luận văn
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
- -
LÊ THIÊN LÝ
NGHIÊN CỨU THĂM DÒ KHẢ NĂNG TẠO ðA BỘI THỂ
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SỐC LẠNH
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Mã số: 60.62.70
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS: NGUYỄN TƯỜNG ANH
HÀ NỘI - 2008
Trang 2LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan rằng ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các trích dẫn ñều ñúng sự thật và có nguồn gốc rõ ràng
Tôi xin cam ñoan rằng các số liệu về kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược dùng ñể bảo vệ bất cứ một học hàm, học vị nào khác
Học viên: Lê Thiên Lý
Trang 3LỜI CẢM ƠN
đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn ựến Khoa sau ựại học trường đại học Nông Nghiệp I - Hà Nội, Phòng đào tạo và hợp tác quốc tế - Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I ựã tổ chức và tạo ựiều kiện thuận lợi cho tôi tham gia khóa học này
Xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ, tập thể cán bộ phòng Di truyền - chọn giống, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1 ựã tạo mọi ựiều kiện về cơ sở vật chất cho tôi thực hiện ựề tài này
Sự biết ơn sâu sắc xin ựược gửi ựến thầy giáo Pgs.ts Nguyễn Tường Anh người ựã tận tình hướng dẫn và giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành ựề tài tốt nghiệp này
Xin chân thành cảm ơn các ựồng nghiệp, bạn bè ựã giúp ựỡ tôi trong suốt thời gian qua
Cuối cùng tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn ựến cha, mẹ và những người thân yêu ựã luôn khuyến khắch ựộng viên cho tôi có ựược như ngày hôm nay
Bắc Ninh: Tháng 11 năm 2008
Lê Thiên Lý
Trang 4MỤC LỤC
LỜI CAM ðOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ v
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
PHẦN 1: MỞ ðẦU 1
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1.Một số ñặc ñiểm sinh học, sinh sản của ñối tượng nghiên cứu cá Tra 3
2.1.1 ðặc ñiểm phân loại 3
2.1.2 ðặc ñiểm về hình thái sinh lý 3
2.1.3 ðặc ñiểm về sinh trưởng 4
2.1.4 ðặc ñiểm về dinh dưỡng 4
2.1.5 ðặc ñiểm về sinh sản 4
2.2 Các cơ sở khoa học và phương pháp tạo ra ña bội thể 5
2.2.1 Tạo ra tam bội 8
2.2.2 Tạo ra tứ bội 8
2.3.Tổng quan về tình hình nghiên cứu ña bội trong và ngoài nước 8
2.3.1 Những nghiên cứu ña bội ngoài nước 8
3.2 Những nghiên cứu ña bội trong nước 14
2.3.3 Sự khác biệt giữa cá ña bội và lưỡng bội 15
2.4 Một số phương pháp xác ñịnh ña bội thể 18
2.4.1 Xác ñịnh theo kích thước nhân tế bào hồng cầu 18
2.4.2 ðo hàm lượng ADN (Flow cytometry) 18
2.4.3 Theo tế bào học, ñếm nhiễm sắc thể 19
PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
3.1 ðịa ñiểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu 20
3.1.1 ðịa ñiểm nghiên cứu 20
3.1.2 Thời gian nghiên cứu 20
3.1.3 ðối tượng nghiên cứu 20
3.1.4 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu 20
3.2 Phương pháp theo dõi quá trình phát triển của phôi 21
3.3 Phương pháp thử nghiệm gây sốc lạnh 21
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu thực hiện thí nghiệm 21
3.3.2 Phương pháp gây sốc 22
3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23
3.4 Phương pháp xác ñịnh các yếu tố: 24
3.5 Xác ñịnh thể ña bội 24
3.6 Phương pháp chăm sóc và quản lý cá ñể xác ñịnh tỷ lệ ña bội 25
3.6.1 Ấp trứng 25
3.6.2 Ương cá bột lên hương 26
3.6.3 Ương từ hương ñến khi xác ñịnh ña bội thể 26
Trang 53.7 Phương pháp xử lý số liệu 26
PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27
4.1 Kết quả nghiên cứu tìm hiểu thời ñiểm gây sốc 27
4.1.1 Theo dõi các quá trình phát triển của phôi cá tra 27
4.1.2 Xác ñịnh số lượng trứng thí nghiệm 29
4.2 Tỷ lệ thụ tinh ở các nhiệt ñộ và thời lượng sốc khác nhau 29
4.2.1 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 50C 29
4.2.2 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 70C 30
4.2.3 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 90C 30
4.3 Kết quả về tỷ lệ nở ở nhiệt ñộ, thời lượng sốc khác nhau 32
4.3.1 Tỷ lệ nở qua thời lượng sốc khác nhau ở 50C 32
4.3.2 Tỷ lệ nở qua thời lượng sốc khác nhau ở 70C 33
4.3.3 Tỷ lệ nở qua thời lượng sốc khác nhau ở 90C 33
4.3.4 So sách tỷ lệ nở qua nhiệt ñộ, thời lượng sốc khác nhau 34
4.4 Tỷ lệ sống ở nhiệt ñộ, thời lượng sốc khác nhau 35
4.4.1 Tỷ lệ sống qua thời lượng sốc khác nhau ở 50C 35
4.4.2 Tỷ lệ sống qua thời lượng sốc khác nhau ở 70C 35
4.4.3 Tỷ lệ sống qua thời lượng sốc khác nhau ở 90C 36
4.4.4 So sánh tỷ lệ sống qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 36
4.5 Tỷ lệ dị hình ở nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 37
4.5.1 Tỷ lệ dị hình qua thời gian sốc khác nhau ở 50C 37
4.5.2 Tỷ lệ dị hình qua thời gian sốc khác nhau ở 70C 38
4.5.3 Tỷ lệ dị hình qua thời gian sốc khác nhau ở 90C 38
4.5.4 So sánh tỷ lệ dị hình qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 39
4.6 Kết quả ño kích thước nhân tế bào hồng cầu của cá Tra 40
4.6.1 Kết quả ño kích thước nhân tế bào hồng cầu 40
4.6.2 Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu 41
4.7 Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu ≥ 1,5 lần cá bình thường 42
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ðỀ XUẤT 45
5.1 Kết luận: 45
5.2 ðề xuất: 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
PHỤ LỤC 55
Trang 6DANH MỤC CÁC BIỂU ðỒ
Biểu ñồ 4.2 1: Tỷ lệ thụ tinh sốc ở 5 0 C 29
Biểu ñồ 4.2 2: Tỷ lệ thụ tinh sốc ở 7 0 C 30
Biểu ñồ 4.2 3: Tỷ lệ thụ tinh khi sốc ở 9 0 C 30
Biểu ñồ 4.2 4: Tỷ lệ thụ tinh qua nhiệt ñộ và thời lượng sốc khác nhau 31
Biểu ñồ 4.3 1: Tỷ lệ nở ở 5 0 C 32
Biểu ñồ 4.3 2: Tỷ lệ nở ở 7 0 C 33
Biểu ñồ 4.3 3: Tỷ lệ nở ở 9 0 C 33
Biểu ñồ 4.3 4: Tỷ lệ nở ở nhiệt ñộ, thời lượng sốc khác nhau ở 34
Biểu ñồ 4.4 1: Tỷ lệ sống khi sốc ở 50C 35
Biểu ñồ 4.4 2: Tỷ lệ sống khi sốc ở 7 0 C 35
