Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại hạt nano kim loại đến quá trình nảy mầm ở hạt đậu tương glycine max l merr

Ở Việt Nam những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu về ảnh hưởng của nano trên các đối tượng cây trồng khác nhau như: ngô, dâu tây, hoa cúc...Từ năm 2015, Dự án trọng đi

-* -

PHẠM THỊ HÒE

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI HẠT NANO KIM LOẠI

ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƯƠNG

(GLYCINE MAX (L.) MERR)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017

-* -

PHẠM THỊ HÒE

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ LOẠI HẠT NANO KIM LOẠI

ĐẾN QUÁ TRÌNH NẢY MẦM Ở HẠT ĐẬU TƯƠNG

(GLYCINE MAX (L.) MERR)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

khoa học của TS Trần Mỹ Linh và PGS.TS Nguyễn Lai Thành Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được công bố dưới bất kỳ hình thức nào

Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ

Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn

Học viên

Phạm Thị Hòe

(Viện Hóa sinh biển – Vện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và

PGS.TS Nguyễn Lai Thành (Khoa Sinh học – Đại học Khoa học Tự nhiên –

ĐHQGHN) đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt cho em những kiến thức cũng như kinh nghiệm làm việc, giúp em khắc phục được những khuyết điểm của mình để có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình Xin cảm ơn nguồn kinh phí từ dự án KHCN trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam mã số

VAST.TĐ.NANO-NN/15-18 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong nông

nghiệp” do PGS TS Nguyễn Hoài Châu làm chủ nhiệm

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã trang bị kiến

thức cho em trong suốt quá trình học tập

Em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Tường Vân và ThS Nguyễn Chi Mai cùng các cán bộ Phòng Tài nguyên Sinh Vật - Viện Hóa sinh biển – Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn bên cạnh giúp đỡ, hỗ trợ em trong thời gian em thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã

luôn bên cạnh quan tâm, động viên tinh thần và tạo điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Phạm Thị Hòe

DANH MỤC HÌNH vi

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT vii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 - TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương 3

1.1.1 Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương 3

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương 5

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 6

1.2 Vai trò của các nguyên tố vi lượng đối với sự phát triển của cây trồng 8 1.2.1 Vai trò của sắt đối với sự phát triển của cây trồng 10

1.2.2 Vai trò của đồng đối với sự phát triển của cây trồng 11

1.2.3 Vai trò của kẽm đối với sự phát triển của cây trồng 11

1.2.4 Vai trò của coban đối với sự phát triển của cây trồng 12

1.3 Công nghệ nano và ứng dụng trong nông nghiệp 12

1.3.1 Giới thiệu chung về công nghệ nano 12

1.3.2 Hạt nano kim loại 14

1.3.3 Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano – hạt nano kim loại trong nông nghiệp 14

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu 22

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 22

2.2.1 Hóa chất 22

2.2.2 Thiết bị 22

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao 23

2.3.2 Chuẩn bị các dung dịch hạt nano kim loại 24

2.3.3 Xử lý hạt đậu tương với các dung dịch hạt nano kim loại 24

2.3.4 Phân tích các chỉ tiêu về hình thái 24

2.3.5 Đánh giá ảnh hưởng của các hạt nano kim loại đến khả năng phân bào ở đỉnh sinh trưởng rễ 25

2.3.6 Đánh giá ảnh hưởng của các hạt nano kim loại đến quá trình nảy mầm của đậu tương ở mức độ phân tử 26

2.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến tỷ lệ nảy mầm và tốc độ nảy mầm của hạt đậu tương 33

3.2 Ảnh hưởng của hạt nano kim loại sự phát triển của rễ mầm đậu tương 35

3.3 Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến sự phát triển của chồi mầm đậu tương 38

3.4 Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến khả năng phân bào ở đỉnh sinh trưởng của rễ 40

3.5 Ảnh hưởng của một số hạt nano kim loại đến mức độ methyl hóa DNA đậu tương 41

3.5.1 Tách chiết DNA tổng số 41

3.5.2 Phân tích mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 18 giờ 43

3.5.3 Phân tích mức độ methyl hóa ở các mẫu rễ mầm 48 giờ 44

3.6 Ảnh hưởng của hạt nano kim loại đến sự biểu hiện của một số gen liên quan đến quá trình nảy mầm của hạt đậu tương 46

3.6.1 Tách chiết RNA tổng số 46

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

Bảng 2 Các thiết bị chính được sử dụng trong đề tài 23

Bảng 3 Nồng độ các dung dịch nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 4 Thông tin gen đích và các mồi được sử dụng trong phản ứng RT-PCR 31

Bảng 5 Thành phần của phản ứng RT-PCR 32

Bảng 6 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR 32

Bảng 7 Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến tỷ lệ nảy mầm của hạt đậu tương 34

Bảng 8 Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến chiều dài rễ mầm đậu tương 36 Bảng 9 Ảnh hưởng của nFe, nCu, nZnO và nCo đến chiều dài chồi mầm đậu tương 38

Bảng 10 Ảnh hưởng của hạt nFe, nCu, nZnO và nCo đến quá trình phân bào của các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của rễ mầm đậu tương 41

Bảng 11 Kết quả đo quang phổ các mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 18 giờ 42

Bảng 12 Kết quả đo quang phổ các mẫu DNA tách từ mẫu rễ mầm 48 giờ 43

Bảng 13 Mức độ methyl hóa DNA ở các mẫu rễ mầm 18 giờ 43

Bảng 14 Mức độ methyl hóa DNA ở các mẫu rễ mầm 48 giờ 44

Bảng 15 Kết quả đo quang phổ mẫu RNA tách từ các mẫu rễ mầm 18 giờ 47

Bảng 16 Kết quả đo quang phổ mẫu RNA tách từ các mẫu rễ mầm 48 giờ 47

bắt đầu nứt vỏ nảy mầm, phát triển rễ mầm (radicle), trụ mầm (hypocotyl)

và 2 lá mầm (cotyledons) tách ra, chồi mầm xuất hiện 5

Hình 2 Đường chuẩn định lượng cytidine trong các mẫu phân tích 28

Hình 3 Đường chuẩn định lượng 5-methylcytidine trong các mẫu phân tích 28

Hình 4 Hình thái rễ mầm đậu tương ở các lô thí nghiệm 37

Hình 5 Hình thái chồi mầm đậu tương ở các lô thí nghiệm 39

Hình 6 Hình thái nhiễm sắc thể trong các kì phân chia của các tế bào ở đỉnh sinh trưởng của rễ mầm đậu tương trong lô đối chứng 40

Hình 7 Ảnh điện di DNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 giờ (A) và 48 giờ (B) sau xử lý hạt 42

Hình 8 Ảnh điện di RNA tổng số của các mẫu rễ mầm đậu tương thời điểm 18 giờ (A) và 48 giờ (B) sau xử lý hạt 46

Hình 9 Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của 8 gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm 18 giờ 49

Hình 10 Kết quả phân tích mức độ biểu hiện của 8 gen nghiên cứu ở các mẫu rễ mầm 48 giờ 50

cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNase Deoxyribonuclease

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA Ethylenediamine tetra acetic acid

