Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

LỜI CẢM ƠNĐề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu” là nội dung em chọn để nghiên cứu và l

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo: Chính quyNgành: Công nghệ Thực phẩm

Khóa học: 2016 - 2020

Thái Nguyên, năm 2020

LÊ MAI HƯƠNG

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG TÁCH CHIẾT TINH DẦU TỪ LÁ TRẦU KHÔNG VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH

KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CNSH - CNTP

2016 - 2020Người hướng dẫn: TS Lương Hùng Tiến

Thái Nguyên, năm 2020

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu

từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu” là nội dung

em chọn để nghiên cứu và làm khóa luận tốt nghiệp sau bốn năm theo học chương

trình đai học, chuyên ngành Công nghệ thực phẩm tại trường Đại học Nông lâmThái Nguyên

Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này, đầu tiên em xin chân thành gửilời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại họcNông lâm Thái Nguyên, cùng với quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Côngnghệ thực phẩm đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốtbốn năm học tập và rèn luyện tại trường

Sáu tháng thực tập là cơ hội cho em tổng hợp thêm và hệ thống hóa lại nhữngkiến thức đã học, đồng thời kết hợp với thực tế để nâng cao kiến thức chuyên môn.Qua quá trình thực tập này, từ những chỗ còn bở ngỡ cho đến thiếu kinh nghiệm, em

đã gặp phải rất nhiều khó khăn nhưng với sự giúp đỡ tận tình của thầy TS Lương Hùng Tiến đã giúp em có được những kinh nghiệm quý báu để hoàn thành tốt kì thực tập này cũng như viết lên bài báo cáo hoàn chỉnh nhất Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến giáo viên hướng dẫn em - thầy TS Lương Hùng Tiến, người đã

nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em thực hiện bài báo cáo này

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô ThS Phạm Thị Phương

đã tận tình giúp đỡ, định hướng cách tư duy và cách làm việc khoa học cho em

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã luôn động viên,giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình

Với việc hạn chế về kiến thức cũng như kinh nghiệm thực tiễn nên bài khóaluận không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được ý kiến đóng góp quýbáu của các Thầy Cô và các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 30 tháng 5 năm

2020

Sinh viên

E ictaruli

EAEC EHEC EIEC EPEC ETEC I

MH MIC MRSA PBS PPCĐ PPVS R

S

S aureus

TNF TSST

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không 4

Bảng 2.2 Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi 5

Bảng 2.3 Phân loại của Staphylococcus aureus 18

Bảng 2.4 Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng 22

Bảng 2.5 Phân loại Escherichia coli 26

Bảng 2.6 Phân loại Salmonella 31

Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng 35

Bảng 3.2 Danh mục hóa chất sử dụng 35

Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu 39

Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu từ lá Trầu không 40

Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42

Bảng 4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 44

Bảng 4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết dến hàm lượng tinh dầu 45 Bảng 4.4 Kết quả ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố chiết tinh dầu từ lá Trầu không 46

Bảng 4.5 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình chiết tinh dầu từ lá Trầu không 47

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của tinh dầu đến khả năng kháng khuẩn 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây Trầu không 4

Hình 2.2 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 19

Hình 2.3 Trực khuẩn Escherichia coli 27

Hình 2.4 Tụ cầu khuẩn Salmonella 32

Hình 4.1 Bề mặt đáp ứng hàm lượng tinh dầu lá Trầu không 48

Hình 4.2 Hàm kỳ vọng và điều kiện tối ưu của hàm lượng tinh dầu lá Trầu không 48 Hình 4.3 Kích thước vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng vi sinh vật thử nghiệm 50

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC VIẾT TẮT ii

DANH MỤC BẢNG iii

DANH MỤC HÌNH iv

MỤC LỤC v

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn dề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về Trầu không 4

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không 4

2.1.2 Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không 5

2.1.3 Một số nghiên cứu về trầu không 6

2.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật 10

2.2.1 Khái niệm và mục đích của chiết 10

2.2.2 Các phương pháp tách chiết 10

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 12

2.3.1 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược liệu 12

2.3.2 Những yếu tố thuộc về dung môi 14

2.3.3 Những yếu tố thuộc về kỹ thuật 15

2.4 Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm 17

2.4.1 Tổng quan về Staphylococus aureus (S aureus) 17

2.4.2 Tổng quan về Escherichia coli (E coli) 25

2.4.3 Tổng quan về Salmonella (Sal) 30

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU 35

3.1 Vật liệu nghiên cứu 35

3.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 36

3.3 Nội dung nghiên cứu 36

3.4 Phương pháp nghiên cứu 36

3.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu 36

3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III 36

3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 37

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 41

PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không 42

4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu 42

4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu .43

4.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu 45

4.1.4 Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không 46

4.2 Kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không 48

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn dề

Cây Trầu không có tên khoa học là Piper betle L thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae),

là một trong những loài thực vật nhiệt đới quan trọng ở khu vực châu Á, được trồngrộng rãi ở Ấn Độ, Sri Lanka, Malaysia, Thái Lan, … Tên thường gọi của nó là Trầu(tiếng Việt) Betle (tiếng Anh), Paan (tiếng Ấn Độ), Phlu (tiếng Thái) và Sirih (tiếngBahasa Indonesia) [33] Lá trầu được nghiên cứu cho thấy trong lá có chứa một số chất

dễ bay hơi [35], khoáng chất [30], glycosid [26], enzym, vitamin, các axit amin thiếtyếu [21] và tanin [34] Dịch chiết của lá Trầu không có các chất kháng khuẩn, khángviêm và chống ung thư [31] Các đặc tính chống oxy hóa và chống viêm của lá trầuđược cho là do các thành phần hóa học khác nhau có trong lá Lá trầu mà có hàm lượngphenol và flavonoid càng cao thì có hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư càng cao[36,32] Chống lở loét cũng là do hàm lượng flavonoid trong lá trầu cao Người ta đãthấy rằng khi chiết tách tinh dầu có trong lá Trầu có khả năng chữa lành vết loét dạ dày[35] Còn ở nước ta, trong y học cổ truyền Việt Nam, lá trầu được sử dụng cho nhiềumục đích khác nhau như nhai trầu để chắc răng, chữa viêm mủ chân răng, nước sắc látrầu để rửa hoặc đắp trị vết thương, bỏng, lở loét, mụn nhọt, chàm, lá trầu ngâm trongnước sôi dùng nhỏ mắt để chữa bệnh viêm kết mạc [10] Ở Việt Nam PGS.TS.Nguyễn Quang Linh cùng các cộng sự ở Khoa Thủy sản – Đại học Nông Lâm Huế chếtạo ra hợp chất Bokashi Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các

vi sinh vật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là Eugenol, Chavicol,Estradiol, Cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm

Lactobacillus Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi

sinh vật có lợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môitrường, không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản; khi ao nuôi tôm được bổ sungchế phẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được

bổ sung Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng độ

7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn: Vibrio, Aeromonas, E coli,

Coliform, Staphylococcus Còn ở nồng độ 5.000 ppm đến 10.000 ppm có khả năng

ức chế các nấm: Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng: Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium Còn kết quả nghiên cứu của

các nhà khoa học Trường đại học Cần Thơ cho thấy, tinh dầu lá Trầu không biểu

hiện hoạt tính kháng vi sinh vật tốt Nó có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương như Bacillus subtillis và các loại nấm gây hại như Aspergillus niger và Fusarium oxysporum Kết quả này cho thấy tiềm năng kháng khuẩn và kháng nấm của tinh dầu lá Trầu không có thể ứng dụng được vào thực tế.