Biểu ñồ 4.4 3: Tỷ lệ sống khi sốc ở 9 0 C 36
Biểu ñồ 4.4 4: Tỷ lệ sống qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 37
Biểu ñồ 4.5 1: Tỷ lệ dị hình qua thời gian sốc khác nhau ở 5 0 C 37
Biểu ñồ 4.5 2: Tỷ lệ dị hình qua thời gian sốc khác nhau ở 7 0 C 38
Biểu ñồ 4.5 3: Tỷ lệ dị hình sốc ở 9 0 C 38
Biểu ñồ 4.5 4: Tỷ lệ dị hình qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 39
Biểu ñồ 4.6 1: Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu khi sốc ở 5 0 C 41
Biểu ñồ 4.6 2: Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu khi sốc 7 0 C 41
Biểu ñồ 4.6 3: Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu khi sốc 9 0 C 42
Biểu ñồ 4.6 4: Tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu ≥ 1,5 lần cá bình thường 43
DANH MỤC HÌNH Hình 3 1 Lấy mẫu máu trên cá tra 25
Hình 3 2 ðo kích thước nhân tế hồng cầu 25
Hình 3 3 Nâng nhiệt trứng sau khi sốc 26
Hình 3 4 Ấp trứng trong lồng vải 26
Hình 4 1 Hình thành mũ phôi 28
Hình 4 2 Mũ phôi ñạt cao nhất 28
Hình 4 3 Gð 2 tế bào 29
Hình 4 4 Gð 4 tế bào 29
Hình 4 5 Kích thước nhân tế bào cá Tra sau khi sốc lạnh 44
Hình 4 6 Kích thước nhân tế bào hồng cầu cá Tra bình thường 44
Trang 7DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4 1: Thời gian và các giai ñoạn phát triển của phôi 28
Bảng 4 2: Số trứng trong 1 ml 29
Bảng 4 3: So sánh tỷ lệ thụ tinh ở nhiệt ñộ, thời lượng sốc khác nhau 31
Bảng 4 4: So sánh tỷ lệ nở qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 34
Bảng 4 5: So sánh tỷ lệ sống qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 36
Bảng 4 6: So sánh tỷ lệ dị hình qua nhiệt ñộ, thời gian sốc khác nhau 39
Bảng 4 7: Thể tích nhân tế bào hồng cầu 40
Bảng 4 8: Tỷ lệ kích thước nhân tế bào hồng cầu ≥ 1,5 lần so với cá bình thường ơ nhiệt ñộ và thời lượng sốc khác nhau 43
DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ Sơ ñồ 2 1 Cơ sở khoa học của quá trình phụ sinh nhân tạo 5
Sơ ñồ 2 2 Cơ sở khoa học của quá trình mẫu sinh nhân tạo 6
Sơ ñồ 2 3 Cơ sở khoa học của các quá trình tạo thể ña bội 6
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ðC Nghiệm thức ñối chứng
Max Giá trị lớn nhất
Min Giá trị nhỏ nhất
SE Sai số chuẩn
STD ðộ lệch chuẩn
Var Phương sai mẫu
n Số lượng mẫu
V Thể tích nhân tế bào
a Nửa trục chính
b Nửa trục phụ
Trang 8PHẦN 1: MỞ ðẦU
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn phân bố tự
nhiên ở Việt Nam, Campuchia, Thái Lan có thể nuôi rất thành công với mật
ñộ cao và sản lượng lớn ở nước ta, ñặc biệt là ở ñồng bằng sông Cửu Long, hơn
nữa nguồn giống cũng có thể chủ ñộng vì ñã có công nghệ sinh sản nhân tạo
Hiện tại cá tra ñang có sản lượng xuất khẩu lớn nhất trong các loài cá nuôi nước ngọt, với nhiều mặt hàng chế biến ña dạng và phong phú sang hàng chục nước
và vùng lãnh thổ [8]
Trên thế giới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã tạo ra nhiều dạng ña bội bằng các phương pháp khác nhau ở một số loài ñộng vật thủy sản như cá và thân mềm hai mảnh vỏ ðối với việc tạo ña bội thể ở cá thì việc sử dụng sốc nhiệt và sốc áp suất ñược sử dụng nhiều hơn còn hoá chất thường ñược dùng trên ñối tượng nhuyễn thể như Hầu Thái Bình Dương Nghiên cứu tam bội thể
ñã thực hiện thành công trên một số loài cá da trơn như: Cá nheo mỹ (Ictalurus
puntatus) , cá Trê vàng (C macrocephalus), Trê phi (C gariepinus), Trê ñen (C
fuscus) Mặc dù nghiên cứu ña bội ñược thực hiện trên nhiều ñối tượng thuỷ sản nhưng số lượng ñưa vào sản xuất vẫn chưa phải là nhiều, ngay từ thời kỳ ñầu khi mới tìm ra phương pháp gây ña bội thể, người ta thấy rằng, tính ña bội
có liên quan trực tiếp với những tế bào có kích thước lớn, từ ñó mà các cơ quan sinh dưỡng phát triển mạnh, nhanh lớn hơn dạng lưỡng bội Mục ñích chính là tạo ra giống thủy sản tam bội thể ñể khai thác ñược lợi thế của thể tam bội như
sự tăng trưởng nhanh, tính bất thụ cũng như khả năng chịu ñựng môi trường sống khắc nghiệt, khả năng kháng bệnh tốt
Ở Việt Nam vấn ñề nghiên cứu tạo giống ña bội một số loài ñộng vật thủy sản chưa ñược chú trọng ñến và có rất ít các công trình nghiên cứu tam bội thể, mới chỉ có thử nghiệm bước ñầu trên cá chép và cá trê bằng phương pháp
Trang 9sốc nhiệt Chưa có một nghiên cứu nào trong và ngoài nước nghiên cứu ña bội trên cá tra
Hiện nay công nghệ sinh học và nuôi trồng thủy sản ñã và ñang trên ñà phát triển giúp chúng ta có thể áp dụng cho những mục ñích như: nuôi cấy tế bào gốc, chuyển cấy gen, chuyển ñổi giới tính, mẫu sinh, phụ sinh hay tạo ña bội thể ở trên các loài thủy sản, hơn nữa, nghề nuôi thủy sản ñang ngày càng phát triển ñòi hỏi cần có con giống có chất lượng tốt và có tiềm năng cho năng suất, hiệu quả cao Do vậy, xây dựng cơ sở nghiên cứu tạo giống ña bội thể ở một số loài cá chủ lực có giá trị kinh tế trong nuôi trồng thuỷ sản như là cá Tra
là cần thiết ðể làm ñược ñiều này, chúng ta cần phải tiến hành nghiên cứu tạo
ña bội thể trên cá tra, ổn ñịnh ñược phương pháp tạo ña bội thể trên ñối tượng này, ñồng thời xác ñịnh các ñặc ñiểm của giống ña bội thể
Xuất phát từ những vấn ñề trên, ñồng thời dựa trên một số phương pháp tạo ña bội ñã ñược thực hiện thành công trên cá ở trong và ngoài nước, tôi xin ñược chọn ñề tài:
“Nghiên cứu thăm dò khả năng tạo ña bội thể trên cá Tra (Pangasianodon
hypophthalmus) bằng phương pháp sốc lạnh”
Mục tiêu nghiên cứu
Bước ñầu tìm hiểu phương pháp quy trình tạo ña bội và cách xác ñịnh những cá thể ña bội tạo ñược ra ở cá Tra
Nội dung nghiên cứu
- Theo dõi quá trình phát triển của phôi ở giai ñoạn sớm
- Bước ñầu thử nghiệm gây sốc tạo ña bội thể trên cá tra qua một số chỉ tiêu nhất ñịnh về nhiệt ñộ, thời ñiểm và thời khoảng xử lý gây sốc lạnh
- So sánh một số chỉ tiêu về tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở, tỷ lệ sống, tỷ lệ tạo ra ña bội thể qua các thí nghiệm gây sốc
Trang 10PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.Một số ñặc ñiểm sinh học, sinh sản của ñối tượng nghiên cứu (cá Tra) 2.1.1 ðặc ñiểm phân loại
Theo tài liệu của Lindberg G.V, 1974, (trích qua [4]) thì cá Tra ñược sắp xếp theo hệ thống phân loại như sau:
Loài Cá tra P hypophthalmus (Sauvage, 1978)
2.1.2 ðặc ñiểm về hình thái sinh lý
Cá Tra có miệng rộng nằm ở ñầu mõm, dãy răng hàm trên hoàn toàn bị che khuất bởi hàm dưới khi miệng khép lại Vây bụng có 8 tia phân nhánh, gai mang trên cung thứ nhất có số lượng tăng dần theo kích thước cá, số gai mang thường ít, khi lớn thì có nhiều hơn Bóng hơi của cá tra có một thùy kéo dài quá xuống bụng tới gần nửa phần sau của vây hậu môn Râu cá tra có 2 ñôi, một ñôi hàm trên và một ñôi hàm dưới
Cá Tra sống chủ yếu trong nước ngọt, có thể sống ñược ở vùng nước lợ với ñộ mặn 7 - 10‰, có thể chịu ñược nước phèn với pH > 5, dễ chết ở nhiệt ñộ dưới 150C nhưng chịu nóng tới 390C Cá Tra có số lượng hồng cầu trong máu nhiều hơn các loài cá khác, cá có cơ quan hô hấp phụ và có thể hô hấp bằng bóng khí và da nên có thể chịu ñược môi trường sống thiếu hàm lượng oxy hòa tan Mức tiêu thụ oxy và ngưỡng oxy của cá tra thấp hơn 3 lần so với cá mè trắng [4]
Trang 112.1.3 ðặc ñiểm về sinh trưởng
Cá Tra có tốc ñộ tăng trưởng cao, còn nhỏ cá tăng nhanh về chiều dài Trong ao nuôi cá có thể ñạt từ 1,0 ñến 1,5 kg (Năm ñầu tiên), những năm về sau
cá tăng trọng nhanh hơn, có khi ñạt tới 5 – 6 kg/năm [5]
Cỡ cá 10+ trong tự nhiên tăng trọng ít, Cỡ cá 9+ trong ao ñạt 16,5kg trong khi cá tự nhiên tuổi 20+ cũng chỉ ñạt 15 – 17kg [4]
2.1.4 ðặc ñiểm về dinh dưỡng
Cá Tra khi hết noãn hoàng thì thích ăn mồi tươi sống, vì vậy chúng ăn thịt lẫn nhau ngay trong bể ấp và tiếp tục ăn thịt lẫn nhau nếu không ñược cho
ăn ñầy ñủ Dạ dày cá khi phình to có hình chữ U và có thể co giãn ñược, ruột cá ngắn không gấp khúc lên nhau mà dính vào màng treo ruột ngay dưới bóng khí
và tuyến sinh dục Cá có Dạ dày to và ruột ngắn là ñặc ñiểm của cá thiên về ăn ñộng vật.Tuy nhiên khi ương nuôi cá giống trong ao, chúng ăn ñộng vật phù du
có kích thước vừa cỡ miệng, và có thể ăn thức ăn nhân tạo sau ñó [4], [5]
2.1.5 ðặc ñiểm về sinh sản
Tuổi thành thục của cá ñực là 2 tuổi và cá cái là 3 tuổi, trọng lượng cá thành thục lần ñầu từ 2,5 – 3,0 kg trong tự nhiên chỉ gặp cá thành thục trên sông ở ñịa phận Campuchia và Thái lan Cá Tra không có cơ quan sinh dục phụ nên nếu nhìn hình dáng bên ngoài thì khó phân biệt ñược cá ñực với cá cái Tuyến sinh dục bắt ñầu phân biệt ñược ñực cái từ giai ñoạn II tuy màu sắc chưa khác nhau nhiều Ở các giai ñoạn sau, buồng trứng tăng về kích thước, hạt trứng
có màu vàng, tinh sào có dạng phân nhánh, màu hồng chuyển dần sang mầu trắng sữa
Hệ số thành thục của cá tra khảo sát ñược trong tự nhiên từ 1,76 ñến 12,94% (cá cái), và từ 0,83 ñến 2,1% (cá ñực) ở cá ñánh bắt tự nhiên trên sông
cỡ từ 8 ñến – 11 kg Trong ao nuôi vỗ hệ số thành thục của cá ñạt tới 19,5%
Trang 12Mùa vụ thành thục của cá trong tự nhiên bắt ñầu từ tháng 5 – 6 dương lịch, cá có tập tính di cư ñẻ tự nhiên trên những khúc sông có ñiều kiện sinh thái phù hợp thuộc ñịa phận Campuchia và Thái lan, không ñẻ tự nhiên ở phần sông của Việt Nam [4], [5]
Sức sinh sản tuyệt ñối của cá từ 200 ngàn tới vài triệu trứng, sức sinh sản tương ñối ñạt 135 ngàn trứng/kg cá cái Kích thước của trứng cá Tra tương ñối nhỏ và khi rụng trong nước có tính dính, trứng sắp ñẻ có ñường kính trung bình 1mm, sau khi ñẻ và trương nước ñường kính trứng có thể tới 1,5 – 1,6 mm [4]
2.2 Các cơ sở khoa học và phương pháp tạo ra ña bội thể
Quá trình thụ tinh ở hầu hết các loài cá xảy ra ở môi trường bên ngoài nên chúng ta có thể thực hiện ñược việc tạo cá mẫu sinh, phụ sinh hay cá tam bội và tứ bội
• Phụ sinh nhân tạo
Sơ ñồ 2 1 Cơ sở khoa học của quá trình phụ sinh nhân tạo
Chiếu xạ vào noãn bào trước khi gieo tinh ñồng thời phong toả nguyên phân ñầu tiên của quá trình phân cắt tạo hợp tử lưỡng bội
Trang 13• Mẫu sinh nhân tạo:
Sơ ñồ 2 2 Cơ sở khoa học của quá trình mẫu sinh nhân tạo
a: Tạo thành phôi ñơn bội, không bình thường và chết ngay sau khi nở
b: Phong toả giảm phân II tạo hợp tử lưỡng bội
c: Phong toả nguyên phân ñầu tiên của quá trình phân cắt tạo hợp tử
lưỡng bội
Sơ ñồ 2 3 Cơ sở khoa học của các quá trình tạo thể ña bội
a: Tác ñộng vào quá trình phân bào giảm nhiễm II tạo thể tam bội 3n
b: Quá trình nguyên phân lần thứ I bị tác ñộng tạo hợp tử tứ bội
Trang 14Hiện tượng ña bội ñược hình thành do bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội của loài ñược tăng lên nhưng không phân ly trong quá trình phân bào giảm nhiễm hoặc nguyên phân ñầu tiên trong quá trình phân cắt của phôi hoặc là do ñược lai tạo [1], [27]
ða bội thể ñược tạo ra bằng cách sốc nhiệt, sốc áp suất hay bằng các chất hóa học vào ñúng thời ñiểm thích hợp kể từ lúc trứng mới ñược gieo tinh
Ở cá sốc nhiệt và sốc bằng áp xuất ñược các nhà khoa học sử dụng nhiều
và rất thành công, tuy nhiên sốc bằng áp xuất có nhiều rủi ro và nguy hiểm nên sốc nhiệt ñược sử dụng rộng rãi nhất, hơn nữa thao tác dễ dàng hơn, ít tốn kém
và an toàn ðối với sốc nhiệt nóng hay lạnh ñều có thể áp dụng cho các loài cá vùng nhiệt ñới hay vùng ôn ñới Tuy nhiên sốc nóng tốt hơn ñối với các loài cá vùng ôn ñới và sốc lạnh tốt hơn ñối với loài cá nhiệt ñới
Sốc nhiệt nóng do ở nhiệt ñộ cao nên quá trình tạo hợp tử của trứng diễn
ra trong thời gian ngắn nên gây bất lợi trong việc thực hiện, hơn nữa tỷ lệ dị hình sẽ cao Ngược lại sốc lạnh quá trình tạo hợp tử diễn ra lâu hơn nên ta cũng
sự ñánh giá, so sánh ñưa ra ñược thời ñiểm sốc tối ưu
Khoảng thời gian sốc phải bắt ñầu trước khi quá trình phân bào giảm nhiễm lần II diễn ra và ñược tiếp tục duy trì ñến khi noãn bào không còn khả năng ñẩy thể cực thứ 2 ra ngoài
Trang 152.2.1 Tạo ra tam bội
Sự tác ñộng bằng các tác nhân vật lý, hóa học hay nhiệt ñộ ñều vào thời ñiểm trứng vừa mới ñược gieo tinh có thể tạo ra ña bội thể Thời ñiểm tác ñộng vào là quá trình phân bào giảm nhiễm lần thứ II, ở quá trình này tác ñộng nhằm ngăn chặn thể cực thứ hai bị ñùn ra Kết quả trứng ñược thụ tinh có 3 thể ñơn bội: một của trứng, một của tinh trùng và một từ thể cực thứ II Ngoài ra sử dụng phương pháp lai tạo giữa thể tứ bội và thể lưỡng bội cũng cho ta thể tam bội [1], [11], [27]
2.2.2 Tạo ra tứ bội
Thể tứ bội ñược tạo thành khi tác ñộng vào quá trình nguyên phân lần nhứ nhất của hợp tử trong quá trình phát triển của noãn bào Ở quá trình này khi nhiễm sắc thể khi ñã nhân ñôi ta tác ñộng bằng các tác nhân vật lý, hóa học hay nhiệt chống lại sự hình thành hai tế bào ñầu tiên của hợp tử tạo thành hợp
tử tứ bội [1], [11]
2.3.Tổng quan về tình hình nghiên cứu ña bội trong và ngoài nước
2.3.1 Những nghiên cứu ña bội thể trên cá ở ngoài nước
Nghiên cứu ña bội thể trên các ñối tượng thủy sản trên thế giới ñã ñược tiến hành thực hiện rất sớm, tuy nhiên vẫn còn chậm hơn nhiều so với trồng trọt
và chăn nuôi Các công trình nghiên cứu trên cá, nhuyễn thể và giáp xác ñã mang lại nhiều kết quả về mặt sinh học, kinh tế và sinh thái ðặc biệt ñối với cá
có rất nhiều loài ñã ñược nghiên cứu và tạo thể ña bội thành công như: Cá chép,
cá trê, cá hồi, cá rô phi, cá chạch, cá trắm cỏ, cá mè, cá rô hu Cùng với việc nghiên cứu ñể tạo ra thể ña bội thì những nghiên cứu ñánh giá về mặt sinh học giữa các thể ña bội và thể lưỡng bội cũng ñược tiến hành song song Ta có thể thấy ñược qua một số công trình nghiên cứu ñiển hình trên các loài cá sau [29]
Trang 16khoảng thời gian 10 phút tỉ lệ ña bội ñạt 100% [65] Ở cá hồi hồng (Pink
salmon ), cá hồi bạc (Coho salmon), cá hồi (Chinook) khi gây sốc từ 28 ñến
300C tại thời ñiểm 10 phút sau thụ tinh, trong khoảng thời gian là 10 phút tỉ lệ
ña bội ñạt là 58-84% [69] Ngoài ra còn một số phương pháp khác như tạo tam
bội ở cá hồi vân (Rainbow trout) bằng cách gây sốc bằng pH và muối can xi ñối
với trứng và tinh trùng, hoặc gây sốc bằng oxyd nitơ (N2O) có thể tạo ra 80% cá
tam bội ở cá hồi (Salmo salar) [45]
Khi nghiên cứu về những ñặc ñiểm của thể tam bội về mặt sinh học trên
cá Hồi chúng ta ñã nhận thấy cả những ưu ñiểm và nhược ñiểm mà thể ña bội mang lại
Sự sinh trưởng:
Trong tuổi ñầu tiên, cá hồi cái tam bội sinh trưởng chậm hơn cá lưỡng bội [65] TheoTabata và ctv, (1999) thì sau thời ñiểm thành thục cá hồi tam bội sinh trưởng nhanh hơn cá lưỡng bội [67] Cho ñến khi ñược 2 năm tuổi sự sinh trưởng của cá hồi vân lưỡng bội chậm ñi và cá hồi tam bội sinh trưởng nhanh hơn 14,5 % so với cá bình thường [69] Thorgaard và ctv, (1979) cho rằng cá hồi tam bội không chỉ sinh trưởng nhanh hơn mà hệ số chuyển hoá thức ăn còn tốt hơn cá lưỡng bội [68] Tuy nhiên ở ñộ tuổi từ 0 ñến 1, cá hồi vân tam bội và lưỡng bội có hệ số chuyển hoá thức ăn giống nhau Cá hồi thái bình dương tam bội sinh trưởng nhanh hơn so với cá lưỡng bội ở môi trường nước biển [34]
Trang 17Blanc và Vallee (1999) ñã thấy rằng có sự tương quan mạnh mẽ giữa thể lưỡng bội, tam bội của cá hồi vân và cá hồi nâu ñối với sự sinh trưởng, tuy nhiên sự lai tạo có thể phá vỡ mối tương quan này [15] Sự sinh trưởng khác nhau có thể ñược giải thích bởi sự phát triển khác nhau của mô cơ Johnston và ctv (1999)
ñã kiểm tra sự phát triển của cơ và sự phát triển giới tính ở cá hồi và thấy rằng
cá tam bội sinh trưởng nhanh hơn cá lưỡng bội [46]
Tỉ lệ sống:
Tỉ lệ sống của cá hồi vân tam bội trong giai ñoạn 60-105 ngày là thấp hơn so với thể lưỡng bội [67] Tuy nhiên khi cá hồi vân gần ñến giai ñoạn thành thục sinh dục trong năm thứ 2 thì tỉ lệ chết của cá lưỡng bội, ñặc biệt là con ñực
là cao hơn [67] Ở cá hồi vân, cá hương tam bội có tỉ lệ sống kém hơn lưỡng bội khi chúng sống trong ñiều kiện môi trường khắc nghiệt [64] Tỉ lệ sống thấp hơn của cá hồi vân tam bội ở giai ñoạn sớm có thể do sự phát triển phôi Cá tam bội và lưỡng bội ñược nuôi trong cùng ñiều kiện thời gian nhưng phôi tam bội phát triển nhanh hơn phôi lưỡng bội Có thể là do một vài vấn ñề trong thời kỳ phát triển và ương nuôi Việc hấp thụ nước bởi noãn hoàng dự trữ là giống nhau
ở các mức ña bội, tuy nhiên ở giai ñoạn cá bột, cá tam bội nhỏ hơn 5% so với cá lưỡng bội [37] Trong suốt 2,5 năm tuổi cá hồi ñại tây dương tam bội có tỉ lệ sống thấp hơn cá lưỡng bội [63] Cá hồi ñại tây dương tam bội thường có tỉ lệ chết cao hơn lưỡng bội khi nuôi ở các trang trại
Chất lượng thịt cá:
Thành phần kết cấu của thịt cá là không khác nhau ở cá hương tam bội và lưỡng bội của cá hồi vân Tuy nhiên ñã có nhiều loài cá hồi tam bội ñược ñưa vào thương mại hoá như cá hồi biển, cá hồi vân do cá hồi tam bội có kích thước lớn hơn và chất lượng thịt cá cao hơn so với cá hồi lưỡng bội
Trang 18• Cá da trơn
Các công trình nghiên cứu ña bội thể trên cá da trơn: Trên cá Trê phi
(Clarias gariepinus) khi gây sốc lạnh ở nhịêt ñộ 50C ở thời ñiểm sau thụ tinh 3 phút trong khoảng thời gian 40 phút tỉ lệ ña bội ñạt 80-100% [38] Trên cá Trê
vàng Thái Lan (Calarias macrocephalus) khi gây sốc ở 70C ở ngay thời ñiểm
thụ tinh trong vòng 25 phút tỉ lệ cá ña bội ñạt 80% Ở cá trê ñen (Clarias
fuscus) việc sốc lạnh tại thời ñiểm 3 phút sau khi thụ tinh trong khoảng thời gian 20 phút ở nhiệt ñộ sốc 40C cũng rất thành công khi tạo ra cá tam bội Theo Wolters và cộng sự, nghiên cứu tạo ra 100% tam bội thể trên cá Nheo mỹ
(Ictalurus punctatus) sau khi sốc lạnh ở nhiệt ñộ 50C trong khoảng thời gian 1,0
giờ và ở thời ñiểm 5 phút sau khi thụ tinh Trên cá da trơn Nam Mỹ (Rhamdia
quelen) khi sốc lạnh ở nhiệt ñộ 40C và 70C trong khoảng thời gian 20 phút tỷ lệ tam bội ñạt ñược lần lượt là 97,9% và 92,0% trong cùng một thời ñiểm gây sốc
3 phút sau khi thụ tinh, tuy nhiên tỷ lệ tam bội giảm ñi rất nhiều khi khoảng thời gian gây sốc lên ñến 30 phút [29]
Sự sinh trưởng:
Cá da trơn tam bội lớn nhanh hơn cá lưỡng bội ở vào thời ñiểm 8 ñến 9
tháng tuổi (90g) [24], [77] Cá trê ñen Trung Quốc (Clarias fuscus) tam bội và
cá nheo châu Âu (Silurus glanis) tam bội sinh trưởng nhanh hơn cá lưỡng bội
bình thường trong năm ñầu tiên [56] Cá da trơn tam bội không chỉ sinh trưởng nhanh hơn mà hệ số chuyển hoá thức ăn còn tốt hơn thể lưỡng bội [77] Cá da trơn tam bội chuyển hoá thức ăn hiệu quả hơn cá lưỡng bội trong môi trường bể nuôi và trong thí nghiệm này cá tam bội cũng lớn nhanh hơn cá lưỡng bội [24]
Chất lượng thịt cá: Cá trê phi tam bội có hàm lượng protein thấp, nhiều
mỡ, nhiều năng lượng trong mỗi gram thịt cá hơn so với cá lưỡng bội Ở cá da
trơn tam bội có sức chống chịu với vi khuẩn gây bệnh ñốm ñỏ Aeromonas
hydrophila như cá lưỡng bội [28]
Trang 19Ớ Cá rô phi
đã có nhiều nghiên cứu tạo ựa bội thể trên cá rô phi và chủ yếu tập trung nghiên cứu về thời ựiểm, cường ựộ và khoảng thời gian xử lý khi gây sốc sau khi trứng ựã ựược thụ tinh Những nghiên cứu chỉ ra rằng khoảng thời gian diễn
ra quá trình phân bào giảm nhiễm lần II ở cá rô phi trong khoảng từ 3 ựến 9 phút tắnh từ khi trứng bắt ựầu ựược thụ tinh, tuy nhiên cá tam bội vẫn ựược tạo
ra khi sốc tại thời ựiểm 0,5 phút sau thụ tinh và trong khoảng thời gian 15 phút [42] Don và Avatalion (1988) ựã so sánh hiệu quả tạo tam bội trên cá rô phi
vằn (O niloticus) bằng sốc nhiệt nóng ở nhiệt ựộ 39,50C, 40,50C và 41,50C tại thời ựiểm 3,5- 4 phút sau thụ tinh trong khoảng thời gian xử lý 3, 3,5 và 4 phút với sốc lạnh (110C trong vòng 60 phút) Họ cho rằng phương pháp sốc lạnh có nhiều thuận lợi hơn sốc nóng vì khi sốc nóng ở nhiệt ựộ cao thì quá trình hình thành giao tử diễn ra rất nhanh (3 Ờ 4 phút), trong khi ựó sốc lạnh (110C trong thời gian 60 phút) thì quá trình này kéo dài từ 0 ựến 15 phút [26]
Khi gây sốc cá rô phi xanh (Oreochromis aureus) ở nhiệt ựộ 39,50C ở thời ựiểm sau thụ tinh 3 phút trong khoảng thời gian 3,5-4 phút thu ựược tỉ lệ ựa bội ựạt 100% [26]
Sự sinh trưởng:
Cá rô phi tam bội lớn nhanh hơn cá lưỡng bội từ 66 ựến 90% [42]
Tỉ lệ sống: Cá rô phi tam bội và lưỡng bội (O aureus) có tỉ lệ sống giống nhau [40], cá O niloticus tam bội và lưỡng bội có sự tăng trưởng như nhau trong môi
trường bể nuôi [18]
Chất lượng thịt cá: Không phát hiện ra sự khác nhau giữa cá rô phi tam bội và lưỡng bội về thành phần hoá sinh
Tỉ lệ giới tắnh:
Trang 20Cá rô phi (O aureus) tam bội con cái dị giao tử ZX hoàn toàn vô sinh và
tỉ lệ con cái là 80% ðiều này chỉ ra rằng loại gen WZZ và WWZ là mang tính cái Ở một số loài khác thì phần lớn là ñực ðiều này phù hợp khi nhiễm sắc thể (NST) giống cái trội hơn trong hệ thống xác ñịnh giới tính WZ ở cá
Do ñặc ñiểm cá thể tam bội bất thụ cho nên việc tạo cá rô phi tam bội có
ý nghĩa kinh tế to lớn Việc nuôi cá rô phi tam bội thương phẩm ở quy mô công nghiệp có thể ñảm bảo ñem lại hiệu quả cao [29]
• Cá Chạch (Misgurmus anguillicaudatus)
Các công trình nghiên cứu trên cá chạch khi gây sốc ở nhiệt ñộ 10C ở thời ñiểm 5 phút sau thụ tinh trong 30 - 40 phút ñạt tỉ lệ 100% ña bội ñối với cá
chạch (Misgurnus anguillicaudatus) Ở cá chạch (Misgurnus fossilis) khi gây
sốc bằng tác nhân là áp suất ở 400-500kg/cm3 ở thời ñiểm 6 phút sau thụ tinh ñạt tỉ lệ 60- 80% thể ña bội.Tốc ñộ sinh trưởng của cá chạch (M
anguillicaudatus) tam bội là chậm hơn cá lưỡng bội
Trang 21Ớ Cá chép (Cyprinus carpio)
đã có một số công trình nghiên cứu ựa bội trên cá Chép Hollebecq (1988) ựã gây sốc ở nhiệt ựộ 400C ở thời ựiểm sau thụ tinh 4 phút trong khoảng thời gian sốc là 1 - 1,5 phút, ựạt tỉ lệ ựa bội từ 80 ựến 100% [39]
Tốc ựộ sinh trưởng và tỷ lệ sống:
Theo Bienarz (1997) trong suốt năm tuổi thứ 2 khi mà tuyến sinh dục gần ựạt ựến sự thành thục, cá chép tam bội sinh trưởng nhanh hơn cá chép lưỡng bội tuy nhiên cá chép tam bội có tỉ lệ sống như cá chép lưỡng bội trong môi trường
ao nuôi
Chất lượng thịt cá:
đối với thành phần axắt béo, cá chép tam bội có lượng axit với một mối nối ựôi 16:1, 18:1 nhiều hơn, nhưng lượng axit với nhiều mối nối ựôi 22:6 ắt hơn, so với cá lưỡng bội và những axắt béo trung tắnh ở cá tam bội là cao hơn so với cá lưỡng bội [49]
Ớ Cá thơm Ayu (Plecogossus altivelis)
Khi gây sốc ở 0 - 0,50C tại thời ựiểm sau thụ tinh 6 phút và trong khoảng thời gian sốc là 30 - 60 phút thì tỉ lệ ựa bội ựạt 100% Cá ayu tam bội có tỉ lệ
mỡ tắch luỹ cao hơn trong cơ so với cơ thể lưỡng bội kể cả ở lượng thức ăn có hàm lượng mỡ thấp hay cao Sau khi thành thục hàm lượng mỡ trong cơ giảm
ựi nhanh chóng Cá ayu tam bội P altivelis có sức chống chịu với Vibrio
anguillarium so với cơ thể lưỡng bội là như nhau [41]
2.3.2 Những nghiên cứu ựa bội trong nước
Ở nước ta nghiên cứu về ựa bội thể trên các ựối tượng thủy sản còn rất
hạn chế, các ựối tượng ựược nghiên cứu là cá Chép (Cyprinus carpio), ở cá Trê vàng (Clarias macrocephalus) Theo báo cáo của nhóm tác giả Nguyễn Công
Trang 22Dân và ctv (2005) về việc tạo cá chép tam bội thể, ựã tạo ựược tam bội thể tỉ lệ
là 45% và cá ựược gây sốc có tốc ựộ phát triển hơn cá không ựược gây sốc [25]
Nghiên cứu tạo thể tam bội ở cá Trê vàng bằng phương pháp sốc lạnh, sau khi thụ tinh 3 phút gây sốc ở 30C trong khoảng thời lượng xử lý 40 phút từ khi trứng bắt ựầu ựược thụ tinh cho kết quả tỷ lệ thụ tinh ựạt từ 50,05 Ờ 72,16% với tỷ lệ nở từ 70,10 ựến 78,55% Trong nghiên cứu này cá trê tam bội có khối lượng và chiều dài lớn hơn cá lưỡng bội nhưng cũng chưa sai khác nhau nhiều Các chỉ tiêu sinh lý của cá trê vàng tam bội như ngưỡng nhiệt ựộ thấp hơn cá trê vàng lưỡng bội (0,50C), có ngưỡng oxy, tiêu hao oxy và tần số hô hấp cao hơn Phẩm chất thịt cá trê vàng tam bội và cá lưỡng bội tương tự như nhau, tuy nhiên hàm lượng các a xắt béo thiết yếu trừ Methionine ở cá tam bội ựều cao hơn so với cá trê vàng lưỡng bội [7]
2.3.3 Sự khác biệt giữa cá ựa bội và lưỡng bội