HPLC High-performance liquid chromatography

MWNT Multi walled carbon nanotubes

NOM Natural Organic Material

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

MỞ ĐẦU

Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) là một trong những cây trồng mũi nhọn

trong chiến lược phát triển kinh tế của nước ta Hạt đậu tương được sử dụng làm

thực phẩm cho người, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp và xuất

khẩu… Hơn nữa, cây đậu tương còn là cây trồng có khả năng cải tạo đất Mặc dù,

Việt Nam đã có những chính sách quy hoạch để mở rộng và phát triển trồng cây đậu

tương nhưng do năng suất còn thấp nên sản lượng vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu

trong nước Trong những năm gần đây, Việt Nam vẫn phải nhập khẩu lượng lớn đậu

tương từ các nước khác như Mỹ, Brazil, để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về

nguyên liệu sản xuất cũng như các sản phẩm từ đậu tương Do đó, việc tăng năng

suất và sản lượng đậu tương là đòi hỏi cấp thiết hiện nay của ngành trồng trọt ở

nước ta Việc ứng dụng các thành tựu của khoa học công nghệ hiện đại vào sản xuất

nông nghiệp sẽ là giải pháp hữu hiệu nhất để giải quyết vấn đề này

Công nghệ nano là một công nghệ mới đã được ứng dụng hiệu quả để tạo ra

các sản phẩm hữu ích trong nông nghiệp như phân bón nano, chế phẩm tăng cường

năng suất cây trồng, thuốc trừ sâu nano, chế phẩm nano xử lý các chất thải nông

nghiệp Ở Việt Nam những năm gần đây, các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu

về ảnh hưởng của nano trên các đối tượng cây trồng khác nhau như: ngô, dâu tây,

hoa cúc Từ năm 2015, Dự án trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong nông nghiệp” đã được

triển khai nhằm tạo các sản phẩm nano và phát triển ứng dụng các sản phẩm này

trong hầu hết các lĩnh vực của ngành nông nghiệp ở Việt Nam như trồng trọt, chăn

nuôi, thủy sản Mặc dù ảnh hưởng tích cực của một số hạt nano kim loại đến quá

trình sinh trưởng và năng suất của cây trồng đã được nhiều công trình khoa học

chứng minh nhưng các nghiên cứu về cơ chế tác động của các hạt nano đến từng

quá trình sinh lý, sinh hóa quan trọng của cây trồng như nảy mầm, quang hợp, hấp

thụ nước và khả năng chống chịu điều kiện bất lợi,… vẫn còn rất ít Các nghiên cứu

về cơ chế tác động và đánh giá ảnh hưởng của mỗi loại hạt nano tới cây trồng sẽ là

cơ sở khoa học để ứng dụng các chế phẩm nano vào sản xuất nông nghiệp

Xuất phát từ thực tiễn trên, đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại

hạt nano kim loại đến quá trình nảy mầm ở hạt đậu tương (Glycine max (L.)

Merr)” được thực hiện nhằm mục tiêu đánh giá tác động của bốn loại hạt nano kim

loại (Fe, Cu, ZnO, Co) đến quá trình nảy mầm ở hạt đậu tương thông qua các phân

tích về hình thái, tế bào và mức độ biểu hiện của một số gen quan trọng Giai đoạn

nảy mầm là bước đầu tiên trong chu kỳ sống của thực vật và có vai trò quan trọng

trong sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Do đó, những tác động ở giai đoạn

nảy mầm sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng, phát triển và năng suất của cây trồng Kết

quả của đề tài sẽ góp phần tạo cơ sở khoa học để ứng dụng các chế phẩm nano kim

loại nhằm tăng năng suất cây trồng, góp phần xây dựng nền nông nghiệp phát triển

bền vững ở nước ta

Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về cây đậu tương

1.1.1 Các thời kỳ sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương

Đậu tương (Glycine max (L.) Merr) còn gọi là đậu nành, là loài cây trồng cạn

ngắn ngày, được trồng phổ biến ở các nước Đông Nam Á, Bắc và Nam Mỹ Ở Việt

Nam, cây đậu tương được trồng nhiều ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (An

Giang, Đồng Tháp,…) và một số tỉnh miền núi phía Bắc (Hà Bắc, Lạng Sơn, Cao

Bằng,…)

Quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương được chia thành hai

thời kỳ: thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng (Vegetative Stages) và thời kỳ sinh sản

(Reproductive Stages) [2, 34] Trong đó, thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng được chia

thành nhiều giai đoạn như sau:

 Giai đoạn 1 (Emergence – VE): hạt nảy mầm cho đến khi thân mầm đội

lá mầm vươn lên khỏi mặt đất

 Giai đoạn 2 (Cotyledon – VC): hai lá mầm tách ra hoàn toàn, hai lá đơn

mọc phía trên lá mầm

 Giai đoạn một lá kép ( first trifoliolate – V1): cây có một lá kép

 Giai đoạn hai lá kép (second trifoliolate – V2): cây có hai lá kép

 Giai đoạn n lá kép ( nth

trifoliolate – Vn): cây có n lá kép, số lượng lá kép trên cây phụ thuộc vào đặc điểm di truyền của từng giống

Tiếp theo thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, cây chuyển sang thời kỳ sinh sản

với các giai đoạn sau:

 Giai đoạn R1 (Beginning flowering): Cây bắt đầu ra hoa

 Giai đoạn R2 (Full bloom): Cây có hoa đầy đủ

 Giai đoạn R3(Beginning pod): Cây bắt đầu tạo quả

 Giai đoạn R4 (Full pod): Cây có đủ quả

 Giai đoạn R5(Beginning seed): Cây bắt đầu tạo hạt

 Giai đoan R6 (Full seed): Quả có đủ hạt

 Giai đoạn R7 (Beginning maturity): Quả bắt đầu chín

 Giai đoạn R8 (Full maturity): Quả chín hoàn toàn

Trong thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng, giai đoạn nảy mầm (giai đoạn 1) là

giai đoạn đầu tiên và đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát

triển của cây Giai đoạn nảy mầm được tính từ khi gieo hạt giống xuống đất, hạt hút

ẩm trương lên, rễ mầm xuất hiện, thân mầm vươn lên đội hai lá mầm lên khỏi mặt

đất, lá mầm xoè ra, 2 chồi mầm bắt đầu xuất hiện mọc đối xứng trên vị trí 2 lá mầm

(Hình 1) Yêu cầu của giai đoạn này là hạt đậu tương phải có đủ nước, nhiệt độ phù

hợp và đủ hàm lượng oxy

+ Nước: Hạt đậu tương hút nhiều nước hơn so với các cây trồng khác Hạt

phải hút một lượng nước trên 50% trong lượng hạt thì hạt mới nảy mầm

+ Nhiệt độ: Quá trình nảy mầm rất mẫn cảm đối với nhiệt độ Nhiệt độ từ 15-

30oC là thích hợp nhất cho quá trình nảy mầm của hạt đậu tương Trong

khoảng nhiệt độ này, chỉ gieo sau 3-7 ngày là hạt đã nảy mầm Nếu nhiệt độ

thấp hơn 10oC quá trình hạt nảy mầm thường kéo dài tới 12-15 ngày Nếu

nhiệt độ cao trên 30oC hạt nảy mầm nhanh nhưng mầm yếu

+ Hàm lượng O2: có liên quan tới ẩm độ đất, nếu ẩm độ đất trên 90% thì

không đủ O2 để hạt nảy mầm

Khi có đủ nước, oxy và ở nhiệt độ phù hợp thì hạt sẽ hút nước trương lên,

các enzyme chuyển hóa như protease, amylase trong hạt bắt đầu được hoạt hóa

chuyển các chất dự trữ ở dạng phức tạp sang đơn giản để nuôi phôi và hình thành bộ

phận mới [2] Các kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng mRNA tăng khi hạt hút

nước, chủ yếu là mRNA của các gen liên quan đến quá trình tổng hợp protein và

enzyme thuỷ phân Ở giai đoạn này, các enzyme thủy phân các chất dự trữ có vai

trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất giúp cho hạt chuyển từ trạng thái ngủ

sang trạng thái hoạt động Sau khi hạt trương nước, phôi bắt đầu sinh trưởng, giai

đoạn đầu là sự kéo dài các tế bào làm cho trụ dưới lá mầm vươn dài ra, vỏ hạt tách

ra và cố định cây mầm, trụ trên mầm vươn dài để lộ lá mầm và đỉnh sinh trưởng,

tiếp theo là sự phân chia và kéo dài của các tế bào làm cho cây mầm hình thành [3]

Hiện tượng nảy mầm là bước đầu tiên trong chu kỳ sinh trưởng và phát triển

của cây trồng Bên cạnh các điều kiện ngoại cảnh thì các nguyên tố vi lượng thường

có trong thành phần của các enzyme cũng có vai trò quan trọng trong quá trình nảy

mầm Nguyên tố vi lượng ở nồng độ thích hợp có khả năng thúc đẩy nhanh sự nảy

mầm của hạt, từ đó ảnh hưởng tới toàn bộ quá trình sinh trưởng và các hoạt động

sinh lý của cây [54]

Hình 1 Các mốc chính trong quá trình nảy mầm ở đậu tương: hạt hút đủ nước, hạt bắt