Qua các nghiên cứu cho ta thấy khả năng kháng vi sinh vật của tinh dầu láTrầu nhằm đóng góp cơ sở khoa học cho tác dụng điều trị các bệnh do nhiễm khuẩn

và nấm của tinh dầu Trầu không, đồng thời tinh dầu Trầu không có giá trị kinh tếcao, là mặt hàng hiện đang có nhu cầu lớn trên thị trường vì được sử dụng rất nhiềutrong mỹ phẩm, trong y học và cả ngành nông nghiệp Đồng thời bước đầu được sửdụng trong thủy hải sản

Xuất phát từ thực trạng trên em tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu”.

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không.

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu

-Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng tinh dầu

- Tối ưu hóa quá trình tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Đề tài động viên khích lệ sinh viên tham gia công tác nghiên cứu khoa học

- Giúp sinh viên có cơ hội tiếp cận với các thao tác kỹ thuật trong thực tế, củng

cố các kiến thức đã học

- Bổ sung kiến thức thông qua hoạt động nghiên cứu thực tiễn, trau dồi kiếnthức bản thân, tích lũy kinh nghiệm thực tế, đồng thời tiếp cận công tác nghiên cứukhoa học phục vụ cho công việc nghiên cứu và công tác sau này

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học vào nghiên cứu khoa học

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Là cơ sở cho các thử nghiệm sử dụng các hoạt chất có tính kháng khuẩn sửdụng trong y học, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sửdụng của lá Trầu không

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về Trầu không

2.1.1 Phân loại và đặc điểm thực vật học của trầu không

Vị trí phân loại thực vật [10]: Trầu không còn có tên gọi khác là cây trầu, trầucay, trầu thược tương, trầu mòlu (Campuchia)

Bảng 2.1 Vị trí phân loại thực vật của lá trầu không [10]

Hình 2.1 Cây Trầu không

Đặc điểm thực vật học: Trầu không là một cây mọc leo, thân nhẵn Lá mọc so

le, cuống có bẹ, dài 1,5 - 3,5cm, phiến lá hình trái xoan, dài 10 - 13cm, rộng4,59cm, phía cuống hình tim (đối với những lá phía gốc) đầu lá nhọn, khi soi lênthấy rất nhiều điểm chứa tinh dầu rất nhỏ, gân lá thường có năm gân Hoa khác gốcmọc thành bông có cuống dài bằng cuống lá, mọc đối diện với lá, hoa đơn tính.Bông đực dài bằng phiến lá, trục bông phủ lông, lá bắc không cuống, không cólông, hình tròn hoặc hình trứng ngược Nhị hoa, bao phấn hình bầu dục, chỉ nhịngắn Bông cái ngắn hơn, trục phủ lông [4] Quả mọng, lồi, tròn, có những lôngmềm ở đỉnh Toàn cây có mùi thơm cay

Phân bố và thu hái: Cây Trầu được trồng khắp nơi ở nước ta để lấy lá, ăn trầu.Chúng còn được trồng nhiều ở các nước Châu Á, vùng nhiệt đới như Indonexia,Philipin [10] Ở Việt Nam có 2 loại trầu chính là trầu mỡ và trầu quế Lá trầu mỡ to

bản, dễ trồng Trầu quế có vị cay, nhỏ lá, được ưa chuộng hơn trong tục ăn trầu.Trầu không được trồng bằng dây vào mùa xuân, người ta làm giàn cho cây leo lên.Cây trồng không ưa ẩm và Ca(OH)2, nên người ta thường trồng sát tường, cạnh bểnước để thuận tiện cho việc tưới và bón thêm vôi cũ Lá được hái thu hái quanhnăm, dùng tươi hay phơi khô, có khi tán bột dùng dần [3].

2.1.2 Thành phần hóa học và công dụng của lá trầu không

Theo phân tích, cứ 100g lá Trầu không thì có đến 85,4% độ ẩm, 3,1% protein,0,8% chất béo, 2,3% muối khoáng, 2,3% chất xơ và 6,1% carbohydrat Hàm lượngkhoáng chất và vitamin chủ yếu là canxi, carotene, thiamin, riboflavin, niacin vàvitamin C [3] Trong lá trầu không có 0,8 - 1,8%, có khi đến 2,4% tinh dầu, tỷ trọng0,958 thơm mùi creozot (củi đốt), vị nóng [3] Theo Phạm Thế Chính và cs [5] tinhdầu lá trầu có chứa các hợp chất như là eugenol, eugeny acetat, chavicol vàdiacetoxylbenzen, các hợp chất này đều là dẫn xuất của phenol, có nhiệt độ sôi cao,

tỷ trọng và chiết suất cao

Bảng 2.2 Thành phần các chất chứa trong lá trầu tươi [3]

viêm nhiễm… [3] Các hợp chất polyphenol trong lá trầu có khả năng chống oxi hóacao, ức chế một số nguyên nhân gây bệnh loét dạ dày Nước pha lá trầu không cònđược dùng làm thuốc nhỏ mắt chữa viêm kết mạc, chữa bệnh chàm mặt của trẻ em.

Có nơi còn giã lá trầu không đắp lên ngực để chữa ho và hen, hoặc đắp lên vú đểchữa bệnh tắc sữa [3] Trầu không còn có tác dụng kháng sinh rất mạnh đối với các

vi trùng: tụ cầu, Subtilit và trực trùng E coli [18].

Một số bài thuốc dân gian từ Trầu không [4]

Bài thuốc chữa đau họng: Khi đau họng, dùng trầu không sẽ rất có công hiệu.Lấy lá trầu không và ít hoa quả xay nhuyễn lấy nước trộn thêm mật ong rồi ngậmthật lâu, nếu uống được thì càng tốt, sẽ giảm các kích thích gây ho

Bỏng nước sôi: Lá trầu hơ nhẹ để lá mềm ra rồi phết một lớp thầu dầu rồi đặtnhẹ lên vết bỏng Cứ sau vài giờ lại thay một lá trầu mới Sau vài lần, dịch trong vếtbỏng sẽ tiêu hết, chỗ rộp không mọng nước, không gây mủ Nên dùng vào ban đêm

và vứt đi vào sáng sớm

Chữa đau mắt đỏ (viêm kết mạc): Lấy ba lá trầu không, năm đến mười lá dâu

vò nát, cho vào ca, đổ ngập nước sôi để xông hơi con mắt đau Xông mỗi lần 5 - 10phút, ngày 2 lần Thuốc giúp chóng hết viêm, mắt dịu

Rửa vết thương, vết bỏng bị nhiễm khuẩn: Lá trầu không và phèn đen mỗi thứ20g vò nát hoặc giã nát, đổ 1,5lít nước, sắc lấy 1lít, rửa tại chỗ ngày 1lần

Ngoài ra Trầu không còn có tác dụng tăng sinh lực, làm sạch răng và làm ngọt miệng.

2.1.3 Một số nghiên cứu về trầu không

2.1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Dưới tên gọi Bokashi Trầu, chế phẩm sinh học chiết xuất từ lá Trầu không củaTrung tâm ươm tạo và chuyển giao công nghệ - Đại học Huế đã được Hội sở hữu trí tuệViệt Nam trao giấy chứng nhận sản phẩm tin cậy PGS.TS Nguyễn Quang Linh, chủnhiệm đề tài cho biết, lá trầu sau thu hái được làm sạch, làm khô nước và xay nhuyễn,

ly tâm lấy được dịch chiết xuất lá Trầu Cho dịch chiết lá Trầu lên men với các vi sinhvật có lợi, chế phẩm tạo nên có thành phần chủ yếu là eugenol, chavicol, estradiol,

cadinen, các hợp chất phenol và các vi sinh vật chủ yếu nhóm lactobacillus.

