Bài viết tiến hành thu thập. phân lập và xác định nguồn bệnh bạc lá bằng kỹ thuật PCR. Bảo quản nguồn bệnh phân lập đƣợc để làm vật liệu nghiên cứu. Mời các bạn cùng tham khảo để nắm chi tiết hơn nội dung nghiên cứu.
Trang 1PHÂN LẬP, CHẨN ĐOÁN BỆNH BẠC LÁ LÚA BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ VÀ BẢO
QUẢN NGUỒN BỆNH CHO NGHIÊN CỨU
DENTIFICATION OF RICE BACTERIAL LEAF
BLIGHT Xanthomonas oryzae BY PCR
Đoàn Thị Thanh
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam
Abstract
Bacterial blight (BB) is one of the most destructive disease of rice plants in almost rice growing countries in both temperature and tropical regions especially in Asia This is also a major disease of rice in Viet nam This disease is multiplicate increase during the past 10 years in the Northern Vietnam in both two seasons of rice We collected 0 isolates of the bacterial leaf bright of rice from various regions of Northern Vietnam The
identification of Xanthomonas oryzae (X.oryzae) species by PCR showed that: There are 29 isolates of X.oryzae
by using primers X R -F and X R -R2 Time preservation of X.oryzae in liquid glycerol last one year, in skim
milk medium over one year and in water only two months
Keywords: Xanthomonas oryzae, PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạc lá nguyên nhân do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv oryzae gây nên, là một
trong những bệnh hại nguy hiểm đối với cây lúa
trong cả hai vụ: vụ xuân và vụ mùa ở nước ta
Những năm gần đây bệnh gây thiệt hại rất nặng,
đặc biệt là trên các giống lúa lai và những giống
lúa thuần nhập nội từ Trung quốc Do vậy cần
xác định chính xác nguồn bệnh làm vật liệu cho
công tác chọn tạo giống là cần thiết Do vậy,
chúng tôi đã tiến hành thu thập phân lập và xác
định nguồn bệnh bạc lá bằng kỹ thuật PCR Bảo
quản nguồn bệnh phân lập được để làm vật liệu
nghiên cứu
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu bao gồm 0 nguồn
bệnh được thu thập từ các vùng trồng lúa ở miền
Bắc Việt Nam
- Các môi trường để phân lập và bảo quản vi khuẩn và hoá chất cần thiết để chạy PCR xác định nòi vi khuẩn bạc lá lúa
2.2 Phương pháp nghiên cứu
- Phân lập nòi vi khuẩn bạc lá lúa trên môi trường Wakimoto, 1995
- Phương pháp lây nhiễm theo GS.TS.S.Taura (2000)
- Phương pháp PCR để xác định nòi vi khuẩn theo GS.TS.S.Taura (2000)
- Phương pháp bảo quản của Wakimoto
nguy Hwang (1998)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
.1 Thu thập nguồn bệnh
Chúng tôi đã thu thập nguồn bệnh từ các vùng trồng lúa ở miền Bắc Việt nam Kết quả thu được
Trang 2ở bảng 1
Bảng1 Danh sách các isolates đã thu thập
STT Nơi thu thập STT Nơi thu thập
1 Dòng vi khuẩn chuẩn từ
RR
17 VAS
, Hà Nội - 6
2 An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây 18 Sơn Tây, Hà Tây
An Khánh, Hoài Đức, Hà Tây 19 TT xã, Sơn Tây, Hà Tây
4 VAS
, Hà Tây
20 Sơn Tây, Hà Tây
5 Hoài Đức, Hà Tây 21 Văn Giang, Hưng ên -1
6 Đồng Hỷ, Thái Nguyên 22 Văn Giang, Hưng ên -2
7 Đồng Hỷ, Thái Nguyên 2 Trại TN Lai Cách, Hưng ên -1
8 ĐH Nông Lâm, Thái Nguyên 24 Trại TN Lai Cách, Hưng ên -2
9 Thanh Trì, Hà Nội 25 Trường NN, Việt ên, Bắc Giang
10 VAS
, Hà nội -1
26 Đông Hưng, Thái Bình
11 VAS
, Hà nội -2
27 Hưng Hà, Thái Bình
12 VAS
, Hà nội -
28 Thái Thuỵ, Thái Bình
1 Quế Võ, Bắc Ninh -1 29 Gia Lâm, Hà Nội
14 Quế Võ, Bắc Ninh -2 0 Trâu Quì, Hà Nội
15 VAS
, Hà nội -4
1 Văn Giang, Hưng ên
16 VAS
, Hà nội -5
.2 Lây nguồn bệnh để xác định isolates là
bệnh Xanthomnas oryzae
- Trước xác định bệnh tiến hành lây thử lên
R24 để thử độc tính của vi khuẩn sau bảo quản
- Tạo dung dịch lây nhiễm: Sau 48 giờ vi
khuẩn nuôi cấy trong môi trường Wakimoto mọc
Khi đó ta lấy một vòng vi khuẩn hoà với 10 ml
nước tạo dung dịch có nồng độ vi khuẩn từ 108-
109 / 1 ml nước Đem dung dịch đó đi lây nhiễm
- Lây nhiễm mỗi chủng 1 cây, mỗi cây cắt toàn
bộ lá có trên cây đó Kết quả ở hình 1
Trang 31 2 4
Hình 1 Lây nhiễm nguồn bệnh
để thử độc tính
1, 2 Nguồn có độc tính cao; Nguồn có độc tính
trung bình, 4 Nguồn kháng bệnh
Ly trích DNA
Tất cả các isolates đựơc nuôi cấy trên môi
trường Wakimoto, 1995 sau 49 giờ để chiết tách
AND Phương pháp chiết tách ADN thep phương
pháp của Wakimoto, 1995
.4 Xác định bệnh bạc lá bằng phương
pháp PCR
Xác định bệnh bạc lá lúa nhờ cặp mồi của
X R -F và X R -R2 theo phương páhp của
Adachi và ku (2000)
.4.1 Phản ứng PCR
+ Hoá chất cần cho phản ứng PCR
Hoá chất cần cho phản ứng gồm Taq bufer,
Trí-HCL, KCl, Trion X-100, Taq polymera,
MgCl2, dNPT, DNA khuôn,vv
+ Nhân gen
Sau khi đã hoàn chỉnh các mẫu ly trích DNA
trên ta tiến hành nhân gen Đặt các mẫu vào trong
máy nhân gen theo một chu kỳ nhiệt nhất định,
đối với gen bệnh bạc lá chúng tôi dùng một chu
kỳ nhiệt riêng
.4.2 Điện di sản phẩm PCR
Sau khi kết thúc phản ứng PCR, tiến hành
chạy điện di sản phẩm nhân gen, chạy điện với
agarose 2%.:
Sau khi đã pha trộn đầy đủ, ủ chúng ở 70C trong Water bath hoặc ven trong vòng 6 tiếng, hoặc có thể
ủ qua đêm Tiếp đó chạy điện di sản phẩm gen cắt bằng agarose 2% Lúc này có thể phân biệt được các vạch
Thường điện di dòng điện có hiệu điện thế là 60V, cường độ dòng điện là 200 mA trong 0 phút Trong trường hợp muốn có kết quả nhanh có thể chạy với dòng điện 100 V, cường độ dòng điện 200
mA trong 15 phút Tuỳ từng trường hợp mà có thể
xử lý cường độ, hiệu điện thế cũng như thời gian khác nhau
.5 Kết quả phản ứng PCR để xác định bệnh bạc lá từ các isolates
Sau khi điện di, quan sát các vạch trên gel, chúng tôi thu được kết quả ở hình 2:
Hình 2 Xác định nguồn vi khuẩn X.oryzae bằng PCR
- Đường 1: Gồm các isolates từ 1-15: số 1 là nguồn bệnh chuẩn X.oryzae
- Đường 2: số isolates từ 16- 0: số isolates
theo thứ tự của bảng 1
Kết quả ở hình 2 cho thấy 0 isolates thu thập
đều là vi khuẩn X.oryzae vì vạch băng trùng với
Trang 4vạch băng số 1 dòng chuẩn của vi khuẩn
X.oryzae
.6 Các phương pháp bảo quản vi khuẩn
X.oryzae
- Phương pháp bảo quản bằng nước cất: sau
khi cấy vi khuẩn 2- ngày trên môi trường SPA
(môi trường Wakimoto, 1995) Lấy 0.2ml dịch
khuẩn ở nồng độ 104 tế bào /ml cho vào 1ml nước
cất vô trùng, lắc đều và bảo quản ở 6-80
C Sau 1,
2, , 4 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức
độ sống sót của tế bào vi khuẩn
- Phương pháp bảo quản bằng phủ dung dịch
glycerol: Lấy 0.2ml dịch khuẩn ở nồng độ 10 tế bào /ml cho vào 1ml nước cất vô trùng, lắc đều
và bảo quản ở 6-80C Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn
- Phương pháp bảo quản vi khuẩn trong băng: Lấy 0.2ml dịch khuẩn ở nồng độ 104 -6tế bào /ml cho vào 1ml nước cất vô trùng, lắc đều và bảo quản ở 6-80C Sau 4, 8, 12 tháng cấy chuyển 1 lần để xác định mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn
Kết quả đựơc ghi nhận ở bảng 2:
Bảng 2 Mức độ sống sót của tế bào vi khuẩn qua các giai đoạn bảo quản
Phương pháp
bảo quản
Đường kính khuẩn lạc (mm) Tỷ lệ sống (%)
Thời gian mọc (giờ)
Trong nước cất
1 tháng
2 tháng
tháng
4 tháng
0.60
0 0 0.10
0
100
65
15
0
48
50
56
0
Trong glycerol
4 tháng
8 tháng
12 tháng
16 tháng
0.66 0.67 0.65 0.60
100
100
98
40
48
48
48
54
Trong Skim milk
4 tháng
8 tháng
12 tháng
16 tháng
0.68 0.70 0.68 0.69
100
100
100
98
48
48
48
48 Kết quả ở bảng 2 cho thấy bảo quản vi khuẩn
X.oryzae trong nước cất chỉ được 1-2 tháng,
trong glycerol khoảng 12 tháng, trong Skim milk
là trên 16 tháng
V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1 Kết luận
1 Thu thập được 0 isolates ở các vùng khác nhau để phân lập bệnh bạc lá lúa
2 Chẩn đoán được 29 isolates là vi khuẩn
X.oryzae bằng kỹ thuật PCR do sử dụng cặp mồi
Trang 5chọn lọc
4.2 Đề nghị: Cần nghiên cứu và thu thập
thêm nhiều nguồn vi khuẩn bạc lá lúa trên các vùng bị bệnh hại
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Adachi.N and T ku, 2000 PCR
mediated detection of Xanthomonas oryzae pv
ryzae by aplification of 16S-2 S rDNA spacer
sequence J Gen.Plant Pathol 66: 0- 09
2
zuka, A and kaku, H, 2000 A historical review of
bacterial blight of race Bull Nati
nst Agrobiol Resour 15:1-207
Suwas, T 1962 Studies on the culture
media of Xanthomonas oryzae ( yeda et
shiyama)
4 Wakimoto, S, 1995 Studies on multipulication
phage (Xanthomonas oryzae bacteriophage) 1
neăstep growth experiment under variuos
condition Sci.Bull.Fac.Agric Kyushu niv 15:
151-160 (in Lapanese with
nglish summary)
5 Phan Hữu Tôn, 2004 Chiến lược chọn tạo
giống lúa chống chịu bệnh bạc lá miền Bắc Việt
nam Hội nghị quốc tế Quốc gia về chọn tạo
giống lúa Nhà xuất bản nông nghiệp, tr.115-120,
2004