đầu nứt vỏ nảy mầm, phát triển rễ mầm (radicle), trụ mầm (hypocotyl) và 2 lá mầm

(cotyledons) tách ra, chồi mầm xuất hiện

(http://www.fssystem.com/Agronomy/News/Pages/The-Soybean-Hypocotyl-and-Hypocotyl-Arch.aspx)

1.1.2 Giá trị kinh tế của cây đậu tương

Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao với hàm lượng protein trung

bình khoảng 38-40% Đặc biệt, protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong

số các protein có nguồn gốc thực vật, dễ tiêu hóa hơn protein động vật và không có

các thành phần tạo thành cholesterol hay axit uric,… Hạt đậu tương có chứa hàm

lượng chất béo cao hơn các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực

vật quan trọng Trong hạt đậu tương có nhiều loại vitamin với hàm lượng cao như

vitamin B1, B2 và các loại vitamin khác như vitamin A, E, K, D, C, Đặc biệt

trong hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng một số vitamin tăng lên đáng kể như

vitamin C, vitamin E Hạt đậu tương cũng chứa nhiều chất khoáng như canxi (Ca),

phosphor (P), sắt (Fe) [2]

Từ hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 loại sản phẩm khác

nhau Trong đó, hơn 300 loại thức ăn được chế biến bằng nhiều phương pháp từ cổ

truyền, thủ công cho đến hiện đại dưới các dạng tươi, khô, lên men như làm giá,

bột, tương, đậu phụ, chao, tào phớ, sữa đậu nành, bánh kẹo, Bột đậu tương sau

khi đã ép dầu còn được dùng làm nguyên liệu để chế biến thức ăn giàu đạm cho gia

súc và gia cầm Ở nhiều nước phát triển, người ta còn sử dụng đậu tương vào các

ngành công nghiệp khác như chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất

dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không [6]

Một tác dụng có ý nghĩa quan trọng của cây đậu tương trong lĩnh vực sản

xuất nông nghiệp đó là khả năng cải tạo đất do khả năng cố định đạm của vi khuẩn

nốt sần Rhizobium japonicum sống cộng sinh ở rễ cây đậu tương Trong điều kiện

thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần cộng sinh có thể tích lũy được một lượng đạm tương

đương từ 20-25 kg ure/ha Bởi vậy, các nốt sần ở rễ cây đậu tương được coi là

những “nhà máy phân đạm tí hon” làm giàu đạm cho đất, không gây ô nhiễm môi

trường và đồng thời còn làm sạch bầu khí quyển

1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây đậu tương đóng vai trò rất quan trọng trong cơ cấu cây

trồng nông nghiệp và đặc biệt là ở các tỉnh miền núi phía Bắc Do đậu tương là loại

cây ngắn ngày và có khả năng trồng trên nhiều loại đất khác nhau nên rất thích hợp

làm cây trồng luân canh, xen canh, gối vụ với nhiều loại cây trồng khác nhau làm

tăng hiệu quả sử dụng đất trong nông nghiệp Tuy nhiên, quy mô sản xuất vẫn còn

nhỏ lẻ và chưa cạnh tranh được với các loại cây khác Diện tích trồng cây đậu tương

đã được mở rộng từ năm 2011 nhưng năng suất và sản lượng còn thấp Năm 2013,

tổng sản lượng đậu tương toàn quốc mới chỉ đạt được 168,4 nghìn tấn đáp ứng

khoảng 1/10 nhu cầu Năng suất ở các năm tiếp theo (2014 và 2015) vẫn ở mức

thấp Vì thiếu khả năng cạnh tranh, tới năm 2016, diện tích gieo trồng đậu tương đã

bị giảm chỉ còn 94 nghìn ha, sản lượng đạt 147,5 nghìn tấn, năng suất tăng nhẹ

8,2% so với năm 2015 (Bảng 1) Để bù đắp sự thiếu hụt về thực phẩm giàu protein

trong nước, đồng thời đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của ngành công nghiệp thức

ăn chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản, Việt Nam phải nhập khẩu một lượng lớn bột

đậu tương từ các nước khác Theo số liệu của Tổng cục Hải quan Việt Nam và

USDA (United Stated Department of Agriculture), năm 2012 Việt Nam nhập

1289,9 nghìn tấn đậu tương (trị giá 777,3 triệu đô la Mỹ) Quý I/2013, Việt Nam

nhập khẩu nguyên liệu thức ăn chăn nuôi trên 712 triệu USD, tăng gần 54% so với

cùng kỳ năm 2012, trong đó những loại nguyên liệu thức ăn giàu đạm như đậu

tương, khô dầu đậu tương phải nhập khẩu khoảng 70 - 80% nhu cầu Theo ước tính,

giá trị nhập khẩu đậu tương 8 tháng đầu năm 2017 đạt hơn 1,1 triệu tấn và 509 triệu

USD, tăng 17,9% về khối lượng và tăng 22,5% về giá trị so với cùng kỳ năm 2016

[58]

Bảng 1 Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam giai đoạn 2011-2016

Năm Diện tích gieo trồng

(nghìn ha)

Năng suất (tấn /ha)

Tổng sản lƣợng (nghìn tấn)

Nguồn: Tổng cục Thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Định hướng phát triển sản xuất đậu tương của nhà nước ta đã được Thủ

tướng Chính phủ phê duyệt theo “Chiến lược quy hoạch tổng thể và phát triển sản

xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030” Theo đó, diện

tích đất quy hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa để năm 2020

diện tích gieo trồng khoảng 350 ngàn ha, sản lượng 700 ngàn tấn Vùng sản xuất

chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên, Nam Bộ

Các nhà khoa học Việt Nam cũng đang tiếp tục nghiên cứu để cho ra giống

đậu tương có sản lượng cao hơn và chi phí sản xuất thấp hơn tại một số khu vực

Trong thời gian gần đây, song hành với mục tiêu chiến lược của ngành nông nghiệp

nhiều giống đậu tương mới và quy trình kỹ thuật đã được giới thiệu trong sản xuất,

bao gồm giống HL203 (Nguyễn Văn Chương, 2009); HL07-15 (Nguyễn Văn

Chương và cộng sự, 2013); HLĐN 29 và HLĐN 25 (Bùi Chí Bửu và cộng sự, 2013)

đã được cho phép sản xuất thử tại Đông Nam bộ, Tây Nguyên và Đồng bằng sông

Cửu Long (Nguyễn Văn Chương, 2013); các giống ĐT51, ĐT26 (Trần Thị Trường,

2008); Đ8, Đ2101 (Nguyễn Văn Lâm, 2010) được công nhận chính thức và sản xuất

thử tại Đồng bằng sông Hồng Nhiều quy trình kỹ thuật riêng cho từng giống cây

trồng đã được ứng dụng, nhưng vẫn chưa đạt hiệu quả cao và chưa có một công

trình nghiên cứu nào mang tính đột phá để sản xuất đậu tương với giá thành hạ, có

hiệu quả kinh tế cao

Với tình hình trên thì việc nghiên cứu và ứng dụng những thành tựu mới của

khoa học công nghệ để tăng năng suất đối với cây đậu tương ở nước ta là yêu cầu

rất cấp thiết, trước mắt là để đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước và giảm

nhập khẩu các sản phẩm liên quan

1.2 Vai trò của các nguyên tố vi lƣợng đối với sự phát triển của cây trồng

Trong 74 nguyên tố hóa học tìm thấy trong cơ thể thực vật có 11 nguyên tố đa

lượng (chiếm 99,95%), hơn 60 nguyên tố còn lại là các nguyên tố vi lượng và siêu vi

lượng (chiếm 0,05%) Tuy chiếm một hàm lượng rất nhỏ song các nguyên tố vi lượng

đóng một vai trò quan trọng trong đời sống cây trồng như tham gia vào thành phần cấu

tạo của các enzyme, vitamin, quá trình tổng hợp của các hormone thực vật…[5]

