống ly tâm 50 ml, hút chính xác 100µl dung dịch chuẩn 1000 µg/kg AO bằng micropipet cho vào ống.Lắc xoáy nhẹ để trộn đều dung dịch thêm chuẩn vào mẫu

- Chiết mẫu

Thêm chính xác 15 ml hỗn hợp dung dịch MeOH:H2O (tỉ lệ 90:10).Lắc xoáy khoảng 1 phút Sau đó lắc 30 phút trên máy lắc, ly tâm 5 phút, tốc độ 5000 rpm, nhiệt độ 4oC Lọc và lấy toàn bộ dịch chiết AO Hút chính xác 1,0 ml dịch chiết AO hòa vào 4 ml nước cất (Hỗn hợp dung dịch A)

2.3.2.2 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn

Pha dãy dung dịch chuẩn gồm 6 điểm nồng độ: 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 20 µg/kg trong dung môi MeOH

Tiến hành phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS

Trình tự bơm mẫu:

- Dung môi pha mẫu

- Dãy dung dịch chuẩn

- Mẫu trắng

- Mẫu mẫu kiểm soát

- Mẫu thử

-Mẫu dung dịch chuẩn kiểm soát

Sử dụng phần mềm MassLynx 4.1 để thu thập số liệu và xây dựng đường chuẩn

Tính toán kết quả

Hàm lượng AO (µg/kg) trong mẫu được tính theo công thức

𝐻𝐿 = 𝐶𝑚 𝑥 𝑉𝑥𝐹

𝑚Trong đó:

HL: hàm lượng AO trong mẫu phân tích (µg/kg)

Cm: nồng độ AO khi tiêm vào thiết bị (µg/kg ), được xác định theo đường chuẩn

V: thể tích dung dịch rửa giải (V= 4 ml)

F : hệ số pha loãng (F= 15/1=15)

m : khối lượng cân mẫu (g)

22

2.3.3 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm và xử lý kết quả

- Tiến hành khảo sát đơn biến, lựa chọn các điều kiện phù hợp để chiết tách

AO ra khỏi nền mẫu như: dung môi chiết, cột chiết pha rắn để làm sạch, dung môi rửa giải sau cột

- Sau khi đã lựa chọn được các điều kiện phù hợp, tiên hành khảo sát và đánh giá các thông số ảnh hưởng đến quá trình chiết bằng phương pháp mặt mục tiêu (RSM) sử dụng mô hình bậc hai tâm xoay với 20 thí nghiệm được tiến hành theo quy hoạch thực nghiệm, dùng phương pháp đạo hàm để tìm các điều kiện tối ưu để

xử lý mẫu

- Sử dùng phần mềm Minitab 16 và Microsoft Excel để tính toán xử lý số liệu

23

3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC-MS/MS

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ MS/MS

Nghiên cứu đã tiến hành khảo sát xác định Auramin O trên hệ thống MS bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử (ESI+) với chế độ bắn phá ion dương dưới dạng ion phân tử [M+H]+ Để tối ưu hóa điều kiện khối phổ, sử dụng hệ thống bơm tự động của thiết bị, bơm trực tiếp dung dịch chuẩn AO nồng độ 100µg/kg vào detector MS/MS Chọn chế độ khảo sát tự động IntelliStart được tích hợp trong hệ thống và kỹ thuật ghi phổ MRM để tối ưu hóa và lựa chọn ion mẹ và ion con để định lượng và định tính.Quan sát quá trình khảo sát tự động trên thiết bị (kết quả trung bình của 3 lần lặp lại), cho thấy thế mao quản Capillary, điện thế Cone Volt , năng lượng va chạm là những thông số ảnh hưởng lớn đến cường độ tín hiệu của các ion phân tích khi phân tích khối phổ và các mảnh ion con có cường độ tín hiệu khác nhau, mảnh ion con M/z có cường độ lớn nhất dùng để định lượng, mảnh con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để định tính chất phân tích

Các điều kiện tại nguồn ion hóa ESI đã được hệ thống UPLC-MS/MS Xevo

TQ MS tự động tối ưu hóa theo tốc độ dòng pha động, để đảm bảo độ nhạy của thiết

bị [49] Phần mềm IntelliStart sẽ tự động cài đặt các thông số khi chúng ta cài đặt tốc độ dòng vào thiết bị Điều kiện nguồn ESI+ tại tốc độ dòng 0,3 ml được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Điều kiện nguồn Ion hóa ESI +

Chế độ ion hóa/ Ionization ESI+(chế độ ion dương)/MRM

Nhiệt độ nguồn ion hóa 150oC

24

Các kết quả tối ưu hóa điều kiện phân tích trên MS/MS được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS

Chất phân

tích

Ion mẹ (M/z)

Ion con (M/z)

Mục đích Điện áp

mao quản (KV)

Thế phân mảnh (V)

Năng lượng va chạm (V)

Auramin O 268,24 147,05 Định

Auramin O 268,24 122,08 Định tính 0,5 44 24

Hình 3.1 Sắc đồ 3 mảnh ion con tại điều kiện tối ưu hóa trên MS/MS

Dựa vào tín hiệu píc trên hình 3.1 và hình 3.2, cho thấy mảnh ion con M/z=147,05 có tín hiệu độ nhạy cao nhất (6,26e7) nên được lựa chọn làm mảnh ion định lượng và mảnh ion con M/z=122,08 có tín hiệu thấp hơn được lựa chọn làm mảnh ion định tính

M/z=147,02

M/z=122,05

M/z=106,96

25

Cơ chế phân mảnh phổ khối lượng của AO được giả định như ở hình 3.2

Hình 3.2.Cơ chế phân mảnh phổ khối của AO

Nhận xét: Tại các điều kiện tối ưu ở bảng 3.1 của hệ thống MS/MS cho tín hiệu píc ổn định và độ nhạy, độ chọn lọc cao

