Luận văn tốt nghiệp đại học: Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin

Với mục đích phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin, khảo sát ảnh hưởng và điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin của chủng phân lập được, mời các bạn cùng tham khảo luận văn tốt nghiệp đại học Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp Bacteriocin. Hy vọng nội dung luận văn phục vụ hữu ích nhu cầu học tập và nghiên cứu.

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN LACTIC

VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG

HỢP BACTERIOCIN

SVTH: LÊ THỊ HỒNG VÂN

CBHD: THS NGUYỄN VŨ TUÂN

TP Hồ Chí Minh, 01/2008

TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong công nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi từ rất lâu đời bởi ứng dụng phong phú của nó trong cuộc sống Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp các bacteriocin, những peptide hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Để có

những khảo sát sâu hơn trước hết cần phải có chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được

bacteriocin cao Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích:

- Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin

- Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được

Ching vi khuẩn sẽ được phân lập từ các nguồn tự nhiên như sữa tươi tự lên men, các

loại rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá), kim chỉ và giá đỗ

Qua quá trình thí nghiệm, ta có được chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa tươi tự lên men

thể hiện vùng ức chế Ƒ¿sferia monocytogenes chứng tỏ có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin

Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự sinh trưởng và sự sinh tổng hợp

bacteriocin của chủng nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Từ kết quả đạt

được thì khi nuôi cấy chủng trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 30°C chủng sẽ sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất Khi đó, độ đo quang O.D 600nm = 1.417 va hoat tinh bacteriocin dat 2250 AU/ml

Tóm lại, nghiên cứu đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic yêu cầu từ sữa lên men

tự nhiên và điều kiện nuôi cấy tối thích để chủng sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở 30°C

Với những ý nghĩa của nghiên cứu, em hy vọng sẽ làm được những khảo sát có ý nghĩa

và góp phần tạo nền tảng cho những nghiên cứu sau này, mang lại những giá trị thật lớn

trong việc bảo quản thực phẩm, đảm bảo an toàn thực phẩm và nâng cao giá trị sống của

COn người

MỤC LỤC

MO DAU ccccccccssssseccccsssvessccssscececsssveeccensnseessessuvevecearavesecsesseeccessnetesesssnnerecsesaneseeee 1

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1.2 Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 8

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 23

1.2.5 Định vị và tỉnh sạch bacteriocin - co se veseo 26 1.2.6 Ứng dụng của bacteriocin 2s sex re crxxerea 27

1.3 PHẦN LẬP VI KHUẨN LLACTIC -¿+-©2222©2z+tvtEEEEEErrrrrrrrrrrrrrree 33

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Ching vi sinh vật và môi trường nuôi cấy, giữ giống 37

2.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM .2 2+ SE +S+EtEEtEEtSEeEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErEerrerrerees 39

2.3.1 Phương pháp dan đều và cấy ria 5-55 ĂS sec 40

2.3.3 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh

Chương 3: KẾT QUA VA BAN LUẬN

A ^

3.1 PHAN LAP 9Ó 9 6 0000000 0000000 000 00000.000.000 00.000 0.000.000.000 000.0 00 0.0.0.0 00.0 00 0700 0.0 070.000 0 00-0 0 000.00 00.00 0.0.0.0 0 08.0.0000 06.680 0 0 068.08 45

3.2 KHAO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TONG HOP BACTERIOCIN CUA

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

AL KET LUAN occccccccccccsesscssessescssessesussucscssesucsusssscsessessssssescsessesisssesssieareacsaesaseasanees 60 4.2 KIEN NGHI oo cccccccccccsecscsscssescssessessssucssssesscasssscsesssecsssssecsessesscseacsissresreseeseeasanees 60 TAI LIEU THAM KHAO .ccccccccccscsccssssscscsscocsssssscsssveasscsscasavsssacasssavavaueacassasaves 62

PHU LUC «99 90 9 9 9 6 9 0 8 9 9 6 9 0 60886.060.600 8 086108 8.8 8.60 0.6 008 0.8.0 8.8 8 019 0.8.0.8 8 0070 8008.800 9.0.0.8 000 8.0.8.0 6 0.0 000.09 0.0.8.0 8.8.6.0 8.0 6 010.0 0 0 68

Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học tác dụng phổ rộng

với nhiều loài sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người thì những hướng nghiên cứu trên những chất chống vi sinh vật mới có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc

hiệu đối với từng loài vi sinh vật gây hại đang được quan tâm [27]

Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm Đây là

những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở

nhiều nước phát triển Loài có khả năng sinh tổng hợp ra nó cũng không có gì xa lạ với chúng ta, đó là các vi khuẩn lactic, những vi khuẩn mà con người sử dụng trong thực phẩm hang ngan nim nay [16] Bacteriocin tiv Lactococcus lactis là các protein nhỏ, bển nhiệt, chống vi sinh vat Nisin 14 m6t bacteriocin được sử dụng rộng rãi do có hoạt tính với phổ

rộng kháng các vi khuẩn G”, bao gém Listeria monocytogenes, ngan chan sy phat trién cia

bao tf nay mam Bacillus va Clostridium [18]

Các chủng vi khuẩn lactic là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất các thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, phomai Chúng sản xuất rất nhiều các

hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như

là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng [7]

Những chủng vi khuẩn lactic khác nhau sẽ có khả năng sinh tổng hợp những loại bacteriocin khác nhau, với số lượng khác nhau [27] Vì vậy mà việc tìm ra các nguồn tự

nhiên để có thể phân lập ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hàm lượng chất chống vi sinh vật cao là cần thiết

Từ những điều thực tiễn đó, việc tìm ra được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và sản xuất được các loại bacteriocin sử dụng trong việc bảo

quản thực phẩm an toàn là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng Trong bài nghiên cứu này, chúng ta sẽ xây dựng những bước khởi đầu cho việc khảo sát sâu rộng hơn và có giá trị ứng dụng hơn Mục tiêu nghiên cứu của luận văn gồm:

- Từ những nguồn tự nhiên như sữa, kim chi, các rau quả muối chua, giá đỗ phân

lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

- Khảo sát sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin chủng phân lập

được

- Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ lên sự sinh

trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin để từ đó có thể rút ra được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn.