Các nguyên tố vi lượng là yếu tố thiết yếu của sự sống, vì hầu hết các quá trình

tổng hợp và chuyển hoá các chất được thực hiện nhờ các enzyme, mà trong thành

phần của enzyme đều có các nguyên tố vi lượng Hiện nay biết khoảng 1000 hệ

enzyme và có tới 1/3 số hệ enzyme này được hoạt hoá bằng các ion kim loại Sắt là

thành phần bắt buộc trong các enzyme oxy hóa khử có nhóm apoenzyme là vòng

porphyrin như các hệ cytochrome (a, b, c, f), cytochrome oxydase, peroxidase Đồng

trong polyphenoloxydase, ascorbinoxydase Một số metalloenzyme có nhóm hoạt

động là flavin (các flavoprotein) thường chứa 2 hay 3 kim loại trong đó có một kim

loại đóng vai trò chủ yếu Điển hình cho các enzyme này là nitritreductase chứa Mo,

Cu, Mn; hyponitritreductase chứa Fe, Cu; nitrogenase chứa Mo, Fe; nitratereduclase

chứa Mo, Cu; hydroxylamine reductase chứa Mn, Mo Ngoài các metalloenzyme

thực sự, còn gặp nhiều kim loại (Na, Mg, Al, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Rb,

Cd, Cs, ) là các yếu tố tham gia vào quá trình hoạt hóa của nhiều enzyme [5]

Các nguyên tố vi lượng có vai trò trong quá trình tổng hợp các phytohormone

và vitamin Kẽm (Zn) có vai trò trong quá trình sinh tổng hợp các hợp chất dạng indol

và serin bị kìm hãm; có tác dụng phối hợp với nhóm gibberellin Mangan (Mn) hỗ trợ

cho hoạt động của nhóm auxin và có tác dụng đặc hiệu đến hoạt tính của enzyme

auxin oxidase Boron (B) có tác động tích cực đến quá trình sinh tổng hợp auxin, thúc

đẩy việc vận chuyển các chất điều hoà sinh trưởng Mối liên quan giữa các nguyên tố

vi lượng với các vitamin đã được nghiên cứu Mn, Cu, Zn và nhiều nguyên tố vi

lượng khác tập trung trong các cơ quan chứa nhiều vitamin Coban trong vitamin

B12; boron có liên quan đến sinh tổng hợp vitamin C; Mn, B, Zn, Mo, Cu có liên

quan đến sinh tổng hợp vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12) Các nguyên tố vi lượng

có tác dụng lớn đối với quá trình quang hợp Sinh tổng hợp chlorophyll không

những cần có Fe, Mg mà cả Mn, Cu trong lục lạp Các nguyên tố Co, Cu, Zn, Mo

có ảnh hưởng tốt đến độ bền vững của chlorophyll Các nguyên tố Zn, Co có tác

động tích cực đến sự tổng hợp carotenoid… B, Mn, Zn, Cu, Co, Mo tham gia

trong việc thúc đẩy sự vận chuyển các sản phẩm quang hợp từ lá xuống các cơ

quan dự trữ [5]

Ngoài ra, các nguyên tố vi lượng còn góp phần làm tăng khả năng chống chịu

của thực vật trong điều kiện bất lợi Theo El-Fouly và cộng sự (2011), dung dịch hỗn

hợp của 3 nguyên tố vi lượng Fe, Mn, Zn (tỷ lệ 1:1:1) ở 2 nồng độ 0,1 và 0,15% có

tác động làm tăng khả năng chịu mặn của lúa mì [20] Ashraf và cộng sự (2012),

cho rằng các nguyên tố vi lượng là cần thiết cho cây họ đậu trồng trong đất có độ

ẩm thấp Các nguyên tố vi lượng có vai trò đối với hầu hết các loại cây họ đậu, đặc

biệt để chống lại các tác động có hại của hạn hán đến quá trình tăng trưởng, năng

suất và các hoạt động trao đổi chất của cây Việc sử dụng các nguyên tố vi lượng ở

nồng độ thích hợp sẽ làm tăng khả năng cố định nitơ, hàm lượng chất khô và năng

suất hạt của cây họ đậu Hơn nữa, chúng là thành phần thiết yếu của enzyme, chuỗi

truyền điện tử và kích hoạt các hoạt động trao đổi chất trong cây họ đậu để chống

lại điều kiện bất lợi [9]

1.2.1 Vai trò của sắt đối với sự phát triển của cây trồng

Sắt là một trong các nguyên tố vi lượng có vai trò quan trọng và cần thiết cho

quá trình quang hợp và hô hấp của cây Sắt tham gia vào hệ thống các enzyme để

thực hiện phản ứng oxy hóa khử và chuỗi vận chuyển điện tử trong cây, tổng hợp

chất diệp lục, duy trì cấu trúc của lục lạp Sắt là một phần trong cấu trúc hoạt động

sống của cây trồng như hệ Herm trong diệp lục, chuỗi vận chuyển điện tử ở cây

trồng, tổng hợp enzyme Sắt có vai trò điều hòa những phản ứng cần thiết để thực

vật phát triển và sinh sản như: hô hấp, quang hợp, khử nitrat và sulfat Ở những cây

thiếu sắt, lượng sắt do bộ rễ hấp thụ trước hết được sử dụng cho nhu cầu của rễ

chính rồi sau đó được vận chuyển tới các mô có tốc độ phát triển mạnh mẽ nhất

Quá trình thâm nhập của sắt vào bên trong tế bào của phần rễ diễn ra dễ dàng nhờ

sự trợ giúp của các ion citrat có sẵn trong các kênh dẫn của cây Khi đó, các nguyên

tử sắt tạo phức với citrat và vận chuyển bên trong cây dưới dạng phức chelate [5]

Hàm lượng sắt trong đất khá cao, khoảng 10% và thường ở dạng các hợp

chất oxide, hydroxide, phosphate Trong môi trường đất thoáng khí, hữu cơ có tính

kiềm thì sắt ở hóa trị III, trong điều kiện ngập nước, chua, sắt thường ở dạng hóa trị

II

Sắt thường được sử dụng như một loại phân bón tác động vào quá trình nảy

mầm và cây con mang lại hiệu quả cao Phân bón sắt có hai dạng: sắt sulfat và sắt

chelate Sắt sulfat (FeSO4) chứa khoảng 20% sắt Phân bón sắt có giá thành rẻ và

chủ yếu được sử dụng để phun trên lá Bón cho đất thường không hiệu quả, đặc biệt

là độ pH trên 7,0 bởi vì sắt dễ biến đổi thành Fe3+ và gây kết tủa sắt oxide Chelate

là các hợp chất ổn định, các ion kim loại bảo vệ chúng khỏi quá trình oxy hóa và

nước mưa Dạng muối phức này cho phép làm tăng lượng nitơ trong cây lên 16 -

21%, phosphor tăng 18 - 20%, đồng thời giảm thiểu rõ rệt nguy cơ nhiễm bệnh Sử

dụng sắt dưới dạng dung dịch muối trộn lẫn với một số nguyên tố vi lượng khác để

xử lí khoai tây trước khi gieo trồng kết hợp với một số chất điều hòa sinh trưởng

làm tăng năng suất khoai tây lên trên 10% [49]

1.2.2 Vai trò của đồng đối với sự phát triển của cây trồng

Hàm lượng trung bình của đồng trong mô thực vật là 0,02 mg/kg chất khô

Trong cơ thể thực vật, đồng thường xuất hiện ở các bộ phận đang sinh trưởng Đồng

tham gia vào thành phần của hệ enzyme oxidase Đồng có tác dụng lớn đến quá

trình tổng hợp protein, tham gia vào giai đoạn đầu của quá trình đồng hóa nitrat Vai

trò của đồng đối với tổng hợp protein có liên quan đến quá trình trao đổi acid

nucleic Đồng góp phần tích cực trong quá trình chuyển hóa glucide, phospholipid,

nucleoprotein, quá trình trao đổi vitamin, kích thích các yếu tố sinh trưởng Đồng có

liên quan đến dinh dưỡng nitơ vì vậy lúc bón phân đạm nhất là NH4+ thì nhu cầu về

đồng của cây cũng tăng lên Đồng tăng tính chịu lốp đổ nhờ điều tiết hàm lượng các

chất ức chế có bản chất phenol của cây, làm tăng tính chống nấm bệnh Ngoài việc

chống đổ cây, đồng còn có tác dụng chống hạn, chống rét và tăng khả năng giữ

nước của mô Thiếu đồng, cây sẽ phát triển chậm, mất nước và héo Đối với các cây

thân thảo, thiếu đồng sẽ dẫn đến hiện tượng đầu lá bị trắng, hoa không phát triển

Đối với các cây ăn quả, thiếu đồng gây ra hiện tượng khô đỉnh Cây khoai tây, cà

chua thiếu đồng sẽ dễ bị nấm bệnh Nguồn phân bón cung cấp đồng phổ biến là

CuSO4.H2O chứa 35% đồng, CuSO4.5H2O chứa 25% đồng hoặc cũng có thể sử

dụng phế liệu sản xuất từ quặng pyrit đồng để bón cho cây [5]

1.2.3 Vai trò của kẽm đối với sự phát triển của cây trồng

Kẽm có tác động đến hầu hết quá trình sinh lí, sinh hóa của thực vật bao gồm

dinh dưỡng khoáng, hô hấp, quang hợp, sinh tổng hợp chất hữu cơ, sự thoát hơi

nước, hình thành các mô mới và khả năng chống chịu của cây [5]

Kẽm đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở thực vật do

tác động đến hoạt động của enzyme hydrogenase và carbonic anhydrase, duy trì tính

ổn định của các tiểu phần ribosome và tổng hợp cytochrome Các enzyme thực vật

được hoạt hóa bởi kẽm tham gia vào quá trình trao đổi chất carbohydrate, duy trì

tính toàn vẹn của màng tế bào, điều hòa auxin, tổng hợp và tạo phấn hoa Kẽm tham

gia vào việc điều hòa và duy trì sự biểu hiện gen liên quan đến khả năng chống chịu

của thực vật trong điều kiện bất lợi Kẽm cũng là yếu tố cần thiết cho việc tổng hợp

tryptophan, tiền chất của IAA (Indole-3-acetic acid ), có vai trò quan trọng trong

quá trình sinh tổng hợp hormone auxin Thiếu kẽm sẽ làm cây phát triển còi cọc,

tăng khả năng bị bệnh, ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng và sản phẩm thu hoạch

[21]

Hàm lượng kẽm trong cây dao động khoảng 15 - 22 mg/kg chất khô Phân

bón kẽm được cung cấp ở một số dạng như: kẽm sunfat, kẽm sunfat heptahydrat,

kẽm sunfat hydroxide, kẽm clorua, kẽm nung chảy với silicat

1.2.4 Vai trò của coban đối với sự phát triển của cây trồng

Coban (Co) là thành phần thiết yếu trong cấu trúc của nhiều enzyme và

co-enzyme ở thực vật Coban tác động đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của thực vật

ở nhiều mức độ khác nhau tùy thuộc vào nồng độ của coban trong rễ và đất Trong

thực vật, coban là thành phần trung tâm của vitamin cobanlamin (vitamin B12)

Hoạt tính xúc tác của carboxylase được gia tăng khi có mặt Mg, Mn, Co Coban cần

cho việc ra hoa, tạo quả, chống sâu bệnh, nắng nóng, tác động tốt đến độ bền vững

của chlorophyll và quá trình tổng hợp carotenoid Coban hiện đang được sử dụng để

diệt khuẩn và tăng sức đề kháng trên rau quả Sự có mặt của coban rất cần thiết

trong quá trình lên men, trao đổi chất và có ý nghĩa đối với cố định nitơ phân tử

bằng con đường sinh học ở cây họ đậu [40] Ngoài ra, coban cũng làm tăng khả

năng hấp thụ lân của cây

Loại phân bón được sử dụng rộng rãi và phổ biến để bổ sung coban là

CoSO4.7H2O có chứa 21% Co

1.3 Công nghệ nano và ứng dụng trong nông nghiệp

1.3.1 Giới thiệu chung về công nghệ nano

Công nghệ nano là ngành công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích,

chế tạo và ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình

dáng và kích thước trên quy mô nanomet (≤ 100 nm) [18] Ý tưởng đầu tiên về công

nghệ nano được đưa ra bởi nhà vật lý học người Mỹ Richard Feynman vào năm

1959 Tới năm 1974, thuật ngữ “công nghệ nano” bắt đầu được Nario Taniguchi sử

dụng để đề cập đến khả năng chế tạo cấu trúc vi hình của mạch vi điện tử [35] Vật

liệu nano mang các đặc tính lý hóa khác biệt, thường là vượt trội hơn so với các vật

liệu thô tương ứng ban đầu, dựa vào hai đặc điểm chủ yếu là hiệu ứng bề mặt và

hiệu ứng lượng tử [47] Những đặc điểm này ảnh hưởng đến đặc tính hóa lý chung

của các vật liệu nano và thậm chí tạo ra các đặc tính mới không giới hạn

Trong những thập kỷ vừa qua, các thành tựu trong nghiên cứu khoa học đã

thúc đẩy công nghệ nano trở thành công nghệ mới có vai trò quan trọng trong việc

cải thiện giá trị kinh tế của các sản phẩm phục vụ cho đời sống của con người

Thành công đầu tiên trong ứng dụng công nghệ nano là tạo ra các chip điện tử có

dung lượng lớn và tốc độ xử lý cực nhanh trong thiết bị viễn thông,…Trong y học,

sử dụng các hạt nano liên kết với các phối tử như kháng thể, peptide hay các phân

tử nhỏ,… để nhắm mục tiêu là tế bào ung thư Với kích thước trung bình từ 5-100

nm, các hạt nano có vùng bề mặt lớn và các nhóm chức năng để kết hợp với các

chất chẩn đoán (quang học, phóng xạ) cho phép phát hiện ung thư sớm đồng thời

hướng đích thuốc điều trị ung thư để không làm ảnh hưởng đến các tế bào bình

thường [39] Bên cạnh đó, công nghệ nano còn mở ra tiềm năng ứng dụng trong

công nghệ tái tạo mô xương, van tim, mạch máu,…[52] Kể từ đầu những năm

2000, công nghệ nano cũng đã đưa ngành công nghiệp thời trang bước sang một

trang mới với việc sử dụng hạt nano bạc để tạo ra quần áo, tất có khả năng diệt vi

khuẩn gây mùi hôi khó chịu Công nghệ nano cũng đã góp phần giải quyết nhiều

vấn đề liên quan đến nông nghiệp và đem lại sự cải thiện to lớn so với nền nông

nghiệp truyền thống Việc sử dụng các hạt nano trong việc đẩy mạnh sinh trưởng

của cây trồng và kiểm soát một số bệnh trên cây trồng cũng đang được thực hiện

Hơn thế nữa, các nhà khoa học đã và đang tìm cách đưa công nghệ nano ứng dụng

ngày càng sâu rộng hơn vào trong đời sống và đặc biệt là việc giải quyết các vấn đề

mang tính toàn cầu như ô nhiễm môi trường, cải tạo môi trường

1.3.2 Hạt nano kim loại

Hạt nano (nanoparticles - NPs) là các nguyên tử hoặc phân tử tổng hợp có

kích thước trong khoảng từ 1-100 nm NPs có thể được tạo ra từ nhiều loại vật liệu

thô và khả năng hoạt động của NPs phụ thuộc vào thành phần hóa học, kích thước

hoặc hình dạng của các hạt Có thể chia các NPs thành 3 nhóm dựa vào nguồn gốc

hình thành: tự nhiên, ngẫu nhiên và nhân tạo Các hạt nano kim loại phần lớn thuộc

nhóm NPs nhân tạo, chúng không chỉ mang các đặc tính hóa lý độc đáo mà còn

mang những tác động sinh học rất đa dạng Trong những năm gần đây, hạt nano và

các hạt khoáng có kích thước nano của các kim loại quý là đối tượng nghiên cứu

chuyên sâu bởi chúng có các đặc tính điện tử, quang học, từ tính và lý hóa rất đặc

biệt [47]

Các hạt nano kim loại được chế tạo bằng các phương pháp vật lý và hóa học

khác nhau Các phương pháp vật lý được áp dụng phổ biến là phóng điện hồ quang,

nghiền bi năng lượng cao, nhiệt phân và bóc lớp laze Các phương pháp hóa học

bao gồm ngưng tụ hóa hơi, điện hóa, hóa siêu âm, sol – gel, đồng kết tủa, mixen

đảo, khử hóa học Trong số các phương pháp kể trên, phương pháp khử hóa học

được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong nông nghiệp

nhằm tạo ra các sản phẩm hạt nano có vai trò kích thích sinh trưởng của cây trồng

[23]

1.3.3 Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ nano – hạt nano kim loại trong nông

nghiệp

1.3.3.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Trên thế giới, nhiều quốc gia đã xác định được tiềm năng của công nghệ

nano trong lĩnh vực nông nghiệp và đang nỗ lực khám phá và phát triển tiềm năng

này nhiều hơn thông qua nghiên cứu Việc áp dụng công nghệ nano vào nông

nghiệp được đặt ra lần đầu tiên trong chương trình hành động của Bộ Nông nghiệp

Hoa Kỳ vào tháng 9/2003 và đã được dự đoán sẽ là công nghệ then chốt làm thay

đổi sản xuất nông nghiệp trong tương lai [24] Trong những năm đầu tiên, việc ứng

dụng công nghệ nano trong sản xuất nông nghiệp vẫn còn là lý thuyết, nhưng sau đó

đã đạt được thành tựu đáng kể trong một số lĩnh vực quan trọng như lai tạo các

giống cây trồng mới; phát triển các vật liệu mới như phân bón nano, thuốc trừ sâu

nano thay thế hóa chất nông nghiệp truyền thống; chế phẩm nano xử lý các chất thải

nông nghiệp; cảm biến nano phát hiện mầm bệnh và giám sát điều kiện môi trường

trên cánh đồng [37] Bên cạnh đó, các sản phẩm của công nghệ nano còn giúp cải

thiện các đặc tính sinh học của cây trồng và vật nuôi như tăng năng suất, tăng khả

năng hấp thụ chất dinh dưỡng và chuyển đổi kỹ thuật canh tác tân tiến hơn [51]

Việc sử dụng phân bón nano để thay thế phân bón hóa học thông thường giúp tăng

hiệu quả sử dụng chất dinh dưỡng và tăng khả năng chống chịu của cây trồng trong

điều kiện khí hậu ngày càng bất lợi Đặc biệt, vật liệu nano an toàn, thân thiện với

môi trường, đồng thời còn giúp cải tạo môi trường bị ô nhiễm [43]

Trong trồng trọt, một số nghiên cứu gần đây về ảnh hưởng của việc xử lý hạt

giống của một số đối tượng cây trồng với hạt nano kim loại trước khi gieo đã được

công bố Theo Prasad và cộng sự (2012), khi sử dụng hợp chất nano oxit kẽm

(nZnO) xử lý trên hạt lạc trước khi gieo với những liều lượng khác nhau, đã cho

thấy nZnO ở liều lượng 1000 ppm làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm, sức sống cây con,

hàm lượng diệp lục trong lá, cây ra hoa sớm và năng suất cao hơn 34% so với

nghiệm thức xử lý hạt với ZnSO4 Nghiệm thức nano trên đã được áp dụng trong

thí nghiệm ở quy mô đồng ruộng trong vụ Đông Xuân 2008/2009, kết quả cho thấy

việc xử lý với nghiệm thức nZnO ở liều lượng thấp hơn 15 lần so với ZnSO4 cho

năng suất hạt cao hơn từ 26,3 – 29,5%, tuy nhiên khi xử lý với nồng độ nZnO cao

hơn (2000 ppm) thì cây sinh trưởng và phát triển kém [42] Năm 2013,

Mahmoodzadeh và cộng sự đã nghiên cứu tác động của nano titan oxit với những

nồng độ khác nhau (10, 100, 1000, 1200, 1500, 1700 và 2000 mg/L) trên đối

tượng cây cải dầu, đã xác định nano titan oxit ở nồng độ 2000 mg/L đã làm gia

tăng tỷ lệ và khả năng nảy mầm [32]

Trong các nguyên tố hóa học cần thiết cho quá trình phát triển bình thường

của thực vật, các vi chất như mangan (Mn), đồng (Cu), sắt (Fe), kẽm (Zn), bo (Bo),

clo (Cl), molipđen (Mo), coban (Co) có tác dụng thúc đẩy sự phát triển của cây

Năng suất cây trồng tăng lên không ngừng theo sau cuộc Cách mạng Xanh đã làm

giảm đi số lượng lớn các chất vi lượng có sẵn trong đất như Zn, Fe và Mo và các

phương pháp hạn chế độ chua của đất cũng góp phần vào việc thiếu hụt các vi chất

trong cây trồng do thiếu vi chất trong đất [8] Một số ít nghiên cứu đánh giá ảnh

hưởng không mong muốn của các vật liệu nano đến các loài cây trồng cho thấy thực

tế phần lớn các trường hợp hạt nano là có lợi hoặc không có ảnh hưởng đáng kể đến

hoạt động bình thường của cây, một số ít trường hợp gây ảnh hưởng bất lợi cho

những loài cây trồng nhất định [11, 45]

Các nhà khoa học cho rằng dưới tác động của các hạt nano, các tế bào thực

vật sẽ phản ứng bằng cách thay đổi sự biểu hiện gen và một số con đường sinh hóa

liên quan, từ đó ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng Tuy

nhiên, cho tới nay chỉ có một số ít các công bố về cơ chế tác động của các hạt nano

đối với một số loại thực vật Phần lớn các nghiên cứu mới chỉ tập trung tìm hiểu các

cơ chế vận chuyển và hấp thụ của các loại hạt nano kim loại

Đối với các hạt nano thuộc nhóm carbon, khả năng hấp thụ NPs của cây phụ

thuộc vào khả năng phân tán của chúng trong môi trường đất, trong đó các vật liệu

hữu cơ tự nhiên (NOM) với tính kỵ nước dễ dàng tương tác với các NP kỵ nước dẫn

đến hình thành quá trình cân bằng động giữa NP-NOM Lin và cộng sự (2009) đã

nghiên cứu quá trình hấp thụ, vận chuyển và tích lũy của các hạt nano carbon dạng

fulleren C70 và dạng ống nano carbon đa vách (MWCNT) trong cây lúa Kết quả

cho thấy, các hạt C70 dưới dạng tập hợp màu đen được tập trung trong phần rễ

nhiều hơn so với trong thân và lá của cây lúa sau khi nảy mầm Sự hiện diện của tổ

hợp NOM-C70 trong lá lúa được các tác giả dự đoán rằng chúng đã được vận

chuyển theo các kênh dẫn nước và dinh dưỡng từ rễ lên Trong khi đó ở cây trưởng

thành C70 chủ yếu được tập trung tại phần lá và hệ thống dẫn trong thân cây và hầu

như không có mặt trong rễ Kết quả này chứng tỏ NPs được vận chuyển từ rễ lên

các phần khác của cây lúa Sự vận chuyển của C70 trong cây lúa được xem là được

thực hiện dưới tác dụng của lực thẩm thấu Ngược lại, đối với tổ hợp

NOM-MWCNT thì quá trình hấp thụ diễn ra không đáng kể [28] Chen và cộng sự (2010)

đã chứng minh tổ hợp C70-NOM kỵ nước bao vây các mao quản trên thành tế bào,

trong khi đó các hạt nano fullerol C60(OH)20 có tính ưa nước nên dễ dàng đi qua

thành tế bào hành tây Allium cepa và tập trung ở khoang giữa thành tế bào và màng

plasma [14] Khodakovskaya và cộng sự (2009) đã đề xuất giải pháp sử dụng kết

hợp các phương pháp Raman, nhiệt quang và âm quang (PT - photothermal, PA -

photoacoustic) kết hợp với kỹ thuật di truyền để nghiên cứu sự tương tác giữa các

ống nano carbon với cây Với cách tiếp cận này, các tác giả đã phát hiện ra rằng

MWCNTs có thể gây ra những biến đổi trước đây chưa được biết về biểu hiện của

một số gen quan trọng trong lá và rễ cây cà chua Gen liên quan đến stress và gen

LeAqp2 liên quan đến kênh dẫn nước trong cây đã được hoạt hóa tăng biểu hiện,

dẫn đến tăng tốc độ nảy mầm và phát triển của mầm cây cà chua được nuôi trong

môi trường có chứa các ống nano carbon [25]

Đối với các hạt nano oxit kim loại, Asli và Neumann (2008) đã khảo sát quá

trình hấp thụ và vận chuyển các hạt nano TiO2 (30 nm) trong các rễ đã được loại bỏ

đầu rễ và cho thấy ở tiết diện đỉnh rễ đó không có mặt các hạt nano, có thể do kích

thước hạt nano TiO2 lớn hơn đường kính mao quản của thành tế bào rễ (6,6 nm)

[10] Quá trình hấp thụ magnetit (Fe3O4, 20 nm) của chồi cây bí ngô đã được Zhu

và cộng sự (2008) nghiên cứu trong môi trường nuôi trồng thủy canh (hydroponic)

Kết quả cho thấy, các tín hiệu từ các hạt nano từ tính đều được ghi nhận trong rễ,

thân và lá của chồi cây bí ngô Các tác giả cũng cho thấy, khả năng hấp thụ NPs

phụ thuộc vào môi trường sinh trưởng vì quá trình hấp thụ hạt nano không được

phát hiện khi cây sinh trưởng trên môi trường đất và suy giảm đáng kể trong môi

trường cát Điều đó có thể là do hiện tượng bám dính, khó giải phóng của các hạt

nano sắt từ trên các hạt đất và cát Ngoài ra, khả năng hấp thụ nano sắt từ còn phụ

thuộc vào loài cây, không có sự hấp thụ đối với loài đậu Phaseolus limensis [56]

Mặt khác, Wang và cộng sự (2011) đã không phát hiện được sự hấp thụ Fe3O4 có

đường kính 25 nm bởi cây bí ngô và cho rằng các hạt nano có kích thước lớn ít có

khả năng xâm nhập qua thành tế bào và vận chuyển qua màng plasma Lý do có thể

là mao quản thành tế bào có kích cỡ từ 2-20 nm nên chỉ cho phép ion và các phân

tử nước với kích thước khoảng 0,28 nm đi qua [53] Các công trình nghiên cứu về

quá trình vận chuyển của NPs trong cây lương thực được tìm thấy không nhiều Sự

khác biệt về quá trình vận chuyển của các hạt nano ZnO và CeO2 trong cây đậu

tương đã được Lopez-Moreno và cộng sự (2010) tiến hành Các hạt nano CeO2

được cây đậu tương hấp thu nguyên dạng mà không bị chuyển hóa thành dạng ion

Ce4+, trong khi nguyên tố Zn trong cây chỉ được tìm thấy dưới dạng ion Zn2+ Trên

cơ sở kết quả phân tích khẳng định lượng ion Zn2+

giải phóng ra từ các hạt nano ZnO vào dung dịch thủy canh trong suốt thời gian khảo sát rất thấp (8-25 mg/L đối

với nồng độ ZnO 500-4000 mg/L), có thể dự đoán rằng các hạt nano ZnO đã được

chuyển hóa trên bề mặt rễ cây đậu tương [29] Quá trình hấp thụ và vận chuyển các

hạt nano Ni(OH)2 (8,7 nm) trong loài cây Prosopis sp đã được Parsons và cộng sự

(2010) khảo sát, kết quả phân tích phổ tia XANES cho thấy sự có mặt của các hạt

nano Ni(OH)2 trong rễ và chồi của cây mà hạt giống đã được xử lý bằng hạt nano

không có lớp bảo vệ, trong khi đó đối với cây được xử lý bằng hạt nano được bọc

một lớp citrat thì các hạt nano Ni chỉ được tìm thấy trong rễ [41] Tuy nhiên, sự

chuyển hóa trong các hạt nano khác như C70, MWCNTs, SWCNTs, Fe3O4 và TiO2

không được quan sát thấy [48, 56]

Đối với các hạt nano thuộc nhóm kim loại hóa trị không, Lee và cộng sự

(2008) đã khảo sát quá trình hấp thụ và vận chuyển nano đồng (nCu) trong cây đậu

xanh (mungbean) và cây lúa mỳ phát triển trong môi trường thạch chứa nCu Kết

quả cho thấy, nCu được tích lũy trong 2 loài cây này tương ứng là 8 và 32 mg/kg

sinh khối trên môi trường chứa nCu với nồng độ 1000 mg/L [27] Quá trình hấp

thụ nano nhôm (nAl) của một loài đậu đã được Doshi và cộng sự (2008) khảo sát

trong môi trường đất có chứa 10-10000 mg nAl (1-100 nm) trong 1 kg đất trồng,

kết quả là hàm lượng nAl trong cây đậu không có gì khác biệt so với mẫu đối

chứng [17] Stampoulis và cộng sự (2009) là nhóm đầu tiên nghiên cứu quá trình

hấp thu nano bạc (nAg) trong cây bí ngô (Curcubita pepo) Nồng độ nAg được tìm

thấy trong chồi được xử lý với 10-1000 mg/L nAg trung bình lớn hơn 4,7 lần so

với trường hợp xử lý bằng dung dịch huyền phù của bột bạc khối có cùng nồng độ

Đó là do các ion bạc được giải phóng ra nhanh hơn từ các hạt nano bạc Trong khi

đó, nAg không được tìm thấy trong cây bắp cải đã được xử lý với nAg [48] Điều

đó cho thấy, sự hấp thụ các hạt nano kim loại hóa trị không phụ thuộc vào loài cây

cũng như bản chất của hạt nano kim loại này

1.3.3.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, công nghệ nano bước đầu cũng đã được nghiên cứu và ứng

dụng trong nông nghiệp Các nhà khoa học thuộc Viện Công nghệ môi trường (Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) hợp tác với các nhà khoa học Liên

bang Nga đã chế tạo thành công các hạt nano kim loại hóa trị không Ag, Fe, Co, Cu

và nano ZnO dưới dạng bột siêu phân tán Các chế phẩm nano kim loại này được

đánh giá hiệu quả thông qua việc nghiên cứu tác động của chúng đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của một số loại cây trồng Theo Quoc Buu Ngo và cộng sự

(2014), khi sử dụng nano kim loại Fe, Co, và Cu dạng bột ngâm nước xử lý với hạt

giống đậu tương ĐT51 trước gieo trồng đã làm tăng tỷ lệ nảy mầm 25%, tăng hàm

lượng diệp lục từ 7-15%, gia tăng số lượng nốt sần từ 20-49% và tăng năng suất

16% so với đối chứng [38] Vụ Đông xuân 2013-2014, Trung tâm Nghiên cứu Thực

nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc phối hợp cùng Viện Công nghệ Môi trường (Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) đã khảo sát, đánh giá vật liệu nano

kim loại Fe, Co và Cu trên đậu tương và ngô lai Qua các nghiệm thức xử lý trên hạt

đậu tương trước gieo trồng cho thấy, tỷ lệ nảy mầm và sức sinh trưởng ban đầu ở

thời kỳ 6-10 ngày sau gieo của đậu tương được gia tăng đáng kể, chiều cao cây tăng

hơn đối chứng không xử lý từ 2-8%, số lượng quả chắc trên cây đạt cao hơn đối

chứng từ 27-48% [1] Đối với cây ngô, năng suất hạt ngô cao nhất ở nghiệm thức

xử lý nCu, đạt 9 tấn/ha, vượt 10% so với đối chứng [4] Trong vụ Xuân Hè, tháng

1-4/2014, Viện Công nghệ Môi trường đã tiến hành khảo sát tác động của hạt nCu đến

khả năng sinh trưởng, năng suất và chất lượng của 3 giống lúa ngắn ngày được

trồng phổ biến ở phía Nam: VN121, OM4900 và IR50404, trên chân ruộng chủ

động được nước tưới tại xã Long Phước, huyện Long Thành, Đồng Nai Kết quả

cho thấy, hạt nCu có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển, tính chống chịu

và năng suất lúa theo hướng rút ngắn thời gian sinh trưởng, tăng cường tính chống

chịu đạo ôn và tăng năng suất lúa Tháng 10-11/2014, Phòng Nghiên cứu Bảo vệ

thực vật thuộc Viện KHKT Nông Nghiệp Miền Nam đã tiến hành thí nghiệm đánh

giá hiệu lực phòng trừ bệnh đốm nâu thanh long của nAg Ở điều kiện in vitro nAg

nồng độ 25-250 ppm có khả năng ức chế sự phát triển của nấm N dimidiatum tương

đương với các loại hóa chất diệt nấm đang được sử dụng phổ biến trong phòng trừ

bệnh đốm nâu thanh long tại Bình Thuận, Long An và Tiền Giang Trong điều kiện

nhà lưới, nghiệm thức nAg-C1 có khả năng phòng trừ hiệu quả 95,53% bệnh đốm

nâu thanh long ở thời điểm 7 ngày sau lần phun 2, sau lần phun 3 hiệu quả phòng

trừ bệnh là 100% và duy trì ở mức 98% đến thời điểm 14 ngày sau 3 lần phun [7]