2.3.3.1 Tốc ựộ sinh trưởng:
So với cá lưỡng bội, cá tam bội có khả năng sinh trưởng nhanh hơn [71], hoặc bằng ở cá rô phi [26], hoặc chậm hơn (cá hồi, cá da trơn) Nhìn chung cá lưỡng bội sinh trưởng nhanh hơn cá tam bội từ giai ựoạn nhỏ ựến giai ựoạn bắt ựầu thành thục sinh dục Sau giai ựoạn này cá tam bội sinh trưởng nhanh hơn và
có hiệu quả sử dụng thức ăn tốt hơn Thông thường cá tam bội sinh trưởng nhanh hơn so với cá bình thường khi cá bắt ựầu bước vào giai ựoạn thành thục sinh dục, ựó là giai ựoạn cá lưỡng bội phải sử dụng rất nhiều năng lượng cho tuyến sinh dục ựể phục vụ cho quá trình sinh sản [60], [61] đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về so sánh tốc ựộ tăng trưởng giữa cá tam bội và cá bình thường, ựối với mỗi loài cá khác nhau mối tương quan về tốc ựộ sinh trưởng lại
có sự khác nhau.Theo Wolters và ctv (1983) ở cá nheo khi nuôi trong bể qua
thời gian 8 Ờ 9 tháng thì cá tam bội sinh trưởng tốt hơn Trên cá hồi Coho cá
tam bội tăng trưởng nhanh hơn cá lưỡng bội 14,5% [69] Giải thắch về vấn ựề này Muntzung (1936) cho rằng thể tam bội sinh trưởng chậm hơn là do kắch cỡ
Trang 23của tế bào tam bội to hơn ñã làm giảm số lượng tế bào [54] Myers (1986) còn cho rằng có một nguyên nhân quan trọng khác là những tác ñộng trong quá trình gây sốc ñã làm tốc ñộ sinh trưởng của thể tam bội chậm hơn ở thời kỳ cá bột [55] Trong nhiều trường hợp, thể tam bội có khả năng sinh trưởng nhanh hơn thể lưỡng bội bình thường là do chúng không mất nhiều năng lượng cho sự phát triển tuyến sinh dục, nhờ vào ñó có thể tập trung cho sự sinh trưởng ñược nhanh hơn [71]
2.3.3.2 Sự chống chịu với môi trường khắc nghiệt và khả năng kháng bệnh
Khả năng chống chịu bệnh tật:
Khả năng chống chịu bệnh tật vẫn còn ít ñược nghiên cứu ở cá thể tam bội Những nghiên cứu hoá sinh chỉ ra rằng cá tam bội cá khả năng chống chịu bệnh tật thấp hơn cá lưỡng bội Sự khác nhau về huyết học có thể dẫn ñến sự khác nhau trong chống chịu bệnh tật giữa cá lưỡng bội và tam bội Hệ thống miễn dịch của cá tam bội có thể thấp hơn so với cá lưỡng bội, tuy nhiên ở loài
cá thơm ayu (P.altivelis) cá tam bội và lưỡng bội thì khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio anguillarum như nhau [41]
Sức chịu ñựng ở môi trường sống có hàm lượng oxy hòa tan thấp ở cá tam bội chưa ñược nghiên cứu nhiều, theo Stillwell và Benfey (1999) thì hàm lượng ô xy hòa tan thấp ñã ảnh hưởng ñến việc chuyển tải ô xy trong máu, sự tập trung của các tế bào hồng cầu là cách ñể ñánh giá khả năng chuyển tải và cung cấp ô xy trong máu Theo Benfey và ctv (1983) ở cá hồi ñại dương, sức chịu ñựng môi trường có hàm lượng ô xy hòa tan thấp ở cá tam bội và lưỡng bội như nhau [29]
2.3.3.3 Sinh sản:
Có nhiều nghiên cứu về sự phát triển tuyến sinh dục của thể ña bội Thông thường cá tam bội bất thụ và tuyến sinh dục phát triển kém Hầu như cá chép ñực và cá cái tam bội một năm tuổi ñã không phát triển tuyến sinh dục và
Trang 24bất thụ, cá hồi ñại dương bất thụ, hệ số thành thục sinh dục (GSI) giảm 77% so với cá lưỡng bội ñồng thời buồng trứng cũng nhỏ hơn và ít noãn bào hơn [29]
Trên cá da trơn như cá trê phi, cá nheo hệ số thành thục sinh dục cũng thấp hơn so với cá lưỡng bội Richter và ctv (1987) cho rằng ở cá trê phi ñực tam bội các tinh nguyên bào với các tinh bào ñầu tiên bị ngưng lại ở kỳ ñầu của quá trình phân bào giảm nhiễm Theo Tiwary và ctv (1999) ở cá chạch
(Misgurnus fossilis) các tinh nguyên bào giảm rất nhiều tại giữa ống sinh tinh
[29] Allen và ctv (1986) cho rằng trên cá trắm cỏ tam bội, tinh trùng có hình dạng bất thường và có kích thước khác nhau, tinh trùng ñều có ñuôi nhưng có rất it tinh ở dạng 3N còn lại chủ yếu tinh trùng ở dạng 6N [29]
2.3.3.4 Chất lượng thịt cá
ðặc ñiểm thịt cá và chất lượng thịt cá: Một lợi ích tiềm năng của thể ña bội ñó là sự thay ñổi về ñặc ñiểm thịt cá Quá trình giảm sự phát triển của tuyến sinh dục giúp cho giảm sự lãng phí năng lượng cho sự phát triển của tuyến sinh dục và tăng khối lượng thịt ở cá tam bội Những con cá này thường vượt kích thước khi cá ñược thu hoạch [28]
2.3.3.5 Khả năng chuyển hoá thức ăn
Sự khác nhau nhiều hay ít trong sinh trưởng giữa thể tam bội và lưỡng bội có thể bị phụ thuộc vào hiệu suất chuyển hoá thức ăn và sử dụng thức ăn Thông thường cá nheo mỹ tam bội có khả năng chuyển hóa thức ăn tốt hơn cá lưỡng bội [77] Khả năng chuyển hóa thức ăn của cá trê ñen tam bội tốt hơn cá lưỡng bội sau một tháng nuôi, nhưng sau những tháng tiếp theo ñó khả năng này là như nhau [29] Tính bất thụ ñã ảnh hưởng ñến thành phần thịt cá Shelbourn và ctv (1992) cho rằng cá bất thụ có hàm lượng lipid cao hơn và ñộ
ẩm thấp hơn cá bình thường [42]
Trang 252.3.3.6 Hình thái học và sự nhận dạng
Dựa vào những dấu hiệu bên ngoài như màu da, ñường bên Ở cá da trơn tam bội màu da ñen hơn cá lưỡng bội, cá tam bội ñược tạo ra khi cho lai cá trắm cỏ với cá mè hoa có những ñặc ñiểm về hình thái và số lượng vẩy và số tia vây khác so với thể lưỡng bội ñồng thời ruột cũng dài hơn so với cá lưỡng bội [29]
2.4 Một số phương pháp xác ñịnh ña bội thể
Cá ña bội ñã từng ñược xác ñịnh bằng nhiều phương pháp khác nhau như ño trực tiếp nhân tế bào hồng cầu (Beck và Biggers 1983), ðếm nhiễm sắc thể (Kligerman và Bloom, 1977), Phân tích làm lượng ADN, sử dụng các marker di truyền như Microsatellite, Isozyme
2.4.1 Xác ñịnh theo kích thước nhân tế bào hồng cầu
ðây là phương pháp rất phổ biến và sử dụng rộng rãi, thể tích của nhân tế bào hồng cầu sẽ tăng theo lượng ADN trong tế bào máu Tuy nhiên phương pháp này không phải là hoàn toàn chính xác khi ta trực tiếp thao tác ño thể tích nhân hồng cầu
2.4.2 ðo hàm lượng ADN (Flow cytometry)