Chương 1:

TỔNG QUAN

1.1 VIKHUẨN LACTIC

1.1.1 Đặc điểm chung

1.1.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vỉ khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria-LAB) là các vi khuẩn G', chịu acid, không hình

thành bào tử, hình que hoặc hình cầu [2] Một số loài hiếu khí và có thể sử dụng oxygen

thông qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi những giống khác ky khí nghiêm ngặt

Vi khuẩn lactic phát triển tối ưu ở pH 5.5—5.8 và và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối v6i cdc amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khoáng, acid béo và carbohydrate

[1, 45]

Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên

men carbohydrate Dic diém nay da gan lién LAB với thực phẩm lên men để acid hoá

ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng LAB, cung cấp một hàng rào ngăn cần vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh

[11]

LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sản phẩm lên men bởi vì hoạt tính trao đổi chất đặc biệt của nó Sự acid hoá, sản phẩm của acid hữu cơ, và các chất kháng khuẩn

khác như bacteriocin, góp phần to lớn trong bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế mầm

bệnh và chất gây ô nhiễm Sự chuyển hoá lactose nhờ nuôi cấy vi khuẩn lactic đã làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hoá hơn Nhiều hoạt tính biến dưỡng và enzyme của LAB dẫn

đến sự sản xuất các chất dễ bay hơi hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng cho san

phẩm lên men [45]

Các giống của LAB chủ yếu là Lacfobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, LacfOCOCCHs,

Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weisella [11, 45]

(a)

(b)

(c)

Hình 1.1: Hình ảnh một số vi khudn lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus

thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11]

1.1.1.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được chia thành ba nhóm dựa trên mô hình lên men

- _ Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose

- _ Lên men đị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic va

thành acid lactic Qua trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi glucose được tiêu thụ Đại diện cho kiểu lên men này là các gidéng Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus,

Pediococcus va Lactobacillus nhém I

LAB lên men dị hình phân giải glucose theo con đường pentose phosphate Một phân

tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6-phosphogluconate và sau đó khử

nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO; Kết quả 14 pentose—5—phosphate bi chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate GAP sau đó được chuyển hoá thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chat trung gian 14 acetyl-CoA vA acetaldehyde Vé mat ly thuyét,

sản phẩm cuối (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với từ quá trình đị hoá một

phân tử glucose Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconosfoc, Oenococcus, Weissella, va Lactobacillus nhém II [45, 47]

- Phdn gidi protein [11]

Protein bị cắt thành những hợp chất nhỏ hơn

proteinase Protein +H,0 ————————————* polypeptide

Hoạt tính này của Lacfobacilius trong hệ thống đường ruột làm thuỷ phân protein bởi

hệ vi sinh vật tiêu hoá đễ dàng, một đặc tính có giá trị cao cho trẻ em, người bệnh và người già

- - Phân giải lipid [11]

Phức hợp chất béo bị cắt thành các hợp chất nhỏ hơn

lipase

Hoạt tính này được sử dụng trong việc thiết kế chế độ dinh dưỡng cho trẻ em, người bệnh và người già Bằng chứng từ thử nghiệm y khoa và lâm sàng cho thay Lactobacillus

có thể phân hủy cholesterol

- _ Biến dưỡng lactose [1]]

LAB cé enzyme f-galactosidase, glycolase va lactic dehydrogenase (LDH) san xuat acid lactic ti lactose Acid lactic dudc xem là có một số chức năng sinh lý như:

- Lầm tăng sự tiêu hoá protein sữa bằng cách kết tủa chúng trong sữa đông

- Cải thiện khả năng sử dụng calcium, phosphor và sắt

- Kích thích sự bài tiết dịch từ da day

- Làm gia tăng nhu động ruột

- Cung cấp nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp

Vị trí đồng phân quang học của acid lactic được sản xuất dựa vào bản chất của môi

trường Hình dạng cấu trúc của các isomer nầy như sau:

D (-) levorotatory lactic acid L (+) dextrorotatory lactic acid

Ở người, cả hai isomer đều được hấp thụ lên thành ruột Trong khi L (+) lactic acid được chuyển hoá hoàn toàn nhanh chóng trong tổng hợp glycogen, D (-) lactic acid được

tổng hợp ít hơn, và acid không được chuyển hoá sẽ được thải ra trong nước tiểu Khả năng

chuyển lactose thành acid lactic được sử dụng điều trị thành công bệnh không dung hợp lactose Những người mắc bệnh này không thể chuyển hoá lactose bởi vì thiếu hệ thống enzyme cần thiết hoặc chúng hoạt động không bình thường Acid lactic làm thấp pH môi

trường ruột xuống khoảng 4 đến 5 để ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa

và E coli, vi sinh vật đòi hỏi pH môi trường tối ưu là 6 đến 7 Một vai acid dé bay hơi sản xuất trong quá trình lên men cũng có hoạt tính ức chế dưới điều kiện thế oxy hoá khử thấp

Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và

chức năng sinh hóa có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt trong bảng dưới đây

Bảng 1.1: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động của chúng

Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua

màng, làm thấp pH nội bào Nó gây

nhiễm của vi sinh vật bằng cách ức chế chúng và liên kết với receptor đặc biệt của tế bào

Hiện nay, có những mối quan tâm về việc ứng dụng bacteriocin trong cả bảo quản thực

phẩm và ức chế mầm bệnh vi khuẩn Hầu hết các bacteriocin đều được chiết xuất từ vi

khuẩn hên quan trong lên men thực phẩm Sự sản xuất bacteriocin và tính kháng được

xem là các đặc tính quan trọng của chủng, có thể được sử dụng trong thương mại như là chất loại bỏ hoặc làm giảm sự phát triển của chủng gây bệnh không mong muốn [34]

Hiện nay, các nghiên cứu đi sâu vào việc mở rộng hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin, đáng chú ý là nisin cùng với những nhân tố kháng khuẩn khác như hệ thống lactoperoxide hiện diện trong sữa, các tác nhân khác và các bacteriocin khác [16]

1.1.2 Các chủng vi sinh vật có kha năng sinh tổng hợp bacteriocin

1.1.2.1 Chủng Lactococcus lactis

(a) Giới thiệu [1 1]

Ching Lactococcus lactis (Lc lactis) lA c4c vi sinh vat quan trong nhat trong san xuat

thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, fromage Chúng sản xuất nhiều hợp

chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng

Dựa vào đặc tính sinh héa, Lc lactis dudc phan thanh: Lc lactis subsp lactis, Lc lactis subsp cremoris va Lc lactis subsp cremoris Lc lactis subsp lactis c6 kha năng phát triển

duoc 6 nhiét dé 40°C, séng dudc 6 néng dé mudi Ain lén dén 4.0% va san xuat dudc

amonia ti arginine trong khi Lc lactis subsp cremoris khéng có tinh chat nay Lec lactis

subsp lactis biovar diacetylactis dudc phan biét dựa vào khả năng chuyển héa citrate

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong công nghiép cia ching Le lactis 1a plasmid được mã hoá, có nghĩa là plasmid mang gen có các đặc tính như biến dưỡng lactose và sản xuất proteinase cũng như tính kháng bacteriophage Các plasmid biến

dưỡng quan trọng khác và chức năng của chúng ở Lac/ococcus cũng đã được mô tả Do đó,

hiện nay chúng ta đã có những hiểu biết về gen plasmid kiểm soát biến dưỡng đường

sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, sử dụng citrate, tính kháng phage, biến

dưỡng và giới hạn DNA, sự tập hợp tế bào, sản xuất bacteriocin Thêm vào đó,

Lactococcus chứa nhiều plasmid, kích cỡ từ 1 đến >100 kbp Plasmid mã hoá cho

bacteriocin thường lớn và kích thước của chúng từ 81 đến 133 kbp Chủng Lc /acfis thường

có từ 2 đến 11 plasmid DNA, trong khi số lượng phổ biến thường là từ 4 đến 7

(b) Tính chất của chủng Lc lacHs [10, 11]

