Luận văn nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học và bảo tồn tinh dịch chó berger

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết

quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược công bố trong bất kỳ công

trình nào

Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Lê Thị Huệ

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận ñược sự hướng dẫn trực tiếp của Thầy hướng dẫn: TS ðỗ Văn Thu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới sự chỉ bảo tận tình của Thầy

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tơi toàn bộ các thầy cô thuộc khoa Thú y – Trường ðHNN Hà Nội, những người trực tiép truyền dạy cho tôi những kiến thức cơ bản, bổ ích trong suốt quả trình tôi học tập tại khoa

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32)- Bộ Công an

Xin chân thành cảm ơn gia ñình và bạn bè, ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm

2.1 Tình hình phát triển và sử dụng chó nghiệp vụ ở Việt Nam 4

2.3 Một số ñặc ñiểm sinh học tinh dịch chó Berger 7 2.4 Môi trường pha loãng và ñông lạnh tinh dịch chó 16 2.5 Sơ lược về quá trình giao phối và phóng tinh 23

3 ðối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 25 3.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25

3.2.1 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch và các yếu tố ảnh

hưởng lên phẩm chất tinh dịch

25

3.2.2 Pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó ở 50C 26

4.1 Sinh häc tinh dÞch chã vµ c¸c yÕu tè ¶nh h−ëng 46

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Berger 46

Bảng 3 Ảnh h−ëng cña mïa vô lªn chÊt l−îng tinh dÞch 54 Bảng 4 Ảnh h−ëng cña chu kú khai th¸c lªn phÈm chÊt tinh dÞch 56

Bảng 5 Ảnh hưởng của môi trường pha loãng lên phẩm chất tinh

dịch trong quá trình bảo tồn

58 Bảng 6 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ bảo tồn lên phẩm chất tinh dịch 60

Bảng 7 Ảnh hưởng của tỷ lệ lòng ñỏ trứng gà trong môi trường lên

Bảng 14 Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh ñông lạnh 77

1 MỞ ðẦU 1.1 ðẶT VẤN ðỀ

Từ lâu chó là ñộng vật gần gũi, thân thiện với con người và ñược con người nuôi dưỡng thuần hóa, là con vật thông minh hiểu ý và trung thành với chủ Ngoài ra chó còn có những khả năng ñặc biệt mà các loài vật khác không có: mắt có khả năng nhìn xuyên trong bóng tối, mũi có khả năng phân biệt

19000 mùi khác nhau Chính vì thế mà ngày nay một số giống chó ñã ñược huấn luyện, biệt hóa ñể trở thành chó nghiệp vụ phục vụ trong công tác an ninh, quốc phòng

Năm 1960 chúng ta ñã xây dựng ñàn chó nghiệp vụ từ các nguồn giống nhập và lai tạo Hiện nay có 5 giống chó ngoại (chó Berger, Cocker, Rottweiler, Bốc sơ và Labrador) ñược sử dụng vào công tác nghiệp vụ của ngành Công an và Quân ñội Hai giống chó ñang ñược sử dụng nhiều và có khả năng nhất là chó Berger Việt Nam và chó Cocker (Tây Ban Nha)

Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (ñược nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC ðức (nhập

từ những năm 1970, 1980) ðây là hai giống chó chủ lực, ñược huấn luyện trang bị cho các ñơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của Công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các ñồn biên phòng Giống chó này hiện tại ở nước ta có hàng mấy nghìn con ñược nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ của Bộ Công an và trường D24 Bộ ñội biên phòng Tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ có một ñàn chó tương ñối thuần, nhưng số lượng rất ít Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và ñược nuôi dưỡng dùng trong việc bảo vệ và làm kinh tế, nhưng lai tạp khá nhiều và không ñược chọn lọc do việc nhân giống tự phát Chó Cocker (Tây Ban Nha) ñược nhập từ Liên Xô, Cu-ba trong những năm 1980, thường sử dụng vào mục ñích huấn luyện ñể phát hiện hơi ñặc ñịnh (ma tuý và chất nổ)

ðây là giống chó dễ nuôi, tính thích nghi cao, dễ phát triển Cũng như giống chó Berger,

do việc nhân giống tự phát, cho nên ñàn chó Cocker ñang có nguy cơ bị thoái hoá và tạp pha Tuy ñàn chó Berger và Cocker có số lượng lớn, nhưng

do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, do ñó ñã làm mất ñi những ñặc ñiểm, khả năng vốn có của giống chó nghiệp vụ

Mặc dù chó nghiệp vụ có vai trò lớn trong việc giữ gìn an ninh, quốc phòng nhưng do số lượng còn ít vì ña số các giống chó nghiệp vụ ñều nhập giống từ nước ngoài và giá thành nhập nội từ 5000USD - 8000USD

Ở Việt Nam, hiện nay mạng lưới thụ tinh nhân tạo bằng tinh pha loãng

bò, lợn, trâu, ngựa,… ñã phổ biến trên toàn quốc, ngoài ra chúng ta ñã xây dựng ñược ngân hàng tinh ñông lạnh phục vụ cho công tác thụ tinh nhân tạo

và lưu giữ gen quí

Bởi vậy, việc nghiên cứu ñể nhân giống chó nghiệp vụ là một việc cần thiết và cấp bách Vấn ñề ñặt ra là cần có những biện pháp cụ thể ñể nhân giống, lai tạo giống chó

Thụ tinh nhân tạo là phương pháp tối ưu ñể sử dụng có hiệu quả ñực giống tốt, có khả năng di truyền cao, nhằm cải tạo giống, giảm số lượng ñực giống, cùng với công nghệ gen di truyền, thụ tinh nhân tạo ñã ñưa ñược công nghệ sinh sản ñạt ñến ñỉnh cao

Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học tinh dịch là cơ sở khoa học ñể ñánh giá chất lượng tinh dịch, từ ñó giúp xác ñịnh pha loãng bảo tồn tinh ñạt chất lượng cao Chỉ khi nào tinh dịch có chất lượng tốt mới ñưa vào pha loãng bảo tồn và ñông lạnh Nếu biết ñược lượng tinh dịch, nồng ñộ, hoạt lực, sức sống, kỳ hình, kỳ hình acrosome của tinh dịch thì có thể xác ñịnh ñược tỷ lệ pha loãng thích hợp

Hiện nay, ở nước ta việc thụ tinh nhân tạo và ñông lạnh tinh dịch chó

còn là vấn ñề mới và ít ñược quan tâm, kể cả các Trung tâm Huấn luyện chó

nghiệp vụ vẫn sử dụng hình thức phối tự nhiên, trong khi ñó thì thế giới ñã có

từ lâu

ðể tạo ra ñược chó nghiệp vụ có phẩm giống tốt, ñồng thời lưu giữ

bảo tồn ñược quỹ gen quí của các giống chó nghiệp vụ chúng tôi tiến hành

thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học và bảo tồn tinh

2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN VÀ SỬ DỤNG CHÓ NGHIỆP VỤ Ở VIỆT NAM

Năm 1960 chúng ta ñã xây dựng ñàn chó nghiệp vụ từ các nguồn giống nhập và lai tạo Hiện nay, chúng ta có 5 giống chó ngoại ñược sử dụng vào công tác nghiệp vụ của ngành Công an và Quân ñội (chó Berger, Cocker, Rottweiler, Bốc sơ và Labrador) Hai giống chó ñang ñược sử dụng nhiều và

có khả năng nhất là chó Berger Việt Nam và chó Cocker (Tây Ban Nha) Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (ñược nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC ðức (nhập từ những năm 1970, 1980) ðây là hai giống chó chủ lực, ñược huấn luyện trang

bị cho các ñơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các ñồn biên phòng, cửa khẩu của lực lượng Bộ ñội biên phòng Giống chó này hiện tại ở nước ta có tới hàng mấy nghìn con ñược nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ của Bộ Công an, trường D24 Bộ ñội biên phòng Ngay từ những năm ñầu chúng ta ñã tiến hành giữ giống thuần, lai tạo cho sinh sản và phát triển Cho tới nay, chúng ñã có ngoại hình, thể chất và năng lực làm việc không kém so với giống gốc ban ñầu, chúng ñã thích nghi tốt trong ñiều kiện khí hậu, nuôi dưỡng ở nước ta và ñã có những thành tích xuất sắc trong phục vụ chiến dấu Tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ có một ñàn chó tương ñối thuần, nhưng số lượng rất ít Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và ñược nuôi dưỡng dùng trong việc bảo vệ và làm kinh tế, nhưng lai tạp khá nhiều và không ñược chọn lọc do việc nhân giống tự phát Chó Cocker (Tây Ban Nha) ñược nhập từ Liên Xô, Cu-ba trong những năm 1980, thường sử dụng vào mục ñích huấn luyện ñể phát hiện hơi ñặc ñịnh (ma tuý và chất nổ) ðây là giống chó dễ nuôi, tính thích nghi cao, dễ phát triển Cũng như giống chó Berger, do việc nhân giống tự phát, cho nên ñàn chó Cocker ñang có nguy cơ

bị thoái hoá và tạp pha Tuy ñàn chó Berger và Cocker có số lượng lớn,

nhưng do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng

tự phát, do ñó ñã làm mất ñi những ñặc ñiểm, khả năng vốn có của giống chó nghiệp vụ