Chế phẩm vừa có khả năng kháng khuẩn và có khả năng tăng cường vi sinh vật cólợi trong đường tiêu hóa của động vật thủy sản; không gây ô nhiễm môi trường,không gây tồn dư trong cơ thể động vật thủy sản Khi ao nuôi tôm được bổ sung chếphẩm, tôm sẽ khỏe và có vỏ kitin cứng hơn, màu sáng hơn so với tôm không được

bổ sung Bokashi trầu ở nồng độ 4,5 ppm có khả năng ức chế hoạt động và ở nồng

độ 7,5 ppm có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn Vibrio, Aeromonas, E coli, Coliform, Staphylococcus Bokashi trầu ở nồng độ 5.000 đến 10.000 ppm có khả năng ức chế các nấm Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces và các ký sinh trùng Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Gregarine Với nồng độ 100.000 ppm, Bokashi trầu có khả năng ức chế nấm Lagenium và Fusarium.

Phạm Thị Thắm và cộng sự đã phân lập các hợp chất trong thân cây Trầukhông, kết quả thu được cho thấy các lớp chất trong thân cây Trầu không đã đượcphân lập lớp thành 3 chất có độ phân cực khác nhau nhờ sử dụng dung môi chiếttheo độ phân cực tăng dần Lớp chất kém phân cực được phân bố vào dung môichiết n-hexan (cặn chiết H), lớp chất có độ phân cực trung bình được phân bố vàodung môi diclometan (cặn chiết D), cặn chiết có độ phân cực cao được phân bốtrong dung môi etyl acetat (cặn chiết E) Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định củacác cặn chiết H, D, E đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy hai cặn chiết D và E cóhoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Nguyễn Chí Thiện và cộng sự đã khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng

vi sinh vật của tinh dầu lá Trầu không (Piper betel L.), họ hồ tiêu (Piperaceae) Tinh

dầu lá trầu không được ly trích thành công bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước đạt hiệu suất 0,63% Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ

(GC-MS), thành phần hóa học chính trong tinh dầu lá Trầu không được xác định làhợp chất 4-Allyl-1,2diacetoxybenzene với hàm lượng 34,55% Hoạt tính kháng visinh vật của tinh dầu được đánh giá bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ để xácđịnh nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)

Phạm Thế Chính với bài báo “Thành phần hóa học của tinh dầu lá Trầu (Piper betle L.) trồng tại Hải Dương” Trong thí nghiệm sử dụng phương pháp chưng cất lôi

cuốn hơi nước đặc biệt có hiệu ứng muối kết hợp với đun hồi lưu, đã tách thànhcông tinh dầu lá trầu được trồng tại Hải Dương với hiệu suất đạt 1,01% Tinh lá trầutách được có tỷ trọng cao là 0,963 và chiết suất lớn là 1,5362 Bằng phương phápsắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS), họ đã khẳng định tinh dầu lá trầu trồng tạiHải Dương có thành phần hóa học chính là eugenol, với hàm lượng lên tới 77,24%.

Từ tinh dầu này họ đã sử dụng phương pháp sắc ký cột thường nhồi bằng silica geltheo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/etyl axetat, 10/1…;

đã phân lập được eugenol tinh khiết và đã khẳng định được cấu trúc của nó bằng cácphương pháp phổ hiện đại IR, MS, 1H&13C-NMR

2.1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Theo nghiên cứu “Steam and Water Distillation of Piper Betle, OcimumBasilicum, Cymbopogon Winterianus, and Citrus Hystrix Leaves for Activity of InsectRepellent against Mosquito” của tác giả Engrid Juni Astuti cho thấy lá trầu, lá húngquế, lá sả đỏ có chứa tinh dầu có khả năng có hoạt tính đuổi muỗi thay thế một số chất

có hoạt tính đuổi muỗi như DEET Mục tiêu của đề tài: Để có được loại đuổi muỗi tựnhiên từ tinh dầu Phương pháp: Chưng cất hơi nước để thu được tinh dầu, GC-MS đểbiết hàm lượng hóa học của nó Thử nghiệm hoạt tính dễ bay hơi của tinh dầu đối với

côn trùng trong các nồng độ khác nhau để chống muỗi vằn (Aedes aegypti) sử dụng với

đối tượng là chuột trong 6 giờ Kết quả: Chưng cất hơi nước và nước thu được dầu với0,56% v / b (lá trầu), 0,33% v / b (lá húng quế), 1,7025% (lá sả đỏ) và 0,693% (láchanh) Trong của tinh dầu của lá trầu GC-MS Piper chứa các hợp chất 4-Allylphenylacetate (19,284%) và C10H12O2 (Trans-isoeugenol) (18,485%), tinh dầu của lá húng quếchứa hợp chất z-citral (54,201%), tinh dầu lá sả đỏ chứa các hợp chất C10H18O(Citronellal) (35,843%) và tinh dầu của lá chanh chứa C10H18O Citronellal (66,550%).Kết quả của thí nghiệm này cho thấy rằng sự kết hợp giữa tinh dầu lá Trầu không vàtinh dầu lá Húng quế có hoạt tính đuổi côn trùng không khác với DEET 13%, ngoại trừnồng độ thấp hơn 50:50 Trong khi sự kết hợp của tinh dầu lá Sả đỏ và tinh dầu láchanh cho thấy có sự khác biệt về bảo vệ giữa các nhóm điều trị và có sự khác biệt vềbảo vệ ở khoảng thời gian thử nghiệm vì giá trị p <0,05 Kết luận: Sự

kết hợp của 2 lá: lá Trầu không và lá Húng quế hoặc lá Sả đỏ và lá chanh có khảnăng như một loại thuốc chống côn trùng tự nhiên thay thế DEET [23]

Trong nghiên cứu này, tinh dầu được chiết tách từ 7 loại lá trầu khác nhau tại cáctỉnh địa phương khác nhau (Bangla, Bagerhati, Manikdanga, Meetha, Kalibangla,Chhaanchi và Ghanagete) với mục đích cho thấy các loại giống khác nhau thì có cácthành phần hóa học và có tính chất ức chế enzyme của các loại là khác nhau Các loạitinh dầu này ức chế glucuronidase, liên quan đến bài tiết xenobamel, và cho thấy cácđặc tính gây độc tế bào Nghiên cứu cho thấy khả năng ứng dụng tiềm năng của tinh

dầu lá Trầu không (Piper betle L.) trong lĩnh vực y tế và mỹ phẩm [35]

Ảnh hưởng của các loại dung môi khác nhau tới các đặc tính chống oxy hóa và

chống viêm của việc chiết tách lá Trầu không (Piper betle L.) đã được nghiên cứu Các

dung môi được sử dụng là nước, ethanol, ethyl acetate và hexane Sắc ký lỏng hiệunăng cao (HPLC) đã được sử dụng để xác định cấu hình hóa học và nồng độ của cáchợp chất có trong lá trầu không, cụ thể là hydroxychavicol (HC) và eugenol (EU) Khảnăng chống oxy hóa của các chất có trong lá Trầu không được đánh giá bằng cách sửdụng hai xét nghiệm quét gốc superoxide-xanthine / xanthine oxyase superoxide (xétnghiệm SOD) và xét nghiệm diệt gốc tự do 1,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Cácxét nghiệm chống viêm được sử dụng là các xét nghiệm ức chế hyaluronidase (HYA),xanthine oxyase (XOD) và lipoxygenase (LOX) Kết quả HPLC cho thấy HC và EUđược phát hiện trong tất cả các loại dung môi chiết nhưng nồng độ cao nhất là trongnước Năng suất chiết cao nhất thu được bằng cách sử dụng nước Tất cả các dung dịchchiết đều có khả năng chống oxy hóa cao nhưng với việc chiết bằng nước cho thấy sự

ức chế là mạnh nhất Các chất có trong dịch chiết cũng thể hiện sự ức chế đáng kể trongcác xét nghiệm XOD và LOX Kết quả chỉ ra rằng hoạt tính sinh học của dung dịchchiết có liên quan đến HC và EU [36]

2.2 Một số phương pháp tách chiết các chất từ thực vật: [16]

2.2.1 Khái niệm và mục đích của chiết

Khái niệm: Là quá trình tách và phân ly một hoặc một số chất ra khỏi nguyênliệu dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng với một pha lỏngkhông hòa tan với nó

Mục đích của chiết: là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thểtích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độcủa các chất nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra còn dùng phươngpháp chiết pha rắn để tách các hợp chất trong hỗn hợp phức tạp với điều kiện thíchhợp Thường dùng trong phân tách các hợp chất tự nhiên

2.2.2 Các phương pháp tách chiết

Tách chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước:

Nguyên tắc: Dựa trên nguyên lý của quá trình chưng cất một hỗn hợp khôngtan lẫn vào nhau là nước và tinh dầu Khi hỗn hợp này được gia nhiệt hai chất đềubay hơi Nếu áp suất của hơi nước cộng với áp suất của tinh dầu bằng áp suất củamôi trường thì hỗn hợp sôi và tinh dầu được lấy ra cùng với hơi nước

Ưu điểm: Thiết bị gọn gàng, dễ chế tạo, quy trình sản xuất đơn giản Trongquá trình chưng cất có thể phân chia các cấu tử bằng cách ngưng tụ từng phần theothời gian Thời gian tương đối nhanh, nếu chưng cất gián tiếp thì mất khoảng 6 - 10giờ, nếu thực hiện liên tục thì mất 30 phút đến 1 giờ Có thể tiến hành chưng cất vớicác cấu tử chịu được nhiệt độ cao

Nhược điểm: Không áp dụng phương pháp này với những nguyên liệu có hàmlượng tinh dầu thấp vì thời gian chưng cất kéo dài, tốn rất nhiều hơi và nước ngưng

tụ Tinh dầu thu được có thể bị giảm chất lượng nếu có chứa các cấu tử bị thủyphân Không có khả năng tách các thành phần khó bay hơi trong các thành phần củanguyên liệu Hàm lượng tinh dầu còn lại trong nước chưng tương đối lớn

Tách chiết bằng dung môi:

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên nguyên tắc sử dụng dung môi thích hợp

để hòa tan những cấu tử mang hương trong nguyên liệu đã được xử lý thành dạng

thích hợp ở nhiệt độ phòng Dung môi chiết sẽ ngấm qua thành tế bào của nguyênliệu, các hợp chất trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, sau đó sẽ xuất hiện quátrình thẩm thấu giữa dịch chiết bên trong dung môi với bên ngoài dung môi dochênh lệch nồng độ Sau khi chiết phải thực hiện quá trình tách dung môi ở áp suấtthấp để thu tinh dầu.

Yêu cầu của dung môi chiết: Có nhiệt độ sôi thấp, nhưng không quá thấp đểhạn chế tổn thất dung môi và thuận lợi trong việc ngưng tụ hơi dung môi Khôngtương tác hóa học với tinh dầu Có khả năng thu hồi tái sử dụng Độ nhớt thấp đểkhông làm giảm tốc độ khuếch tán Có khả năng hòa tan tinh dầu lớn, nhưng hòa tanhợp chất không được hòa tan nước để tránh làm loãng dung môi và hạn chế khảnăng hòa tan tinh dầu của dung môi Dung môi phải tinh khiết, không được ăn mònthiết bị, không gây mùi lạ đối với tinh dầu và ít độc hại với con người Khi bay hơidung môi không để lại cặn vì cặn còn lại từ dung môi có thể ảnh hưởng xấu hoặcphá hủy mùi thơm của tinh dầu Dung môi rẻ tiền, dễ kiếm

Tách chiết bằng soxlet: Đây là phương pháp chiết nóng bằng cách đun hồi lưu

dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra Dùng thiết bị này để chiết nhiều lần

liên tục và tiết kiệm dung môi Các dung môi thường dùng là n-hexan (C6H14),diclometan (CH2Cl2), etanol (C2H5OH)

Chiết ngâm: Là phương pháp ngâm dược liệu với một loại dung môi với vài

ba lần lắc hoặc khuấy ở nhiệt độ phòng Gồm: phương pháp ngâm một lần, ngâm

nhiều lần và ngâm nóng Đây là phương pháp phổ biển trong các phương pháp táchchiết thực vật vì đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền

Phương pháp ngấm kiệt: Chiết xuất ngấm kiệt được tiến hành bằng cách

thường xuyên tách các chất chiết ra khỏi nguyên liệu Phương pháp này thườngxuyên dùng dung môi sạch nên có nhược điểm là mất nhiều thời gian

Chiết siêu âm: Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng khả năng chiết xuất Chiết siêu

âm là phương pháp chiết sử dụng sóng với tần số 20000Hz Dùng siêu âm có thể rútngắn thời gian chiết nhờ tác dụng của siêu âm, làm tăng diện tích giữa hai pha

bằng cách phân tán chúng ra thành những hạt nhỏ, phá vỡ các màng tế bào, tăngcường sự xáo trộn của hỗn hợp.

Chiết xuất ngược dòng: Nguyên tắc của chiết xuất ngược dòng là hướng di

chuyển của dung môi ngược dòng với hướng di chuyển của nguyên liệu, bản chất làphương pháp chiết xuất nhiều lần được cải tiến để tận dụng khả năng hòa tan củadung môi Nguyên liệu lần lượt được chiết bằng những dịch chiết có nồng độ hoạtchất giảm dần, nguyên liệu kiệt nhất sẽ được chiết xuất bằng dung môi mới và dùnglàm dung môi chiết cho các bình tiếp theo

Chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn: Thay vì sử dụng các loại dung môi

hữu cơ chúng ta có thể sử dụng CO2 ở trạng thái siêu tới hạn (31,10C, 73 atm), nước

ởtrạng thái siêu tới hạn (3740C, 218 atm) hay chất lỏng ở dạng ion tại nhiệt độ phòng,

hệ hai pha, hệ thống không có dung môi sử dụng bề mặt bên trong của đất sét, zeolit,silic oxit và nhôm Sử dụng phương pháp chiết này cho phép thu được sản phẩm có

độ tinh khiết, có màu sắc và hương vị hoàn toàn giống với tự nhiên, không bị biếnđổi như trong các phương pháp chiết khác

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: [16]

2.3.1 Những yếu tố thuộc về thành phần, cấu tạo của dược

liệu Màng tế bào dược liệu

Màng tế bào dược liệu có ảnh hưởng nhiều đến quá trình khuếch tán

Đối với thực vật còn non hay mỏng mềm như cỏ cây, hoa lá, thành phần củamàng tế bào chủ yếu là cellulose Cellulose có tính chất không tan trong nước vàkhông tan trong các dung môi khác, bền vững ở nhiệt độ cao, có tính mềm dẻo đànhồi Đối với dược liệu loại này, dung môi dễ thấm vào dược liệu, do đó chỉ cần xaythô dược liệu Nếu xay mịn, dễ kéo theo nhiều tạp vào dịch chiết

Đối với dược liệu đã già, rắn chắc như hạt, gỗ, rễ, vỏ thân thì màng tế bào cóthể bị hóa bần, hoá cutin, hoặc có thể bị phủ thêm một lớp sáp đó là những chất cóbản chất lipid, có tính chất không thấm nước và khí, do đó dung môi khó thấm vàodược liệu Một số loài thực vật khi già màng tế bào có thể bị hoá gỗ, hoá khoáng, bịphủ thêm lớp dioxyt silic hoặc canxi carbonat, màng tế bào trở nên dày, rắn chắc, nên

dung môi khó thấm vào dược liệu hoặc màng tế bào có thể bị phủ thêm lớp chấtnhầy Chất nhầy tan được trong nước, nhưng khi hút nước nó bị trương nở và trởnên nhớt, làm bít kín các ống mao quản trên màng tế bào, gây cản trở sự thấm củadung môi, cản trở quá trình khuếch tán Do đó với những dược liệu đã già, rắn chắc,nên xay nhỏ dược liệu, tạo điều kiện cho dung môi dễ thấm ướt dược liệu, chất tan

dễ khuếch tán vào dung môi

Chất nguyên sinh

Chất nguyên sinh có thành phần hoá học rất phức tạp và không ổn định Chấtnguyên sinh có tính nhớt, tính đàn hồi, không tan trong nước, không màu và khôngbền đối với nhiệt ở nhiệt độ 50 - 600C, chúng bị mất hoạt tính sinh học (trừ trườnghợp ở những hạt khô, quả khô, chất nguyên sinh có thể chịu được tới 80 - 1050C)

Có thể nói chất nguyên sinh là một môi trường dị thể phức tạp, có thể coi đó là một

hệ keo nhiều pha, tạo thành từ những hợp chất cao phân tử, phân tán trong môitrường nước (ví dụ: giọt dầu, giọt mỡ, hạt tinh bột, hạt tinh thể ) Chất nguyên sinh

có tính chất bán thấm, có nghĩa là chỉ thấm đối với dung môi mà không cho chất tan

đi qua Do đó để chiết được các chất tan trong tế bào, người ta phải tìm cách pháhuỷ chất nguyên sinh bằng cách làm đông vón chúng bằng nhiệt (sấy hoặc phơikhô) hoặc bằng cồn (hơi hoặc cồn nóng)

Một số tạp chất có thể có trong dược liệu

Đó là sản phẩm của các quá trình trao đổi chất, là chất dự trữ hoặc chất thảicủa cây Các chất này thường gây cản trở hoặc cũng có khi có tác dụng thuận lợicho quá trình chiết xuất Dưới đây là một số ví dụ:

Đối với những dược liệu chứa nhiều pectin, gôm hoặc chất nhầy: Đó là nhữngchất tan được trong nước, và khi tan trong nước thì bị trương nở, tạo dung dịch keo,làm tăng độ nhớt, gây cản trở cho quá trình chiết xuất Có thể loại các chất này bằngcách cho kết tủa trong cồn cao độ

Đối với những dược liệu chứa nhiều tinh bột: Tinh bột có tính chất không tantrong nước lạnh, nhưng ở nhiệt độ cao tinh bột bị hồ hoá, làm tăng độ nhớt của dungdịch, gây cản trở cho quá trình chiết xuất Do đó đối với những dược liệu loại này,

không nên xay dược liệu quá mịn, tránh giải phóng ra nhiều tinh bột và không nênchiết ở nhiệt độ cao để tránh bị hồ hoá.

Đối với những dược liệu chứa chất béo, dầu mỡ, tinh dầu, sáp, nhựa: Đó lànhững chất không tan trong nước và thường tan trong các dung môi không phâncực Nếu dùng dung môi chiết là nước, các chất này sẽ làm dung môi khó thấm vàodược liệu, gây cản trở quá trình chiết xuất, do đó cần phải loại chúng đi bằng cácdung môi thích hợp trước khi chiết Nếu dùng dung môi không phân cực để chiết,dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, những tạp này sẽ bị loại đi trong giai đoạn tinh chế.Đối với những dược liệu chứa enzym: Enzym có bản chất là protein, ở nhiệt

độ 60 - 700C enzyme bị mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ lạnh enzym chỉ bị ngừng hoạtđộng, sau đó nếu nâng đến nhiệt độ thích hợp thì enzym lại được phục hồi Tuỳ từngtrường hợp cụ thể mà enzym có thể gây cản trở hoặc cũng có khi lại tạo điều kiệnthuận lợi cho quá trình chiết xuất

Có ba phương pháp để diệt enzym:

Phương pháp nhiệt ướt: nhúng dược liệu vào lỏng sôi (nước sôi hoặc cồn sôi)

Phương pháp nhiệt ẩm: cho dược liệu qua hơi ẩm (hơi nước sôi hay hơi cồn sôi)

Phương pháp nhiệt khô: cho dược liệu qua luồng không khí nóng

2.3.2 Những yếu tố thuộc về dung môi

Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là: độ phâncực, độ nhớt, sức căng bề mặt

Độ phân cực của dung môi

Nói chung dung môi ít phân cực thì dễ hoà tan các chất không phân cực và khóhoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực Ngược lại, dung môi phân cực mạnh thì

dễ hoà tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hoà tan các chất ít phân cực.Dựa vào độ phân cực của dung môi người ta phân loại như sau:

Dung môi không phân cực: ether dầu hoả, xăng, hexan, heptan, benzen, toluen…

Dung môi phân cực yếu và vừa: chloroform, diclorethan, aceton, ethylacetat

Dung môi phân cực mạnh: nước, glycerin, các loại cồn có mạch cacbon ngắn

(methanol, ethanol, isopropanol ).

Độ nhớt, sức căng bề mặt của dung môi

Nói chung, dung môi có độ nhớt càng thấp hoặc có sức căng bề mặt càng nhỏthì dung môi càng dễ thấm vào dược liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiếtxuất còn nếu dung môi có độ nhớt càng cao hoặc có sức căng bề mặt càng lớn thìdung môi khó thấm vào dược liệu, làm cho quá trinh chiết xuất gặp khó khăn

2.3.3 Những yếu tố thuộc về kỹ thuật

Đó là những yếu tố có thể thay đổi được bằng các biện pháp kỹ thuật khácnhau, nhằm tạo ra những điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất

Đó có thể là những yếu tố: nhiệt độ, thời gian, độ mịn của dược liệu, khuấy trộn,

siêu âm

Nhiệt độ chiết xuất

Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Einstein, khi nhiệt độ tăng thì hệ sốkhuếch tán cũng tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tănglên Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điềukiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợicho quá trình chiết xuất trong một số trường hợp sau:

Đối với những hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá

huỷ một số hoạt chất như vitamin, glycosit, alcaloit

Đối với tạp: khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của hoạt chất tăng mà độ tancủa tạp cũng đồng thời tăng theo, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một

số tạp như gôm, chất nhầy khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở; tinh bột bị hồ hoá,

độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế.Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dungmôi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi.Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hoà tan toả nhiệt: khi nhiệt độ tăng,

độ tan của chúng lại bị giảm Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên ta thấy tuỳ từng trường hợp cụ thể mà cần lựa chọnnhiệt độ sao cho phù hợp (tuỳ thuộc vào các yếu tố như dược liệu, dung môi,phương pháp chiết xuất )

Thời gian chiết xuất

Khi bắt đầu chiết, các chất có phân tử lượng nhỏ (thường là hoạt chất) sẽ đượchoà tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tửlượng lớn (thường là tạp chất như nhựa, keo ) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽkhông chiết được hết hoạt chất trong dược liệu; nhưng nếu thời gian chiết dài quá,dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Tómlại, cần phải lựa chọn thời gian chiết xuất sao cho phù hợp với thành phần dược liệu,

dung môi, phương pháp chiết xuất

Độ mịn của dược liệu

Khi kích thước dược liệu thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt dược liệu, hoạtchất khó được chiết vào dung môi Khi độ mịn dược liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúcgiữa dược liệu và dung môi tăng lên; theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vàodung môi tăng lên, do đó thời gian chiết xuất sẽ nhanh hơn

Tuy nhiên trong thực tế, nếu xay dược liệu quá mịn sẽ gây ra một số bất lợicho quá trình chiết xuất như sau:

Khi ngâm dược liệu vào dung môi, bột dược liệu bị dính bết vào nhau, tạothành dạng bột nhão, vón cục Do đó sẽ khó khuấy trộn giữa dược liệu và dung môi,quá trình chiết xuất xảy ra bị chậm lại Mặt khác, vì bột dược liệu bị dính bết vàonhau nên khi rút dịch chiết, dịch chiết bị chảy chậm hoặc không chảy được (gọi làhiện tượng tắc thiết bị)

Khi bột dược liệu quá mịn, nhiều tế bào thực vật bị phá huỷ, dịch chiết bị lẫnnhiều tạp; gây khó khăn cho quá trình tinh chế, bảo quản

Từ những phân tích trên ta thấy cần phải lựa chọn độ mịn của dược liệu saocho thích hợp, tuỳ thuộc vào từng trường hợp hợp cụ thể, tuỳ thuộc vào dược liệu,

dung môi, phương pháp chiết xuất

Khuấy trộn

Khi dung môi tiếp xúc với dược liệu, dung môi sẽ thấm vào dược liệu, hoà tanchất tan, chất tan sẽ khuếch tán từ dược liệu vào dung môi qua màng tế bào Sau mộtthời gian khuếch tán, nồng độ chất tan trong tế bào giảm dần, nồng độ chất tan tronglớp dung môi tăng dần, chênh lệch nồng độ giữa trong và ngoài tế bào giảm dần, tốc

độ quá trình khuếch tán cũng giảm dần, đến một lúc nào đó sẽ xảy ra quá trình cânbằng động giữa hai pha Như vậy, nếu không có khuấy trộn, quá trình khuếch tán sẽxảy ra rất chậm Theo định luật Fick, chênh lệch nồng độ giữa hai pha là động lựccủa quá trình khuếch tán.

Do đó muốn tăng cường quá trình khuếch tán, cần phải tạo ra chênh lệch nồng

độ bằng cách di chuyển lớp dịch chiết ở phía sát màng tế bào (nơi có nồng độ caohơn) ra phía xa hơn và di chuyển lớp dung môi ở phía xa (nơi có nồng độ thấp hơn)đến sát màng tế bào Điều này được thực hiện bằng cách khuấy trộn Như vậy bằngcách khuấy trộn, người ta đã tăng cường được tốc độ khuếch tán

Tuỳ từng trường hợp cụ thể mà người ta chọn loại cấu tạo cánh khuấy và tốc

độ khuấy sao cho phù hợp

Siêu âm

Năng lượng của siêu âm có tác dụng làm tăng mạnh tính thẩm thấu và khuếchtán nhờ những tác dụng của siêu âm như sau: Làm tăng diện tích tiếp xúc giữa haipha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ Phá vỡ một phần màng tế bào.Tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp Có tác dụng làm nóng tại chỗ

Phương pháp siêu âm có nhiều ưu điểm làm tăng cường quá trình chiết xuất.Tuy nhiên, phương pháp này mới chỉ được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm màchưa được áp dụng trong sản xuất

Ngoài những yếu tố kể trên, còn nhiều yếu tố khác cũng gây ảnh hưởng đếnquá trình chiết xuất Ví dụ: áp suất, pH môi trường, chấn động cơ học, dòng điệncao áp …

2.4 Giới thiệu chung về các vi sinh vật thử nghiệm

2.4.1 Tổng quan về Staphylococus aureus (S aureus)

2.4.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Staphylococus aureus (S aureus) do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào

năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) nghiên cứu tụ cầukhuẩn từ thời kì đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học [1]

Ngày 9 tháng 4 năm 1880, bác sĩ người Scotland Alexander Ogston đã trình bàytại hội nghị lần thứ 9 của Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó ông sử

dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (S aureus), trình bày tương đối đầy đủ vai trò của vi

khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ trong lâm sàng

Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi

khuẩn này Ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là S aureus Năm 1926 Julius von

Daranyi là người đầu tiên phát hiện ra mối tương quan giữa sự hiện diện của hoạtđộng men coagulase huyết tương của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó Tuynhiên mãi đến năm 1984, phát hiện này mới được chấp nhận rộng rãi [1]

Phân loại S aureus theo khoa học [1]:

Bảng 2.3 Phân loại của Staphylococcus aureus

GiớiNgànhLớpBộHọChiLoài

Phương pháp phân loại dựa vào kháng nguyên: Các tụ cầu khuẩn có nhiều

loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic

Acid teichoic: Là kháng nguyên ngưng kết chủ yếu của tụ cầu và làm tăng tác

dụng hoạt hóa bổ thể Đây còn là chất bám dính của tụ cầu vào niêm mạc mũi Acidnày gắn vào polysaccharid vách tụ cầu vàng Đây là thành phần đặc hiệu của khángnguyên O

Protein A: Là những protein bao quanh bề mặt vách tụ cầu vàng và là một tiêu

chuẩn để xác định tụ cầu vàng 100% các chủng tụ cầu vàng có protein này Sở dĩkháng nguyên này mang tên protein A, vì protein này gắn được phần Fc của IgG.Điều này dẫn tới làm mất tác dụng của IgG, chủ yếu là mất đi opsonin hóa(opsonisation), nên làm giảm thực bào

Vỏ polysaccharid: Một số ít chủng S aureus có vỏ và có thể quan sát được bằng

phương pháp nhuộm vỏ Lớp vỏ này bao gồm nhiều tính đặc hiệu kháng nguyên

và có thể chứng minh được bằng phương pháp huyết thanh học Kháng nguyênadherin (yếu tố bám), giống như nhiều vi khuẩn khác, tụ cầu có protein bề mặt đặchiệu, có tác dụng bám vào receptor đặc hiệu tế bào Adherin có thể là các protein:laminin, fibronectin, colagen.

Phương pháp phân loại bằng phage (phage typing): Các phương pháp phân

loại dựa trên kháng nguyên của tụ cầu là rất khó khăn, vì vậy việc phân loại tụ cầuvàng chủ yếu dựa trên phage Sự ký sinh của phage trên vi khuẩn mang tính đặc

hiệu rất cao Đây là phương pháp được sử dụng nhiều trong phân loại S aureus, vì

đây là vi khuẩn gây nhiễm trung nhiều nhất trên người

2.4.1.2 Đặc điểm của vi khuẩn S aureus

Là loại cầu khuẩn, Gram dương, có đường kính khoảng 0,8 - 1µm Các tế bàothường liên kết với nhau thành hình chùm nho, không có lông, không nha bào vàthường không có vỏ

Hình 2.2 Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus

Là loại vi khuẩn yếm khí tùy tiện, không di động, không sinh bào tử [1] Làloài có pH phát triển khá rộng, trong khoảng 4 - 9,8, khoảng pH tối ưu là 6 - 7, bịkìm hãm ở pH < 4,8 Chúng phát triển tốt ở aw = 0,83 - 0,86

Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển là 370C, tuy nhiên chúng là loài chịu nhiệttốt, có thể tồn tại trong 16h ở 600C và pH = 7,3 Có khả năng sống ở nồng độ muối 9

- 10% Tụ cầu vàng có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vikhuẩn không đa bào khác Tụ cầu vàng bị diệt ở 800C trong 1 giờ (trong khi các vikhuẩn khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút) Khả năng đề kháng với nhiệt độ

của tụ cầu vàng thường phụ thuộc vào khả năng thích ứng nhiệt độ tối đa (450C) mà

vi khuẩn có thể phát triển được

Tụ cầu vàng có khả năng kháng một số kháng sinh như penicillin G do vikhuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid Một số còn

kháng được methicillin resistance Staphylococcus aureus (viết tắt là MRSA), do nó

tạo ra được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh Hiện nay một số rất ít

tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ kháng sinh được dùng trongcác trường hợp này là vancomycin

Tụ cầu vàng có hệ thống enzyme phong phú, những enzyme được dùng trongchuẩn đoán là coagulase, có khả năng làm đông huyết tương người và động vật khi

đã được chống đông Đây là tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với các

tụ cầu khác Hoạt động coagulase giống như thrombokiase tạo thành một “áofibrinogen” trong huyết tương Coagulase có hai loại: Một loại tiết ra môi trườnggọi là coagulase tự do và một loại bám vào vách tế bào gọi là coagulase cố địnhKhi phát triển vi khuẩn này có khả năng tạo ra sắc tố từ màu trắng đến màuvàng sạm, nhiệt độ 200C - 250C thích hợp nhất cho chúng tạo màu

Tạo độc tố enterotoxin Nhiệt độ thích hợp cho chúng tạo ra độc tố 70C - 470C,khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình này là 400C - 450C, các độc tố này bền vớinhiệt, chúng không bị phân hủy ở 1000C trong 30 phút

Có khả năng phát triển trên nhiều môi trường khác nhau Trên môi trường thạch

tụ cầu vàng tạo thành khuẩn lạc S, có đường kính từ 1 - 2mm, bề mặt nhẵn Khuẩn lạcthường có màu vàng chanh sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 370C Trên môi trường thạchmáu, tụ cầu vàng phát triển nhanh tạo tan máu hoàn toàn Trên môi trường canh thang,

tụ cầu vàng làm đục môi trường và nếu để lâu nó có thể lắng cặn Tụ cầu vàng có khảnăng chịu được nồng độ muối cao, vi khuẩn này có thể phát triển trong môi trườngchứa đến 15% NaCl Nguồn nitơ sử dụng là nguồn acid amine Nếu trong môi trường

có chứa các acid amine như: Arginine, cystine, phenylalanine và các vitamin B3, B5, B1,

H sẽ rất thuận lợi cho S aureus phát triển Vi khuẩn sinh thử nghiệm coagulase, có khả

năng lên men và sinh acid từ mannitol, saccharose

2.4.1.3 Độc tố S aureus

Tạo enterotoxin chịu nhiệt tốt: Chúng là những chuỗi protein có khối lượng phân tử thấp khoảng 25000 - 29000 Da Có 6 loại enterotoxin là A, B, C, D, E, F.

trong đó độc tố B thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng

Về miễn dịch 6 loại này được phân biệt khá rõ ràng, mặc dù giữa chúng có khángnguyên chéo Về cơ chế gây bệnh độc tố enterotoxin kích thích tạo ra một lượng lớninterleukin I và II Xác định enterotoxin bằng các kỹ thuật miễn dịch

Độc tố gây hội chứng shock nhiễm độc (Toxic shock syndromme toxin TSST): Độc tố gây shock nhiễm độc thường gặp ở những phụ nữ có kinh dùng bông dày bẩn hoặc những người bị nhiễm trùng vết thương Độc tố này khó phân

-biệt với enterotoxin F của tụ cầu vàng TSST kích thích giải phóng TNF (TumorNecrosis Factor) yếu tố hoại tử u và các interleukin I, II Cơ chế gây shock của nótương tự như của nội độc tố

Exfoliatin toxin hay epidermolytic toxin: Đây là một ngoại độc tố Nó gây nên

hội chứng phỏng rộp và chốc lở da (Scaded Skin Syndrome) ở trẻ em Hội chứng này

đã được biết khá lâu, nhưng mãi đến năm 1971 người ta mới biết đến exfoliatin Độc tốnày được tạo bởi gen của 85% các chủng tụ cầu vàng thuộc loại phage nhóm II

Alphatoxin: Độc tố này gây tan các bạch cầu có nhân đa hình và tiểu cầu, từ

đó gây ra các ổ áp xe, gây ra hoại tử da và tan máu Alphatoxin là một protein trọng

lượng phân tử 33000 - 36000 Dalton Nó gắn trên màng tế bào và thể hiện các thuộctính hoạt động bề mặt Độc tố có tính kháng nguyên nhưng kháng thể của nó không

có tác dụng chống nhiễm khuẩn

Độc tố bạch cầu (Leucocidin): Mặc dù một số staphylosyn chứa độc tố bạch

cầu, nhưng chỉ một độc tố tụ cầu thực sự độc với bạch cầu và được coi là leucocidin.Độc tố này gây độc cho bạch cầu người và thỏ và không gây độc cho bạch cầu các loạiđộng vật khác Nó cũng có tác dụng hoại tử da thỏ Leucocidin bao gồm 2 mảnh

F và S và có thể tách rời bằng sắc ký in, trọng lượng phân tử là 32000 và 38000 Dalton Nếu tách rời 2 mảng này thì mất tác dụng gây độc

Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): Vào 1979, Schlivent và cộng sự

đã tách biệt được một độc tố từ tụ cầu vàng Về nhiều phương diện, độc tố nàytương tự độc tố sinh mủ của liên cầu Protein ngoại độc tố này có tác dụng sinh mủ

và phân bào lymphocyt, đồng thời nó làm tăng nhạy cảm về một số phương diện đốivới nội độc tố như gây shock và hoại tử gan và cơ tim Sau đó, người ta đã phân biệtđược 3 loại ngoại độc tố sinh mủ, ký kiệu là A, B, C Ba loại này khác nhau về trọnglượng phân tử (theo thứ tự: 1200, 1800 và 22000 Dalton) về tính đặc hiệu khángnguyên nhưng giống nhau về khả năng sinh mủ và phân bào

Dung huyết tố (hemolysin còn gọi là staphylokysin): Tụ cầu vàng sinh ra 4

loại hemlysin có các tính chất khác nhau

Bảng 2.4 Các loại dung huyết tố của tụ cầu vàng Loại hồng cầu

ngựa, cừu, chuột

Sinh enzyme gây độc cho người: Catalase chuyển hydrogen peroxit thànhnước và oxy, coagulase làm đông huyết tương, hyaluronase làm tan acid hyaluroicgiúp vi khuẩn vào cơ thể

2.4.1.4 Bệnh do S aureus

Staphylococcus aureus thường sống ở da người, đường hô hấp, đường tiêu hóa Có khoảng 40 - 50% người có Staphylococcus aureus ở trong khoang mũi, ngoài ra còn thấy chúng ở quần áo, đồ vật Khi Staphylococcus aureus tiết ra coagulase sẽ làm

thương tổn tạo ra mụn nhọt, làm đông sợi huyết Từ ổ nhiễm chúng có thể xâm nhậpvào các nơi khác qua đường máu và có thể gây viêm phổi, viêm màng não, viêm cơtim, viêm thận, viên tủy xương [13] Do tụ cầu vàng ký sinh ở da và niêm mạc mũi, nên

nó có thể xâm nhập qua các lỗ chân lông, chân tóc hoặc các tuyến dưới da Sau đó gâynên các nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ áp xe, eczema, hậu bối…Mức

độ các nhiễm khuẩn này phụ thuộc vào sự đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn.Nhiễm tụ cầu ngoài da thường gặp ở trẻ em và người suy giảm miễn dịch Tụ cầu vàng

là vi khuẩn thường gây nhiễm khuẩn huyết nhất Do chúng gây nên nhiều loại nhiễmkhuẩn, đặc biệt là các nhiễm khuẩn ngoài da, từ đấy vi khuẩn xâm nhập vào máu gâynên nhiễm khuẩn huyết Đây là một nhiễm trùng rất nặng Từ nhiễm khuẩn huyết, tụcầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên ổ áp xe (gan, phôi, não, tủy xương )hoặc viêm nội tâm mạc Có thể gây nên các vêm tắc tĩnh mạch Một số nhiễm trùngkhu trú này trở thành viêm mạn tính như viêm xương, Viêm phổi do tụ cầu vàngthường ít gặp Nó chỉ xảy ra sau viêm đường hô hấp do virus (như cúm) hoặc saunhiễm khuẩn huyết Tuy vậy cũng có viêm phổi tiên phát do tụ cầu vàng, ở trẻ em hoặcnhững người suy yếu Tỷ lệ tử vong của bệnh này khá cao, vì thế nó được coi là bệnhnặng Ngộ độc thức ăn do phải độc tố ruột của tụ cầu, hoặc do tụ cầu vàng vốn cư trú