> Biến dưỡng protein

Giống như tất cả các LAB khác, Løcfococcus có nhu cầu đinh dưỡng phức tap Dé

phát triển, chúng đồi hỏi các protein, peptide, các amino acid đặc biệt, các nucleic acid và vitamine, Trong sữa, nồng độ isoleucine, leucine, valine, histidine va methionine can

thiết cho Lactococcus 14 thấp hơn 1 mg/l Nó bao gồm các amino acid tự do, có mặt ban đầu trong sữa, cung cấp nguồn nitơ cho khoảng 2% mật độ tế bào cuối cùng Casein, có

khoảng 80% protein hiện diện trong sữa, trở thành nguồn nitơ sơ cấp sau khi dùng hết nitơ

từ các nguồn không phải protein

> Bién du@ng lactose

Biến dưỡng lactose cia ching Le lactis khdc véi bién đưỡng lactose của các vi khuẩn

lactic khác Khác biệt là ở sự dị hoá cùng lúc glucose và galactose Chức năng của con đường đó đối với Lactococcus là để sinh năng lượng và acid lactic là sản phẩm phụ

> Biến dưỡng citrate

Trong nhém Lactococcus thi chi Lc lactis subsp lactis biovar diacetylactis la có khả

năng biến dưỡng citrate hiện diện trong sữa Sản phẩm cuối cùng của biến dưỡng citrate

la diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic và carbondioxide, chúng tạo nên hương vị cho các loại thực phẩm bơ sữa lên men

Citrate được vận chuyển vào tế bào mà không cân có sự biến đổi Ở Le lactis subsp

lactis biovar diacetylactis, phan ứng này được xúc tác bởi citrate permease

> Sinh tổng hợp bacteriocin

Các chủng thuộc loài Lc lactis cé6 khả năng sinh tổng hợp rất nhiều các hợp chất có

hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cả bacteriocin Các hợp chất này xuất hiện như là sản

phẩm cuối của quá trình biến dưỡng

+ * ` ` Z * a tA + s * a ˆ

Bacteriocin từ Lactococcus 1a cdc protein nhỏ, bền nhiệt, chống lại các vi khuẩn lân

cận Nisin là bacteriocin được biết đến nhiều nhất, có 34 amino acid, khối lượng phân tử

3354 kDa, thuộc nhóm lantibiotic, được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm Nisin

gây cản trở việc cung cấp năng lượng của tế bào bằng cách tạo nên bào tử trên màng và làm mất điện thế màng Nisin có hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G”, bao gồm

cả L monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử ndy mam Bacillus va Clostridium

và thông qua việc thêm calcium, nó sẽ có hoạt tính kháng lại một số vi khuẩn G” Một hợp chất khác, lacticin 3147 được xác định là từ Lactococcus thu nhận từ chủng Irish Kefir st dụng trong sản xuất bơ Bacteriocin này ngăn cản các mầm bệnh từ vi khuẩn G' như Staphylococcus, Clostridium, Listeria spp., Streptococcus [10]

Ngay nay, nisin 1A bacteriocin tY LAB duy nhất được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm Hai sản phẩm khác là ALTA 2431 và Microgard đã được phát triển làm chất kéo đài tuổi thọ thực phẩm dựa trên sản phẩm lên men thô của LAB

1.1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic khác có khả năng sinh tổng hop bacteriocin

Một số chủng vi khuẩn lactic khác có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được tổng

cảm với trypsin, L Ì_chymotrypsin, proteinase K, và pronase E, kháng pepsin [37]

Plantaricin | Lactobacillus 3500- | On định ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp,

trong 10 phút Hầu hết ổn định ở pH acid

hay trung tính Nhạy cảm với pronase, trypsin, và LÍ chymotrypsin, kháng lại

pepsin, proteinase K, LÍ amylase, và lipase [21]

bavaricus 4000 | pH bang 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin,

trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, khang lai véi catalase

[30]

Piscicolin Carnobacterium | 4416 | On định ở pH bằng 2 sau khi lưu trữ 2 tháng

tại pH 2-3, trở nên ít ổn định hơn khi pH

tăng Nhạy cảm với LÍ chymotrypsin, LL chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII,

va trypsin, khang catalase, lipase và

lyzozyme [25]

Variacin Micrpcoccus 2658 | On định ở pH ty 2 dén 10, bén nhiét 115°C

varians trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E,

proteinase K, ficin, khang catalase [14]

Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm

đặc hiệu hay ức chế mạnh mế sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác

Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chết vi sinh vật Chính vì lý do nầy nên thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, còn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâm đúng mức Theo thời gian sử dụng

chất kháng sinh hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên trầm trọng đã

gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra hiệu ứng trên

của chúng rất thấp Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các bacteriocin đã

được phục hổi và phát triển Các chế phẩm bacteriocin điển hình là n¡sin, điplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococcus), pediocin A, pediocin PA—1, pediocin AcH (tit Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (t¥Y Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (ti Leuconostoc), propionicin PLG—1, jensenin G (từ Propionicbacterium) [28]

Bacteriocin được tìm thấy lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, được sản xuất bởi

một chủng E coii để chống lại các chủng khác trong dịch nuơi cấy Thuật ngữ “colicine ” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), cịn “bacteriocin” được sử dụng bởi Jacob et

aÍ (1953) như là thuật ngữ chung cho các protein cĩ đặc tính kháng khuẩn cao Thuật ngữ

colicine ngày nay là để chỉ các protein cĩ tính kháng khuẩn được sản xuất bởi nhiều lồi

E coÏï và các lồi thuộc họ Emterobacteriaceae [28]

1.2.2 Bacteriocin từ LAB

Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhĩm vi khuẩn lactic vì

từ xa xưa người ta đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa

sự nhiễm các vi khuẩn gây bệnh Bởi vì LAB và chất chuyển hố của chúng đã được tiêu thụ với số lượng cao qua nhiều thế hệ người tiêu thụ các thực phẩm truyền thống mà khơng cĩ ảnh hưởng cĩ hai nao, LAB tiếp tục như là nguồn sản xuất bacteriocin sử dụng

trong thực phẩm, kể cả dạng hợp chất tinh khiết hay dịch chiết từ mơi trường phát triển

Cĩ thể thu được bacteriocin thơ bằng cách nuơi chủng LAB sản xuất bacteriocin trên một phức hợp cơ chất Dịch lên men thơ cĩ chứa các chất khác bên cạnh bacteriocin LAB là vi khuẩn nuơi cấy được sử dụng đầu tiên trong ngành sản xuất thực phẩm lên men, chúng hiển nhiên được sử dụng nhiều nhất cho sự biến đổi gen để tạo các chủng cơng nghiệp bị thiếu gen điều hồ sinh tổng hợp nên bacteriocin mong muốn [27]