3.1.2 Tối ƣu hóa các điều kiện phân tích trên hệ thống UPLC

3.1.2.1 Lựa chọn cột pha tĩnh

Nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp UPLC để thực hiện phép tách sắc ký, để khai thác các tính năng của thiết bị này nhằm tăng cường độ phân giải, phép phân tích chọn lọc hơn, cân bằng xảy ra nhanh hơn, rút ngắn thời gian phân tích cũng như đáp ứng được tính chất phân cực và cấu trúc phân tử của chất phân tích cần lựa chọn cột pha tĩnh phù hợp Dựa vào các tài liệu tham khảo [34], [35], [60] và tính chất hóa học củaAO là chất phân cực trung bình nghiên cứu

đã sử dụng cột pha tĩnh không phân cực C18(2,1x50 mm; 1,7µm) với hạt nhồi có đường kính nhỏ được chế tạo theo công nghệ polyethoxysilan, chịu được áp suất cao cũng như môi trường axit và bazơ tốt để tiến hành AO trên hệ thống UPLC

3.1.2.2 Thành phần pha động và chế độ gradient

Về nguyên lý, phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detector MS có đặc điểm giống các phương pháp LC sử dụng các detector khác Tuy nhiên, với detector MS,

26

pha động cần phải có thành phần phù hợp Đối với detector MS cùng với việc sử dụng kỹ thuật ion hóa tia điện ESI thì thành phần pha động không chứa các chất khó bay hơi như đệm phosphate, EDTA… và dung môi cần có sức căng bề mặt thấp để quá trình phun điện tích dễ dàng ion hóa chất phân tích và bay hơi dung môi diễn ra

dễ dàng hơn [13] Do vậy, nghiên cứu lựa chọn Acetonitril và nước cất kết hợp với

1 % axit formic để làm pha động

Để đảm bảo chất phân tích được tách hoàn toàn ra khỏi cột, góp phần tăng

độ nhạy của chất và độ ổn định của phương pháp, nghiên cứu đã thực hiện khảo sátthay đổi thành phần pha động ở hai chế độ là đẳng dòng và gradient Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 6 µg/kg để tiến hành phân tích tại các điều kiện trên HPLC: tốc độ dòng 0,3 ml/phút, cột pha tĩnh C18 (2,1x50 mm; 1,7µm) và điều kiện

đã tối ưu trên hệ thống MS/MS.Quá trình thay đổi các chế độ chạy đẳng dòng pha động được thực hiện tại hai tỷ lệ khác nhau được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Chương trình đẳng dòngpha động

Tên chương trình

Kênh A: axit fomic 0,1% trong ACN

Kênh B: axit fomic 0,1% trong nước

27

Kết quả ở sắc đồ hình 3.3 cho thấy khi phân tích trên UPLC với chương trình chạy đẳng dòng pha động thì pic ra quá sớm (thời gian lưu 0,37 phút) vì cột pha tĩnh ngắn (50 mm) nên AO được rửa giải nhanh ra khỏi cột, điều này còn làm cho píc bị chẻ, tín hiệu pic không ổn định và làm giảm độ nhạy của phương pháp

Nghiên cứu tiếp tục khảo sát tại điều kiện gradient pha động như bảng 3.4

Bảng 3.4 Chương trình gradient pha động

Tên chương

trình gradient

Thời gian (Phút)

Kênh A: axit fomic 0.1% trong ACN

Kênh B: axit fomic 0.1% trong nước

28

Kết quả khảo sát của ba chương trình gradient được thể hiện trên sắc đồ hình 3.4

Hình 3.4 Sắc đồ các chương trình 3,4,5chạy gradient

Sắc đồ hình 3.4 cho thấy tín hiệu pic của dung dịch chuẩn 6 µg/kg khi phân tích tại các chương trình 3; 4; 5 cân xứng, nhọn đẹp Độ nhạy của 3 píc tại 3 chương trình xấp xỉ bằng nhau điều này cho thấy tỉ lệ gradient thành phần pha động cho kết quả tương đối ổn định Việc thay đổi thời gian gradient chỉ làm thay đổi thời gian lưu của píc

Qua quá trình khảo sát chúng tôi lựa chọn chương trình gradient 5 cho diện tích píc cao nhất, píc cân xứng và thời gian lưu ra sớm hơn chương trình 3 và 4

29

cứu sử dụng cột pha tĩnh có kích thước hạt nhồi rất nhỏ 1,7 µm nên tốc độ dòng lựa chọn khoảng 0,1-0,3 ml/phút để đảm bảo áp suất của toàn hệ thống không quá cao (nhỏ hơn áp suất chịu đựng của hệ thống) và không thay đổi lớn trong suốt quá trình gradient

Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng phù hợp được thực hiện như sau: tiến hành phân tích dung dịch chuẩn 5 µg/kg trên hệ thống UPLC-MS/MS cố định các điều kiện như điều kiện MS/MS, cột pha tĩnh, thành phần pha động đã tối ưu và thay đổi tốc độ dòng tại các mức: 0,1; 0,2; 0,3 ml/phút Tiêm lặp lại 3 lần tại nồng độ 5 µg/kg ở mỗi tốc độ dòng tương ứng Kết quả thu được ở bảng 3.5:

Bảng 3.5 Diện tích pic khi thay đổi tốc độ dòng

Tốc độ dòng Thời gian lưu (phút) Diện tích pic trung bình

Hình 3.5 Sắc đồ tại tốc độ dòng 0,1 ml/phút