Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus CIAV) lưu hành tại miền bắc việt nam

Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus CIAV) lưu hành tại miền bắc việt nam Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus CIAV) lưu hành tại miền bắc việt nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2020

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -ĐÀO ĐOAN TRANG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM

Ở GÀ (CHICKEN INFECTIOUS ANEMIA VIRUS- CIAV)

LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ

TS Nguyễn Văn Giáp

LỜI CAM ĐOAN

Dữ liệu trong luận án là một phần của đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và

dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (chicken infectious anemia virus, CIAV) lưu hành ở miền Bắc Việt Nam”, mã số 04/DAVB, được tài trợ bởi

Dự án Việt- Bỉ, giai đoạn 2014-2019

Tôi xin cam đoan: (1) tất cả các kết quả thu được trong luận án này do bản thân tôi và nhóm nghiên cứu thực hiện và được phép công bố với sự đồng ý của chủ nhiệm

đề tài và các thành viên tham gia thực hiện; (2) các kết quả được trình bày trong luận án

là trung thực, khách quan và không trùng lặp với bất kỳ một luận án tiến sĩ nào đã công

bố trước đây; (3) mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả luận án

Đào Đoan Trang

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án, tác giả đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện của rất nhiều cá nhân, đơn vị và tổ chức

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ và

TS Nguyễn Văn Giáp, những người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Bên cạnh đó, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến dự án Việt- Bỉ tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã cấp kinh phí đề tài để tôi có thể thực hiện được nội dung nghiên cứu của luận án

Đồng thời, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Quản lý đào tạo, Ban Chủ nhiệm khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, cùng toàn thể các thầy, cô giáo và cán bộ Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu và giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Nhân dịp hoàn thành luận án, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể Lãnh đạo và toàn thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Thực nghiệm và Bảo tồn Vật nuôi (Viện Chăn nuôi), các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã luôn tạo điều kiện về thời gian, động viên, chia sẻ vật chất, tinh thần, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Nghiên cứu sinh

Đào Đoan Trang

2.2.10 Biện pháp phòng bệnh 19

4.1.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà nhiễm CIAV trong tự nhiên 37

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

nhiễm ở gà

serotype 4

Taxonomy of Viruses

Ủy ban quốc tế về phân loại virus

quang gián tiếp

quản truyền nhiễm

Marek’s

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

4.17 Trình tự gen ORF1 của CIAV (nucleotide 1-582) 61

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN

Tên tác giả: Đào Đoan Trang

Tên Luận án: Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus gây bệnh thiếu máu truyền

nhiễm ở gà (Chicken Infectious Anemia Virus - CIAV) lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Phương pháp nghiên cứu

Hai nhóm phương pháp chính được dùng trong nghiên cứu này, bao gồm: (i) kỹ thuật PCR dùng để phát hiện CIAV trong mẫu bệnh phẩm và giải trình tự gen virus (ii) Ứng dụng tin sinh học, với các phần mềm như MEGA, Weblogo, BEAST, PastML v.v để phân tích đặc điểm sinh học phân tử và dịch tễ học phân tử của CIAV

Kết quả chính và kết luận

Có 2 nhóm kết quả nghiên cứu chính đã đạt được trong nghiên cứu này, bao gồm:

(1.1) Đã chứng minh được sự có mặt phổ biến của virus gây bệnh thiếu máu

truyền nhiễm ở 10 tỉnh miền Bắc Gà ở mọi lứa tuổi, mục đích chăn nuôi, quy mô và

phương thức chăn nuôi đều nhiễm CIAV, với tỷ lệ trung bình là 62,2% (1.2) Đã xác

định được có bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà nuôi với các biến đổi bệnh lý đại thể điển

hình ở: teo cơ quan lympho và tủy xương nhạt màu (1.3) Bằng gây bệnh thực nghiệm,

đã chứng minh virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở miền Bắc có độc lực, gây ra các biến đổi bệnh lý điển hình của bệnh như giảm tỷ khối huyết cầu, teo tuyến ức, teo túi Fabricius và tủy xương nhạt màu

(2) Đặc điểm dịch tễ học phân tử của CIAV ở miền Bắc Việt Nam đã được làm rõ

thông qua việc (2.1) xác định được hai nhóm di truyền là genogroup G2 và G3 lưu

hành, với 100% số chủng CIAV không nằm cùng nhánh với các chủng virus vacxin

(2.2) Kết quả phân tích còn cho thấy CIAV lưu hành ở miền Bắc Việt Nam có nguồn

gốc đa dạng: virus thuộc genogroup G2 có nguồn gốc từ các chủng virus lưu hành ở Argentina và Mỹ Trong khi đó virus thuộc genogroup G3 có nguồn gốc từ chủng virus lưu hành ở Trung Quốc, Đài Loan và Ba Lan Sau khi xâm nhập, các chủng CIAV có khả năng đã tạo thành những nhánh di truyền riêng biệt và tiếp tục lây lan

THESIS ABSTRACT

PhD candidate: Dao, Doan Trang

Thesis title: Molecular epidemiological study of chicken infectious anemia virus

(CIAV) in Northern of Vietnam

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives

This study firstly investigated the prevalence of CIAV in ten northern provinces

of Vietnam Based on the identification of CIAV, compatible clinical and gross lesions

of chicken infectious anemia, the molecular epidemiology of CIAV was analyzed under different aspects in order to revealed genetic, phylogenetic characterizations and spatial- temporal distributions of CIAV in northern provinces

Materials and Methods

Two major groups of methods were used, including: (i) PCR based method for viral detection and Sanger’s sequencing (ii) Applied bioinformatics for genetic, phylogenetic and molecular epidemiological Several tools were utilized, such as: BioEdit, MEGA, WebLogo, BEAST, PastML, etc

Main findings and conclusions

Two findings were obtained from this study, as following:

(1.1) The wide prevalence of CIAV in ten northern provinces were proven The

virus was detected in chickens of all ages, scales and production types, with an average

positive rates of 62.2% (1.2) The clinical disease of chicken infectious anemia readily

existed with the typical pathological changes were detected in naturally infected birds,

such as: atrophy of lymphoid tissues, and pale of bone marrow (1.3) Being able to

induce compatible gross lesions of chicken infectious anemia under experiment conditions, the pathogenicity of a CIAV strain circulating in the North was proven

(2) The molecular epidemiological characterisation of CIAV in Northern Vietnam

were elucidated through (2.1) the identification of two circulating genogroups of G2 and

G3 All of detected CIAV strains was proven not belonging to vaccine strain and did not

display significant motifs of attenuated viruses (2.2) The analysis also showed that

CIAV circulating in Northern Vietnam has diverse origins: the genogroup G2 virus was

derived from the strains circulating in Argentina Meanwhile, the viruses of genogroup G3 were originated from the strains circulating in China, Taiwan and Poland Upon introduction, CIAV seemed to diversify locally and started to diffuse spatial-temporally into different geographic areas

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Chăn nuôi là một bộ phận quan trọng của nền nông nghiệp Việt Nam Bên cạnh nhiều cơ hội và thuận lợi, ngành chăn nuôi gia cầm đã và đang phải đối mặt với không ít thách thức và khó khăn; trong đó, dịch bệnh được xem là trở ngại lớn, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi Hiện nay, một trong những bệnh ở gia cầm ít được quan tâm nghiên cứu ở nước ta là tình trạng suy giảm miễn dịch, với vai trò lớn thuộc về các virus tác động trực tiếp tới hệ miễn dịch của vật nuôi Virus gây ức chế miễn dịch đã và đang đe dọa ngành chăn nuôi gia cầm bởi thiệt hại kinh tế trong sản xuất với tỷ lệ tử vong cao do gà dễ bị nhiễm trùng thứ cấp (Dohms & Saif, 1984) và có đáp ứng miễn dịch thấp đối với vacxin phòng bệnh (Lutticken, 1997) Trong số đó, CIAV (chicken infectious anemia virus)- nguyên nhân gây bệnh bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia- CIA) (Yuasa & cs., 1979) được xem là một trong các bệnh có ảnh hưởng lớn về kinh tế trên phạm vi thế giới (Balamurugan & Kataria, 2006) Bệnh trở lên phổ biến, được thông báo xuất hiện ở hầu hết các nước chăn nuôi gà trên thế giới (Toro & cs., 2006; Bougiouklis & cs., 2007; Oluwayelu, 2010) do virus có khả năng lây lan, đề kháng mạnh với các yếu tố sát trùng và gây ức chế đơn thuần hoặc kết hợp với các tác nhân truyền nhiễm khác

Từ khi CIAV được phát hiện đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về CIAV và bệnh do virus gây ra trên phạm vi toàn cầu với kết quả thu được từ nhiều khía cạnh: đặc tính sinh học, cơ chế sinh bệnh, cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus; đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng, bệnh tích của bệnh và biện pháp can thiệp Đáng chú ý là cơ chế gây ức chế miễn dịch của virus bởi khả năng tấn công vào các cơ quan miễn dịch, làm cạn kiệt các tế bào lympho của tuyến

ức, túi Fabricius và tế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast) ở tủy xương (Adair, 2000; Dhama & cs., 2008) Ngày nay, sinh học phân tử phát triển đã tạo thuận lợi cho các nghiên cứu chuyên sâu về CIAV Cấu trúc bộ gen virus đã được giải mã cùng với các đặc điểm về di truyền đã giúp cho việc xác định chủng, phân loại virus

và sản xuất vacxin phòng bệnh, từ đó góp phần hạn chế thiệt hại do virus gây ra Đến nay, vacxin phòng CIA đã được sử dụng phổ biến trên thế giới, đặc biệt ở các nước có ngành chăn nuôi gà phát triển Tuy nhiên, thông tin về CIA cũng như sự hiểu biết về CIAV tại Việt Nam có phần hạn chế Tính đến thời điểm hiện tại, công bố

về sự có mặt của kháng thể kháng CIAV trong huyết thanh gà vào năm 2013 (Trinh & cs., 2015b) cũng như kết quả phân loại phát sinh gen của các chủng CIAV tại miền Bắc Việt Nam (Van Dong & cs., 2019) là hai nghiên cứu về CIAV với các mẫu bệnh phẩm lấy tại Việt Nam nhưng được thực hiện ở nước ngoài Bên cạnh đó, theo thông

tư 10/2016/TT-BNNPTNT, hiện có 2 loại vacxin phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm được phép lưu hành: Nobilis CAV P4 (Intervet) và AviPro Thymovac (Lohmann Animal Health GmbH) tuy nhiên việc sử dụng vacxin cũng như hiểu biết của người chăn nuôi ở Việt Nam về CIAV và CIA rất khiêm tốn Vì vậy, chúng tôi nhận thấy rằng nghiên cứu các đặc điểm sinh học phân tử của các chủng CIAV lưu hành ở một

số tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam rất cần thiết, là cơ sở khoa học của việc sử dụng các vacxin hiện có trên thị trường để phòng CIA Kết quả thu được sẽ là nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về CIAV tại Việt Nam, góp phần tiến tới kiểm soát và hạn chế ảnh hưởng của bệnh do CIAV gây ra đối với ngành chăn nuôi gà của Việt Nam, giai đoạn hiện nay và trong tương lai

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

* Mục tiêu tổng quát: trả lời câu hỏi có hay không có sự lưu hành gây bệnh của CIAV ở đàn gà nuôi tại Việt Nam và nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân

tử của virus làm cơ sở để đề xuất biện pháp phòng bệnh hiệu quả giúp nâng cao năng suất, chất lượng đàn gà

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI

- Đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam đã xác định được có sự lưu hành của CIAV ở đàn gà trên địa bàn của 10 tỉnh/thành phố ở miền Bắc Việt Nam: Hòa Bình, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Hà Nội, Bắc Ninh, Hải Dương, Hà Nam, Nam Định, Hải Phòng

và Quảng Ninh;

- Kết quả nghiên cứu đã giải mã được 3 trình tự gen hoàn chỉnh và 52 trình

tự gen ORF1 của các chủng CIAV lưu hành tại thực địa; cho thấy virus thuộc 2 nhóm di truyền G2 và G3; có độc lực và không cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang được sử dụng

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu đã khẳng định sự lưu hành của CIAV cũng như sự có mặt của CIA trong các đàn gà nuôi ở một số tỉnh phía Bắc của Việt Nam Biểu hiện lâm sàng, biến đổi bệnh lý của gà trong tự nhiên được khẳng định bởi kết quả PCR đối với các mẫu bệnh phẩm và kết quả gây bệnh thực nghiệm bởi chính các chủng CIAV lưu hành đã nhấn mạnh sự cần thiết phải xem xét đến vai trò và ảnh hưởng của CIAV và CIA đối với ngành chăn nuôi gà hiện nay

- Nghiên cứu đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các chủng CIAV đã và đang lưu hành ở đàn gà nuôi tại 10 tỉnh/thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam: các chủng thuộc về 2 nhóm di truyền G2, G3; là các chủng có độc lực và không cùng nhánh với các chủng virus vacxin Từ thực tế trên, việc sử dụng vacxin trở nên cần thiết để bảo vệ các đàn gà đối với bệnh do CIAV gây ra

- Kết quả là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ cho nghiên cứu về bệnh (CIA) và virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (CIAV); cũng như cho công tác giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi- Thú y tại Việt Nam

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 VIRUS GÂY BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại virus gây bệnh

Virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (chicken infectious anemia virus- CIAV) lần đầu tiên được phát hiện từ đàn gà thương phẩm bị bệnh ở Nhật Bản (Yuasa & cs., 1979) với tên ban đầu là CAA (chicken anemia agent- yếu tố gây thiếu máu ở gà) Tên gọi CAA bắt nguồn từ đặc điểm tác nhân gây bệnh không nhân lên trên một số môi trường nuôi cấy tế bào (Yuasa, 1983) Về sau, CAA được chứng minh là một virus khi phát hiện ra tác nhân này nhân lên trên một số dòng tế bào lymphoblastoid của gà (Yuasa & cs., 1983) Sau khi được chứng minh là virus, tên gọi CAV hoặc CIAV được dùng thay cho CAA (Mcnulty, 1991; Noteborn & cs., 1991; Meehan & cs., 1992)

Về phân loại, trước đây, CIAV được xếp vào giống Gyrovirus và họ

Circoviridae (Meehan & cs., 1992; Pringle, 1999) Năm 2017, trên cơ sở phân

tích lại một cách có hệ thống các bằng chứng về sự khác biệt rõ rệt của CIAV với

virus thuộc họ Circoviridae, ủy ban quốc tế về phân loại virus (ICTV), đã chuyển CIAV và giống Gyrovirus vào họ Anelloviridae (Rosario & cs., 2017)

Hình 2.1 Cây phát sinh chủng loại của giống Gyrovirus

Nguồn: Truchado & cs (2019)

Trước năm 2011, CIAV là thành viên duy nhất của giống Gyrovirus được

biết đến Hiện tại, đã xác định được 12 virus, bao gồm GyV2 -GyV10, HGyV1

(Human Gyrovirus), ASPaGyV (Ashy storm petrel Gyrovirus) và GyV11

(Truchado & cs., 2019) Mối liên hệ giữa các thành viên được trình bày ở hình 2.1 Dựa vào đặc điểm phân nhánh, CIAV (đóng khung, hình 2.1) là một nhánh độc lập

trong giống Gyrovirus, có quan hệ gần gũi với GyV6 và GyV7

2.1.2 Hình thái, cấu trúc CIAV

CIAV là một virus không có vỏ bọc, đường kính trung bình từ 19,1 nm- 26,5 nm (Gelderblom & cs., 1989) Cấu trúc bề mặt capsid có 60 tiểu đơn vị được sắp xếp theo 12 vòng hình loa kèn (King & cs., 2011)

Hình 2.2 Hạt virus dưới kính hiển vi điện tử

Nguồn: Todd & cs (1990) Dưới kính hiển vi điện tử, hình ảnh nhuộm âm bản CIAV tinh khiết cho thấy hạt virus có dạng hình cầu, với khoảng 10 gai nhô lên rõ ràng trên bề mặt (Todd & cs., 1990) Về vật chất di truyền, bộ gen CIAV là sợi ADN đơn, dạng vòng, dài khoảng 2,3 kb Bộ gen CIAV có 3 khung đọc mở (ORF) lồng một phần vào nhau, theo thứ tự ORF2- ORF3- ORF1 Trong đó ORF2, ORF3 và ORF1 mã hóa lần lượt cho 3 protein là: VP2 (24 kDa), VP3 (14 kDa) và VP1 (52 kDa) (Noteborn & cs., 1991; Schat & Van Santen, 2008)

Hình 2.3 Cấu trúc bộ gen CIAV

Nguồn: Rosario & cs (2017)

Hình 2.3 so sánh cấu trúc gen giữa thành viên của họ Circoviridae và

Anelloviridae Virus thuộc họ Anelloviridae có đặc điểm (i) gen mã hóa protein

lồng nhau và cùng chiều, (ii) không có cấu trúc stem-loop với 9 nucleotide đặc

trưng Hai đặc điểm cơ bản trên thấy ở các thành viên của họ Circoviridae Trong

số 3 protein virus, VP1 là protein cấu trúc duy nhất được biết đến có vai trò tạo thành capsid, có thể được phát hiện trong các hạt virus có độ tinh khiết cao (Todd

& cs., 1990) Nó đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra kháng thể trung hòa ở

gà bị nhiễm bệnh VP2 là protein không cấu trúc, có thể hoạt động như một protein làm khung (scaffold) trong quá trình lắp ráp virion (Noteborn & cs., 1998) VP2 còn có hoạt tính của phosphatase (dual-specificity phosphatase) nhận biết đặc hiệu đồng thời phân tử tyrosine, serine hoặc threonine ở vị trí cắt (Peters

& cs., 2002) VP3 là protein không cấu trúc hay là 1 apoptin gây ra cơ chế chết chương trình hóa (apoptosis) cho các tế bào tiền thân ở vùng tủy của tuyến ức và các tế bào hemocytoblasts trong tủy xương (Noteborn & cs., 1994)

2.1.3 Sức đề kháng của CIAV

CIAV mang các đặc điểm đề kháng cao với nhiệt độ, chloroform của một virus không có vỏ bọc (Yuasa, 1992) Nhìn chung, virus có sức đề kháng cao

trong điều kiện tự nhiên CIAV chịu được nhiệt độ 56oC hoặc 70oC trong 1 giờ

phút (Urlings & cs., 1993) Đối với các hóa chất dùng sát trùng chuồng trại, CIAV trong huyễn dịch bệnh phẩm bị bất hoạt hoàn toàn bởi iodine hoặc sodium

2.1.4 Tính kháng nguyên và sự biến đổi chủng của CIAV

Sử dụng kháng thể đa dòng, các nhà khoa học trên thế giới không phát hiện sự khác nhau về đặc tính kháng nguyên giữa các chủng CIAV phân lập được

ở Nhật Bản, châu Âu và châu Mỹ (Yuasa & Imai, 1986; Mcnulty & cs., 1990) Với kháng thể đơn dòng, sự khác biệt nhỏ về đặc tính kháng nguyên giữa các chủng CIAV đã được tìm thấy (Trinh & cs., 2015a) Trên capsid protein của CIAV tồn tại vùng “siêu biến đổi” từ amino acid 139 đến 151 (Renshaw & cs., 1996), nhưng mới chỉ có bằng chứng về sự thay đổi amino acid của vùng này đến

đặc tính nhân lên của CIAV in vitro (Renshaw & cs., 1996)

Dựa vào phản ứng huyết thanh học, nhìn chung các chủng CIAV được xem thuộc về một type huyết thanh đơn (Schat & Van Santen, 2008) Năm 2002, một nhóm nhà khoa học ở Mỹ công bố phát hiện CIAV-7 phân lập từ gà 17 tuần tuổi có bệnh tích của bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Spackman & cs., 2002a) Trong điều kiện thí nghiệm, CIAV-7 gây ra tình trạng bệnh giống bệnh thiếu máu truyền nhiễm, nhưng CIAV-7 lại có đặc tính kháng nguyên khác với chủng CIAV tham chiếu (không bị trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu kháng CIAV chủng Del-Ros) (Spackman & cs., 2002b) Do đó, chủng CIAV-7 được giả định là một type huyết thanh học thứ 2 của virus gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Spackman & cs., 2002b) Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có thêm nghiên cứu

về CIAV-7 được công bố

2.2 BỆNH THIẾU MÁU TRUYỀN NHIỄM Ở GÀ

2.2.1 Giới thiệu chung

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà (CIA) được đặc trưng bởi tình trạng thiếu máu không tái tạo (aplastic anemia) do sự phá hủy các tế bào tạo máu (hematopoietic stem cell) ở tủy xương và thoái hóa các mô lympho (lymphoid depletion) (Mcnulty, 1991) Bên cạnh đó, do tình trạng ức chế miễn dịch (immunosuppression), gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm dễ mắc các bệnh kế

phát, giảm đáp ứng với các loại vacxin phòng bệnh (Hagood & cs., 2000) Sự xuất hiện của CIA là được đánh giá là một trong những mối đe dọa nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gà ở các nước trên thế giới (Mcnulty, 1991; Balamurugan & Kataria, 2006)

2.2.2 Địa dư bệnh

Lịch sử phát hiện CIA gắn với sự phát hiện CIAV (chủng Gifu-1) lần đầu tiên năm 1979 ở Nhật Bản (Yuasa, 1983) Tiếp sau đó, CIAV đã được phân lập ở nhiều nước: chủng ConnB được phân lập từ gà bị bệnh Marek’s (Goryo & cs., 1987b); chủng CIA-1 được phân lập năm 1988 tại một trang trại ở Delaware (Mỹ) (Lucio & cs., 1990); chủng Cux-1 (C) được phân lập ở Cuxhaven (Đức) vào năm 1991 (Chandratilleke & cs., 1991); chủng L-028 được phân lập vào năm

1992 tại một trang trại ở New York (Mỹ) (Renshaw & cs., 1996), v.v Bằng phản ứng huyết thanh học, CIAV được xác định có mặt ở khắp các nước, ví dụ như ở Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, Úc, NewZealand và Nam Phi, v.v Nghiên cứu hồi cứu các mẫu huyết thanh thu thập từ 1959- 2005 cho biết nhiều khả năng virus đã hiện diện từ trước những năm 1970 (Toro & cs., 2006)

Ghi chú: dựa vào thông tin được công bố qua các bài báo khoa học, trình tự gen được công bố trên

GenBank, đã xác định được các quốc gia có sự hiện diện của CIAV (đánh dấu)

Hình 2.4 Bản đồ phân bố của CIAV ở các nước trên thế giới

Cho đến nay CIAV và bệnh thiếu máu truyền nhiễm đã có mặt ở nhiều nước thuộc tất cả các châu lục (hình 2.4) Ở khu vực Đông Nam Á, CIAV đã được xác định ở Thái Lan, Campuchia, Lào, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Hailemariam

& cs., 2008; Kye & cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Trinh & cs., 2015b)

2.2.3 Thiệt hại do bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây ra

Nghiên cứu tại Israel (Davidson & cs., 2004) khi quan sát 6 đàn gà thịt cho thấy nhiễm CIAV làm giảm sức sản xuất, ví dụ như tăng trưởng kém hơn, tỷ lệ tử vong cao hoặc tăng cường các triệu chứng của các bệnh trong trường hợp nhiễm ghép Cụ thể, nghiên cứu đã chỉ ra dấu hiệu giảm tổng tăng trưởng ở mức 35.000

kg của một đàn so với hai đàn khác cùng với dấu hiệu của bệnh thiếu máu truyền nhiễm (viêm da, xuất huyết cơ, tủy xương nhạt màu, tỷ lệ tử vong cao) Bên cạnh

đó, tỷ lệ tử vong tăng cao ở các đàn nhiễm CIAV (gấp 4 lần so với đàn bình thường) Tuy nhiên, hậu quả cuối cùng và phổ biến là sự cộng gộp ảnh hưởng từ nhiều yếu tố: quản lý yếu kém, các stress trong đàn, yếu tố di truyền của giống và các mầm bệnh ghép

Đối với gà thịt, nhiễm IBDV làm chậm sự phục hồi tuyến ức sau khi CIAV gây teo tuyến ức ở gia cầm (Hoerr, 2010); nhiễm CIAV làm tăng cường khả năng gây bệnh của MDV (Jeurissen & De Boer, 1993) hoặc CIAV có liên quan đến nhiễm trùng tụ cầu khuẩn và viêm da hoại tử Khi gà bị nhiễm nhiều loại mầm bênh, ví dụ như CIAV với MDV, REV hoặc IBDV, v.v… sẽ làm cho tỷ lệ ốm và

tỷ lệ chết tăng cao Bệnh thường xảy ra với đàn gà từ 2 - 4 tuần tuổi khiến cho gà chậm phát triển, tỷ lệ chết dao động từ 10 - 20%, có trường hợp lên đến 60% Với gà trên 6 tuần tuổi, bệnh thường liên quan đến hội chứng thiếu máu - xuất

huyết (aplastic anemia - hemorrhagic syndrome)

Bệnh thiếu máu truyền nhiễm gây thiệt hại kinh tế, giảm lợi nhuận khoảng 18,5% do giảm tăng trọng, tăng tỷ lệ chết của gà từ 3- 15 tuần tuổi (Mcilroy & cs., 1992) Tuy nhiên, đối với ngành sản xuất trứng gà sạch, bệnh thường gây ra những khó khăn và ảnh hưởng lớn nhất bởi Ủy ban châu Âu yêu cầu trứng dùng

để sản xuất vacxin dùng cho gà dưới 7 ngày tuổi không được tạp CIAV Ngoài

ra, tại Úc, châu Âu và Mỹ, chỉ những trứng sạch CIAV mới được dùng để sản xuất vacxin phòng bệnh quai bị và sởi cho người Bên cạnh đó, chi phí bỏ ra để đảm bảo và duy trì các biện pháp an toàn sinh học là không nhỏ bởi virus có sức

đề kháng mạnh với các hóa chất sát trùng (Toro & cs., 2006) Đứng ở khía cạnh này, CIAV gián tiếp gây ra các thiệt hại về kinh tế do phải áp dụng các biện pháp

an toàn sinh học nghiêm ngặt trong quá trình nuôi

2.2.4 Loài vật mắc bệnh

Gà là vật chủ chính của CIAV mặc dù gà tây và chim cút ở Nhật Bản có thể nhiễm CIAV (Schat & Van Santen, 2008) CIAV không chỉ được phát hiện ở

các đàn gà thịt mà ở cả các đàn gà SPF (Cardona & cs., 2000) Gà trống và mái đều mẫn cảm; gà giống thịt được cho rằng mẫn cảm hơn với bệnh Gà ở các lứa tuổi đều cảm nhiễm với CIAV nhưng giai đoạn sau 2 tuần tuổi sự mẫn cảm với bệnh giảm nhanh do sự hoàn thiện của hệ miễn dịch (immuno competency) (Hu

& cs., 1993b), trong đó gà 1 ngày tuổi mẫn cảm nhất (Rosenberger & Cloud, 1989) Từ 2012 trở lại đây, bằng phương pháp PCR, tại Trung Quốc đã phát hiện được CIAV từ phân của người (Zhang & cs., 2012), chuột, chó hoang (Fang & cs., 2017) và mèo (Niu & cs., 2019) Mặc dù vậy, các loài này chưa được chứng minh là vật chủ của CIAV (Fang & cs., 2017)

2.2.5 Phương thức truyền lây

Có 2 phương thức làm lây truyền CIAV, truyền dọc và truyền ngang Phương thức lây truyền ngang hay dọc đều dẫn đến sự lây lan của CIAV trong các đàn gà (Yuasa, 1983; Mcnulty, 1991) Một lượng lớn CIAV được bài thải qua phân từ các gà nhiễm bệnh (Imai & cs., 1999) Vì vậy, phân gà được xem là một nguồn lây nhiễm quan trọng Theo nghiên cứu trên, lây truyền ngang thông qua tiếp xúc trực tiếp/ gián tiếp với virus qua đường miệng Cách lây nhiễm này chủ yếu xảy ra ở gà không có kháng thể mẹ truyền trong giai đoạn từ 2- 4 tuần tuổi Chuyển dương tính huyết thanh học xảy ra ở giai đoạn 8- 12 tuần tuổi và sự lây nhiễm ngang gây bệnh phần lớn ở thể cận lâm sàng (Mcnulty & cs., 1988) CIAV có thể lây lan theo đường truyền dọc và truyền ngang nhưng phương thức truyền dọc là quan trọng nhất, virus được truyền từ bố mẹ qua trứng (Dhama & cs., 2002) Sự lây nhiễm qua trứng đã được Yuasa và cộng sự khẳng định (Yuasa & Yoshida, 1983) và từ đó việc ngăn chặn bệnh xảy ra trong môi trường chăn nuôi gà trở nên khó khăn CIAV từ các đàn gà giống âm tính khi kiểm tra kháng thể do có sự lây nhiễm ngang hoặc qua tinh dịch con trống có thể lây nhiễm bệnh cho đời con (Yuasa & cs., 1987; Hoop, 1993) Trong tự nhiên, sự lây truyền dọc thường xuất hiện ở giai đoạn 3- 9 tuần tuổi sau khi gà tiếp xúc với CIAV, thậm chí xảy ra sớm hơn ở giai đoạn gà từ 1- 3 tuần tuổi và đáp ứng miễn dịch phát triển ở các gà giống lây nhiễm có thể bảo vệ đàn con khỏi sự lây nhiễm dọc (Schat & Van Santen, 2008) Ngoài ra, các yếu tố gây stress trong quá trình sản xuất và vận chuyển có thể làm tăng sự lây nhiễm CIAV hoặc kéo dài thời gian nhiễm CIAV bởi sự thay đổi nội tiết tố dẫn đến sự lây truyền dọc và chuyển dương tính huyết thanh học khi gà ở giai đoạn gần thành thục về tính biệt (Cardona & cs., 2000)

2.2.6 Cơ chế sinh bệnh

CIAV tấn công và phá hủy các tế bào tạo máu tiền thân (hemocytoblast), làm cạn kiệt các tế bào tiền lympho ở tuyến ức với biểu hiện teo tuyến ức, từ đó xuất huyết ở các mô dưới da, trong cơ và gây suy giảm miễn dịch (Adair, 2000; Todd, 2000; Dhama & cs., 2002; Miller & Schat, 2004; Van Santen & cs., 2004) Đích tấn công chủ yếu của CIAV vào tế bào lympho tiền thân của tuyến ức (CD4+/CD8+, T-cells) và tiền tế bào máu, sau đó chúng tái tạo chủ yếu trong các tiền tế bào máu ở tủy xương và tế bào tuyến ức tiền thân ở vùng vỏ của tuyến ức, nơi diễn ra sự nhiễm trùng gây teo và gây chết tế bào bởi cơ chế apoptosis (cơ chế chết tự nhiên) (Jeurissen & cs., 1992; Smyth & cs., 1993; Noteborn & Koch, 1995) Sự tạo máu, tạo tủy và sản xuất tế bào lympho bị ảnh hưởng nghiêm trọng dẫn đến biểu hiện lâm sàng của sự thiếu máu do giảm hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu; ngoài ra, các tế bào lympho nhiễm virus còn bị phá hủy bởi cơ chế apoptosis, kích hoạt bởi protein VP3 (Dhama, 2002)

Cho đến nay, các nghiên cứu về khả năng gây bệnh của CIAV cho thấy khả năng gây thiếu máu của CIAV phụ thuộc trực tiếp vào liều virus nhiễm, tuổi gia cầm nhiễm và sự kế phát của các yếu tố gây bệnh khác (Yuasa & cs., 1988; Dhama, 2002) Ngoài ra, các tác nhân gây ức chế miễn dịch có tác dụng hiệp đồng với CIAV làm bệnh tiến triển ở thể nặng Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh rằng IBDV ức chế và làm giảm cường độ sự sản sinh kháng thể

mẫn cảm của gà đối với CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989)

2.2.7 Triệu chứng bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Triệu chứng lâm sàng của bệnh thiếu máu truyền nhiễm phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: lứa tuổi, tình trạng miễn dịch; liều lượng và đường xâm nhập của virus Hình 2.5 trình bày tóm tắt mối tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa tuổi và tình trạng miễn dịch Gà ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với CIAV (virus gây ra tình trạng nhiễm trùng) (Kaffashi & cs., 2006), tuy nhiên, gà càng lớn khả năng mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm càng giảm (age resistance) (Mcnulty, 1991) Gà trên 3 tuần tuổi sau khi nhiễm CIAV thường sản sinh đáp ứng miễn dịch có khả năng bảo hộ, ngăn cản tiến triển thành thể bệnh lâm sàng Mặc dù vậy, đặc tính đề kháng theo lứa tuổi có thể bị phá vỡ nếu trong giai đoạn này gà

bị nhiễm các virus gây ức chế miễn dịch (ví dụ như IBDV) làm cho khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch chống lại CIAV bị giảm sút, dẫn tới tiến triển bệnh ở thể lâm sàng (vùng E, hình 2.5) (Mcnulty, 1991; Hu & cs., 1993a) Gà dưới 3 tuần tuổi nhiễm CIAV thường mắc bệnh rất điển hình (Yuasa & cs., 1979; Goodwin

& cs., 1989; Buscaglia & cs., 1994) Trường hợp có kháng thể thụ động ở ngưỡng bảo hộ, hiệu giá kháng thể trung hòa ≥ 40 (vùng A, hình 2.5), gà con dù

ở lứa tuổi mẫn cảm vẫn không mắc bệnh ở thể lâm sàng (Otaki & cs., 1992)

Hình 2.5 Tương quan giữa biểu hiện bệnh, lứa tuổi và tình trạng miễn dịch

trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Biểu hiện bệnh thiếu máu truyền nhiễm được trình bày ở phần dưới đây Khi bệnh xảy ra ở thể cấp tính, thời gian ủ bệnh từ 1- 14 ngày Ngoài các triệu chứng không điển hình (ủ rũ, xù lông, giảm ăn), gà bệnh có biểu hiện thiếu máu

như mào yếm nhợt nhạt (Yuasa & cs., 1979; Adair, 2000) Tỷ lệ chết thường từ 5- 10% (trong 2- 4 tuần sau khi nhiễm) nhưng có thể lên tới 60% trong trường hợp kế phát bệnh khác (Bulow, 1991; Dhama, 2002; Dhama & cs., 2002; Dhama

& cs., 2004; Balamurugan & Kataria, 2006) Nếu sống sót qua giai đoạn này, các

gà sẽ dần hồi phục sau 4- 5 tuần nhiễm bệnh Thông thường, các triệu chứng sẽ biểu hiện nặng nề khi có sự kế phát các mầm bệnh khác, đặc biệt là virus gây suy giảm miễn dịch (Adair, 2000) Điển hình là các trường hợp nhiễm kế phát với MDV (Miles & cs., 1999), với IBDV (Imai & cs., 1999), FAV (Toro & cs., 2001), reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994)

Hình 2.6 Triệu chứng của gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Gowthaman (2019) Chỉ tiêu phi lâm sàng của tình trạng thiếu máu là tỷ khối huyết cầu giảm, dao động từ 6 - 27% (Balamurugan & Kataria, 2006) Ở gà khỏe mạnh, tỷ khối huyết cầu thường lớn hơn 27% mặc dù chỉ số này cũng thay đổi tùy theo từng giống gà Ví dụ gà giống trứng có chỉ số PCV thấp hơn gà giống thịt; gà càng lớn thì chỉ số này càng giảm Khi gà bị bệnh thiếu máu truyền nhiễm, máu gà có thể

bị đặc hoặc loãng hơn, thời gian đông máu tăng, tương bào nhạt hơn bình thường Chỉ số hematocrit xuống dưới 27% sau khi gây nhiễm 8 - 10 ngày, dao động từ 10 - 20% ở ngày 14 - 20 và thậm chí có thể xuống dưới 6% ở những gà gần chết Ở những gà hồi phục, sau 6 - 21 ngày chỉ số PCV bắt đầu tăng trở lại,

về mức bình thường (29 - 35%) sau khi nhiễm 28 - 35 ngày (Dhama & cs., 2008) (hình 2.7)

Hình 2.7 Biến động tỷ khối huyết cầu ở gà mắc bệnh

Nguồn: Wani & cs (2014) Bằng gây bệnh thực nghiệm, tỷ khối huyết cầu của nhóm gây nhiễm (đường nét đứt, hình 2.7) giảm so với nhóm đối chứng Sự giảm này rõ nhất sau gây nhiễm 14 ngày với tỷ khối huyết cầu trung bình ở nhóm gây nhiễm là 18,22

± 2,22 trong khi đó của nhóm đối chứng là 34,12 ± 4,72 (Wani & cs., 2014) Nguyên nhân dẫn đến chỉ số hematocrit giảm là do hiện tượng giảm tế bào máu, bao gồm giảm số lượng hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu - hậu quả khi các tiền tế bào máu bị dung giải rất sớm (3 - 4 ngày sau khi gây nhiễm) Khi gà qua khỏi, công thức máu sẽ trở lại bình thường sau 40 ngày

2.2.8 Bệnh tích bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Teo cơ quan lympho nói chung, đặc biệt là tuyến ức và biểu hiện tủy xương nhạt màu (hình 2.8) được xem là bệnh tích đại thể đặc trưng nhất (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Pope, 1991; Smyth & cs., 1993; Dhama & cs., 2002) Ngoài ra, có một số biến đổi khác như: xuất huyết, tụ máu ở tổ chức liên kết dưới da; gan sưng, nhạt màu hoặc vàng nhạt (Yuasa & cs., 1979; Dhama, 2002)

Hình 2.8 Bệnh tích đại thể ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm

Nguồn: Yuasa & cs (1979)

Có một vấn đề cần chú ý là: khi gà nhiễm CIAV gây ra tình trạng suy giảm miễn dịch nghiêm trọng và gà dễ mẫn cảm với các mầm bệnh là virus như MDV (Miles & cs., 1999); IBDV (Imai & cs., 1999); FadV4 (Toro & cs., 2001); reovirus (Mcneilly & cs., 1995) và NDV (De Boer & cs., 1994) dẫn tới những ảnh hưởng hiệp đồng của các yếu tố (Pope, 1991) Chính vì vậy, bệnh tích ở gà mắc bệnh thiếu máu truyền nhiễm khi bị nhiễm ghép có sự thay đổi, khác với trường hợp nhiễm đơn

2.2.9 Chẩn đoán bệnh thiếu máu truyền nhiễm ở gà

2.2.9.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán lâm sàng CIA có thể dựa vào lịch sử đàn giống, tình trạng hoặc dấu hiệu lâm sàng, kết luận về huyết học và bệnh lý mổ khám (Goodwin & cs., 1992a) Chẩn đoán lâm sàng dựa vào các dấu hiệu điển hình ở gà bệnh trong giai đoạn mẫn cảm và các bệnh tích phản ánh hiện tượng thiếu máu, ví dụ như: mào, tích nhợt nhạt, gan sưng và nhạt màu, thận nhạt màu, tủy xương nhạt màu và mô lympho tập trung bị teo (túi Fabricius, tuyến ức)

2.2.9.2 Chẩn đoán phi lâm sàng

- Phương pháp phân lập virus:

CIAV có khả năng nhân lên và được phân lập ở gà SPF mẫn cảm, trong phôi gà và trong nuôi cấy tế bào (Yuasa & cs., 1979; Mcnulty, 1991; Dhama & cs., 2002; Balamurugan & Kataria, 2006); trong khi đó thời điểm 12 - 16 ngày sau khi gây nhiễm CIAV cho gà lớn thấy có biểu hiện bệnh tích Trong phôi gà, CIAV nhân lên ở túi lòng đỏ nhưng hiệu giá virus không đủ cao để gây chết phôi hoặc gây ra các tổn thương điển hình của bệnh Tuy nhiên, gà con mới nở mang các dấu hiệu của bệnh CIAV không nhân lên được trong các môi trường nuôi cấy tế bào thông thường nhưng phát triển được trong một số dòng tế bào lympho hình thành trong bệnh Marek’s (Marek’s disease virus- MDV) và bệnh gây khối

u lympho (Yuasa, 1983; Renshaw & cs., 1996) Cho đến nay, dòng tế bào được

sử dụng phổ biến cho việc phân lập CIAV là dòng tế bào MDCC-MSB1 lấy từ khối u lympho ở lách của gà bị bệnh Marek’s Các chủng virus có thể gây nhiễm khác nhau cho các dòng tế bào phụ như MDCC-CU147, khi đó dòng tế bào T (lấy từ tổn thương cục bộ của MD) được báo cáo nhạy cảm nhất để phân lập virus, có thể sản xuất ra một lượng virus gấp từ 10- 100 lần so với dòng MSB1

- Kỹ thuật PCR:

PCR được ứng dụng từ rất sớm để phát hiện CIAV, mồi đặc hiệu được thiết kế phát hiện trình tự gen bảo thủ mã hóa protein VP2 (Noteborn & cs., 1992b) Ở những vùng đã sử dụng vacxin nhược độc phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm, việc sử dụng cặp mồi kể trên không cho phép phân biệt giữa chủng virus vacxin và chủng virus gây bệnh Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng cặp mồi nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP1 của virus, sau đó cắt bằng enzyme cắt giới hạn (Van Santen & cs., 2001; Natesan & cs., 2006; Mohamed, 2010; Nayabian & Mardani, 2013) Ví dụ cụ thể trình bày ở hình 2.9

Tác giả Mohamed đã dùng cặp mồi đặc hiệu nhân lên toàn bộ gen mã hóa protein VP1 (VP1-1: 5’-ATGGCAAGACGAACTCGCAGACCGAGAGGC-3’, VP1-R: 5’-TCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATGGTGCT-3’) Tinh sạch sản

phẩm PCR và cắt bởi enzyme MboI (Mohamed, 2010) Hình 2.9 cho thấy, sản

phẩm cắt là khác nhau giữa các chủng thực địa (3- 5 sản phẩm cắt) với chủng virus vacxin (6 sản phẩm) Đáng chú ý, các đoạn sản phẩm cắt cũng khác nhau giữa các chủng thực địa và cho phép phân biệt các chủng CIAV giữa các mẫu xét nghiệm Hiện có nhiều loại enzyme được dùng trong phản ứng RFLP-PCR để

phân biệt các chủng, ví dụ như: BamHI, BgM, SstI và XbaI (Noteborn & cs., 1992b), HinfI (Nayabian & Mardani, 2013) Để tăng khả năng phân biệt, có thể

kết hợp một số enzym cắt giới hạn để phân biệt các chủng CIAV, ví dụ như:

HhaI, DdeI và HaeIII (Natesan & cs., 2006).

Ghi chú: giếng 1: chủng virus Cux-1 từ vacxin Thymovac; giếng 2-5: các chủng CIAV thực địa

Hình 2.9 Kết quả RFLP-PCR phân biệt các chủng CIAV

Nguồn: Mohamed (2010)

Ý nghĩa của RFLP-PCR không chỉ dừng lại ở khả năng phân biệt giữa các chủng, mà còn có thể cho phép phát hiện đồng nhiễm nhiều chủng CIAV khác nhau ở cùng một trang trại Ở cấp độ cá thể, việc phát hiện đồng nhiễm CIAV cần phải sử dụng đến công cụ giải trình tự gen (hình 2.10)

Ghi chú: mũi tên biểu thị các vị trí có 2 đỉnh tín hiệu (đa hình nucleotide)

Hình 2.10 Kết quả giải trình tự gen phát hiện đồng nhiễm các chủng CIAV

Nguồn: Ducatez & cs (2006) Việc phát hiện ra các đỉnh tín hiệu kép (mũi tên, hình 2.10) ở một vài vị trí nucleotide là minh chứng cho sự tồn tại các chủng CIAV mang các đột biến khác nhau (đồng nhiễm) Hiện tượng đồng nhiễm CIAV thuộc hai cụm di truyền khác nhau đã được phát hiện ở mẫu bệnh phẩm gà bệnh tại Trung Phi và Cameroon (Snoeck & cs., 2012)

Nói tóm lại, PCR được xem là kỹ thuật có độ nhạy và độ chính xác cao, phù hợp cho sự phát hiện ADN của CIAV trong các mẫu bệnh phẩm (Miller & cs., 2003) PCR với độ nhạy và chính xác cao giúp phát hiện CIAV ngay cả trong các ca bệnh biểu hiện ở thể cận lâm sàng (Balamurugan & Kataria, 2006; Simionatto & cs., 2006) Sử dụng kỹ thuật PCR cạnh tranh; hoặc realtime PCR

có thể định lượng virus (Dhama & cs., 2002; Markowski-Grimsrud & cs., 2002; Caterina & cs., 2004; Van Santen & cs., 2004) Ngày nay, giải trình tự gen là một công cụ cho chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học phân tử của CIAV (Todd & cs., 1990; Dhama & cs., 2002; Dhama & cs., 2004; Natesan & cs., 2006; Simionatto

& cs., 2006)

- Phương pháp phát hiện gián tiếp

Đối với việc phát hiện huyết thanh: ELISA, VNT và IFA là những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất (Dhama & cs., 2002; Tannock & cs., 2003) bởi kháng thể kháng CIAV là dấu hiệu tồn tại trước đó của CIAV, trong đó phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp và các test ELISA có thể được áp dụng để phát hiện kháng thể kháng CIAV (Rosenberger & Cloud, 1989) Hiện nay, các kit ELISA được sử dụng phổ biến để sàng lọc các đàn giống nghi nhiễm virus trước khi vào giai đoạn đẻ trứng (Miller & Schat, 2004) Kỹ thuật ngưng kết gián tiếp bằng hạt nhựa (blocking latex agglutination test) cũng đã được phát triển và cho kết quả tương đồng 93,6% so với phản ứng trung hòa (Trinh & cs., 2015b)

2.2.9.3 Chẩn đoán phân biệt

Cần tiến hành các chẩn đoán phân biệt với các bệnh Marek’s, Gumboro, bệnh do FAdV4 gây ra, bệnh do các độc tố nấm mốc (mycotoxin), v.v (Dhama, 2002) Do đặc điểm giống nhau về lứa tuổi và bệnh tích ở cơ quan có thẩm quyền miễn dịch, cần chẩn đoán phân biệt giữa bệnh Gumboro và bệnh thiếu máu truyền nhiễm Cụ thể: gà dưới 13 tuần tuổi khi mắc Gumboro và bệnh thiếu máu truyền nhiễm đều có biểu hiện ủ rũ khá giống nhau (Wang & cs., 2011; Gowthaman, 2019) Tuy nhiên, bệnh thiếu máu truyền nhiễm thường có các biểu hiện bên ngoài như xuất huyết ở da cánh Bệnh tích mổ khám có nhiều điểm chung, ví dụ như hiện tượng teo túi Fabricius Tuy nhiên, bệnh tích sưng và xuất huyết túi Fabricius chỉ gặp ở bệnh Gumboro (Wang & cs., 2011) mà không có ở bệnh thiếu máu truyền nhiễm (Bahmaninejad & cs., 2012) Một số bệnh tích điển hình chỉ gặp trong bệnh thiếu máu truyền nhiễm, ví dụ như tủy xương nhạt màu

2.2.10 Biện pháp phòng bệnh

* Vệ sinh phòng bệnh: công tác chăm sóc, quản lý tốt đàn giống và vệ sinh phòng bệnh, tăng cường biện pháp đảm bảo an toàn sinh học là những biện pháp tổng hợp giúp ngăn chặn bệnh xảy ra (Engstrom, 1999)

* Phòng bệnh bằng vacxin: biện pháp kiểm soát trực tiếp nhất và hạn chế được sự lây truyền dọc của bệnh là sử dụng vacxin cho đàn bố mẹ trước khi vào giai đoạn khai thác trứng khoảng vài tuần Vacxin được sử dụng vào thời điểm

13 - 15 tuần tuổi, không được muộn quá 3 tuần trước khi gà bắt đầu đẻ bói để tạo đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng cao (hiệu giá trung hòa > 8 log2) giúp ngăn chặn sự truyền virus qua trứng (Vielitz & cs., 1987; Mcnulty, 1991) Vacxin nhược độc được sử dụng bằng cách cho uống, vacxin vô hoạt được sử dụng theo đường tiêm Tại Việt Nam hiện đang lưu hành vacxin phòng bệnh cho đàn gà gồm:

- Nobilis CAV P4 của hãng Intervet (Hà Lan): vacxin nhược độc đông khô,

gà Vacxin dùng để tiêm cho gà khỏe mạnh từ 6 tuần trở lên Gà đẻ được phòng ít nhất 6 tuần trước khi bắt đầu đẻ Nên tiêm vacxin cho tất cả những con gà dễ mắc bệnh trong trang trại cùng một lúc Trong mọi trường hợp, không được dùng vacxin cho gà nhỏ hơn 6 tuần tuổi Virus vacxin mặc dù không có khả năng gây bệnh thể lâm sàng, vẫn có thể tồn tại lâu dài trong tuyến ức, lách và tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể ở mức thấp (Vaziry & cs., 2011)

- AviPro Thymovac (Lohmann Animal Health GmbH): vacxin nhược độc đông khô chủng Cux-1 phòng bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà Vacxin được dùng bằng cách pha nước uống cho gà từ 12 - 14 tuần tuổi nhưng không được muộn hơn 6 tuần trước khi đẻ (nếu dùng trong giai đoạn 6 tuần trước khi đẻ virus

có thể truyền qua trứng)

2.3 ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA CIAV

2.3.1 Mối quan hệ di truyền giữa các chủng CIAV

Bộ gen của CIAV có tính bảo thủ tương đối cao (Schat, 2009) nên sự khác biệt giữa các chủng virus là thấp Gen mã hóa protein VP1 có vùng mang nhiều biến đổi (amino acid 139 - 151) (Renshaw & cs., 1996)

Bảng 2.1 Đối chiếu cách phân loại nhóm di truyền của CIAV

group

Cụm (Cluster)

Nhóm (Group)

Nhánh (Lineage)

Do đó, từ trước đến nay, trình tự gen mã hóa capsid protein của CIAV thường được dùng để nghiên cứu mối liên hệ di truyền giữa các chủng virus (Islam

& cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018) Từ 2002 cho đến nay có nhiều hơn 30 công bố về mối liên

hệ di truyền giữa các chủng CIAV (Chowdhury & cs., 2002; Ducatez & cs., 2006; Hailemariam & cs., 2008; Eltahir & cs., 2011; Snoeck & cs., 2012; Kye & cs., 2013; Wanasawaeng & cs., 2013; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Li & cs., 2017a; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Tuy nhiên, do phân tích với số lượng trình tự gen khác nhau, tiêu chí phân loại không thống nhất đã dẫn tới tồn tại đồng thời nhiều phân loại nhóm di truyền của CIAV (bảng 2.1)

Nhìn chung, cách phân loại CIAV thành 3 genogroup (I, II, III) được nhiều nhà khoa học trên thế giới sử dụng (Ducatez & cs., 2006; Olszewska-Tomczyk & cs., 2016; Ou & cs., 2018), minh họa ở hình 2.13

Ghi chú: cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid được mã hóa của gen ORF1 được biểu diễn cạnh nhau Đường nét đứt nối vị trí các chủng ở hai cây phát sinh chủng loại

Hình 2.11 Cây phát sinh chủng loại CIAV

Nguồn: Ducatez & cs (2006)

Kết quả trên cho thấy, genogroup II và III của CIAV chiếm đa số, trong khi đó genogroup I chỉ có 2 trình tự gen thu thập được ở Australia Đáng chú ý,

có sự thay đổi về phân nhóm giữa cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự nucleotide và trình tự amino acid (đường nét đứt, hình 2.13) Đặc điểm phân nhánh khác nhau kể trên có thể gặp ở nhiều công bố khác (Olszewska-Tomczyk

& cs., 2016; Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Bên cạnh hệ thống phân loại kể trên, gần đây có một số nghiên cứu đề xuất thêm 2 genogroup IV và V của CIAV (Ou & cs., 2018; Van Dong & cs., 2019) Do không đưa ra tiêu chí phân loại rõ ràng, chủ yếu dựa vào đặc điểm phân nhánh của cây phát sinh chủng loại, nên cách phân chia CIAV thành 5 genogroup cần được kiểm chứng

2.3.2 Sự lưu hành CIAV theo nhóm di truyền ở một số quốc gia

Ở khu vực châu Á, với tổng số 25 chủng CIAV có genome hoàn chỉnh thu thập từ các trang trại khác nhau tại Trung Quốc, nghiên cứu (Eltahir & cs., 2011)

đã phân tích và xây dựng cây phát sinh loài của CIAV Theo đó, cùng với sự so sánh với các chủng CIAV trên thế giới có trong GenBank, nghiên cứu đã chứng minh có 4 nhóm di truyền (A- D) với giá trị boostrap cao Gần đây tại Trung Quốc (Li & cs., 2017b) đã phát hiện sự tái tổ hợp trong cấu trúc gen của chủng CIAV-F10, với khả năng cao đã xảy ra sự tái tổ hợp gen giữa 2 trình tự có mã số GenBank là JQ690762 và KJ728816 Một số tác giả còn phân chia CIAV lưu hành ở Trung Quốc thành các đơn vị dưới nhóm (subgroup) bao gồm: subgroup A1- A3, D1- D4 và E1- E3 (Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013)

Phân tích phát chủng loại dựa vào gen mã hóa cho việc tổng hợp VP1, nghiên cứu tại Hàn Quốc (Kim & cs., 2010) chỉ ra các chủng CIAV lưu hành thuộc nhóm di truyền genogroup II, IIIa và IIIb CIAV lưu hành trong các đàn gà giống dù được phòng vacxin hay không đều có sự tương đồng với các chủng virus vacxin được sử dụng (Kim & cs., 2010)

Tại Thái Lan, khi phân tích cây phát sinh loài từ cơ sở dữ liệu gồm 13 trình

tự nucleotide của Thái Lan và trình tự CIAV trên thế giới, đã xác định có 3 cụm

di truyền (cluster I, cluster II, cluster III) với giá trị bootstrap cao, lần lượt là 91%, 100% và 96% Trong đó, các chủng CIAV của Thái Lan thuộc về cluster I

và cluster III; đồng thời gần gũi với CIAV lưu hành ở Trung Quốc và Nhật Bản (Wanasawaeng & cs., 2013)

Nghiên cứu tại Ấn Độ (Gowthaman & cs., 2014) khi xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng chương trình MEGA 5 với 29 chủng CIAV có sẵn trong

GenBank đã chỉ ra các chủng thực địa thuộc nhánh với các chủng virus từ Trung Quốc, Brazil, Mỹ, Malaysia, Bangladesh và Australia Ở một báo cáo khác, 11 chủng CIAV thu thập ở tỉnh Nagpur (Ấn Độ) từ 2012 - 2015 được xếp vào nhóm

di truyền group A (Ganar & cs., 2017)

Ở châu Âu, một số kết quả về nguồn gốc phát sinh loài của CIAV đã được công bố Tại Slovenia, CIAV phân lập từ 2000 - 2003 nằm cùng nhánh và có mức mức tương đồng gen cao với các chủng virus của Bangladesh, Nhật Bản và

Mỹ (Krapez & cs., 2006) Ở Ba Lan, đã xác định được cụ thể hơn sự lưu hành của 2 genogroup II và III của CIAV Hơn nữa, các chủng virus thực địa này khác biệt rõ với chủng virus vacxin (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016)

Ở châu Phi, nhiều nhóm di truyền của CIAV (group A - D; genogroup II, III) đã được phát hiện ở một số quốc gia, ví dụ như: Nam Phi, Ai Cập, Trung Phi, Cameroon, Nigeria, v.v (Oluwayelu, 2010; Snoeck & cs., 2012; Erfan & cs., 2018) Ở Trung Phi và Cameroon, có 9 cụm di truyền khác biệt (phylogenetic cluster) được xác định CIAV (Snoeck & cs., 2012) Đáng chú ý, các cụm di truyền này (CAF1 - CAF4, CMR1 - CMR5) không bao gồm các chủng virus lưu hành ở các nước khác trên thế giới (Snoeck & cs., 2012)

Từ các tổng hợp về sự có mặt và nguồn gốc phát sinh chủng loại của CIAV

ở các nước trên thế giới, có thể nhận xét rằng: có sự lưu hành của nhiều nhóm di truyền của CIAV phạm vi quốc gia và trên phạm vi châu lục

2.3.3 Khác biệt di truyền của CIAV

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy: ít có sự khác biệt trình tự gen của CIAV phân lập từ các vùng địa lý khác nhau (Ducatez & cs., 2006; Ducatez & cs., 2008; Hailemariam & cs., 2008) Mức tương đồng trình tự nucleotide giữa các chủng phân lập ở mỗi nước mặc dù có khác nhau, nhưng thường ở mức tương đồng cao, ví dụ như 93% (CIAV phân lập tại Alabama, Mỹ) (Van Santen & cs., 2001) hoặc 94,7% - 99,8% (CIAV phân lập tại Ba Lan) (Olszewska-Tomczyk & cs., 2016) Nhìn chung, sự sai khác di truyền giữa các chuỗi nucleotide của CIAV thường dưới 5% và là khoảng cách lớn nhất được tìm thấy giữa các chủng CIAV trên thế giới (Ducatez & cs., 2006; Eltahir & cs., 2011; Zhang & cs., 2013) Bảng 2.2 trình bày kết quả so sánh mức tương đồng giữa các chủng CIAV (Ducatez & cs., 2008)

Bảng 2.2 Khoảng cách di truyền của CIAV dựa vào gen ORF1

Ghi chú: (1) gồm Đức và Slovenia; (2) giữa các trình tự của Mỹ; (3) giữa các trình tự của Nigeria

Phân tích ở cấp độ amino acid cho thấy VP2 và VP3 bảo thủ giữa các chủng; trong khi VP1 đa dạng hơn, với vùng nhiều biến đổi amino acid từ vị trí

139 đến 151 của VP1 (Renshaw & cs., 1996) Sự khác biệt giữa các genogroup I- III của CIAV còn thấp hơn, trong khoảng 1,4% - 3,4% (genogroup I - II); 1,2% - 2,5% (genogroup I - III) và 1,8% - 4,1% (genogroup II - III) (Ducatez & cs., 2006) Do tính tương đồng cao về trình tự amino acid của VP1, sự khác biệt ở một hoặc một vài vị trí cũng có giá trị trong phân biệt giữa các nhóm di truyền của CIAV (hình 2.14)

Hình 2.12 Đặc điểm biến đổi amino acid của VP1 protein

Nguồn: Ducatez & cs (2008)