Gần đây, theo Luong Thien Nghia và cộng sự (2017), hạt nAg có ảnh hưởng tăng

cường sinh trưởng phát triển của cây hoa cúc (Chrysanthemum sp.) trong ống

nghiệm [30]

Nghiên cứu về cơ chế tác động của các vật liệu nano trong đó có các loại hạt

nano kim loại đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng nói chung, nhằm

cải thiện năng suất và chất lượng nông sản là một hướng nghiên cứu khá mới mẻ và

đang được các nhà khoa học trên thế giới rất quan tâm Kết quả nghiên cứu của các

công bố trong và ngoài nước cho thấy, hạt nano kim loại có tác động tích cực đến

quả trình sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng Tuy nhiên, hiểu biết về cơ

chế tác động của hạt nano kim loại đến các quá trình sinh lý, sinh hóa của cây trồng

vẫn còn hạn chế, vì thế có thể làm chậm lại quá trình ứng dụng sản phẩm của công

nghệ cao trong sản xuất lương thực và thực phẩm cho người và động vật Mặc dù

công nghệ nano đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kinh

tế, xã hội và đời sống với rất nhiều ưu điểm và lợi ích nhưng việc sử dụng vật liệu

nano trong sản xuất nông nghiệp là một nhiệm vụ mới và có nhiều thách thức ở Việt

Nam Nhất là trong bối cảnh, Việt Nam đang phải đối mặt với việc thiếu hụt về sản

lượng lương thực trong tương lai do quá trình đô thị hóa ngày càng tăng, diện tích

đất trồng đang giảm sút cộng thêm việc dân số tăng cao, thu nhập từ nông nghiệp

đang ngày bị giảm Ngoài ra, còn có nhiều vấn đề môi trường gây ra từ sản xuất

nông nghiệp như sử dụng phân bón hóa học và hóa chất bảo vệ thực vật làm tăng ô

nhiễm hệ sinh thái Việc làm này giúp nâng cao năng suất cây trồng, giải quyết

được yêu cầu trước mắt trong quá trình canh tác nhưng mang lại nhiều bất lợi lâu

dài và làm tăng chi phí sản xuất do giá thành phân bón hóa học ngày càng tăng Mặt

khác, sử dụng phân bón hóa học trong thời gian dài sẽ làm cho đất bị khô cằn,

lượng phân bón dưa thừa sẽ gây ô nhiễm môi trường nước và không khí, đồng thời

giảm lợi nhuận trong quá trình canh tác Do vậy, sử dụng các chế phẩm nano để cải

thiện năng suất và chất lượng nông sản là hướng đi hiệu quả, thân thiện với môi

trường Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng và tìm hiểu cơ chế tác động cũng như con

đường dẫn truyền các hạt nano xảy ra trong tế bào thực vật, tương tác giữa các hạt

nano với các thành phần tế bào gây ra sự thay đổi sinh lý, sinh hóa, biến đổi ở mức

độ gen và protein… là yêu cầu cấp thiết và có ý nghĩa rất quan trọng; là nền tảng

trong việc định hướng khả năng ứng dụng các vật liệu nano để tăng năng suất và

chất lượng nông sản, góp phần phát triển nền nông nghiệp bền vững và hiệu quả

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

- Giống đậu tương ĐT26 được cung cấp bởi Trung tâm Nghiên cứu và Phát

triển Đậu đỗ thuộc Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm Đây giống đậu tương

có năng suất, chất lượng cao và khả năng chống bệnh tốt, đang được trồng phổ biến

ở các tỉnh phía Bắc

- Các loại hạt nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu bao gồm nano đồng

(nCu), nano sắt (nFe), nano coban (nCo), nano kẽm oxit (nZnO) được tổng hợp và

cung cấp bởi Viện Công nghệ môi trường - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam; hạt nFe*, nCu* và nCo* được cung cấp từ công ty thương mại của Mỹ

Hạt nano trước khi sử dụng trong thí nghiệm được kiểm tra chất lượng bằng phương

pháp đo XRD, đạt độ tinh sạch > 95%, kích thước hạt nano trung bình từ 20-60 nm

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

2.2.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ các hãng hóa chất

chuyên dụng và đạt tiêu chuẩn quốc tế như Fermentas (Mỹ), Thermo Scientific

(Mỹ), Biolabs (Mỹ), và Sigma (Mỹ) Một số hóa chất chính gồm:

- Bộ kit tổng hợp cDNA: Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit

(Thermo scientific)

- Đệm TAE 50 X (Tris-acetate-EDTA) (Tris-base 24,2%; acid acetic

5,71%; EDTA 50 mM, pH 8,0)

- Agarose (Fementas); đệm tra mẫu 6X; thuốc nhuộm gel Redsafe

- Đệm chiết CTAB 4% , dung dịch Trizol (Invitrogen)

- Sodium acetate pH 5.2 ; Tris buffer, pH 7.5; Nuclease P1 (Sigma);

Alkaline Phosphatase (Sigma)

2.2.2 Thiết bị

Đề tài được thực hiện tại Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các

thiết bị nghiên cứu chính sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2

Bảng 2 Các thiết bị chính được sử dụng trong đề tài

Bể siêu âm S120/H ELMA

Kính hiển vi 2 mắt Zeiss Primo Star Zeiss

2.2.3 Dụng cụ và vật tư tiêu hao

Các dụng cụ, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn có

xuất xứ từ những hãng uy tín như: Biologix (Mỹ), Corning (Mỹ),…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Khử trùng hạt giống

Hạt đậu tương được khử trùng bề mặt để loại bỏ khả năng ảnh hưởng của

các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm… ở bên ngoài tác động đến quá trình nảy mầm

Hạt được khử trùng bề mặt bằng khí chlorine (tạo ra từ hỗn hợp 100 mL dung dịch

NaOCl và 3mL HCl đậm đặc) trong 4 giờ [15] Hạt sau khi được khử trùng có thể

được dùng ngay hoặc bảo quản ở 4oC khoảng 1-2 tuần cho thí nghiệm tiếp theo

2.3.2 Chuẩn bị các dung dịch hạt nano kim loại

Các hạt nano kim loại được pha với nước cất khử ion vô trùng theo các nồng

độ nghiên cứu (Bảng 3) và siêu âm (200W, 37kHz) trong thời gian 30 phút để tạo

dung dịch nano siêu phân tán ngay trước khi tiến hành các thí nghiệm xử lý hạt đậu

tương [12]

Bảng 3 Nồng độ các dung dịch nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu

2.3.3 Xử lý hạt đậu tương với các dung dịch hạt nano kim loại

- Chuẩn bị môi trường thạch (agar): Đun sôi hỗn hợp thạch theo tỷ lệ 5 g

thạch/1L nước cất Đổ thạch vào các hộp nhựa sạch, mỗi hộp 450 ml (độ

dày của lớp thạch trong hộp khoảng 3 cm), để thạch nguội hoàn toàn

- Trộn hạt đậu tương đã khử trùng với dung dịch nano đã chuẩn bị theo tỷ lệ

100 g hạt/ 35 ml dung dịch nano siêu phân tán Ủ hạt trong 30 phút, tại nhiệt

độ phòng Đối chứng âm là hạt đậu tương được ủ với nước cất khử ion

- Đặt hạt lên môi trường thạch, các hạt cách nhau 1 cm

- Bổ sung 15 ml nước cất khử ion vô trùng vào mỗi hộp môi trường, đặt giấy

thấm lên bề mặt hạt đậu tương và đóng nắp hộp

- Đặt các hộp mẫu trong tối, ở nhiệt độ phòng

2.3.4 Phân tích các chỉ tiêu về hình thái

Tác động của các hạt nano kim loại sử dụng trong nghiên cứu đến quá trình

nảy mầm của hạt đậu tương được đánh giá thông qua các chỉ tiêu về hình thái bao