Luận án Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm. Mời các bạn cùng tham khảo.
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Phạm Kiên Cường
NHÂN DÒNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
BACILLUS SUBTILIS GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28
CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
Trang 2Công trình được hoàn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Tính cấp thiết của đề tài
Nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây
và trở thành ngành kinh tế quan trọng Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm ở Việt Nam hiện đang đứng trước nhiều khó khăn như dịch bệnh, chất lượng tôm giống sa sút Sự bùng nổ của các dịch bệnh nghiêm trọng do virus tr ng đó ó viru gây hội hứng đốm tr ng (WSSV), đã làm giảm đáng kể sản lượng tôm, gây thiệt hại lớn về kinh tế ngành nuôi tôm
Nhiều nghiên cứu trên thế giới được tiến hành để tìm ra giải pháp hiệu quả chống lại WSSV nhưng kết quả thu được còn hạn chế Một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới hướng đến là tạo các vaccine dựa trên protein cấu trúc của WSSV để kí h thí h đáp ứng miễn dịch ở tôm chống lại bệnh đốm tr ng VP28 là một loại protein vỏ chính của WSSV, đóng vai trò hủ đạo giúp virus g n đặc hiệu lên tế bào tôm, là bước khởi đầu cho quá trình lây nhiễm Chính vì vậy, VP28 là
pr tein được lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đ án WSSV ũng như tạo vaccine cho tôm phòng bệnh đốm tr ng (Rout và tập thể, 2007; Witteveldt và tập thể, 2004) Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm tr ng do WSSV ũng hỉ mới dừng lại ở mức thử nghiệm nhỏ lẻ, hưa tạ được một vaccine chính thức, hiệu quả
Xuất phát từ thự tế trên, húng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạ ra bào
tử Bacillus subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm
tr ng làm ơ ở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh viru đốm tr ng trên tôm
Trang 42 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Nhân dòng, xá định được trình tự và một số đặ trưng ủa gen VP28 từ các mẫu WSSV phân lập được ở á địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam
- Tạ được chủng Bacillus subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử
- Bướ đầu đánh giá được khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm
thẻ chân tr ng của chế phẩm bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt
3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm tr ng ở tôm
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Nhân dòng, xá định trình tự và một số đặ trưng ủa gen vp28 từ
các mẫu WSSV phân lập được ở Việt Nam
- Xây dựng quy trình biểu hiện gen mã hóa cho VP28 trên bề mặt bào
tử Bacillus subtilis
- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm
thẻ chân tr ng khi h tôm ăn thứ ăn trộn bào tử Bacillus subtilis biểu
hiện VP28
4 Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Pr tein, Trường Đại học Khoa
Trang 55 Đóng góp mới của đề tài
- Công trình nghiên cứu có tính hệ thống từ việc nhân bản, nhân
dòng và biểu hiện gen mã hóa protein VP28 tái tổ hợp ở E coli và Bacillus
subtilis Đề tài đã xá định trình tự và một số đặ trưng ủa gen VP28 từ
các mẫu WSSV phân lập được ở Việt Nam
- Nghiên cứu biểu hiện thành công gen mã hóa protein VP28 của
WSSV trên bề mặt bào tử B subtilis dưới dạng các cấu trúc protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, tr ng đó, CotB là protein vỏ của B
subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm
hạn chế cản trở không gian đối với VP28
- Đã tối ưu đượ điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B subtilis biểu
hiện tốt kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu
các tính chất của bào tử tái tổ hợp B subtilis CotB-VP28,
CotB-GST-VP28 trong một số điều kiện môi trường khác nhau
- Đã đánh giá được ự tăng hoạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) phản ánh đáp ứng miễn dịch của tôm thẻ hân tr ng và đánh giá khả năng phòng bệnh đốm tr ng trên tôm thẻ
hân tr ng với mứ bả hộ trên 70% của bào tử B subtilis biểu hiện VP28
trên bề mặt
6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là ơ ở để tạo chế phẩm probiotic
dạng bào tử B subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt,
có khả năng tăng ường miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm
tr ng, giúp góp phần kiểm soát dịch bệnh trên tôm
- Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine
tái tổ hợp dạng bào tử B subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các
vi sinh vật khác gây ra ở tôm
Trang 67 Bố cục của luận án
Luận án gồm 120 trang bao gồm: Phần mở đầu (3 trang); Tổng quan tài liệu (40 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên ứu (19 trang); Kết quả và thảo luận (39 trang); Kết luận và kiến nghị (1 trang), Các công trình khoa học của tác giả liên quan đến luận án (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang ,với 122 tài liệu gồm 2 thứ tiếng tiếng Việt (8 tài liệu) và tiếng Anh (11 tài liệu) Luận án có 15 bảng, 43 hình
Trang 7CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
Virus gây bệnh đốm tr ng (White Spot Syndrome Virus, đượ viết
t t là WSSV) thuộc họ Nimaviridae và chi Whispovirus
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/) VP28, đượ mã hóa bởi đ ạn gen hay khung đọ mở(ORF) 421 bp (wsv421), là một protein vỏ quan trọng, đóng vai trò rất quan trọng trong những bướ đầu tiên của quá trình nhiễm WSSV vào tôm (Van Hulten và tập thể, 2001) Ch đến nay hưa ó giải pháp hiệu quả để ngằn ngừa sự tấn công của loại virus này ở tôm
1.2 Nghiên cứu tạo vaccine dựa trên kháng nguyên vỏ WSSV
Tôm thuộ nhóm động vật giáp xá , ó hệ miễn dịch òn ơ khai, nhưng một số nghiên cứu gần đây h thấy có khả năng phòng ngừa đặc hiệu WSSV khi được kích thích bởi các dạng kháng nguyên VP28 Vì vậy protein VP28 đã đượ họn làm kháng nguyên đí h tr ng việ tạ á hế phẩm dạng va ine để phòng ngừa bệnh đốm tr ng ở tôm VP28 đã được
biểu hiện thành công ở E coli (Zhang và tập thể, 2002; Sathish và tập thể,
2004; Witteveldt và tập thể 2004; Jha và tập thể, 2005; Caipang và tập thể, 2008; Hou và tập thể, 2011; Syed-Musthaq và tập thể, 2011; Mu và tập thể,
2012) Sử dụng VP28 tái tổ hợp là một biện pháp giúp tăng khả năng ống
sót của tôm đối với WSSV Tuy vậy, phương pháp này có hạn hế là khó
áp dụng trên thực tế do protein VP28 không bền vững nếu như được cho trực tiếp và á đầm nuôi tôm, việ ử dụng bằng á h tiêm từng á thể mất nhiều thời gian, ông ứ và hi phí để sản xuất VP28 ũng rất cao
D đó, gần đây đã ó một ố nghiên cứu tập trung vào việc phát triển các dạng vaccine vi khuẩn sống tái tổ hợp biểu hiện VP28 ết quả thu đượ cho thấy rằng các loại bào tử tái tổ hợp VP28 giúp bảo vệ và tăng tỷ lệ
Trang 8sống của tôm khi thử nghiệm với WSSV so với tôm hưa được dùng bào
tử tái tổ hợp VP28 (Fu và tập thể, 2010; Ning và tập thể, 2011) Tuy vậy các kết quả nghiên cứu mới chỉ là bướ đầu, hưa ó một loại vaccine chính thứ nà được tạo ra Vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu để tạ được vaccine phòng bệnh đốm tr ng là hết sức cần thiết
Trang 9CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và nguyên liệu
2.1.1 Đối tượng
23 mẫu tôm có biểu hiện nhiễm WSSV được thu thập từ các đầm nuôi tôm tại các địa phương khác nhau (Hải Phòng; Huế; Khánh Hòa; Thành phố Hồ Chí Minh; Só Trăng; Ninh Thuận; Bến Tre; Bình Định, Kiên Giang; Trà Vinh), được bảo quản ở -80oC hoặc trong cồn 95oC Tôm thẻ chân tr ng (2-5g/con) dùng trong thử nghiệm thử thách khả năng bảo
hộ phòng ngừa WSSV được lấy từ Phân viên nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản B c Trung bộ thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1
2.1.2 Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn B subtilis PY79 và vector pDG364, pDG364-CotB;
pDG364-CotB-GST là quà tặng của GS Simon Cutting, Đại học Hoàng gia Holloway, London, Vương quố Anh
Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; E coli BL21 (DE3 RIL được
mua từ hãng Novagen Vector pET28b của hãng Novagen (Mỹ); các oligonucleotide của hãng Life Technology, kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pGEM TA easy vàT DNA liga e được mua từ hãng Promega; thang chuẩn protein, thang chuẩn DNA 1kb và 100 bp, hỗn hợp dNTP được mua từ hãng Fermentas; Hot-Taq DNA p lymera e được mua từ hãng Enzynomics; kit thôi gel được mua từ Bioneer; MagPure viral DNA/RNA nan kit được mua từ ANABIO R&D; Qiaprep-miniprep kit được mua của hang Qiagen; lyz zyme được mua từ hãng Biobasic
Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu h á đ ạn gen mã hóa cho
VP28 của virus gây bệnh đốm tr ng WSSV, cotB; cặp mồi đặc hiệu cho vị
Trang 10trí amyE front, amyE back của vector pDG 364, cặp mồi của vector pGEM
T và cặp mồi T7 promoter Fw/T7 terminator Rv của hãng Life Technology
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm tr ng từ mẫu tôm nhiễm bệnh
2.2.2 iểm tra ự ó mặt ủa WSSV bằng PCR và định lượng WSSV bằng real-time PCR
2.2.3 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis the phương pháp ủa Nicholson và
Setlow (1990)
2.2.4 Tách chiết DNA bằng kit ủa Qiagen, ANABIO R&D, Định lượng DNA bằng đ độ hấp thụ ánh áng tử ng ại ở bướ óng 260 nm
2.2.5 Nhân bản và kiểm tra ự ó mặt ủa gen vp28 bằng PCR
2.2.6 Định lượng pr tein the phương pháp Brad rd (1976) và tinh sạch proteinVP28 bằng k ái lự qua ột Hisbind
2.2 iểm tra độ ạ h ủa pr tein bằng điện di gel p la rylamide ó SDS (SDS-PGAGE) theo Laemmli (1970)
2.2.8 iểm tra ự biểu hiện ủa gen bằng SDS-PA E, thẩm tá h miễn
dị h và miễn dị h hu nh quang
2.2.9 Thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm tr ng của bào tử B subtilis
tái tổ hợp thông qua đánh giá mứ độ ống ót ủa tôm qua thời gian au khi h nhiễm WSSV và á hỉ ố h ạt độ phen l xida e, superoxide dismutase
Trang 11CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hình 3.1: Nhân b n vp28 b ng PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV ở
các địa điểm khác nhau
M: Thang chuẩn DNA 1kb ; - : Đối chứng âm
1-23:Sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen vp28 từ các mẫu tôm nhiễm
WSSV thu thập ở các địa phương khác nhau
Kết quả PCR (hình 3.1) cho thấy, cả 23 mẫu tôm dương tính với WSSV đều có cho một băng DNA nhân bản duy nhất với kí h thướ như
tính toán lý thuyết (615 bp) của vp28 Tr ng khi đó, mẫu đối hứng âm,
mẫu không ó DNA thì không xuất hiện băng DNA Kết quả này cho phép khẳng định rằng húng tôi đã nhân bản thành ông đ ạn gen mã hóa cho VP28 từ DNA hệ gen của tôm nhiễm viru đốm tr ng
3.1.2 Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28
Đ ạn gen nhân bản bằng PCR ủa á mẫu nghiên ứu đã đượ nhân dòng vào ve t r p E T tạ ra dạng ve t r tái tổ hợp p E -VP28 và au
Trang 12đó á gen vp28 tr ng ve t r tái tổ hợp đã đượ xá định trình tự hi ánh trình nu le tide và trình tự a id amin uy diễn ủa vp28 với trình tự vp28 đã
đượ ông bố trướ đó (Phan Thị Phượng Trang và tập thể, năm 2003) ủa Việt Nam mang mã ố AY168644 (Bảng 3.2) thì thấy rằng ó 5 ự ai khá về trình tự nu leotide đượ phát hiện, đó là A125 , A183 , A22 , A 03 , T51 C và tr ng 5 ai khá này dẫn đến ự thay đổi trình tự a id amin (A125G ->D42G, A183G -> T76A, A403G-> T135A, T517C-> C173R)
B ng 3.2: Một số sai khác của về trình tư nucl tid và acid amin của VP28 thu thập tại Việt Nam so với trình tự đ công ố (AY168644)
Tên mẫu Sai khác
nucleotide
Sai khác mức axit amin suy diễn
Só Trăng, Ninh Thuận, Cam Ranh
1.2 Khánh Hòa và Cần Giờ 1, 4, 7, 9,
10 ở thành phố Hồ Chí Minh
Bến Tre, Bình Định 1, Điền Hương 1,
2, Phong Hải ở Huế Cần Giờ 2, 3, 5,
Trang 13Các nghiên cứu của Wang và tập thể (2008) cho thấy các vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 là các vị trí từ a id amin 28 đến , 8 đến
93 và 171đến 20 D đó A125 dẫn đến sự thay thế aspartatic bằng glycine (D42G) và T517C dẫn đến sự thay thế cysteine bằng arginine (C173R) của các mẫu thu được từ Bến Tre, Bình Định (1), Huế và Cần Giờ (2) ở thành phố Hồ Chí Minh là những sai khác trong vị trí quyết định kháng nguyên của VP28 và rất cần được quan tâm trong các nghiên cứu
tiếp theo 3 trong số 23 trình tự gen vp28 có những khác biệt đáng lưu
0 VN.VP28.BD2.12 đã đượ đăng k trên enBank với các mã số (accession number) tương ứng là JX444992.1, JX444993.1 và JX444994.1 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28
3.2.1 Biểu hiện P28 b ng hệ thống vector pET28b trong E coli
Ve t r tái tổ hợp đượ k hiệu là pGEM – VP28 và đượ tá h ra ở dạng tinh ạ h đượ dùng làm khuôn h phản ứng PCR Cặp mồi đặc hiệu (VP28.2 Fw/Rv được thiết kế dựa trên trình tự nu le tide hai đầu của
gen vp28 ó đưa và thêm trình tự nhận biết của BamHI ở đầu và HindIII
ở cuối để thuận tiện cho ghép gen vào vector pET28b về sau
Đ ạn gen vp28 nhân bản bằng ặp mồi VP28.2 Fw/Rv đượ xử lý bằng HindIII và BamHI và g n và pET28b ũng đã đượ xử l bằng ùng
hai enzyme, ử dụng enzyme g n T DNA liga e Sản phẩm g n đượ biến
nạp vào chủng E coli BL21-RIL Vector tái tổ hợp pET28b-VP28 au đ
đã được tách ra, tinh sạch và giải trình tự đ ạn gen vp28, sử dụng cặp mồi T7Fw/Rv Kết quả đọc trình tự khẳng định ch c ch n gen vp28 đã đưa được
g n và ve t r pET28b đúng trình tự và vị trí khung đọ D đó, đủ ơ ở
để khẳng định đã nhân dòng thành ông gen vp28 vào vector pET28b
Trang 14Kết quả biểu hiện gen vp28 được kiểm tra bằng SDS-PAGE và thẩm
tách miễn dịch (Hình 3.6) cho thấy dịch chiết tế bào BL21-RIL mang vector pET28b-VP28 có chứa băng pr tein 28 kDa, (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3 A Tr ng khi đó, ở mẫu đối chứng âm (tế bào BL21-RIL không mang vector pET28b-VP28) không ó băng pr tein này Kết quả thẩm tách miễn dịch, sử dụng kháng thể đặc hiệu kháng VP28 ũng h thấy sự có mặt của băng pr tein 28 kDa ở các mẫu tương ứng với mẫu trên SDS-
PA E (Đường chạy 7, 8, 9, Hình 3.6B) Từ đó, húng tôi kết luận rằng đã
biểu hiện được VP28 ở E coli
Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu
Trang 15Dịch chiết tế bào có chứa pr tein VP28 (dưới dạng g n với Hi tag)
au đó được tinh sạch bằng cách cho s c ký qua cột His-bind Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của protein VP28 (Hình 3.7A) cho thấy việc sử dụng cột His-bind trong tinh sạ h pr tein VP28 thu được hiệu quả tốt bởi hầu hết các thành phần protein phức tạp bị loại bỏ hết Tr ng á phân đ ạn rửa chiết bằng imidaz l, húng tôi thu được chỉ một băng pr tein ó kí h thước khoảng 28 kDa, tương ứng với kí h thước của protein VP28 tái tổ hợp So sánh kết quả thẩm tách miễn dịch (Hình 3.7B) với kết quả SDS-PAGE cho thấy những băng pr tein xuất hiện trên màng PDVF có cùng
kí h thước 28 kDa với á phân đ ạn tinh sạ h khi điện di SDS-PAGE cho phép khẳng định rằng húng tôi đã tinh ạch thành công protein VP28 Kết quả định lượng protein cho thấy từ 100 ml dịch nuôi cấy, húng tôi đã thu được tổng số 1,26 mg protein VP28-Histag Protein VP28 tinh sạ h được
sử dụng làm đối chứng dương tr ng á nghiên ứu về biểu hiện trên bề mặt bào tử tiếp theo
Hình 3.7: Kết qu SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm
tra độ tinh sạch của VP28
1: Dịch chiết tế bào có chứa protein VP28lên cột His-bind
2: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 5 mM
3: Dịch rửa cột His-bind bằng đệm A có imidazol 80 mM