Hầu hết các bacteriocin từ LAB đều cĩ tính cation, ky nước hay phân tử lưỡng cực hình thành từ khoảng 20 đến 60 gốc amino acid Các bacteriocin thường được phân chia thành 3 hay 4 nhĩm

Nhóm I: gồm các lantibiotic là các peptide nhỏ có chứa các amino acid không phổ biến như lanthionine (Lan), L Ì_ methyllanthionine (MeLAn), dehydrodlanine, và dehydrobutyrine Nhóm I được chia thành 2 nhóm nhỏ tuỳ theo cấu trúc hoá học và hoạt

tính kháng khuẩn

- - Nhóm Ta: lantibiotic type A là các peptide được kéo đài ra với mạng lưới tích điện

dương, hoạt động thông qua việc hình thành các lỗ trên màng tế bào vi khuẩn Một số

nhóm như pep-5 chứa 3 nối monosulfite, epidermin chứa 4 nối monosulfite, nisin A và Z, subtilin thì lại chứa 5 cầu nối monosulfite Kích thước phân tử của lớp phụ Ia dao động từ

1959 kDa ở duramycin đến 4635 kDa ở carnocin U9

-_ Nhóm lb: lantibiotic type B là các phân tử peptide hình cầu nhỏ hơn và có một điện

tích âm hoặc không tích điện, hoạt tính kháng khuẩn liên quan đến sự ức chế các enzyme đặc biệt Một số các bacteriocin lớp phụ Ib như mersacidin, actagardin, cinnamycin và mutacin A Trong đó mutacin À tạo ra bởi Streptococcus mutan

Nhóm II: Các peptide nhỏ (< 10 kDa), bển nhiệt, không có các amino acid biến đổi sau

dịch mã có chứa ít nhất một cầu nối disulfur cần thiết cho hoạt động của chúng Là nhóm

bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân lớp này, các peptide được chia thành 3 nhóm phụ

- Nhom Ila bao gém peptide giống pediocin, có trình tự liên ứng đầu N-Tyr Gly— Asn-Gly-ValL_Xaa-Cys Nhóm phụ này được quan tâm nhiều bởi vì hoạt tính kháng

Listeria, ching lam mat cân bằng điện tích và tao 16 thing làm rò rĩ các chất phân hữu cơ

và gây chết tế bào đích

- - Nhóm IIb gồm các bacteriocin đòi hỏi phải có 2 peptide khác nhau để có hoạt tính

như lactococcin GLI cL, lactococcin M/N, plantaricin EF, JK, enteriocin LS50A va

enteriocin L50B

- — Nhóm IIc: bao gồm tất cả các bacteriocin nhóm 2 không phụ thuộc IHa và IIb,

peptide có nhóm thiol có hoạt tính, đòi hỏi phải cắt giảm nhóm cysteine để có hoạt tính

Nhóm III: nhóm này hiện vẫn chưa được mô tả kỹ Nhóm này có các protein lớn (>30

kDa), dé biến đổi bởi nhiệt độ Một số bacteriocin lớp này là helveticin ] tạo bởi 1.

helveticus 481 và lactacins A và B tạo bởi L acidophilus, helveticin V, acidophilicin A Những loại này ít được các nhà khoa học trong lĩnh vực thực phẩm quan tâm

Klaenhammer (1999) để nghị thêm nhóm 4, là nhóm chứa các bacteriocin phức tạp, đòi hỏi carbohydrate hay lipid để có hoạt tính Tuy nhiên bacteriocin của nhóm này chưa

được miêu tả nhiều ở mức độ sinh hoá để mở rộng định nghĩa Nhóm này bao gồm cả

glycoprotein như lactocin 27 hoặc lipoprotein như lacstrepcin [27]

Hình 1.2: Công thức của Nisin A [24]

1.2.3.2 Co ché sinh téng hop bacteriocin

a Gene va sinh tong hợp

Bacteriocin được tổng hợp với ribosome Gen mã hoá cho sản xuất và miễn dịch của bacteriocin thường được tổ chức thành các operon cluster Nhóm gene bacteriocin có thể được định vị trên nhiễm sắc thể (subtilin và mersacidin), cũng có thể được định vị trên plasmid (divergicin A va sakacin A), hay 1a trén transposon (nisin va lacticin 481) [18] Operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chứa gen mã hoá trén tién peptide, enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng biến đổi, quá trình phân hủy protein chịu trách nhiệm tách rời peptide chỉ đạo, ABC (ATP-binding cassette), họ protein vận chuyển bao gồm protein vận chuyển peptide, protein điều hoà, và các protein tự bảo vệ tế bào sản xuất Peptide chi dao có một vai trò rất quan trọng Nó giữ cho tién peptide ở dạng bất hoạt trong tế bào, phát ra tín hiệu vận chuyển lantibiotic ra khỏi tế bào, chứa các trình tự đặc

biệt chỉ đường cho enzyme sinh tổng hợp đi tới nơi thích hợp để thực hiện sự biến đổi các amino acid và ổn định hình dạng của domain propeptide [18, 28]

Gene mã hoá cho sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II như lactococccin A, B, và M,

pediocin PA-1/AcH, và plantaricin A có nhiều điểm giống nhau trong tổ chức gen, bao

gồm một gen cấu trúc mã hoa cho tién peptide, theo sau bởi một gen miễn dịch, gen dé vận chuyển và protein phụ thêm Một số trường hợp đã tìm ra được gen điều hoà Các

protein phụ thêm là rất cần thiết để các bacteriocin nhóm II được xuất ra Không có bản

sao nào của các protein phụ thêm ở lantibiotic được tìm thấy [16, 1§]

Sự tạo các bacteriocin vi khuẩn G” thường cần nhiều gen ví dụ như cụm gen tao nisin:

- Nis A: prepeptid

- Nis B, nis C: enzyme bién déi amino cacid

- Nis P: ct c4c peptide leader

- Nis L, nis FEG: mién dich

- Nis R, nis K: diéu hoa va biéu hién [18]

hủy peptide chỉ đạo và di chuyển tiền peptide đã được biến đổi hay tiền peptide trưởng thành xuyên qua màng tế bào chất Sự tách rời peptide chỉ đạo có thể diễn ra trước, trong

suốt quá trình hay sau khi xuất ra khỏi tế bào Trong sản xuất lantibiotic nhóm I, như trong

trường hợp của nisin, epidermin, subtilin, và Pep5, phản ứng dehydrate có lẽ được xúc tác bởi enzyme LanB [18]

Hình 1.3: Cơ chế sinh tổng hợp Nisin theo 5 bước [18]

Bacteriocin nhóm II được sinh tổng hợp như là một tiền peptide có chứa một trình tự chỉ đạo đầu N bảo tôn và một điểm làm phân tách protein, với ngoại lệ là bacteriocin nhóm IIc, được sản xuất với một trình tự đơn đầu N điển hình dạng sec và được tiến hành thông qua một con đường còn chưa được biết rõ Không giống như lantibiotic, bacteriocin nhóm II không trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã Sau khi hình thành tiễn peptide,

tiền peptide được tách khỏi peptide chỉ đạo đồng thời với việc được xuất ra khỏi tế bào [18]