Chó nghiệp vụ hiện ñang sử dụng tại Bộ Công an, không có nguồn gốc từ Việt Nam mà ñược nhập từ Nga, ðức, Cuba và Trung Quốc (với giá 5000 -

8000 USD/con) Các giống chó này ñang ñược bảo tồn và phát triển tại Việt Nam, ñã và ñang ñược sử dụng trong các lĩnh vực bảo vệ, truy tìm dấu vết hơi, phát hiện ma tuý Hàng năm chúng thực hiện trên 10.000 nhiệm vụ khác nhau Hiện nay, chúng ta ñã sử dụng chó nghiệp ñể vụ kiểm tra, phát hiện chất ma tuý tại cửa khẩu Tân Sơn Nhất (Quang Khải, 2004) Tuy chó nghiệp

vụ có vai trò rất lớn trong công tác an ninh, quốc phòng, truy tìm ma túy, nhưng vì số lượng chó còn ít nên chỉ ñáp ứng ñược cho cấp tỉnh và thành phố

Bộ Công an ñã có kế hoạch trang bị chó nghiệp vụ tới cấp huyện nhưng khó khăn hiện nay là sự khan hiếm về con giống

Sử dụng chó nghiệp vụ là một biện pháp công tác quan trọng của công tác bảo vệ an ninh trật tự và luôn ñược thể hiện trong các chỉ ñạo của ngành Công

an xuyên suốt lịch sử công tác, chiến ñấu của ngành Cụ thể: chỉ thị số

312/CT- BNV ngày 18/6/1982 về việc tăng cường hiệu quả công tác nuôi dạy

và sử dụng chó nghiệp vụ; Chỉ thị số 13/CT- BNV ban hành kèm theo quyết ñịnh số 178/Qð- BNV ngày 29/9/1992 về việc tăng cường hiệu quả công tác huấn luyện, sử dụng chó nghiệp vụ trong lực lượng Công an nhân dân; và gần ñây là chỉ thị số 09/CT- BCA(C12) ban hành kèm theo quyết ñịnh số 564/Qð- BCA (C12) của Bộ trưởng Bộ Công an ngày 16/6/2004 về tăng cường hiệu quả công tác quản lý, sử dụng chó nghiệp vụ trong lực lượng Công an nhân dân Trong ñó ñặc biệt nhấn mạnh các nội dung:

- Xác ñịnh chó nghiệp vụ là một công cụ hỗ trợ quan trọng trong công tác ñấu tranh ngăn chặn và phòng chống tội phạm của lực lượng Công an nhân dân

- Quản lý sử dụng chó nghiêp vụ là một nhiệm vụ của công tác Công an

- ðịnh hướng phát triển ñến năm 2010: phải ñảm bảo Công an các tỉnh, thành phố trực thuộc trung ương, các ñơn vị của Bộ, các trại giam ñều ñược trang bị chó nghiệp vụ

Thời gian vừa qua, có một số công ty của nước ngoài (Cộng hoà Pháp, Cộng hoà Liên Bang ðức, Liên bang Nga) khi thăm Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ ñã ñạt vấn ñề bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo cho chó nghiệp vụ, nhưng vẫn chưa thực hiện ñược Vì vậy việc nghiên cứu bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo ñối với chó nghiệp vụ là việc làm cần thiết Với vai trò quan trọng của chó nghiệp vụ, các nhà khoa học trên thế giới ñã quan tâm ñến nhiều lĩnh vực như chăm sóc, nuôi dưỡng, huấn luyện và ñặc biệt là công tác giống và bảo tồn nguồn gen các giống chó quý Trong thời gian vừa qua, Viện Công nghệ Sinh học ñã ñược giao nhiệm vụ thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó nghiệp

vụ của ngành Công an” Kết quả của ñề tài ñã bảo tồn ñược tinh dịch ở dạng pha loãng và ñông lạnh, thành công trong thụ tinh nhân tạo chó góp phần phát triển ñàn chó có chất lượng cao phục vụ cho công tác an ninh và Quốc phòng

2.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

Hiện nay trên thế giới có hơn 400 giống chó khác nhau (Youko, 1999), tuy nhiên quân ñội và công an các nước chỉ sử dụng một số giống chó nhất ñịnh cho công tác huấn luyện ñể sử dụng làm chó nghiệp vụ cho các công tác ñặc thù như: xác ñịnh nguồn hơi cá nhân (mùi người), công tác bảo vệ (dùng chó

ñể tấn công), xác ñịnh hơi (tìm ma tuý, thuốc nổ, ), công tác truy tìm, cứu

hộ Một số nước như Trung Quốc, Nga, ðức, Canada ñã trang bị chó nghiệp

vụ đến cấp huyện (Nghiêm Xuân Dũng, 2003) Năm 1991, do lo ngại các tổ chức khủng bố tấn cơng vào các cơ sở của mình khi xẩy ra cuộc chiến tại Vùng Vịnh, cơ quan tình báo Trung ương Mỹ (CIA) quyết định thành lập lực lượng chĩ nghiệp vụ cĩ số mã hiệu K-9 Các con chĩ này được huấn luyện để phát hiện chất nổ (chĩ biết cách ngửi, phân loại và phát hiện đến 19.000 mùi chất nổ) Mũi chĩ cĩ thể nhậy cảm gấp ngàn lần so với mũi con người, chính nhờ khả năng đặc biệt này mà chĩ nghiệp vụ cĩ thể hồn thành tốt nhiệm vụ phát hiện chất nổ Bên cạnh việc canh gác và bảo vệ các cơ sở chính của CIA, trong trường hợp cần thiết, K-9 cịn thực hiện nhiệm vụ cùng với các lực lượng bảo vệ pháp luật khác trên lãnh thổ nước Mỹ như cơ quan bài trừ ma tuý, lực lượng đặc nhiệm chống khủng bố Liên bang, lực lượng cảnh sát kiểm tra giao thơng đường bộ (theo Excelsior, 2003) Gần đây các nhà khoa học Nhật Bản đã phát hiện thấy chĩ cĩ khả năng dự báo động đất Người ta nhận thấy trước khi xảy ra động đất khoảng một tháng thì chĩ sống trong vùng động đất và vùng xung quanh sủa rất nhiều Trong chiến tranh thế giới lần thứ hai, Hồng Quân Liên Xơ đã thành lập sư đồn quân khuyển để tấn cơng xe tăng của bọn phát xít ðức trong điều kiện con người khơng thể làm được, kết quả đã tiêu diệt được trên 300 xe tăng của địch

2.3 MỘT SỐ ðẶC ðIỂM SINH HỌC TINH DỊCH CHĨ BERGER

Tinh dịch gồm 2 phần: tinh trùng chiếm 3 - 5% và tinh thanh chiếm 95 -

Dịch tiết của mỗi tuyến cĩ chức năng và thành phần hố học khác nhau:

Dịch tiết của tuyến củ hành trong suốt, pH trung tính, có tác dụng chủ yếu

ñể bôi trơn niệu ñạo trước khi phóng tinh

Tuyến tinh nang tiết ra dịch tiết màu trắng có chứa enzym Vegikilasa, tạo thành các búi lớn hơn gọi là keo phèn có tác dụng nút cổ tử cung trong quá trình giao phối trực tiếp Nhưng trong thụ tinh nhân tạo, ta phải loại bỏ keo phèn càng nhanh càng tốt vì nó làm cho tinh trùng bị kết dính Ngoài ra, còn

có ñường (fructose, sorbitol), axit béo, một số enzym khác giúp quá trình ôxi hoá cung cấp năng lượng, dinh dưỡng cho tinh trùng Trong dịch tiết này còn

có cả ñệm phosphate và carbonate là hợp chất quan trọng vì chúng giữ pH tinh dịch ñược ổn ñịnh