ðây là một phương pháp dùng ñể ño hàm lượng ADN trong tế bào, ño lượng ADN trong tế bào ñể nhận biết ñược sự khác biệt về hàm lượng ADN trong tế bào ở cá ña bội và lưỡng bội từ ñó có thể ñánh giá ñược sự khác biệt của cá thể Phương pháp này cho ra kết quả nhanh chóng, tuy nhiên dụng cụ tiến hành phương pháp này lại rất ñắt Phương pháp ño hàm lượng ADN ñã xác ñịnh ñược thể tam bội và lưỡng bội ở cá hồi bạc Việc ngưng kết tế bào hồng cầu bằng formalin ñược sử dụng trong phương pháp ño hàm lượng ADN Burn
và ctv, (1986) cho rằng formalin ngưng kết làm hạ thấp số lượng phát huỳnh quang do ñó gây ra những vấn ñề trong việc giải thích số liệu [16] Kucharczyk
và ctv, (1997) ñã có thể phân biệt ñược 100% giữa ñơn bội, lưỡng bội và tam
Trang 26bội của cá vền Abramis brama và cá chó Esox lucius nhưng phải cần tới 40 tế
bào trên 1 con cá ñể ñạt ñược kết quả chính xác, kỹ thuật này ñược áp dụng ñối với cá bơn kết quả là 97%
2.4.3 Theo tế bào học, ñếm nhiễm sắc thể (NST)
Theo tế bào học, việc ñếm NST là biện pháp ñúng ñắn ñể xác ñịnh rõ mức NST Phương pháp kỹ thuật này không phải là tối ưu do chậm và không tiến hành ñược ở số lượng lớn Thêm vào ñó, tế bào học có thể không tìm ra những thể kèm, ñiều này là do những mẫu có số lượng tế bào lớn [21]
Trang 27PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ðịa ñiểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu
3.1.1 ðịa ñiểm nghiên cứu
• Trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ - Cái Bè - Tiền Giang: Theo dõi quá trình phát triển phôi sớm và thực hiện các thí nghiệm gây sốc và ương nuôi
• Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản 1, Phòng Di truyền – Chọn giống: Ương nuôi ñạt kích thước ñể xác ñịnh ña bội thể và xác ñịnh số bộ nhiễm sắc thể ñơn bội
3.1.2 Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 3/2008 ñến - 11/2008
3.1.3 ðối tượng nghiên cứu
Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus)
Cá Tra bố mẹ từ nguồn cá bố mẹ ñang ñược nuôi tại Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt Nam Bộ có thể trọng 5 - 8 kg dùng ñể cho sinh sản nhân tạo thuộc ñề tài “ Nghiên cứu chọn giống cá Tra theo gia ñình” ñang ñược Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II thực hiện
3.1.4 Trang thiết bị dụng cụ nghiên cứu
Kính hiển vi Olympus: Theo dõi quá trình phát triển của phôi, ño kích thước nhân tế bào hồng cầu
Máy ảnh: Chụp những hình ảnh trong quá trình thực hiện thí nghiệm Máy hạ nhiệt Julabo F34: Hạ và duy trì nhiệt ñộ cần sốc lạnh
Nhiệt kế: Theo dõi nhiệt ñộ gây sốc và môi trường trong quá trình thực hiện thí nghiệm
Trang 28Lam, lamen, ñĩa lồng theo dõi quá trình phát triển của phôi, xác ñịnh thể ña bội
Bể ương, lồng ấp, bình thuỷ tinh, chậu, bát cốc ñong, dùng ñể thực hiện các thí nghiệm ương nuôi và ấp trứng
Hoá chất: Dùng ñể xác ñịnh ña bội qua phương pháp xác ñịnh kích thước nhân tế bào hồng cầu: Crystaviolet
3.2 Phương pháp theo dõi quá trình phát triển của phôi
Cá bố mẹ cho sinh sản nhân tạo sau ñó trứng và tinh ñược thụ tinh theo phương pháp thụ tinh khô rồi khử dích bằng dung dịch tanin 1‰ trong khoảng
30 giây và rửa sạch cho vào bể ấp
Lấy mẫu trứng cho vào cốc ñong có dung tích 0,5 lít sau ñó lấy ra một vài trứng vào ñĩa lồng petri rồi theo rõi quá trình phát triển phôi trên kính hiển
vi Mẫu ñược theo dõi liên tục, sau khoảng 3 - 5 phút lại lấy một vài trứng ở cốc ñong sang ñĩa lồng mới và tiếp tục theo dõi, quá trình này ñược thực hiện liên tục ñến khi xuất hiện phôi ở giai ñoạn 8 tế bào
Chụp ảnh và ghi chép các giai ñoạn phát triển phôi sớm, thời gian phát triển của từng giai ñoạn và nhiệt ñộ môi trường ấp trứng, ñặc biệt chú ý thời gian phát triển sớm của phôi, nhằm xác ñịnh thời ñiểm gây sốc tạo ña bội thể
3.3 Phương pháp thử nghiệm gây sốc lạnh
3.3.1 Phương pháp lấy mẫu thực hiện thí nghiệm gây sốc
ðong 10 ml trứng ñã ñược thụ tinh và khử dính vào các lọ nhựa có bao lưới xung quanh, ñể thực hiện các thí nghiệm gây sốc lạnh ở nhiệt ñộ và khoảng thời gian gây sốc khác nhau Lô ñối chứng cũng ñong 10 ml nhưng chuyển ra lồng ấp ở ñiều kiện bình thường, Mục ñích ñể số lượng trứng trong mỗi lồng ấp tương ñương nhau
ðong ra 1 ml trứng ñếm ñể xác ñịnh số lượng trứng sốc nhiệt
Trang 293.3.2 Phương pháp gây sốc
• Chọn thời ñiểm gây sốc
Thời ñiểm gây sốc tính từ khi trứng ñược thụ tinh (trứng và tinh ñược trộn và khuấy ñều với nhau) ñược xác ñịnh sau khi theo dõi quá trình phát triển của phôi
Do ở cá việc nghiên cứu xác ñịnh thời gian xuất hiện thể cực là rất khó vì thế trong nghiên cứu này chỉ có thể chọn thời ñiểm gây sốc qua việc xác ñịnh
thời gian diễn ra quá trình nguyên phân ñầu tiên tạo hợp tử ( giai ñoạn 2 tế bào)
• Chọn nhiệt ñộ gây sốc và thời lượng gây sốc
Căn cứ dựa theo một số chỉ tiêu ñã ñược một số tác giả nghiên cứu gây sốc lạnh tạo ña bội trên một số loài cá da trơn có kết quả tốt như:
Bảng 3.1 Nhiệt ñộ và thời khoảng sốc lạnh trên một số loài cá da trơn
Stt Loài cá gây sốc Nhiệt
ñộ sốc
Thời gian sốc Tác giả
Trang 30Nên bước ñầu thăm dò nhiệt ñộ gây sốc lạnh ở 50C, 70C và 90C và thời lượng xử lý gây sốc 10, 15 và 20 phút
Ấp trứng ñã ñược thụ tinh bình thường (không tham gia sốc nhiệt) làm ñối chứng ñể ñánh giá, so sánh
3.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Bố trí 3 lô thí nghiệm tại 3 mức nhiệt ñộ gây sốc khác nhau 50C, 70C và
90C trong khoảng thời gian xử lý lần lượt 10, 15 và 20 phút ở cùng một thời ñiểm gây sốc Thời ñiểm này ñược xác ñịnh sau khi theo dõi quá trình phát triển của phôi sớm trên cá Tra (Trong nghiên cứu này thời ñiểm sốc ñược xác ñịnh khoảng 6 phút tính từ khi trứng bắt ñầu ñược gieo tinh) Cụ thể các lô thí nghiệm gây sốc lạnh ñược bố trí như sau:
• Gây sốc tại thời ñiểm 6 phút từ khi gieo tinh, nhiệt ñộ gây sốc 50C, thời gian sốc 10, 15 và 20 phút
Trang 313.4 Phương pháp xác ñịnh các yếu tố:
Xác ñịnh số lượng trứng bằng cách ñếm lượng trứng trong 1 ml trứng sau
ñó nhân với tổng thể tích trứng mang ñi sốc