Peptide chi đạo có một vùng nhận biết điều khiển tién peptide trong su6t qué trinh

trưởng thành, và protein vận chuyển, bảo vệ chủng hoang dại bằng cách giữ lantibiotic ở

trạng thái không có hoạt tính khi nó ở bên trong sinh vật sản xuất, và tương tác với domain

tién peptide dé chắc chắn rằng có một cấu hình phù hợp cần thiết cho tương tác enzyme-—

cơ chất [16, 18]

Hình 1.4: Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II theo 4 bước [18]

c Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [16, 18]

Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá huỷ năng lượng hữu ích của tế bào sống Các bacteriocin cia vi khudn G* thường không có receptor đặc hiệu để hút bám mặc dù vẫn có những ngoại lệ Hoạt động khác với vi khuẩn

G ở hai điểm chính sau:

- _ Việc tao bacteriocin thì không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật sản xuất Sự

khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng bacteriocin Ở một vài vi sinh vật thì

phụ thuộc vào hệ thống tiết Ngoài ra, ở vi khuẩn G* c6 sự điều hoà đặc hiệu bacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ

- - Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3 — 9,

thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11, ở điểm đẳng điện cao cho phép chúng

tương tác với bể mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn Đối với các bacteriocin phổ

kháng khuẩn rộng các hợp chất cần thể nhận thì sẽ gắn phần ky nước vào màng vi khuẩn

Sau đó sự liên kết của các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng

làm mất gradient và gây chết tế bào

Lớp lipid tích điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên cho bacteriocin trong

việc hình thành lỗ Ví dụ như nisin: xử lí tế bào bằng nisin cho thấy nó tạo ra khe hở cho

tia UV chiếu được vào trong nội bào; nisin là một bacteriocin có các phần tích điện dương:

liên kết với màng lipid tích điện âm, hình thành lỗ, bên cạnh đó làm trung hoà điện tích

của màng, làm mất đi lực vận chuyển proton Do có sự hình thành lỗ không đặc hiệu, các chất nhỏ như ion, ATP thoát ra ngoài, còn các chất lớn như protein không thoát ra tạo nên

điện thế màng, làm tế bào chết từ từ Một số bacteriocin từ vi khuẩn G” có thể làm bất

hoạt các tác nhân gây bệnh Œ' khi sử dụng tác nhân có tính kìm kẹp (chelating) như EDTA

để phá hủy các đặc tính của lớp rào cản bên ngoài vi khuẩn Œ Ngoài ra, nisin cho thấy là

có tác dụng gây ra sự tự phân của tế bào, gia tăng áp suất nội bào làm cản trở chuyển hóa

năng lượng, ngăn can sự phục hồi vách tế bào

Hình 1.5 : Cơ chế tạo lỗ hay kênh ion trền màng tế bào của bacteriocin nhóm II [18]

Người ta cho rằng các bacteriocin nhóm IIa có thể tự tạo lỗ xuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực Các cystibiotic thuộc lớp IIe như cerecin 7/8, enterocin B, carnobacteriocin A và devergicin A có đặc điểm là có cấu trúc bậc 2 có

sự hiện diện các vùng lớn bao quanh gần như toàn bộ vùng ky nước Trong tất cả các

trường hợp phần cystein đầu tiên tìm thấy nằm sau lysin tích điện dương ở cuối phần ưa

nước và phần thứ hai nằm ở 3 trình tự cuối Liên két disulfur cin cho hoạt tính kháng

khuẩn cuộn trong phần C của protein tạo thành cấu trúc ky nước bển vững, ngoài ra trong

phân tử có chứa glycerin nên phân tử rất linh động Chính sự linh động này cho phép

chuyển từ cấu trúc CJ thành L Ì để thích hợp với tính ky nước Chiều dài của vòng ky nước

du đài xuyên qua màng tế bào chất và khi có sự gắn kết một số lượng lớn cấu trúc vòng sẽ gây chết [1ó, 18]

Các hiểu biết thông thường về phổ ức chế của bacteriocin từ vi khuẩn G” là chúng chỉ

+ +4: A K : + + z + 1 ^“ 4 + ` `» ~,

giết giới hạn một số vi khuẩn Œ” khác Phố giết chết đóng vai trò quan trọng từ những

trường hợp phổ hẹp như Lactococcin A, B, M chỉ giết được Lactococcus đến trường hợp

phổ rộng nhv nisin A, mutacin B cé thể giết được nhiều vi sinh vật như Actinomyces,

Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococus, Mycrobacterium, Propiobacterium, Streptococcus va Staphylococcus Ngudc lại với những hiểu biết trên là các bacteriocin cũng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn Œ gây bệnh như : Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và Neisseria [18]

1.2.3 Bacteriocin từ các loài vi khuẩn khác

> Bacteriocin vi khudn Gram âm |30, 34]

Vi khuẩn G san xuất nhiều bacteriocin khdc nhau, chúng được đặt tên theo tên giống (ví dụ như klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo tên loài (ví dụ như colicin của E coli, marcescin cla Serratia marcescens, alveicin cia Hafma alvei và cloacin của Enterobacter cloacae) cia vi khuẩn sản xuất Bacteriocin do Pseudomonas sản xuất được gọi là pyocin

Klebicin, alyeicin và marcescin cũng có phạm vi giết giới hạn 6 cdc loai Klebsiella,

Hafria và Serratia Bacteriocin sẵn xuất bởi Pseudomonas spp (pyocin) cũng được nghiên

cứu rộng rãi Gen pyocin được mã hoá trên nhiễm sắc thể và thường gặp ở Pseudomonas

Có 3 dạng pyocin đã được mô tả: dạng E, dạng R, và dạng S Pyocin dạng R và dạng F

được sản xuất bởi 90% và dạng S được sản xuất bởi 70% các chủng P aeruginosa được

nghiên cứu Pyocin dạng E và R là bacteriocin dạng đuôi phage, kháng nuclease và protease Pyocin dạng S là bacteriocin nhạy cảm với protease tương tự như colicin

Nhóm gen colicin gồm 3 gen liên kết chặt chẽ với nhau, mã hoá cho các protein gây

độc, protein miễn dịch và protein phân giải Colicin giết tế bào đích bằng cách hình thành

lỗ, bằng hoạt tính nuclease hay bằng cách làm gián đoạn vách tế bào Sự định hướng của gen colicin với gen miễn dịch là khác nhau trong trường hợp nhóm gen colicin hình thành

lỗ hay hoạt tính nuclease Trong trường hợp hình thành lỗ, gen miễn dịch được định hướng đối điện với gen gây độc, có thể giết tế bào từ bên ngoài bằng cách khoang một lỗ lên màng tế bào

> Bacteriocin từ Archaea: halocin va sulfolobicin [34]