Tuyến tiền liệt tiết ra dịch tiết có tác dụng trung hoà ñộ axit có trong cơ quan sinh dục, niệu ñạo con cái khi ñộng dục, và H2CO3 do quá trình trao ñổi chất của tinh trùng tạo ra khi vào cơ quan sinh dục con cái Dịch tiết của tuyến gồm nhiều protein trung tính không trong suốt

2.3.1 Hình thái tinh trùng

Tinh trùng của ñộng vật có hình thái khác nhau ñặc trưng và ổn ñịnh theo loài, có nghĩa là mỗi loài gia súc, tinh trùng của chúng khác nhau Hình thái của tinh trùng chó có hình con nòng nọc, gồm 3 phần: ñầu, cổ và ñuôi Phần ñuôi ñược chia làm 3 phần nhỏ: trung ñoạn, ñuôi chính và ñuôi phụ

Theo Trần Tiến Dũng và cộng sự (2002) [2] kích thước của các phần như sau: ðầu dài: 6,5µ; rộng: 4µ; dày: 1,5µ; cổ thân dài: 10µ; ñuôi: 40-50µ; dài tổng số là: 55-65µ

Phần ñầu ñược tạo thành chủ yếu do nhân tế bào ðầu dẹt, có hình quả trứng, chứa AND liên kết với protein, ñược bao bọc bởi lớp màng, ñỉnh ñầu

có xoang acrosom, bên trong xoang chứa nhiều enzym: Hyaluroridaza, acrosin, proteaza, axit phosphataza, có tác dụng phá vỡ màng phóng xạ trong quá trình thụ tinh Xoang này rất dễ bị bong ra do nhiệt ñộ, áp suất,

pH, Nhân chiếm 76,7 Ờ 80,3% (về thể tắch) phần ựầu, nhân là kho duy nhất chứa mật mã di truyền của ựời trước

Cổ là phần ựể nối lỏng lẻo với phần ựầu, ựiều này phù hợp với mục ựắch nhất ựịnh trong quá trình thụ tinh khi xâm nhập vào trứng thì cổ gãy và ựuôi rời ra Nhưng vì thế mà cổ tinh trùng dễ bị ựứt bởi tác ựộng cơ giới, nhiệt ựộ, hóa chất, dẫn ựến giảm tỷ lệ thụ tinh hoặc tinh trùng không còn khả năng thụ tinh Phần ựuôi ựược bao bọc bởi màng chung của tinh trùng đoạn ựuôi ựược tạo bởi những sợi (dây) ở chắnh giữa có 2 sợi, xung quanh có 9 sợi fibrin nhỏ, xếp theo những vòng tròn ựồng tâm, ở phần trên xếp mau hơn, to hơn và chúng ựược duỗi ra ở phần ựuôi thành chùm tơ ựuôi Chùm tơ ựuôi không

có màng bao bọc, chúng ựược hoạt ựộng tự do như mái chèo giúp tinh trùng hoạt ựộng

2.3.2 Thể tắch tinh dịch

Lượng tinh dịch là số ml hỗn hợp tinh trùng và tinh thanh do tuyến sinh dục phụ tiết ra trong 1 lần lấy tinh (ml/lần) theo Trần Tiến Dũng và cộng sự

2002 [2]

Theo Salisbury (1987) ( Dẫn từ đỗ Văn Thu (2001) [4] ) lượng tinh dịch

là chỉ tiêu kiểm tra ựánh giá chất lượng tinh trùng trong thụ tinh Theo Dương đình Long (1996) [3] lượng tinh dịch là chỉ tiêu về số lượng nhưng có ý nghĩa rất quan trọng về mặt sinh học, kỹ thuật và kinh tế Lượng tinh dịch có liên quan tới khả năng thụ thai vì nó có liên quan ựến số lượng và chất lượng tinh trùng

Lượng tinh dịch còn phụ thuộc vào tuổi, với chó nghiệp vụ, những chó khoảng 1-3 năm tuổi thì lượng tinh thu ựược cao hơn so với những con chưa thành thục về tắnh hay những con già yếu

Theo Corteel (1977) ( Dẫn từ đỗ Văn Thu (2001) [5] ) cho rằng lượng tinh dịch xuất ra còn chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh Lấy tinh bằng kắch

thích xung ñiện cho lượng tinh nhiều hơn lấy tinh bằng âm ñạo giả Lượng tinh nhiều hay ít còn phụ thuộc vào tính dục con ñực và dụng cụ lấy tinh như: nhiệt

ñộ, áp lực,

Mùa vụ thời tiết ảnh hưởng ñến lượng tinh dịch của ñực giống, nó thể hiện quan hệ giữa ngoại cảnh và cơ năng tuyến sinh dục vì ảnh hưởng ñến hàm lượng của nội tiết tố Vào mùa sinh sản, lượng tinh dịch của chó cao hơn mùa không sinh sản (theo Chemineau (1991) [9]; EvansG (1987) [10]) ðiều này có thể giải thích là do trong mùa sinh sản lượng Testosteron tăng kích thích các tuyến sinh dục phụ tiết tinh thanh Ngoài ra, lượng tinh dịch còn chịu ảnh hưởng của chế ñộ quản lý, nuôi dưỡng,

Hoạt lực tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nội, ngoại cảnh như: nhiệt

ñộ, môi trường, ñộ ẩm môi trường, giống, lứa tuổi, Nhiệt ñộ môi trường thích hợp ñể tinh trùng vận ñộng là 35 - 370C Nếu nhiệt ñộ cao thì làm cho tinh trùng

bị chết, nhiệt ñộ thấp thì hoạt lực của tinh trùng giảm thậm chí là ngừng hoạt ñộng, ñây là cơ sở ñể bảo tồn và ñông lạnh tinh dịch chó

Theo Chemineau and Caynie (1991) [9]; Evans (1987) [10], ở ñộng vật hoạt ñộng sinh sản diễn ra theo mùa, vì vậy vào mùa sinh sản hoạt lực của

tinh trùng cao hơn hẳn so với hoạt lực tinh trùng của mùa không phải là mùa sinh sản

2.3.4 Nồng ựộ tinh trùng

Nồng ựộ tinh trùng là chỉ tiêu ựánh giá chất lượng và số lượng của tinh dịch Salisbury (1987) (Dẫn từ đỗ Văn Thu (2001) [4]) cho rằng nồng ựộ tinh trùng là chỉ tiêu quan trọng trong thực tiễn TTNT, nó liên quan mật thiết với

tỷ lệ thụ thai và số con ựẻ ra Nồng ựộ tinh trùng liên quan mật thiết và thường tỷ lệ thuận với hoạt lực tiến thẳng và hoạt tắnh của enzym dehydrogenase

Hazop (1945) (Dẫn từ đỗ Văn Thu (2001 [5]) cho rằng nồng ựộ và sức kháng của tinh trùng là những chỉ tiêu có ý nghĩa cho khả năng thụ tinh của tinh trùng, vì vậy ựể có ựược tinh dịch thắch hợp cần phải lưu ý tới hai chỉ tiêu này Theo Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc đạt (1997) [1] chứng minh rằng nồng ựộ là tham số cần thiết giúp ta quyết ựịnh tỷ lệ pha loãng tinh nguyên với môi trường bảo tồn và ựịnh liều phối thụ tinh nhân tạo Nồng ựộ tinh trùng trong tinh pha loãng có ảnh hưởng ựến kết quả bảo tồn tinh dịch

Corteelz (1977) (Dẫn từ đỗ Văn Thu (2001 [5]); Dương đình Long (1996) [3] cho rằng lượng tinh dịch tỷ lệ nghịch với nồng ựộ tinh trùng Nghĩa

là lượng tinh dịch lớn thì nồng ựộ tinh trùng giảm Nồng ựộ tinh trùng là chỉ tiêu về sức sản xuất sinh học nên phụ thuộc vào nhiều yếu tố