Các yếu tố: Tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở và tỷ lệ dị hình ñược xác ñịnh bằng cách lấy ngâu nhiên 100 trứng ở mỗi nghiệm thức cho vào ñĩa lồng sau 7-8 giờ trứng ñã chuyển sang giai ñoạn phôi vị, ñếm số trứng ñã ñược thụ tinh, nhặt bỏ trứng không thụ tinh, sau 24 – 26h ñếm số cá bột ñể xác ñịnh tỷ lệ nở, tỷ lệ dị hình
Sau khi cá bột nở từ 24 ñến 26 giờ ñếm 250 con cá bột khỏe mạnh không
dị hình chuyển vào thùng nhựa 60 lít ñể ương Sau 3 tuần tuổi ñếm số cá còn sống ñể xác ñịnh tỷ lệ sống
3.5 Xác ñịnh thể ña bội
Sử dụng phương pháp ño kích thước nhân tế bào hồng cầu Tế bào hồng cầu ở cá sốc lạnh với cá bình thường ñều ñược ño chiều dài và chiều rộng của nhân tế bào, sau ñó tính thể tích của nhân tế bào hồng cầu
Tỷ lệ dị hình (%)
=
Số cá dị hình
Số cá bột nở x100
Trang 32Mỗi lô thí nghiệm bắt 15 con, mỗi con ño kích thước 5 nhân tế bào Ở lô ñối chứng bắt 10 con
Theo Stanley và Alen, Beck và Bigger, (1983) thể tích của nhân tế bào hồng cầu (V) ñược thừa nhận bằng: V = 4*¶ab2/3
Trong ñó: a: Nửa trục chính, b: Nửa trục phụ
So sánh nhân tế bào hồng cầu của cá ñược sốc lạnh và cá ñối chứng, xác ñịnh thể ña bội bằng cách tính tỷ lệ thể tích nhân tế bào hồng cầu của cá thí nghiệm với cá bình thường
Hình 3 1 Lấy mẫu máu trên cá tra Hình 3 2 ðo kích thước nhân tế hồng cầu
3.6 Phương pháp chăm sóc và quản lý cá ñể xác ñịnh tỷ lệ ña bội
Trang 33Hình 3 3 Nâng nhiệt trứng sau khi sốc Hình 3 4 Ấp trứng trong lồng vải
3.6.2 Ương cá bột lên hương
Sau khi ấp từ 24h ựến 26h, tùy theo nhiệt ựộ sốc và khoảng thời gian gây sốc trứng ựã nở thành cá bột hết, thường thì trứng ở các lô thắ nhiệm nở chậm hơn trứng ấp bình thường 1- 2 giờ
Sau khi trứng nở khoảng 24 giờ thì chuyển cá bột vào thùng nhựa 60 lắt
ựể ương, ựếm số cá bột thả ban ựầu là 250 con/thùng nhựa Trong 2 ngày ựầu cho ăn ngày 3 - 4 lần bằng artemia, sau ựó cho ăn kết hợp artemia và moina, sau
4 ngày cho ăn moina ngày 2 lần
3.6.3 Ương từ hương ựến khi xác ựịnh ựa bội thể
Sau khi cá nở ựược 3 tuần tuổi, chuyển cá hương ra Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, đình Bảng Ờ Từ Sơn Ờ Bắc Ninh ương tiếp trong giai ựể xác ựịnh ựa bội Cá ựược cho ăn bằng thức ăn viên nổi, ngày cho ăn 2 lần
Khi cá ựạt trọng lượng > 15g thu mẫu lấy máu ở cuống ựuôi lên lam kắnh, nhuộm mẫu và ựo kắch thước nhân tế bào hồng cầu
3.7 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu ựược xử lý và phân tắch thống kê bằng phần mềm Excell trên máy tắnh, các chỉ tiêu so sánh ựược mã hóa bằng hàm acrsin và so sánh LSD ở mức ý nghĩa α = 0,05
Trang 34PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.1 Kết quả nghiên cứu tìm hiểu thời ñiểm gây sốc
4.1.1 Theo dõi các quá trình phát triển của phôi cá tra
Qua tham khảo một số tác giả gây sốc lạnh ở một số loài cá như: cá da
trơn nam mỹ (Rhamdia quelen) thời ñiểm sốc 3 phút sau khi thụ tinh ñạt 97,7% tam bội Cá trê vàng (Clarias macrocephalus) thời ñiểm sốc sau thụ tinh 4,5 phút ñạt 88% thể tam bội Cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon idella) ñạt cao nhất khi sốc ở thời ñiểm 4 phút sau khi thụ tinh ñạt 100% thể tam bội, Ở loài Clarias
fuscus thời ñiểm gây sốc 3 phút sau khi thụ tinh, ở cá nheo mỹ thời ñiểm gây sốc sau thụ tinh là 5 phút ñạt 100% thể tam bội, cá chạch 6 phút sau thụ tinh
Những dẫn liệu trên chứng tỏ ñối với mỗi loài cá thời ñiểm gây sốc sẽ khác nhau và phụ thuộc vào thời gian của các quá trình phân bào giảm nhiễm lần thứ II của mỗi loài
Ở ñây chúng tôi chỉ tập trung tìm hiểu sự phát triển của phôi ở các giai ñoạn phôi sớm, ñến giai ñoạn 8 tế bào, ñể biết ñược thời gian qua mỗi lần phân cắt trong giới hạn nhiệt ñộ nhất ñịnh Bởi vì trên cá việc nghiên cứu tìm hiểu thời gian xuất hiện thể cực là rất khó nên tác giả chỉ có thể tìm hiểu khoảng thời gian xảy ra quá trình nguyên phân lần ñầu tiên tạo ra hợp tử (giai ñoạn 2 tế bào)
Trong thời gian thực hiện các thí nghiệm gây sốc nhiệt ñộ môi trường ấp trứng dao ñộng từ 29.5 – 30 0C sau 5 phút màng thụ tinh hình thành, 15 phút xuất hiện mũ phôi và sau 30 phút noãn bào bắt ñầu quá trình phân chia lần ñầu tiên tạo ra hai tế bào, khoảng 45 phút ở giai ñoạn 4 tế bào và khoảng 60 phút ở giai ñoạn 8 tế bào Có thể thấy thời gian qua mỗi lần phân cắt của phôi cá tra trong khoảng 15 phút/lần, phân chia lần ñầu vào khoảng 30 phút sau khi trứng ñược gieo tinh (Bảng 4.1) Trong nghiên cứu này chúng tôi bước ñầu thử nghiệm thăm dò sốc tại thời ñiểm 6 phút sau khi gieo tinh
Trang 35Kết quả theo dõi quá trình phát triển phôi sớm trên cá tra qua bảng 4-1
Bảng 4 1: Thời gian và các giai ñoạn phát triển của phôi
Thời gian Stt
Giờ Phút Dấu hiệu phát triển
Trứng ñã thụ tinh, màng noãn bào tách khỏi bề mặt trứng, xuất hiện xoang thụ
tinh và mũ tế bào chất
2 30 Xuất hiện 2 tế bào, ñường phân cắt thứ
nhất di theo kinh tuyến
Xuất hiện 4 tế bào, ñường phân cắt thứ
2 ñi theo kinh tuyến vuông góc với
ñường thứ nhất
Xuất hiện 8 tế bào, thêm 2 ñường phân cắt theo kinh tuyến vuông góc với ñường phân cắt thứ 2
Một số hình ảnh các giai ñoạn phát triển phôi sớm trên cá tra
Trang 36
4.2 Tỷ lệ thụ tinh ở các nhiệt ñộ và thời lượng sốc khác nhau
4.2.1 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 5 0
C
Biểu ñồ 4.2 1: Tỷ lệ thụ tinh sốc ở 5 0 C
Trang 37Tỷ lệ thụ tinh sau khi sốc lạnh ở 50C cao nhất sau thời lượng sốc 10 phút trung bình ñạt 73,67% và thấp nhất sau thời lượng 20 phút chỉ ñạt 50,67% và sốc trong vòng 15 phút ñạt 63,67%.Tại lô ñối chứng tỷ lệ thụ tinh ñạt 79%
4.2.2 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 7 0
C
Biểu ñồ 4.2 2: Tỷ lệ thụ tinh sốc ở 7 0 C
Ở nhiệt ñộ sốc 70C cũng có kết quả tương tự như khi sốc ở 50C ñạt cao nhất khi sốc trong khoảng thời gian 10 phút (69,67%) và thấp nhất trong khoảng 20 phút (55%) Tại lô ñối chứng tỷ lệ này là 87% (Biểu ñồ 4.2.2)
4.2.3 Tỷ lệ thụ tinh qua thời lượng sốc khác nhau ở 9 0
C
Biểu ñồ 4.2 3: Tỷ lệ thụ tinh khi sốc ở 9 0 C