Cho đến nay, các archaeocin đã được mô tả đặc điểm chỉ từ hai nhém: nhém Archaea đặc biệt ưa mặn sản xuất halocin, nhóm Archaea đặc biệt ưa nhiệt sản xuất sulfolobicin

Hau hét Archaea đều sản xuất kháng sinh, người ta cho rằng có hang trăm halocin khác

nhau, nhưng chỉ có 7 halocin và một sulfolobicin đã được thu nhận và mô tả đặc điểm đầy

đủ Halocin rất đa dạng về kích cỡ (thay đổi từ 3-35 kDa), bển nhiệt, và phụ thuộc muối Phổ hoạt tính khá rộng với hoạt tính giết chết các haloarchaea khác Hiện nay, chỉ có

halocin H6/H7 là được biết rõ về cơ cấu hoạt động, nó ức chế kênh vận chuyển Na'/H” ở

cả tế bào haloarchaea và động vật có vú

Halocin có thể là peptide (Llio kDa, gọi là microhalocin), hay là protein (>10 kDa),

có hoạt tính kháng sinh, được sản xuất bởi các thành viên của ho Halobacteriaceae

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp bacteriocin

1.2.4.1 Môi trường nuôi cấy

Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng gia tăng tính nhớt của dịch môi trường bằng

cách thêm agar, dextran, glycerol, hay tinh bột sẽ gia tăng năng suất sản sinh bacteriocin

của vi khudn Streptococcus c6 lap từ khoang miệng của người và động vật gặm nhấm

Một nghiên cứu khác của M.A Riley (2007) về staphylococcin 1580 cho thấy nuôi trong môi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với môi trường lỏng

Các chất riêng biệt hợp thành môi trường có thể quyết định sự sản xuất của

bacteriocin Sự sản xuất bacteriocin bởi các chủng khác nhau của S mutans c6 thé lam gia

tăng bằng cách thêm cao nấm men 2% vào môi trường cơ bản Trypticase Tương tự, sự hình thành butyricin 7423 trong môi trường được thấy là phụ thuộc với lượng casein hydrolysate thêm vào cho đến tối đa 5% Sự hình thành bacteriocin của các chủng

Corynebacteria và bởi Staphylococcus dudc thay ring phu thudc ham lugng amino acid

trong môi trường nuôi cấy lon Mangan (2004) được thấy là cần thiết cho nhiều sản phẩm sản sinh trong môi trường hoá học xác định Thêm 0.5% mannitol vào môi trường brain heart infusion broth làm gia tăng năng suất của staphylococcin 426 nhưng giảm lượng staphylococcin 414 Tương tự, glucose lam gia tăng sự sản xuất streptococcin A-FF22 nhưng làm giảm streptococcin B-74628 Những nghiên cứu khác cho thấy thêm vào cả

glucose hay manitol sẽ làm gia tăng sự sản xuất chất ức chế bởi phage type 71

Staphylococcus trong dich chiét dau nành [13]

1.2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

Sự khác nhau của điều kiện môi trường như nhiệt độ, thời gian, oxy, pH có ảnh hưởng đến năng suất của bacteriocin có hoạt tính Nhìn chung, sự sản xuất bacteriocin tốt hơn ở điểu kiện nhiệt độ tối ưu của chủng sản xuất phát triển Nuôi ở nhiệt độ quá cao có thể

ngăn cản sự sản sinh bacteriocin và đôi khi dẫn đến sự thay đổi các đặc tính một cách không thuận nghịch [40]

Việc tạo ra các bacteriocin ở vi khuẩn G* thường khi chuyển từ pha log đến pha ổn định Sản lượng bacteriocin tối đa trong môi trường có thể thấy ở nhiều pha khác nhau trong chu kỳ tăng trưởng Schlegel và Slade (2002) nhận thấy sự sản xuất streptocin STHI nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần mức độ sản sinh bacteriocin trước khi bước vào pha ổn định Trái lại, sản xuất streptococcin A —- FF22 bắt đầu ở cuối pha log và hoạt tính

giảm dần dần khi nuôi kéo đài Tương tự, sản xuất staphylococcin C55 bắt đầu ở pha log,

đạt đến tối đa giữa 24 và 48 giờ phát triển, và sau đó suy tàn dần Butyricin 7423 thì được tiết ra trong suốt cuối pha log, tuy nhiên, perfringocin 11105 chỉ xuất hiện nhiều vào pha

ổn định và sản phẩm của nó dường như lại tiêu hủy một phần tế bào sản xuất

Meitert (2005) đã báo cáo một vai chiing C diphtheriae giai phóng bacteriocin liên tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn Lachowicz (2002) nghiên cứu khả năng

sản xuất staphylococcin A—1262a trên môi trường rắn Hoạt tính được nhận thấy đầu tiên

sau 8 giờ, đạt đến tối đa khi từ 18 đến 24 giờ, và sau đó giảm dần về 0 Những nghiên cứu

khác cũng nhận thấy hoạt tính bacteriocin bị mất khi nuôi kéo dài Sự ảnh hưởng này có

thể liên quan đến sự xuất hiện của chất bất hoạt bacteriocin hay enzyme tiêu hủy hoặc

thay đổi chúng [38, 40]

Một ảnh hưởng thú vị lên sự phục hổi một số bacteriocin là pH Một nghiên cứu về

điều kiện để tối ưu sản xuất colicin K cho thấy rằng điều chỉnh pH môi trường là một yếu

tố then chốt Một số nghiên cứu tìm thấy rằng sản xuất streptococcin A-FF22 trên agar

Todd—Hewitt sé gia ting khi điều chỉnh pH ban đầu của môi trường đến 6.5 [13]

1.2.4.3 Sản xuất chất ức chế bacteriocin và chất làm bất hoạt

Davie và Brock (2003) tìm thấy acid teichoic, thường có trong lớp vỏ tế bao S faecalis

subsp zymogenes X14, góp phần vào tính miễn dịch của vi khuẩn này với bacteriocin của chính nó sản xuất ra (hemolysin) Việc thải ra các sản phẩm ức chế trong giai đoạn sau

chu trình phát triển là kết quả của sự biến mất của bacteriocin trong môi trường nuôi cấy

Tương tự, hoạt tính bacteriocin trong dịch nổi môi trường chứa staphylococcin 1580 được

gia tăng khi thẩm tách, từ đó để nghị rằng các chế phẩm này có thể chứa một chất ức chế

khối lượng phân tử nhỏ của bacteriocin

Tất cả bacteriocin được mô tả đặc điểm đều có chứa một hợp chất protein cần thiết

cho hoạt tính sinh học Sự bất hoạt không thuận nghịch của một số bacteriocin có thể là

kết quả từ sự tiêu hủy bởi protease nếu những chất này cũng sản xuất bởi vi khuẩn