Nồng ựộ tinh trùng cao hay thấp phụ thuộc vào khoảng cách lấy tinh, Chemineau và caynie (1991) [9] nhận thấy khoảng cách giữa hai lần lấy tinh

là một ngày cho nồng ựộ tinh trùng (180 triệu/ml) thấp hơn so với khoảng cách là trên hai ngày (220 triệu/ ml) Theo đỗ Văn Thu thì nồng ựộ tinh trùng của chó nghiệp vụ chịu ảnh hưởng của phương pháp lấy tinh, tần số phối giống và chế ựộ chăm sóc nuôi dưỡng, , sự thay ựổi mùa vụ lấy tinh có ảnh hưởng ựến nồng ựộ tinh trùng Trong mùa sinh sản, nồng ựộ tinh trùng loãng,

không phải mùa sinh sản thì nồng ñộ tinh trùng cao

Khi nghiên cứu về nồng ñộ tinh trùng Corteel (1977) (Dẫn từ ðỗ Văn Thu (2001 [5]) cho rằng các giống khác nhau cho nồng ñộ tinh trùng khác nhau và trong cùng một giống, cùng một lứa tuổi nhưng cá thể khác nhau cho nồng ñộ tinh trùng khác nhau Ngoài ra, nhiệt ñộ, ñộ ẩm, lứa tuổi, ñều ảnh hưởng tới nồng ñộ tinh trùng

2.3.5 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh

Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh là chỉ tiêu quan trọng ñể ñánh giá chất lượng ñực giống

Theo Corteel (1977) (Dẫn từ ðỗ Văn Thu (2001 [5]) thì V.A.C thay ñổi theo mùa vụ lấy tinh, ở mùa sinh sản thì V.A.C cao hơn mùa không sinh sản Ngoài ra, giống khác nhau cho V.A.C khác nhau Tình trạng sức khoẻ, tuổi con vật cũng ảnh hưởng ñến chỉ số V.A.C

Một ñực giống tốt nếu như chỉ số V.A.C cao Shamsuddin (1997) (Dẫn

từ ðỗ Văn Thu (2001) [4] ) cho rằng tổng số tinh trùng trong mỗi lần lấy tinh khác nhau nhiều giữa lần lấy tinh thứ nhất so với lần lấy tinh thứ hai, nếu khoảng cách giữa hai lần lấy tinh là 20 phút Khoảng cách hai lần lấy tinh là một ngày cho chỉ tiêu V.A.C thấp hơn khoảng cách lấy tinh là hai ngày trở lên Lấy tinh bốn lần trong một tuần sẽ làm giảm V.A.C, lấy tinh hai lần trong một tuần là hợp lý

2.3.6 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thường so với tinh trùng bình thường Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là chỉ tiêu ñánh giá chất lượng tinh dịch và là chỉ tiêu có tính ñịnh lượng Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao thì chất lượng tinh dịch kém Tinh trùng kỳ hình có ảnh hưởng xấu ñến khả năng thụ thai Chỉ những tinh trùng khoẻ mạnh có hình dạng bình thường mới tham gia vào quá trình thụ tinh Tinh trùng kỳ hình không tham gia vào quá

trình thụ tinh, vì nó liên quan ựến khả năng phá màng phóng xạ của tế bào trứng

Tinh dịch có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình dưới 20% mới sử dụng trong TTNT hay sử dụng ựực giống trong giao phối tự nhiên Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình cao trong mỗi lần phóng tinh là triệu chứng có liên quan ựến sự rối loạn trong quá trình sinh tinh, trạng thái sức khoẻ của ựực giống hay có thể do kỹ thuật lấy tinh chưa phù hợp nên việc nghiên cứu hình thái tinh trùng kỳ hình ựược áp dụng rộng rãi trong việc chuẩn ựoán hiện tượng mất khả năng sinh sản của ựực giống, cũng như việc áp dụng kỹ thuật khai thác tinh cho phù hợp

Ngay cả với con ựực khoẻ mạnh, sức sinh sản bình thường thì trong tinh dịch vẫn có tinh trùng kỳ hình Bằng phương pháp nghiên cứu so sánh tinh hoàn và tinh dịch của những cá thể chó khác nhau Theo Lagerlof (1939), những thay ựổi sinh lý trong biểu mô tạo tinh trùng phát triển không hoàn hảo

sẽ làm cho tinh trùng phát triển không bình thường

Milovanov (1962) (Dẫn theo Dương đình Long (1996) [3], có hai loại

Một số tác giả ựưa ra giả thiết tinh trùng kỳ hình xuất hiện do rối loạn gián phân trong biểu mô Theo Chemineau và Caynie (1991) [9] tinh trùng kỳ hình có các dạng sau:

- Tinh trùng không bình thường ở phần ựầu như: 2 ựầu, ựầu nhỏ, ựầu to,

2.3.7 Tỷ lệ kỳ hình acrosome

Trong màng, trên cùng của ñầu tinh trùng là hệ thống acrosome Phần trước của ñầu ñược bao phủ một mũ mỏng, tức bao ñầu (Galea capitis) Dưới lớp này có thể ngọn Có thể nhìn thấy thể ngọn qua kính hiển vi ñiện tử Trong bao ñầu tập trung enzym Hyaluronidaza, nhưng ý nghĩa sinh lý của bao ñầu và thể ngọn hoàn toàn chưa ñược rõ Ngày nay người ta cho rằng sự vẹn toàn của chúng giữ vai trò quan trọng như là chỉ số xác suất về khả năng thụ tinh của tinh trùng

Số phận của bao ñầu khi tinh trùng xâm nhập vào ñường sinh dục con cái vẫn còn chưa rõ Enzym Hyaluronidaza giúp tinh trùng chui qua màng phóng xạ của trứng Màng Mucopolysacarit của tế bào trứng bị hòa tan

Khi bảo tồn, hệ thống acrosome dễ bị trương phồng lên, dời khỏi ñầu tinh trùng và làm mất khả năng thụ tinh, nhất là trong môi trường nhược trương

Mặt khác, men Hyaluronidaza lại rất dễ bị thấm suất ra ngoài ðây cũng

là vấn ñề cần nghiên cứu và quan tâm trong quá trình pha chế, bảo tồn và sử dụng tinh dịch nhằm nâng cao tỷ lệ thụ tinh

2.3.8 Tỷ lệ tinh trùng sống

Chỉ tiêu này liên quan chặt chẽ ñến tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng Mào tinh

là nơi cuối cùng của quá trình sinh tinh, là nơi dự trữ tinh trùng Ở ñây, tinh trùng ở trạng thái không hoạt ñộng nên hai tháng vẫn có khả năng thụ tinh, nếu quá thời gian này tinh trùng sẽ bị chết và ñược hấp thụ Khi tác nhân nào

ñó tác ñộng bất lợi ñến quá trình sinh tinh, tình trạng sức khoẻ của ñực giống thì tỷ lệ tinh trùng sống sẽ giảm Tỷ lệ sống của tinh trùng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chế ñộ dinh dưỡng, chế ñộ lấy tinh,

2.3.9 ðặc ñiểm lý - hoá học của tinh dịch

Áp lực thẩm thấu (posm) của tinh dịch giữ vai trò quan trọng với tinh trùng Áp lực thẩm thấu cao hay thấp sẽ ảnh hưởng tới sức sống của tinh trùng Mỗi loài khác nhau thì áp lực thẩm thấu của tinh dịch khác nhau Nếu

áp lực thẩm thấu thấp có thể thấy nhiều tinh trùng kỳ hình ở ñuôi

Năng lực ñệm (β) của tinh dịch, thể hiện khả năng duy trì ñộ pH của tinh dịch Tinh dịch của mỗi loài, cá thể có ñộ pH khác nhau, năng lực ñệm của tinh dịch có liên quan mật thiết tới thành phần các chất trong tinh dịch

ðộ nhớt (η) của tinh dịch có khác nhau tùy thuộc vào nồng ñộ tinh trùng và thành phần tinh thanh ðộ nhớt của tinh dịch và ñộ nhớt của môi trường pha loãng có ảnh hưởng tới khả năng vận ñộng của tinh trùng Khi

ñộ nhớt cao sức căng mặt ngoài lớn tác ñộng lên tinh trùng làm tăng lực ma

sát cản trở tinh trùng vận ựộng

Tỷ trọng của tinh dịch (d) là một yếu tố quan trọng, dựa trên cơ sở của

pH, ựặc ựiểm sinh học của tinh dịch và một số chỉ tiêu khác chúng ta có thể tạo ựược môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch thắch hợp

độ pH tinh dịch là tổng pH của các dịch tiết các tuyến sinh dục phụ Nếu

ựộ pH vượt quá mức, chứng tỏ chức năng của những cơ quan này bất thường hoặc có lẫn những vật lạ như nước tiểu Theo Mekenzi, Miller và Baugues (1932) (Dẫn từ Dương đình Long (1996) [3] ) pH của tinh dịch phụ thuộc vào nồng ựộ ion H+ có trong tinh dịch, nồng ựộ ion H+ cao thì pH thấp, môi trường có tắnh toan độ pH của tinh dịch có tương quan nghịch với nồng ựộ tinh trùng, nồng ựộ tinh trùng cao hay thấp ựều làm thay ựổi pH của tinh dịch

độ pH của tinh dịch có vai trò quan trọng ựối với sức sống của tinh trùng Khi môi trường có tắnh kiềm thì sẽ kắch thắch tinh trùng vận ựộng, làm tăng chất thải của tinh trùng vào môi trường do quá trình trao ựổi chất tạo ra, ựồng thời tinh trùng vận ựộng mạnh thì năng lượng tiêu hao càng lớn, dẫn ựến tinh trùng chóng chết Trong môi trường axắt, sự vận ựộng của tinh trùng bị ức chế (Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc đại (1997) [1]; Sổ tay thụ tinh nhân tạo (1971) [6] ) Như vậy, phải pha loãng tinh dịch trong môi trường có pH toan yếu ựể ựảm bảo duy trì lâu dài sức sống của tinh trùng

2.4 MÔI TRƯỜNG PHA LOÃNG VÀ đÔNG LẠNH TINH DỊCH CHÓ

Môi trường pha loãng là môi trường tổng hợp các thành phần chất ựiện giải, không ựiện giải, chất bảo vệ, nhờ ựó các ựặc tắnh của chúng thường bổ sung cho nhau, giúp tinh trùng sống ựược tốt hơn trong quá trình bảo tồn đây

là vấn ựề có ý nghĩa to lớn về mặt sinh học, kỹ thuật cũng như hiệu quả kinh

tế Vì thế, thành phần các chất trong môi trường phải sẵn có, giá thành thấp và ựảm bảo tốt sức sống của tinh trùng

2.4.1 Cơ sở khoa học xây dựng môi trường pha loãng tinh dịch

Ivanov chỉ ra rằng: tinh thanh không tham gia vào quá trình thụ tinh

mà chức năng sinh học của tinh thanh là nuôi dưỡng, hoạt hoá tinh trùng

Từ ñó có thể thay tinh thanh bằng môi trường có các ñặc ñiểm giống tinh thanh “Có thể dùng tinh trùng ñã ñược pha loãng trong các dung dịch nhân tạo ñể dẫn tinh cho súc vật cái mà vẫn sinh ra ñời con bình thường” (Dẫn từ ðỗ Văn Thu (2001) [4]) Dùng môi trường ñể pha loãng tinh dịch không chỉ nhằm mục ñích thay thế tinh thanh, mà nó còn nhằm mục ñích tránh những hiện tượng xấu của tinh thanh tác ñộng ñến tinh trùng, do trong tinh thanh có những chất tiết từ các tuyến sinh dục phụ kích thích tinh trùng hoạt ñộng làm tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, thay ñổi tính chất màng bọc tinh trùng dẫn ñến màng bọc tinh trùng bị trương phồng lên ñồng thời làm mất ñiện tích trên bề mặt của màng, gây ra hiện tượng tụ dính Vì vậy, nghiên cứu môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch là rất cần thiết

Nguyên tắc cơ bản ñể xây dựng môi trường pha loãng - ñông lạnh tinh dịch

Căn cứ vào những nguyên tắc cơ bản của Milovanov thì môi trường pha loãng cần phải tuân thủ các nguyên tắc sau:

− Áp lực thẩm thấu (posm)

Áp lực thẩm thấu của môi trường phải tương ñương áp lực thẩm thấu của tinh dịch Áp lực thẩm thấu của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng ñộ hoà tan của các phân tử các ion trong ñó Muốn cho sức sống của tinh trùng ñược thuận lợi, ALTT của môi trường phải tương ñương với ALTT nội tại của tinh trùng

− pH của môi trường

Hoạt ñộng của tinh trùng luôn gắn liền với sự thay ñổi pH vì quá trình trao ñổi chất của tinh trùng luôn phụ thuộc vào hoạt tính của các enzym Các enzym này xúc tiến các phản ứng sinh học chỉ trong một giới hạn pH nhất ñịnh Mục ñích của môi trường pha loãng là duy trì sức sống của tinh trùng càng lâu càng tốt, do vậy pH của môi trường thường là môi trường toan yếu Trong môi trường toan yếu sẽ ức chế sự hoạt ñộng của các enzym dẫn ñến làm giảm quá trình trao ñổi chất của tinh trùng, hạn chế sự tiêu hao năng lượng dự trữ của tinh trùng, kéo dài thời gian sống của tinh trùng

− Năng lực ñệm của môi trường

Môi trường phải có năng lực ñệm nhất ñịnh ñể duy trì pH của tinh dịch luôn ổn ñịnh, khử một số chất ñộc ñối với tinh trùng do quá trình trao ñổi chất của tinh trùng tạo ra, ñảm bảo sức sống và quá trình trao ñổi chất của tinh trùng ñược thuận lợi

− Môi trường phải có tỷ lệ các chất ñiện giải và chất không ñiện giải

thích hợp

Chất ñiện giải là những chất cần thiết trong môi trường pha loãng ñể tạo ra môi trường có áp lực thẩm thấu tương ñương với áp lực thẩm thấu của tinh dịch, ổn ñịnh ñộ pH của môi trường Nhưng chính các chất ñiện giải này lại là tác nhân chính gây ra mất ñiện tích trên bề mặt của tinh trùng gây

ra hiện tượng tụ dính ðể ngăn ngừa tình trạng trên, môi trường pha loãng phải có chất không ñiện giải, thông thường tỷ lệ chất ñiện giải và chất không ñiện giải là 2/9

− Tỷ trọng môi trường

Môi trường pha loãng phải có tỷ trọng tương ñương với tỷ trọng của tinh dịch ñể tránh hiện tượng tinh trùng bị lực ñẩy acsimet làm nổi lên trên hoặc áp lực thuỷ tĩnh làm ảnh hưởng ñến hình thái của tinh trùng

− ðộ nhớt của môi trường

ðộ nhớt của môi trường phải tương ñương với ñộ nhớt của tinh dịch ñể tránh tình trạng sức căng mặt ngoài tác ñộng lên màng bọc tinh trùng và ma sát nội quá

2.4.2 Vai trò của các chất trong môi trường pha loãng bảo tồn tinh dịch

− Vai trò của ñường

ðường ñã ảnh hưởng thực sự ñến khả năng vận ñộng, sức sống, tính nguyên vẹn của acrosome trong suốt quá trình bảo quản lạnh Các disaccarid, ngoại trừ lactose, làm giảm tỷ lệ tinh trùng chết ñồng thời làm giảm tỷ lệ acrosome bị phá huỷ nhưng không cải thiện khả năng vận ñộng và khả năng sống sau bảo tồn Trong khi các monosaccarid, ñặc biệt là fructose và xylose

ñã cải thiện khả năng vận ñộng và tỷ lệ acrosome nguyên vẹn Trehalose, xylose và fructose làm tăng khả năng hoạt ñộng của tinh trùng trong các mẫu sau khi bảo tồn ở 50C so với các loại ñường khác

ðường hoạt ñộng như một chất bảo quản lạnh, cung cấp năng lượng cho tinh trùng sống và vận ñộng, duy trì áp lực thẩm thấu của môi trường Ngoài

ra, ñường có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, tránh ñược hiện tượng mất ñiện tích trên bề mặt tinh trùng, do ñó tránh ñược hiện tượng tinh trùng bị tụ dính ðường có vai trò như chất khử, khi có ôxy hoá chính nó giữ vai trò là một chất chống ôxi hoá Milovalov cũng ñã phát hiện ra ñộ nhớt của môi trường

có chất ñường cao hơn so với dung dịch muối Khi pha loãng bằng dung dịch ñường thì các vi khuẩn gây mủ sinh sản ở mức thấp

Các loại ñường thường ñược ñưa vào sử dụng là:

ðường Lactose: Andersen [8] sử dụng trong môi trường Tris - lactose; Evans [10] sử dụng lactose trong môi trường (Lòng ñỏ trứng gà, lactose, glycerol) ñể ñông lạnh tinh chó

Sử dụng ñường Raffinose như: Mathur và cộng sự (1991) [13]; Visser (1974) [16] )

ðường fructose và glucose ñược các nhà nghiên cứu sử dụng, Mathur và cộng sự (1991) [13]

Trong công trình của El - Gaafary (1990) (Dẫn từ ðỗ Văn Thu [4] ) không thấy có sự khác nhau một cách có ý nghĩa về hoạt lực, tốc ñộ bơi, acrosom nguyên vẹn của tinh trùng sau khi bảo tồn ở 370C với hai môi trường

có ñường lactose và raffinose, việc sử dụng fuctose trong môi trường pha loãng và ñông lạnh cho kết quả về sức sống, hoạt lực của tinh trùng tốt hơn so với môi trường sử dụng các loại ñường khác.Các loại ñường khác nhau, nồng

ñộ khác nhau có ảnh hưởng ñến sức sống của tinh trùng trong quá trình ñông bảo tồn Tác giả cho rằng nồng ñộ disaccharide và trisaccharide khác nhau cho kết quả về sức sống của tinh trùng sau bảo tồn khác nhau

− Vai trò của cấc chất ñiện giải và không ñiện giải

Chất không ñiện giải (như các loại ñường) có tác dụng “bảo vệ” cho tinh trùng tránh ñược hiện tượng mất ñiện tích trên bề mặt tinh trùng do nhiều nguyên nhân khác nhau Từ ñó, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống ñược tốt hơn Chất không ñiện giải còn giữ vai trò là chất chống oxy hóa Chất bảo vệ cho chất chống ngưng kết (antiaglutinin) của tinh dịch khỏi bị oxy hóa Sự chuyển thế năng oxy hóa – khử của tinh dịch sang âm tính do chất ñường tiến hành cũng có lợi cho tinh trùng

Tinh trùng rất mẫn cảm với những dung dịch muối như NaCl, KCl, Citrate, tuy vậy, vẫn phải ñưa vào môi trường pha loãng – bảo tồn một lượng muối nhất ñịnh, muối không ñộc và có anion hoá trị cao

Na-Milovanov nhận thấy trong môi trường pha loãng nếu tăng các muối có cation hoá trị cao thì có hại cho tinh trùng Như các muối có cation +2 (Ca, Mg ) làm cho tinh trùng bị tụ dính, muối có cation +3, +4 (Al, Fe ) làm cho tinh dịch bị ñông ñặc và tinh trùng chết rất nhanh ðối với anion thì ngược lại, những muối có anion -2 có tác ñộng lên tinh trùng tốt hơn so với muối có

anion là -1 Theo quan ựiểm trên thì những muối có anion hoá trị cao, thành phần các chất có khác nhau nhưng vẫn duy trì sức sống của tinh trùng tốt như nhau Muối có anion hoá trị 2, 3, 4 sẽ làm tăng sức sống của tinh trùng, còn sử dụng muối có anion hoá trị 1 thì sức sống của tinh trùng bị giảm

Theo Milovanov (1962), Xocolopskaia (1962), (Dẫn từ Dương đình Long (1996) [3] ), cho rằng muối trong pha loãng tinh dịch có các vai trò sau:

- Làm chậm hiện tượng trương phồng chất keo colloid của nguyên sinh chất và màng tinh trùng, hạn chế tình trạng tự ngộ ựộc bằng những sản phẩm toan tắnh của sự phân giải

- Duy trì năng lực ựệm của môi trường pha loãng và ựông lạnh Theo Salisburly (1978) [15] có thể dùng một loại muối vừa ựể duy trì áp lực thẩm thấu vừa có tác dụng ựệm như muối Natri-phosphat, muối natri-citrate, muối natri-bicacbonat Ngoài ra chúng còn cung cấp một lượng CO2 vào môi trường ức chế sự hoạt ựộng của tinh trùng

đỗ Văn Thu (2001) [4] cho rằng muối Tris có tác dụng bảo vệ acrosom ắt

bị hư hỏng trong bảo quản, duy trì sức sống của tinh trùng lâu hơn các muối khác Theo tác giả, tinh trùng có thể chịu ựựng tương ựối rộng với khoảng nồng

ựộ muối Tris Tuy vậy, ựể duy trì sức sống lâu dài cho tinh trùng, ngoài nồng

ựộ muối Tris phù hợp còn có nồng ựộ ựường và loại ựường ựưa vào môi trường cũng phải phù hợp

Muối Citrate cũng ựược các tác giả quan tâm và sử dụng: Mathur và cộng sự (1991) [13] cho kết quả rất khả quan

− Vai trò của lòng ựỏ trứng

Lòng ựỏ trứng gà trong môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó có tác dụng chắnh là bảo vệ, giúp tinh trùng chống hiện tượng choáng, chức năng này ựược thực hiện nhờ Ovoleucitine một dạng của lipide trong lòng ựỏ trứng

gà Việc bổ sung lòng ựỏ trứng gà giúp cải thiện các ựặc ựiểm của môi trường

và nâng cao sức sống tinh trùng một cách rõ rệt

Protein trong lòng ñỏ trứng có Ovovitein và Ovolivetin (tỷ lệ tương ứng 4:1) Những phosphoprotein này là những chất ñệm lưỡng tính rất tốt cho môi trường pha loãng tinh dịch Thành phần lòng ñỏ trứng gà là các Colloid nên nội lực ma sát của phân tử rất lớn Vì vậy, làm tăng ñộ nhớt của môi trường pha loãng tinh dịch Do ñó, sử dụng lòng ñỏ trứng gà phải quan tâm ñến ñiều này ñể bổ sung lòng ñỏ trứng gà vào môi trường cho thích hợp

Simirnov (1974) (Dẫn từ ðỗ Văn Thu (2001) [4] ) cho rằng lòng ñỏ trứng gà có vai trò như chất ñệm thẩm thấu ñặc biệt Sự có mặt của lòng ñỏ trứng gà làm giảm tác dụng của dung dịch nhược trương gồm ñường và muối lên tinh trùng

− Vai trò của glycerol

Glycerol có vai trò ñặc biệt trong quá trình bảo tồn tinh dịch chó ở nhiệt

ñộ thấp

Glycerol liên quan chặt chẽ với những chuyển dịch thẩm thấu xảy ra trong pha loãng ñông lạnh tinh dịch Glycerol làm giảm mức ñộ phân ly của muối, nên làm giảm áp lực thẩm thấu trong môi trường pha loãng tinh dịch Glycerol tạo ra áp lực thẩm thấu bổ sung một cách ñáng kể trong môi trường pha loãng, khi ñưa glycerol vào môi trường thì áp lực thẩm thấu hạ xuống Ngay sau khi pha loãng, glycerol tạo ra áp lực thẩm thấu trong môi trường ở mức ñộ nào ñó, ñã hỗ trợ áp suất thẩm thấu bên trong của tế bào Sau ñó, glycerol xâm nhập vào tế bào chất và làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào Nồng ñộ glycerol bổ sung vào môi trường biến ñộng từ 4 - 12% (Trần Tiến Dũng và Cộng sự (2002) [2] )

Theo D.Visser (1974) [16], sử dụng 4% glycerol trong môi trường có 240mM tris; 75,8 mM citric acid; 22,2 mM glucose; 12% lòng ñỏ trứng gà cho kết quả tốt về hoạt lực tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ acrosome nguyên vẹn

Mathur và cộng sự (1991) [13], ñã sử dụng 4% glycerol trong môi trường

có (18% lòng ñỏ trứng gà; 0,5g lactose; 0,8g raffinose; 0,22g Trisoddium citrate) cho kết quả sau giải ñông với hoạt lực tinh trùng 57,6%

− Vai trò của kháng sinh

Tinh dịch gia súc sau khi ra khỏi cơ thể và ngay cả trong lòng ñỏ trứng

gà khi bổ sung vào môi trường ñều bị nhiễm vi sinh vật ðể hạn chế tác hại của vi khuẩn, ngoài việc thực hiện nghiêm ngặt quy trình vệ sinh thì việc bổ sung kháng khuẩn vào môi trường rất cần thiết Tuy nhiên, các chất kháng khuẩn ñưa vào về ñịnh tính và ñịnh lượng phải vô hại với tinh trùng Các chất kháng sinh thường ñược dùng ñể pha vào môi trường là penicillin, Streptomycin, sulfamit, tetracylin

Cơ chế tác dụng của kháng sinh ñối với các vi khuẩn phụ thuộc vào ñặc ñiểm giải phẫu học của vi khuẩn và cấu trúc hoá học của kháng sinh tố

Vì vậy, mỗi một nhóm kháng sinh sẽ có tác dụng ñặc hiệu nên một loại vi khuẩn nhất ñịnh

Nhóm penicillin

Penicillin tác dụng lên vỏ tế bào ức chế sự tổng hợp các mucopeptit của vỏ

tế bào, vì vậy tế bào bị dung giải và phân huỷ Những vi khuẩn thuộc nhóm gram (+) thì nhạy cảm với penicillin hơn vì vỏ của tế bào vi khuẩn này có tới 60% mucoprotein Còn vi khuẩn gram (-) có vỏ bọc 10% mucoprotein nên không mẫn cảm với penicillin Khi sử dụng penicillin, chúng ta phải ñề phòng hiện tượng kháng thuốc, vì vậy ngày nay người ta ñã chế ra β- lactamin bán tổng hợp

Nhóm Streptomycin

Streptomycin chỉ có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Sau khi ñã gắn vào axit amin thứ 10, streptomycin lại gắn lan toả sang cacbon khác thứ 8 – 11, ñồng thời làm thay ñổi tính thấm của tế bào vi khuẩn dẫn ñến tế bào vi khuẩn chết Như vậy, Streptomycin tác dụng chủ yếu lên vi khuẩn gram (-)

Nhóm Tetracylin

Năm 1965 - 1967 Seoduck, Velisteo ựã nghiên cứu dùng tetracylin với liều 500 - 1000 UI cho 100 ml môi trờng pha loãng tinh dịch ựã ựạt kết quả rất tốt Tuy nhiên, theo tác giả nếu sử dụng liều cao hơn sẽ có hại ựối với tinh trùng (Trần Tiến Dũng và Cộng sự (2002) [3] )

Sữa ựã ựược nghiên cứu và ứng dụng rất sớm bởi Milovanov 1962 (Dẫn

từ Dương đìh Long (1996) [3], Ngày nay, trên thế giới sữa tách chất béo ựược sử dụng nhiều trong môi trường pha loãng tinh dịch chó bảo tồn ở nhiệt

ựộ 00C - 50C trong thời gian vài ngày Ngoài ra, sữa còn ựược sử dụng trong môi trường ựông lạnh tinh dịch chó Sữa tách chất béo rất dễ tìm, là nguyên liêụ rất sẵn lại cho kết quả rất khả quan nên nhiều tác giả sử dụng sữa tách chất béo trong môi trường bảo quản tinh dịch chó: A Lopez- Saez và cộng sự (2000) [7] sử dụng sữa tách chất béo ựể bảo quản tinh dịch chó ở 50C cho kết quả tốt ựến ngày thứ 5 vẫn ựạt A > 50%

Tuy nhiên, ở nước ta vẫn chưa có công trình nào nghiên cứu việc bổ sung sữa tách chất béo vào môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch chó

2.5 SƠ LƯỢC VỀ QUÁ TRÌNH GIAO PHỐI VÀ PHÓNG TINH

Giao phối là chuỗi phản xạ không ựiều kiện, bẩm sinh phức tạp liên hoàn

gồm hưng phấn, cương cứng, giao cấu, phóng tinh Tiến trình này xảy ra khi

con ñực ñã thành thục

Khoảng thời gian chó ñực ñến trước chó cái và giao phối là rất biến ñổi,

nó phụ thuộc vào nhiều tác nhân Tuy nhiên, chúng có những biểu hiện: ñầu tiên chó ñực nhảy lên lưng chó cái và dập mạnh làm lộ ra một phần dương vật khỏi bao quy ñầu, phóng một ít chất lỏng trong, ñây chính là tinh thanh của pha thứ nhất, chứa rất ít tinh trùng Khi giao phối dương vật chó không cần cương cứng vì trong dương vật chó có xương dương vật, nó tạo ñược ñộ cứng cần thiết ñể ñưa dương vật vào âm ñạo Ngay sau ñó, chó ñực sẽ phóng tinh lần hai, lần này rất nhiều tinh trùng Thể tích tinh dịch của pha này biến ñổi từ 0,5-2 ml và ñược lưu giữ ở phía trước của âm ñạo chó cái, gần nhưng chưa tới

cổ tử cung Pha phóng tinh thứ ba chủ yếu là tinh thanh, có tác dụng rủa lòng niệu ñạo chó ñực và nút cổ tử cung chó cái

3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ðỐI TƯỢNG, ðỊA ðIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- ðối tượng nghiên cứu: Sử dụng chó Berger ñược nuôi tại Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32) - Bộ Công an

Chó ñực giống khỏe mạnh, có khả năng khai thác tinh dịch

- ðịa ñiểm nghiên cứu:

Phòng Sinh học tế bào sinh sản - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trung tâm Huấn luyện chó nghiệp vụ (C32) - Bộ Công an

Thời gian thực tập từ tháng 01/2008- 07/2008

3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.2.1 Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch và các yếu tố ảnh

hưởng lên phẩm chất tinh dịch

Các chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó

Khảo sát một số ñặc ñiểm hóa lý của tinh dịch

- Áp lực thẩm thấu của tinh dịch

- Tỷ trọng tinh dịch

- ðộ nhớt tinh dịch

- Năng lực ñệm tinh dịch

Các yếu tố ảnh hưởng lên phẩm chất tinh dịch

- Ảnh hưởng của mùa vụ lên phẩm chất tinh dịch

- Ảnh hưởng của tần xuất khai thác tinh lên phẩm chất tinh dịch

3.2.2 Pha loãng, bảo tồn tinh dịch chó ở 5 0 C

- So sánh một số môi trường bảo tồn tinh dịch

- So sánh các nhiệt ñộ bảo tồn tinh dịch

- Ảnh hưởng của các thành phần trong môi trường: (glycerol, DMSO, ñường, lòng ñỏ trứng gà)

- Ảnh hưởng của phương pháp giải ñông lên chất lượng tinh trùng

3.2.4 Thụ tinh nhân tạo chó

- Xác ñịnh lượng tinh trùng trong một liều phối

- Ảnh hưởng của thời gian bảo tồn tinh dịch ñến tỷ lệ thụ thai

- Theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của chó con do thụ tinh nhân tạo

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp lấy tinh:

Sau khi xem xét, lựa chọn chó ñực ñạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó ñực giao phối trực tiếp ít nhất là 3 ngày trước thời ñiểm lấy tinh Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch ñược khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh

Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau:

- Kắch thắch ở phần tự do của quy ựầu cho ựến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), ựó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh

- Khi chó ựực bắt ựầu dập mạnh ựể chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kắch thắch nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật ựể xuất toàn bộ tinh dịch của pha này

- Sau khi chó ựực xuất hết tinh thì tiếp tục kắch thắch cho ựến khi tinh thanh ra hết, mục ựắch là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó ựực

Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha khác thì bỏ qua

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó

Thể tắch tinh dịch

Theo phương pháp của Milovanov (1926): xác ựịnh thể tắch tinh dịch qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia ựộ hoặc xác ựịnh qua phễu hứng tinh ựã chia ựộ, ựặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và ựọc kết quả ở vạch

cong dưới của mặt tinh dịch

Hoạt lực tinh trùng

Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau (1991): sức hoạt ựộng ựược tắnh bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt ựộng tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát ựược

đánh giá theo thang ựiểm 1,0 như sau:

điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

(%) 100-95 95-85 85-75 75-65 65-55 55-45 45-35 35-25 25-15 15-5

Phương pháp ñánh giá hoạt lực tinh trùng

Dùng ñũa thuỷ tinh sạch lấy một giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, ấm (30 - 350C) Dùng một lá kính khô, sạch ñậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch ñược dàn ñều và không lẫn bọt khí ðặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với ñộ phóng ñại 100 - 400 lần Trong khi kiểm tra, tiêu bản ñược sưởi ấm ở 37 -380C

Tinh trùng có 3 hình thức vận ñộng: tiến thẳng, xoay vòng, lắc lư

Nồng ñộ tinh trùng

Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau và Caynie (1991) [9]: dùng buồng ñếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Newbauer) và ống pha loãng hồng cầu Pha loãng tinh dịch 100-200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch ñến vạch 0,5-1,0 rồi hút NaCl 3% ñến vạch 101)

Trộn ñều tinh dịch ñược pha loãng, bỏ 3 - 4 giọt ñầu, nhỏ một giọt vào buồng ñếm ñã chuẩn bị ðếm tinh trùng trong các ô ñếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và một ô ở giữa Mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400mm2 và ñộ sâu 1/10mm)

Nguyên tắc ñếm:

ðếm tinh trùng theo ñầu: ñếm tinh trùng theo hàng, ñếm hết hàng nọ ñến hàng kia theo hình chữ chi Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ ñếm hai cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải) ðếm cả hai buồng, ñếm xong lấy kết quả trung bình, nếu kết quả của hai bên chênh nhau 30% thì phải làm lại Nếu tinh trùng tụ thành ñám thì phải làm lại

Công thức tính:

C= x1000

N

4000.D.n

Trong ñó: C: Nồng ñộ tinh trùng trong tinh dịch

n: Số tinh trùng ñếm ñược

D: Mức ñộ pha loãng

N: Số ô con ñã ñếm

Công thức ñơn giản (nếu ñộ pha loãng 200 lần ): C= n x107

Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh

Theo John B.Herrick và Self, (1962), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml/lần) × nồng ñộ tinh trùng (triệu/ml) × hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%)

Tỷ lệ tinh trùng sống

Theo phương pháp của Chemineau (1991)

Dung dịch nhuộm: Eosin 1g; Nigrosin 2g; Natri - citrate 5,5; H20 3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml

pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp lực thẩm thấu 310 miliosmol/kg Tiến hành:

- Sau khi pha trộn ñể 50 giây

- Dùng phiến kính thứ hai nhẹ nhàng san ñều hỗn hợp ñã nhuộm

- ðếm tổng số không dưới 150 tinh trùng, ñều ở các vùng, tinh trùng sống không bắt màu

Theo phương pháp của William (1921) kết hợp vơi phương pháp Cheminau (1991)

- Quan sát bằng kính hiển vi Olympus với ñộ phóng ñại 400-1000 lần

- ðếm: lấy ngẫu nhiên, ñếm lần lượt 300 - 500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình

- Tính: (%)= ×100

N

nK

Trong ñó: Ka (%): Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình acrosome

n: Số tinh trùng kỳ hình acrosome

N: Tổng số tinh trùng bình thường và kỳ hình ñếm ñược (N=300-500)

3.3.3 Phương pháp xác ñịnh tính chất lý - học của tinh dịch và môi

M: khối lượng chất lỏng cần ño cùng thể tích

M0: khối lượng nước cất 2 lần

td

Năng lực ñệm

Theo phương pháp của Salisbury, ñối với HCl 0,1N, dùng một lọ con khô, sạch, trung tính, có dung tích 5 - 10 ml Cho vào ñó 1ml (hoặc 0,5ml) chất lỏng cần kiểm tra, ño pH chất lỏng Dùng ống hút vi lượng nhỏ dung dịch HCl 0,1N (n = 3,6) vào lọ trên cho ñến khi pH = 4,0 Ghi lại ñộ chênh lệch pH (dpH)

Công thức tính:

1000

×vdpH

na

Trong ñó:

β: Năng lực ñệm tính trong 1000 lít chất lỏng

a: Lượng axit ñã dùng (lượng HCl 0.1N )

n: ðương lượng gam của axit HCl 0.1N

dpH: Chênh lệch pH trước và sau sử lý

v: Lượng chất lỏng ñã dùng

3.3.4 Pha loãng bảo tồn tinh dịch ở 5 0 C

Môi trường pha loãng tinh dịch Chó

+ Môi trường 1 (Tris): Tris 3,634g - Citric acid 1,99 g - frutose 0,5 g - lòng ñỏ trứng gà 14 ml - Penicillin 100 mg + Streptomycin 100 mg - nước cất hai lần ñủ 100 ml

+ Môi trường 2 (Citrate): Sodium citrate 1,3123 g - Glucose 0,594 g - lòng ñỏ trứng gà 14 ml - Streptomycin 100 mg - Penicillin 100 mg - nước cất hai lần ñủ 100 ml

+ Môi trường 3 (Sữa): Sữa tách chất béo 10 g - Glucose 194 mg - Penicillin 50 mg - Streptomycin 50 mg - nước cất hai lần ñủ 100 ml

Phương pháp pha môi trường

- ðun 100ml nước cất 2 lần ñến nhiệt ñộ sôi Sau ñó lần lượt hòa tan: Muối Tris, acid citric, ñường vào nước, ñể nguội ñến 370C

Pha penicillin + streptomycin khi nhiệt ñộ môi trường ở 370C

Bổ sung lòng ñỏ trứng gà

Bảo quản môi trường ở 4 - 50C, sử dụng trong vòng 3 ngày

Phương pháp pha loãng tinh dịch:

- Môi trường pha loãng ñể ở nhiệt ñộ 350C

- Tinh dịch chó ñựng trong ống hứng tinh, ñặt vào cốc nước ấm 350C, kiểm tra phẩm chất tinh dịch

- Môi trường pha loãng ñược rót nhẹ nhàng vào cốc ñựng tinh với tỷ lệ pha loãng thích hợp (v/v) (phần tinh dịch: phần môi trường) ñậy kín, lắc nhẹ

Phương pháp bảo quản tinh dịch chó ở 5 0 C, 10 0 C, 15 0 C

- Bịt kín lọ tinh dịch ñã pha loãng, sau ñó ñặt vào cốc nước có nhiệt ñộ

350C sao cho phần tinh lỏng vừa ngập nước

- Ghi phía bên ngoài cốc ñựng tinh dịch pha loãng: tên chó, tên môi trường, ngày tháng lấy tinh

- Chuyển vào tủ có ñiều chỉnh nhiệt ñộ, bảo quản ở 50C, 100C, 150C

3.3.5 Công nghệ ñông lạnh tinh dịch chó ở -196 0 C

Môi trường ñông lạnh tinh dịch chó

+ Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng ñỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 UI - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần ñủ 100 ml Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol

+ Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng ñỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 UI - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần ñủ 100 ml

Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol

Bước 2 Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40C trong 2 giờ

Bước 3 Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ

Bước 4 Ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt ựộ 4 0C trong 3 giờ

Bước 5 đông lạnh tinh cọng rạ:

Bước 6 Thả tinh cọng rạ ở -165 0C vào nitơ lỏng -196 0C

3.3.6 Phương pháp nghiên cứu sự thay ựổi của tế bào biểu mô âm ựạo chó trong chu kỳ sinh dục

Thời kỳ tiền ựộng dục

Thời kỳ tiền ựộng dục ở chó cái thường kéo dài trong khoảng 9 ngày Trong thời kỳ này, dưới tác ựộng của estrogen, lớp mô biểu bì của âm ựạo tăng sinh nhanh chóng, thành âm ựạo dầy lên, các mao mạch bị vỡ ra và các tế bào hồng cầu thoát ra khỏi mạch máu ựi vào lòng âm ựạo gây ra hiện tượng chẩy máu qua âm hộ của chó

Trong thời gian ựầu của kỳ tiền ựộng dục, trên phiến ựồ âm ựạo chủ yếu quan sát thấy các tế bào biểu mô nhỏ (Parabasalcell) và biểu mô nhỡ (Intermedialcell)

Tế bào biểu mô nhỏ là những tế bào có kắch thước nhỏ nhất Chúng có hình dạng tương ựối ựồng nhất là hình tròn, có ắt tế bào chất, nhân tế bào to,