ở đường ruột chiếm ưu thế về số lượng Nguyên nhân là sau một thời gian dài bệnhnhân dùng kháng sinh có hoạt phổ rộng, dẫn đến các vi khuẩn bình thường của đườngruột nhạy cảm kháng sinh bị tiêu diệt và tạo điều kiện thuận lợi cho tụ cầu vàng

(kháng kháng sinh) tăng trưởng về số lượng Triệu chứng của ngộ độc thức ăn do tụcầu vàng thường rất cấp tính Sau khi ăn phải thức ăn nhiễm độc tố tụ cầu từ 2 đến 8(giờ), bệnh nhân nôn và đi ngoài dữ dội, phân lẫn nước, càng về sau phân và chấtnôn chủ yếu là nước Do mất nhiều nước và điện giải có thể dẫn tới shock

Nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do tụ cầu khuẩn Đây là trường hợp rất thườnggặp nhất là đối với nhiễm trùng vết mổ, vết bỏng…từ đó dẫn tới nhiễm khuẩn huyết.Các chủng tụ cầu này có khả năng kháng kháng sinh rất mạnh và phải dùng tớivancomycin Tỷ lệ tử vong của bệnh này rất cao.

2.4.1.5 Cách phòng ngừa

Phòng bệnh nhiễm khuẩn tụ cầu chủ yếu là vệ sinh môi trường, quần áo vàthân thể vì tụ cầu có rất nhiều ở những nơi này Đặc biệt là vệ sinh môi trường bệnhviện để chống nhiễm khuẩn bệnh viện

Rửa tay: Rửa tay đúng cách là một trong những biện pháp phòng ngừa thườnghay sử dụng để chống lại các vi trùng

Vết cắt, vết trầy phải luôn được giữ sạch sẽ và được băng kín, khô cho đến khilành Mủ từ vết loét bị nhiễm trùng có thể chứa vi khuẩn cầu vàng và việc che vếtthương sẽ giúp ngăn vi khuẩn lây lan

Giặt quần áo và ga giường bằng nước nóng: Vi khuẩn tụ cầu khuẩn có thể tồntại trên quần áo và ga giường không được rửa sạch đúng cách

Tránh tiêm thuốc bừa bãi, không theo chỉ định của bác sĩ: Người dùng thuốctiêm tĩnh mạch có nguy cơ rất cao mắc nhiều loại bệnh nhiễm trùng nguy hiểm baogồm nhiễm khuẩn do vi khuẩn tụ cầu vàng

Tránh dùng chung vật dụng cá nhân như khăn tắm, khăn trải giường, dao cạo,quần áo và dụng cụ thể thao Nhiễm tụ cầu khuẩn có thể lây lan qua các vật dụng,cũng như từ người này sang người khác Để hạn chế sự kháng thuốc kháng sinh của

vi khuẩn nói chung và tụ cầu vàng nói riêng, không nên tự mua thuốc kháng sinh đểđiều trị khi chưa có chỉ định của bác sĩ

Đối với đội ngũ bác sĩ khám chữa bệnh cần tuân thủ đúng các quy định sử dụng kháng sinh hợp lý của Bộ Y tế đề ra

Vệ sinh cá nhân thật tốt bằng cách tắm rửa hàng ngày với nước sạch, nhất là trẻ nhỏ bụ bẫm có nhiều nếp kẽ, nếp gấp chứa đựng nhiều mồ hôi, bã nhờn

Cần vệ sinh họng, miệng hàng ngày bằng cách đánh răng và súc họng nước muối nhạt trước khi đi ngủ và sau khi ngủ dậy

Điều trị: Kháng sinh trị liệu là biện pháp chủ yếu Vấn đề khó khăn là tụ cầurất kháng thuốc, nên cần phải làm kháng sinh đồ để chọn lọc thuốc thích hợp Dùngvacxin gây miễn dịch chống tụ cầu vàng cũng là một biện pháp cần thiết ở nhữngbệnh nhân dùng kháng sinh ít kết quả Đây là những vacxin chết và có thể được bàochế từ chủng tụ cầu vàng phân lập được ở chính bệnh nhân đó (gọi là vacxin tựliệu), hoặc dùng các chủng tụ cầu vàng mẫu, là những chủng thường gặp (gọi làvacxin trị liệu).

2.4.1.6 Miễn dịch và chuẩn đoán vi khuẩn học

Miễn dịch: Miễn dịch thu được với tụ cầu nói chung và tụ cầu vàng nói riêng,

trong đó tế bào thực bào đóng vai trò quan trọng nhất Đáp ứng miễn dịch qua trunggian tế bào có xảy ra với việc tiết ra các lymmphokin và hoạt hóa đại thực bào Tuy vậynhưng đã không làm tăng được sự diệt khuẩn Miễn dịch dịch thể cũng xuất hiện đểchống lại các yếu tố độc lực (độc tố và enzyme) Nhưng nó không có vai trò bảo vệ có

ý nghĩa Vì tụ cầu ít tiếp xúc với kháng thể hoặc tế bào sản xuất kháng thể Do

vi khuẩn này thường ẩn trú trong các ổ áp xe, trong các cục fibrin và trong các tế bào bạch cầu Như vậy miễn dịch tích cực chống nhiễm tụ cầu ít có vai trò bảo vệ

Chuẩn đoán vi khuẩn học: Phân lập xác định tụ cầu là việc cần thực hiện và

không mấy khó khăn Bệnh phẩm là máu, mủ, phân…tùy theo loại bệnh của tụ cầu.Thạch máu là môi trường thích hợp để phân lập Tụ cầu phát triển rất tốt trên môitrường này Có thể sử dụng môi trường lựa chọn chứa 7,5% NaCl, đường mannitol

và có thể có cả kháng sinh chống vi khuẩn Gram âm, khi bệnh phẩm có nhiều loại

vi khuẩn Tụ cầu vàng có đặc điểm là: khuẩn lạc S có màu vàng nhẹ, cầu khuẩngram dương, hình chùm nho, coagulase dương tính, manitol dương tính, khángnovobiocin, phosphatase dương tính, catalase dương tính

2.4.2 Tổng quan về Escherichia coli (E coli)

2.4.2.1 Lịch sử phát hiện và phân loại

Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trìnhđiều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885 Vì loài này kí

sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli).

Sau khi Theodor Escherich mất (năm 1911), các nhà khoa học đã đổi tên loàinày khá nhiều lần, rồi đến năm 1919 thì được gọi thống nhất toàn thế giới là

Escherichia coli Từ giữa những năm 1940, các bằng chứng nhận được đã cho thấy rằng, một số chủng E coli gây ra tiêu chảy, đặc biệt là ở trẻ em và chúng cũng được gọi là các E coli gây bệnh đưòng ruột [1]

Phân loại E Coli [1]:

GiớiNgànhLớpBộHọChiLoài

Phương pháp phân loại dựa vào cấu trúc kháng nguyên: kháng nguyên E.

coli được chia thành các type huyết thanh Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau.

Phương pháp phân loại dựa vào vị trí gây bệnh: các E coli có khả năng gây

bệnh ở người được chia thành 3 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC

- Intestinal Pathogenie E coli) hay E coli gây tiêu chảy (DEC - Diarrheagenic E coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (EXPEC - Extraintestinal Pathogenic E coli).

Các loại E coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết đến

gồm: EPEC (Enteropathogenic E coli): E coli gây bệnh đường

ruột ETEC (Enterotoxigenie E coli): E coli sinh độc tố ruột

EIEC (EnteroIinvasIve E coli): E coli xâm nhập ruột