Bacteriocinogenic Tac động này lần đầu tiên được chứng minh bởi Serratia marcescens, nhưng nó cũng được tin là đóng vai trò trong việc làm bat hoat bacteriocin cia Clostridium

botulinum và Streptococcus nhóm A Đun chế phẩm bacteriocin mà ổn định nhiệt sẽ làm

bất hoạt protease, do đó bảo vệ bacteriocin [28]

1.2.5 Dinh vi va tinh sach bacteriocin

Nhiều bacteriocin của vi khuẩn G* dường như tôn tại ở hai dạng là liên kết với tế bào

và ở ngoài tế bào Tỷ lệ của mỗi dạng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của môi trường

Bacteriocin trong phan loại nầy bao gồm megecin C—216, lactocin LP27, staphylococcin

1580, butyricin 7423, staphylococcin C55 và streptococin A—FFE22 Những nhận xét tương

tự cũng được báo cáo nhiều với colicin [21]

Trong trường hợp bacteriocin có nhiều ở xung quanh tế bào, các tính chất hoá học, cơ

học, enzyme có thể ảnh hưởng đến việc giải phóng chúng khỏi tế bào Viridin A, B, và C

(bacteriocin cia Streptococcus viridans) c6 thỂ thu được ở trạng thái tế bào tự do (cell-

free) sau khi đồng nhất dịch tế bào sản xuất bacteriocin Staphylococcin 414 cũng được

tìm thấy ở bể mặt tế bào của chủng sản xuất nhưng có thể tách ra bằng cách phá vỡ cơ

học tế bào Trái lại, staphylococcin 462 không thể bị hoà tan bằng cách phá vỡ tế bào sản xuất Các nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng staphylococcin 1580 có thể được trích từ vi khuẩn với 5% NaCl Tuong ty tinh ché colicin E2-W3110 va E3— W3110 va bacteriocin

JF246 của Š marcescens được hỗ trợ bằng cách trich bacteriocin quanh té bao véi 1M

sodium chloride Streptococcin A-FF22 6 dạng liên kết với tế bào có thể được trích bằng cách đun trong axit loãng Streptococcin, nisin và điplococcin cũng có thể được thu bằng

cách trích với axit từ tế bào sản xuất Trong một số nghiên cứu khác phương pháp xử lý

nhiệt dịch nuôi cấy cia Lactobacillus da gia tăng khả năng giải phóng lactocin LP27 từ tế

bào Phương pháp trích với axit dường như có hiệu quả trong ví dụ này Donoghue khi sử dụng một phương pháp khác đã nhận thấy rằng megacin C-2l6 và Cx-337 được giải phóng từ tế bào sinh megacinogenic bằng cách xử lý với lysozyme, kết hợp tiền xử lý với

trypsin Tác giả kết luận rằng megacin được định vị trên bề mặt ngoài tế bào [17]

Thường dịch thô đầu tiên được cô đặc bằng cách lắng tủa phân đoạn với acid, muối, ethanol, hoặc các hỗn hợp khác nhau Sau đó việc tinh chế có thể dựa vào kích cỡ khác

nhau (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) hay thay đổi điện tích (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển) [32]

Một vấn để chung là sự mất hoạt tính trong quá trình tỉnh chế Do đó việc giám sát

hoạt tính bacteriocin (don vi bacteriocin/miligram protein) tại mỗi bước tinh chế và điều

chỉnh khi có thể để tránh việc mất nhiều hoạt tính là rất quan trọng [28]

1.2.6 Ứng dụng bacteriocin

1.2.6.1 Ứng dụng trong bảo vệ sức khoẻ con người

Khi có sự tăng nhanh các vi khuẩn gây bệnh cần phải có phương pháp loại bỏ sự nhiễm Một trong những giới hạn trong việc sử dụng kháng sinh là chúng có phổ ức chế

rộng Điều này sẽ giết không đặc hiệu bất kỳ loại vi khuẩn nào không kháng thuốc Do

đó, kháng sinh tiêu diệt luôn các vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ con người Người ta sử dụng bacteriocin như là một giải pháp thay thế Chúng có phổ ức chế hẹp nên có thể xem như

“thuốc độc thiết kế”, nó có tác dụng đặc hiệu với các vi khuẩn gây bệnh [41]

1.2.6.2 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Hiện nay chỉ có bacteriocin của LAB được phép sử dụng trong thực phẩm lên men vì LAB đã được sử dụng hàng thế kỷ qua để lên men thực phẩm Năm 1988, FDA tiến tới

việc sử dụng nisin trong quá trình khử trùng Pasteur fromage, tạo thành một sự kiện chính thức hợp pháp ở Mỹ trong ứng dụng bacteriocin như là chất phụ gia thực phẩm Khi ước

lượng để sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm phải đòi hỏi sự đánh giá về tính bền nhiệt khi chúng được sử dụng phổ biến trong quá trình chế biến thực phẩm [41]

Từ rất xa xưa, người ta sử dụng phổ biến nitrate để ngăn chặn sự phát triển của

Clostridium trong thịt nhưng vì sự an toàn cho công nghiệp thực phẩm cần phải có một

phương pháp bảo quản khác Nisin có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của bào tử C.

botulinum trong fromage, được thương mại và sử dụng rộng rãi Ưu điểm lớn của nisin là hầu như không tác dụng lên các loài vi khuẩn Œ nên việc sử dụng chúng không làm ảnh

hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột có lợi của người, chúng dễ dàng bị phân hủy trong đường tiêu hoá và hoàn toàn an toàn ở liều sử dụng Ví dụ: liều bảo quản hiệu quả trong

phomát là 100 —- 400 UL/g, trong khi đó liều LD50 trên mèo và chuột non thậm chí tới 7 g/kg ngày Chính nhờ đặc điểm trên nên nisin hiện nay đang được triển khai thử nghiệm

ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới Trong công nghệ chế biến sữa, nisin có thể được sử dụng theo một trong hai cách là: bổ sung chế phẩm nisin trực tiếp vào sữa bột hay vào nguyên liệu sữa trước khi lên men chế biến fromage

hoặc người ta phối hợp sử dụng các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin vào trong quá trình lên men fromage, nhằm khắc phục hiện tượng lên men sinh hơi khó chịu và kiểm soát quá trình lên men butyric do vi khuẩn Clostridium gây ra (trong công nghệ sản xuất fromage, ở

một số nước người ta sử dụng nitrite để khống chế hai quy trình lên men không mong

muốn trên, song một số dẫn xuất của chúng rất độc và có hoạt tính gây ung thư nên người

ta đang nỗ lực tìm kiếm giải pháp thay thế) Tuy nhiên vai trò công nghệ của nisin trong

sản xuất fromage vẫn chưa thực sự tìm được vị trí vững chắc [27, 32]

Trong công nghệ chế biến đồ hộp, sau quá trình thanh trùng bào tử của một số loại vi khuẩn bền nhiệt vẫn còn, ví du: C perfringens, C thermocaccharolyticum hay Bacillus

stearothermophilus Trong rất ít trường hợp có thể vẫn có nguy cơ còn sót lại, việc sử dụng

nisin cho các nhóm sản phẩm này nhằm 2 mục đích là giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn (để cải thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ôn hoà hơn) và kìm

hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu còn bào tử sót) Nhóm sản phẩm

thường áp dụng là: cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm nấm mũ, đậu quả đóng

hộp [16]

Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt (thịt hun khói, đăm bông, xúc xích, thịt

băm ) người ta đang nỗ lực tìm kiếm các giải pháp công nghệ để thay thế cho việc sử

dụng nitrite và nisin hiện đang thu hút được sự quan tâm của các nhà sản xuất, trong đó

hướng phối hợp nisin-nitrite cho hiệu quả rất tích cực và đang được thử nghiệm tiếp tục [22]

Một nhóm sản phẩm khác có thể sử dụng hiệu quả nisin là sữa chocolate Sản phẩm

này, do độ acid thấp nên nguy cơ nhiễm vi khuẩn cao hơn, trong khi đó nhiệt độ thanh

trùng cao ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng mùi và vị sản phẩm Việc kết hợp sử dụng

nisin cho phép hạ thấp nhiệt độ và thời gian thanh trùng, đồng thời lại cải thiện được chất

lượng sản phẩm (ở nồng độ nisin khoảng 80 Ul/ml đã có khả năng ngăn ngừa hiện tượng lên men thối sản phẩm sữa chocolate ở nhiệt độ thường trong vòng 6 tháng) [16]

Kết hợp với các phương pháp hiện đại, những nghiên cứu ngày càng tinh vi va da dang

về mọi khía cạnh của bacteriocin Đã có rất nhiều bacteriocin được nghiên cứu và mô tả

đặc điểm Kevin G Mossie £¿ aÍ (1979) đã mô tả đặc điểm và phương thức hoạt động của bacteriocin sản xuất bởi ching Bacteroides fragilis, Gerald W Upton et al (1977) đã mô

tả đặc điểm của bacteriocin của Streptococcus phân lập được từ bệnh nhân viêm màng tim

trong Raf Callewaert et al (1999) đã mô tả đặc điểm và sản xuất amylovorin L471, một bacteriocin tinh chế từ Lactobacillus amylovorus DCE 471

Bảng 1.3: Một số chủng sản sinh bacteriocin và điều kiện nuôi cấy [1 1]

ATCC 11454

L carnosum Lml Leuconocin Leml MRS 25 %C, 24h

NCDO 955

Các nhà khoa học đã tích cực nghiên cứu để tìm ra các gen liên quan đến sinh tổng

hợp, điều hoà của bacteriocin và miễn dịch của chủng sản xuất Mặc dù một số

bacteriocin đã xác định được gen mã hoá nhưng vẫn còn rất nhiều điểu chưa rõ ràng, như

là cơ chế biến đổi từ tiền peptide thành peptide trưởng thành, các enzyme tham gia, sự sinh tổng hợp được điều hòa như thế nào, đặc biệt là với các bacteriocin lantibiotic Hiện nay, gen mã hoá cho nisin đã được tìm thấy và định vị Một số bacteriocin khác cũng đã

được xác định như lactococcin, variacin, lacticin, plantaricin nhưng vẫn còn nhiều

bacteriocin khác chưa được xác định [16]

Về phương thức hoạt động của bacteriocin, đã đạt được nhiều kết quả và khám phá quan trọng trong vấn để này, ví dụ như lacticin 3147 hình thành lỗ đặc hiệu ion trên màng

tế bào vi khuẩn GÌ Nisin thì liên kết với một chất tẩy cation có hoạt tính bê mặt để thấm

vào vách tế bào vi khuẩn Lactocin 27 tác động lên sự tổng hợp DNA, RNA và protein

[37]

Mặc dù có nhiều bacteriocin được tinh chế, nghiên cứu và mô tả đặc điểm nhưng chỉ

có một số ít được cho là có tiểm năng thương mại Cho đến nay, chỉ có nisin là bacteriocin

tinh khiết duy nhất được sử dụng trong thực phẩm ở Mỹ Nó đã được sử dụng như là chất bảo quản thực phẩm ở trên 50 quốc gia, chủ yếu là trong fromage, rau quả đóng hộp, các sản phẩm qua khử trùng Pasteur như sữa, ngoài ra còn bảo quản trứng và salad tươi [41] Ứng dụng của các bacteriocin khác trong bảo quản thực phẩm cũng được nghiên cứu,

ALTA 2341 được sản xuất từ lên men Pediococcus acidilactici và dựa trên hiệu quả ức

chế của pediocin PA-i/AcH Nó được thêm vào fromage mềm của Mexico rất mẫn cảm với sự nhiễm Listeria Micrograd là kết quả của lên men Propionibacteriưm Nó có hoạt tính chống lại vi khuẩn Œ như là Pseudomonas, Salmonella, Yersinia cũng như là nấm men

và nấm mốc Hoạt tính bảo vệ của Microgard gần như là do có sự hiện diện của acid propionic [36] ALTA 2341 được chấp nhận bởi FDA cho sử dụng trong fromage va

yoghurt mùi trái cây Một sản phẩm khác là Bioprofit là hợp chất của chiing Lactobacillus

và Propionibacterium được dùng trong nuôi cấy thông thường để chống sự phát triển của

nấm men, nim méc, Bacillus spp Clostridium spp và Lactobacillus trong suốt quá trình

lên men bơ sữa [13]

Đặc biệt có một số bacteriocin loại lantibiotic còn có một số ứng dụng trong y được hiện đang được nghiên cứu Epidermin và Gallidermin (2003) cho thấy hoạt tính kháng Propionibacterium acnes, tác nhân gây mụn trứng cá Những chất bảo quản này đưa đến việc các lantibiotic có thể được sử dụng trong xử lý mụn trứng cá ngoài da như là một liệu pháp thay thế cho các kem erythromycin/vitamin A được sử dụng hiện nay

Tương tự, tính ổn định với acid của nisin (HURST, 1981) đã hướng đến nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng nó có thể có ảnh hưởng trong chữa trị bệnh viêm loét dạ dày Vì

hoạt tính kháng khuẩn của nó là chéng lai Helicoacter pylori D6 nhay cia nisin véi cdc

enzyme tiêu hoá lại là trở ngại trong việc sử dụng các chất này trong trị liệu [44]

Nhưng có lẽ ý nghĩa nhất là nhóm cinnamycin thuộc lantibiotic loại B đã cho thấy ảnh

hưởng của chúng đến chức năng miễn dịch của người, sự tăng nhanh leucocyte có thể

đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống virus Herpes simplex Do đó, ứng dụng tiềm năng của những hợp chất này trong việc chăm sóc sức khỏe con người là rõ ràng

[14]

Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong suốt những năm qua để đạt được hiểu biết sâu sắc

về bacteriocin nhưng vẫn cần tiếp tục tìm hiểu để đạt được sự am hiểu đầy đủ về cơ cấu

phân tử, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, cơ cấu hoạt động của bacteriocin Trong

sinh tổng hợp của lantibiotic, chức năng của enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng