Thu nhận bromelin và thử nghiệm dùng chế phẩm bromelin để làm phomat tươi

ENZYM BROMELIN TRONG DỨA 2.1 Đặc điểm chung của enzym bromelin 2.2 Tính chất vật lý của enzym bromelin 2.3 Tính chất hóa học của enzym bromelin 2.3.1 Cấu tạo hóa học 2.3.2 Cấu trúc không

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

o0o

TRẦN THỊ HƯỜNG

THU NHẬN BROMELIN VÀ

THỬ NGHIỆM DÙNG CHẾ PHẨM BROMELIN ĐỂ LÀM PHOMÁT TƯƠI

CHUYÊN NGÀNH:

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ SỐ :2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2003

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

+ Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

+ Phòng Quản Lý Khoa Học Sau Đại Học

+ Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

+ Phòng Thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh - Trường Đại Học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh

+ TS Phạm Minh Tâm

+ Các bạn lớp Cao học Công nghệ Thực phẩm Khóa 11

+ Các thành viên trong gia đình tôi

Đã quan tâm giúp đỡ, tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này

ABSTRACT

Bromelin is an enzyme having proteolytic activity sought in parts of pineable in which the top has most bromelin The recovery of bromelin is described as below:

The tops of pineables are ground in grider follow by pressing the crushed mass to extract stem juice therefrom then the juice after centrifugating in centrifuge about 10 minutes at the rate of 6,000 rpm to separate the liquid from solid is precipitated with absolute alcohol and acetone Using absolute alcohol to precipitate showed the best result and the enzyme recovery yield in this case get 84.27% Drying solid enzymic preparation recovered as a wet precipitate is needed The drying processes is made with or without adding casein into the solid enzymic preparation As the result, the proteolytic of the casein-added enzymic preparation is decreased less than the non casein-added The coagulation of milk using the casein added enzymic preparation as an coagulant

is optimum at temperature of 650C and pH 5.91 After considering the decreasing activity of the enzyme, we found that the enzymic juice easily loses its activity than the dried casein- added enzymic powder The decreasing activity of enzymic juice reach to 50% after one week while the powder is decreased by 29.73% after 3 months

The dried casein-added enzymic preparation is used for making soft fresh cheese

is presented as below:

+ Making solution 1% of enzymic powder

+ The solution is deluted by 70 times

+ Using 0.1 ml deluted solution for 1 ml of milk

The fromage recovery yield obtained is 54,69% and the product has no bitter taste after 3 weeks

Chế phẩm enzym bromelin thu được sau khi sấy có hoạt tính đông tụ sữạ cao nhất ở nhiệt độ tối ưu là 650C và pHopt=5,91 Theo dõi hoạt tính đông tụ sữa của hai dạng chế phẩm bromelin dạng lỏng và dạng bột theo thời gian bảo quản cho thấy chế phẩm enzym bromelin dạng lỏng bị mất hoạt tính trên 50% sau 01 tuần bảo quản, trong khi chế phẩm enzym bromelin dạng bột bị mất hoạt tính 29,73% sau 03 tháng bảo quản

Chế phẩm enzym bromelin dạng bột được ứng dụng trong thử nghiệm làm phomát tươi Hàm lượng enzym bromelin trong thử nghiệm là dung dịch enzym bromelin 1% được pha loãng 70 lần và sử dụng với tỉ lệ 0,1ml enzym/ml sữa Hiệu suất thu hồi phomát là 54,69% Sản phẩm phomát không bị đắng sau 03 tuần bảo quản

MỤC LỤC Nội dung

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 GIỚI THIỆU VỀ ENZYM PROTEASE

1.1 Khái quát về protease

1.2 Cơ chế hoạt động của enzym protease

2 ENZYM BROMELIN TRONG DỨA

2.1 Đặc điểm chung của enzym bromelin

2.2 Tính chất vật lý của enzym bromelin

2.3 Tính chất hóa học của enzym bromelin

2.3.1 Cấu tạo hóa học

2.3.2 Cấu trúc không gian của enzym bromelin

2.3.3 Hoạt tính của bromelin

2.3.4 Cơ chế tác động của enzym bromelin

2.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym bromelin

2.4 Các lĩnh vực ứng dụng của bromelin

2.4.1 Sử dụng bromelin trong quá trình làm đông tụ sữa

2.4.2 Sử dụng bromelin để thủy phân protein

2.4.3 Sử dụng bromelin để thu nhận các chất ức chế protease

2.4.4 Các lĩnh vực ứng dụng khác

3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY DỨA

3.1 Nguồn gốc cây dứa

3.2 Quả dứa

4 TỔNG QUAN VỀ SỮA

4.1 Đặc điểm chung của sữa

4.2 Thành phần hóa học của sữa

4.2.1 Protein

4.2.2 Chất béo trong sữa

4.2.3 Cacbonhydrat

4.2.4 Muối khoáng và vitamin

4.2.5 Hệ enzym trong sữa

4.2.6 Các chất miễn dịch có trong sữa

4.2.7 Các chất khí

4.3 Cấu trúc mixen của casein

4.3.1 Khuynh hướng tự liên kết của các casein

4.3.2 Khuynh hướng cố định các ion của các casein

4.3.3 Cấu trúc của mixen tự nhiên

4.3.4 Độ bền của mixen

5 SẢN PHẨM PHOMÁT

5.1 Định nghĩa

5.2 Nguồn gốc và lịch sử phomát

5.3 Phân loại phomát

5.4 Quy trình sản xuất phomát

5.4.1 Giai đoạn làm đông sữa

5.4.2 Giai đoạn khử nước

5.4.3 Giai đoạn muối phomát

5.4.4 Giai đoạn ủ chín phomát

5.5 Vai trò của enzym đông tụ sữa

5.6 Cơ chế đông tụ sữ bằng enzym

5.7 Các loại enzym đông tụ sữa

5.7.1 Enzym đông tụ sữa từ động vật

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

1.1 Nguyên liệu

1.2 Dụng cụ và thiết bị

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2 Thu nhận chế phẩm enzym bromelin bằng dung môi hữu cơ

2.2.1 Nguyên tắc

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến tính hòa tan của protein

2.2.3 Quy trình chiết tách và thu nhận enyme bromelin

2.3 Phương pháp làm phomát tươi

2.3.1 Quy trình công nghệ sản xuất phomát tươi

2.3.2 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm

3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

3.1 Xác định hoạt tính enzym bromelin theo phương pháp chuẩn

độ formol

3.2 Xác định nồng độ protein trong dung dịch enzym theo phương

pháp biure

3.3 Xác định hoạt tính đông tụ sữa của enzym bromelin

3.4 Phương pháp xác định trạng thái cảm quan của sữa nguyên liệu

3.5 Phương pháp xác định độ chua của sữa và của sản phẩm

phomát

3.5.1 Xác định độ chua của sữa

3.5.2 Xác định độ chua của phomát

3.6 Xác định nitơ acid amin của phomát tươi

3.7 Phương pháp xác định độ khô của nguyên liệu và sản phẩm

3.8 Phương pháp xác định hiệu xuất trong sản xuất phomát tươi

3.9 Đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1 THU NHẬN ENZYM BROMELIN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ

YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA CHẾ PHẨM

ENZYM BROMELIN THU ĐƯỢC

1.1 Thu nhận enzym bromelin bằng dung môi hữu cơ

1.1.1 Kết tủa enzym bromelin bằng cồn tuyệt đối

1.1.2 Kết tủa enzym bromelin bằng aceton

1.2 Khảo sát một số tính chất của chế phẩm enzym bromelin thu

được

1.2.1 Hoạt tính tổng và hoạt tính riêng của enzym bromelin trước và

sau khi tinh sạch sơ bộ bằng cồn tuyệt đối

1.2.2 Xác định ảnh hưởng của casein đến hoạt tính thủyï phân của

enzym bromelin trong quá trình sấy

1.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính đông tụ sữa của chế

phẩm enzym bromeliïn

1.2.4 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm

enzym bromelin

1.2.5 Sự biến đổi hoạt tính đông tụ sữa của các chế phẩm enzym

bromelin theo thời gian

1.2.5.1 Chế phẩm enzym bromelin dạng lỏng

1.2.5.2 Chế phẩm enzym dạng bột có bổ sung casein

2 THỬ NGHIỆM DÙNG CHẾ PHẨM BROMELIN ĐỂ LÀM

2.2 Khảo sát nồng độ enzym trong sản xuất phomát tươi

2.2.1 Ảnh hưởng của độ pha loãng enzym bromelin đến trạng thái

của khối đông

2.2.2 Ảnh hưởng của độ pha loãng enzym bromelin đến các thành

phần trong sản xuất phomát tươi

2.3 Ảnh hưởng của thời gian ly tâm đến độ khô và khối lượng sản

phẩm

2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đông tụ đến cấu trúc và chất lượng sản

phẩm

2.5 Ảnh hưởng của độ chua sản phẩm

2.6 Ảnh hưởng của nồng độ ion canxi

2.7 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong nguyên liệu sữa

2.8 Theo dõi thời gian bảo quản sản phẩm

2.9 Hiệu suất thu hồi sản phẩm

2.10 Sự biến đổi hàm lượng chất khô trong quá trình sản xuất

phomát tươi

2.11 So sánh các tính chất của sản phẩm phomát tươi làm ra với

phomát tươi trên thị trường

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 KẾT LUẬN

2 KIẾN NGHỊ

PHẦN 5: PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Xây dựng đường chuẩn albumin

Phụ lục 2: Xác định thời gian mà vận tốc phản ứng phụ thuộc vào vận

tốc đầu

Phụ lục 3: Bảng giá trị F

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1: Những tính chất vật lý của enzym bromelin thân

Bảng 2: Thành phần acid amin của bromelin thân và quả dứa

Bảng 3: Hằng số Michaelis (pH 6, t 0 = 5 0 C) với các cơ chất khác

nhau

Bảng 4: Hoạt tính phân giải casein và BAA của bromelin và papain

Bảng 5: Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa lên chế phẩm bromelin

Bảng 6: Một số chất ức chế hoạt động của bromelin

Bảng 7: Hoạt tính bromelin theo điều kiện bảo quản

Bảng 8: Thành phần các thuộc phẩm khác nhau của dứa dùng làm

thức ăn gia súc

Bảng 9: Tính chất sinh hóa một số loại protein sữa

Bảng 10: Thành phần khoáng và vitamin trong sữa

Bảng 11: Các loại enzym đông tụ sữa

Bảng 12: Hoạt tính protease và hiệu suất thu hồi enzym bromelin khi

kết tủa bằng cồn tuyệt đối

Bảng 13: Hoạt tính protease và hiệu suất thu hồi enzym bromelin khi

kết tủa bằng aceton

Bảng 14: Hoạt tính riêng và mức độ tinh sạch của enzym bromelin

khi kết tủa bằng cồn tuyệt đối

Bảng 15: Ảnh hưởng của casein đến hoạt tính thủy phân của enzym

bromelin trong quá trình sấy

Bảng 16: Sự biến đổi hoạt tính đông tụ sữa của enzym bromelin

dạng lỏng theo thời gian

Bảng 17: Sự biến đổi hoạt tính đông tụ sữa của enzym bromelin

dạng bột theo thời gian

Bảng 18: Thành phần sữa nguyên liệu

Bảng 19: Trạng thái khối đông tụ thay đổi theo độ pha loãng enzym

bromelin

Bảng 20: Các thành phần trong sản phẩm phomát thay đổi theo độ

pha loãng enzym bomelin

Bảng 21: Độ khô sản phẩm thay đổi theo thời gian ly tâm

Bảng 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đông tụ đến cấu trúc và chất

lượng sản phẩm

Bảng 23: Độ chua của sản phẩm trong quá trình lên men

Bảng 24: Ảnh hưởng của nồng độ canxi

Bảng 25: Ảnh hưởng của nồng độ chất khô trong nguyên liệu sữa

Bảng 26: Chất lượng sản phẩm theo thời gian bảo quản

Bảng 27: Hiệu suất thu hồi sản phẩm phomát tươi từ các loại sữa

khác nhau

Bảng 28: Sự biến đổi hàm lượng chất khô trong quá trình tạo sản

phẩm phomát tươi

Bảng 29: Độ khô và độ axít của các sản phẩm phomát tươi

Bảng 30: Kết quả cảm quan về cấu trúc và mùi vị của cát sản phẩm

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1: Sơ đồ về cơ chế hoạt động của enzym protease

Hình 2: Cấu trúc phần hydrát cacbon của bromelin

Hình 3: Cấu tạo thể casein của sữa

Hình 4: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi enzym bromelin theo tỉ lệ

thể tích dung môi so với thể tích hỗn hợp

Hình 5: Đồ thị biểu diễn hoạt tính riêng của enzym bromelin theo tỉ lệ

thể tích dung môi so với thể tích hỗn hợp

Hình 6: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của casein đến hiệu suất thu

hồi enzym bromelin khi sấy

Hình 7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt độ đông tụ sữa F của

enzym bromelin vào nhiệt độ

Hình 8: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt độ đông tụ sữa F của

enzym bromelin vào pH

Hình 9: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hoạt tính đông tụ sữa của enzym

bromelin dạng lỏng theo thời gian

Hình 10: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi hoạt tính đông tụ sữa của chế

phẩm enzym bromelin dạng bột theo thời gian

Hình 11: Đồ thị biểu diễn sự biến đổi thời gian đông tụ sữa theo độ

pha loãng enzym bromelin

Hình 12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng độ pha loãng enzym bromelin

đến khối lượng sản phẩm phomát thu được

Hình 13: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng độ pha loãng enzym đến hiệu

suất thu hồi sản phẩm phomát

Hình 14: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian ly tâm đến khối

lượng sản phẩm phomát và khối lượng lactoserum tách ra

Hình 15: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi độ khô theo thời gian ly tâm

Hình 16: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ canxi đến thời gian

đông tụ sữa và thời gian tách lactoserum

Hình 17: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chất khô đến thời

gian đông tụ sữa và thời gian tách lactoserum

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của nền kinh tế và sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngành công nghiệp thực phẩm ở nước ta đã không ngừng đổi mới, nâng cao chất lượng cũng như đa dạng hóa các sản phẩm thực phẩm, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của người tiêu dùng

Song song với sự phát triển của các ngành thực phẩm khác, ngành công nghiệp chế biến sữa đang giữ một vị trí quan trọng trong việc tạo ra những sản phẩm thực phẩm với đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của cơ thể con người như các axít amin không thay thế ( từ protít sữa ), các vitamin A, vitamin D, các khoáng chất đặc biệt như canxi, phốt pho… và các nguyên tố vi lượng khác

Sữa được xem là sản phẩm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao do đó các sản phẩm chế biến từ sữa rất phong phú và đa dạng phù hợp với mọi lứa tuổi như sữa tươi, sữa bột, sữa tách béo, sữa chua… và đặc biệt là phomát

Phomát là sản phẩm có giá trị nhất từ sữa vì trong quá trình sản xuất, các chất dinh dưỡng không bị tổn thất mà ngược lại còn được gia tăng nhờ sự tổng hợp của các quá trình sinh hóa Tuy nhiên, việc sản xuất và tiêu thụ phomát ở nước ta vẫn còn trong phạm vi hẹp so với các nước trên thế giới vì vậy, việc nghiên cứu công nghệ cũng như tìm ra nguồn nguyên liệu để sản xuất chúng là vấn đề đang được quan tâm

Trong quá trình sản xuất phomát, nguyên liệu chính thứ hai sau sữa là enzym đông tụ sữa đóng vai tròø rất quan trọng Rennin được xem là enzym đông tụ sữa truyền thống trong sản xuất phomát Tuy nhiên hiện nay, sản lượng chế phẩm rennin không đủ cung cấp cũng như giá thành của nó quá cao, do đó việc tìm ra chế phẩm enzym để thay thế hoàn toàn hoặc thay thế một phần lượng chế phẩm rennin là điều cần thiết Vì vậy, mục tiêu của đề tài được dặt ra là “Thu nhận bromelin và thử nghiệm dùng chế phẩm bromelin để làm phomát tươi”

PHẦN 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1) GIỚI THIỆU VỀ ENZYM PROTEASE

1.1) KHÁI QUÁT VỀ PROTEASE [5]

Protease là các enzym thuộc nhóm hydrolase thủy phân liên kết peptit (- CO –NH -) trong phân tử protein, các peptit và cơ chất tương tự Sản phẩm tạo thành là các pepton, peptit có phân tử lượng nhỏ hoặc các axit amin Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin

Theo phân loại quốc tế, enzym này được phân thành bốn nhóm như sau:

+ Nhóm aminopeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu Nitơ của

mạch polypeptit

+ Nhóm cacboxylpeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon

của mạch polypeptit Cả hai phân nhóm enzym đều là các exo-peptidase

+ Nhóm dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipeptit

+ Nhóm proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptit nội mạch

(endo-peptidase)

Việc thủy giải của protease là một tiến trình vật lý khá đa dạng và hoạt động của chúng chia ra hai loại như sau:

+ Thủy giải có giới hạn: enzym bẻ gãy có giới hạn đối với một hay một số liên

kết peptit có trong phân tử protein

+ Thủy giải không giới hạn: protein bị thủy giải thành những axit amin

1.2) CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM PROTEASE [5]

Cơ chất

Hình 1: Sơ đồ về cơ chế hoạt động của enzym protease

Theo IUBMB 1984 (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) đã phân chia protease thành hai nhóm, bao gồm endopeptihydrolase (phân cắt các liên kết peptit ở giữa chuỗi mạch polypeptit) hay còn gọi là proteinase và

Phức hợp Enzym+cơ chất

Sản phẩm Vùng tâm

hoạt động

Vùng điều hòa

hoạt động

exo-peptithydrolase (thủy phân các liên kết ở đầu mút của chuỗi mạch) hay còn gọi là peptitdase

Riêng endopeptithydrolase được chia thành bốn nhóm với cơ chế thủy giải khác nhau dựa trên cấu trúc tâm hoạt động:

+ Proteinase- xerin: gốc xerin đóng vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động + Proteinase-tiol: có nhóm SH trong trung tâm hoạt động, trực tiếp tham gia phản

ứng xúc tác

+ Proteinase-kim loại: trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại trực tiếp tham

gia phản ứng xúc tác

+ Proteinase-axit (aspartic proteinase): nhóm γ-cacboxyl của aspartat trong trung

tâm hoạt tham gia trong phản ứng xúc tác

¾Cơ chế tổng quát việc thủy giải liên kết peptit:

2) ENZYM BROMELIN TRONG DỨA

2.1) ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA ENZYM BROMELIN [10]

Bromelin là tên gọi chung cho nhóm enzym có khả năng phân giải protein, có trong thân và quả dứa (thuộc họ Bromeliacease)

Bromelin có nhiều trong quả dứa và phần phế liệu khi xử lý trái dứa như vỏ, lõi, chồi, lõi đầu, trong đó nhiều nhất là ở lõi đầu dứa Thường bromelin chiếm 50% lượng protein có trong dứa và hoạt tính xúc tác tương tự như papain (trong mủ đu đủ) hay ficin (trong cây ficus)

Theo danh pháp quốc tế, bromelin mang mã số E.C.3-4-4-24 và là một trong những protease thực vật được phát hiện sớm

2.2) TÍNH CHẤT VẬT LÝ CỦA ENZYM BROMELIN [10]

Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzym bromelin tách từ thân cây dứa và thấy như sau:

Bảng 1: Những tính chất vật lýù của enzym bromelin thân dứa

Hằng số khuếch tán D 7,77*10-7 cm2sec-1

Thể tích riêng phần V 0,743ml/g

Độ nhớt bên trong [l] 0,039dl/g

Sự hấp thu A1% cm ở 280 nm 20,1a

33200b

32100c

Trọng lượng phân tử

a: giá trị được ghi lại

b: bằng phương pháp sa lắng khuếch tán

c: từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong

d: bằng phương pháp Archibald

Từ các số liệu trên cho thấy enzym bromelin trích từ thân cây dứa là protein kiềm với trọng lượng phân tử khoảng 33000 và có kích thước lớn hơn papain 1.5 lần Ngoài cấu trúc xoắn α, bromelin còn có trật tự cấu trúc khác, có lẽ là cấu trúc β

2.3) TÍNH CHẤT HÓA HỌC CỦA ENZYM BROMELIN [10]

2.3.1) Cấu tạo hóa học

Bromelin thân khác với các protease có nhóm sulfur hydryl thực vật vì enzym này là một gốc glycoprotein, có một glycan ở mỗi phân tử gồm 3 manose, 1 xylose, 1 fructose và 2 glucosamin Sợi hydrat cacbon liên kết hoán vị với sợi polypeptit Trong đó một nửa hydrat cacbon dường như không liên quan trực tiếp trong cơ chế xúc tác

Cấu trúc phần hydrat cacbon của bromelin được đề nghị như sau:

O CH

3

CH O

N Asn Arg

O O

Xyl

GlcNAc Man

OH

OH OH

Hình 2: Cấu trúc phần hydrat cacbon của bromelin

Tùy theo phương pháp thu nhận và phương pháp thí nghiệm, thành phần acid amin của bromelin thân và bromelin quả là khác nhau Bromelin thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và trong khoảng 283-

161 đối với bromelin quả

Các nghiên cứu đã ghi nhận, phân tử bromelin thân được cấu tạo bởi một sợi polypeptit có acid amin đầu amin (–NH2)là valin và đầu cacboxyl làø glycin có pI= 9,5 và với bromelin quả acid amin đầu –NH2 là alanin

Thành phần acid amin của thân và quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 2: Thành phần acid amin của bromelin thân và quả dứa

Acid amin (mg/ml) Thân Trái xanh Trái chín Papain

2.3.2) Cấu trúc không gian của bromelin [10]

Phân tích cấu trúc bậc một của bromelin, Murachi và Bussain cho thấy sự sắp xếp

acid amin trong phân tử bromelin tương tự trong papain và ficin

Bromelin:

-Ser -Val-Lys-Asn- Gln-Asn-Pro-Cys-Gly-Ala-Cys-Tryp

Cấu trúc bậc I ở vùng lân cận tâm hoạt động của bromelin, papain, ficin

Các enzym này đều là các protease có tâm hoạt động chứa cystein với cầu nối

-S-S- (disulfur) giữa 2 sợi peptit với nhau Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu Bromelin thân có một nhóm sulfur hydryl cần cho hoạt tính xúc tác và 5 cầu nối disulfit ở mỗi phân tử

Ngoài ra trong bromelin thân còn có sự hiện diện của ion Zn2+ với hàm lượng

2 mg/g enzym, có thể đóng vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzym

2.3.3) Hoạt tính của bromelin [2,10]

Bromelin có ba loại hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase Nói chung hoạt tính esterase ở bromelin trội hơn papain và ficin

Bảng 3: Hằng số Michaelis (pH=6, t0 =5 0 C ) với các cơ chất khác nhau

Cơ chất Enzym

BAA BAEE BAME

Bromelin thân 1,2.10-3 17.10-1 3,2.10-2

* BAA:Benzoyl-L-Arginin Amit

* BAEE: Benzoyl-L-Arginin Ethyl- Ester

* BAME: Benzoyl-L-Arginin Methyl- Ester

Như vậy hằng số xúc tác của bromelin đối với BAEE gấp 140 lần so với BAA khác hẳn với trường hợp papain và ficin Người ta cho rằng đó là do cơ chế xúc tác khác nhau

Theo Octa thì bromelin có hoạt tính phân hủy casein mạnh hơn papain và ficin Bromelin thân lại mạnh hơn bromelin quả Điều này được thể hiện ở bảng sau:

Bảng 4: Hoạt tính phân giải casein và BAA của bromelin và papain (UI/mg)

Bromelin thân có nhiều cơ chất đặc trưng và có thể thủy phân các cơ chất tổng hợp và cơ chất tự nhiên Cơ chất tổng hợp được sử dụng nhiều nhất là BAEE, BAA, N-benzoyl-L-arganine metyl ester (BAME) …

Khả năng thủy phân của bromelin đối với các protein khác nhau là khác nhau Sự thủy phân của bromelin tốt nhất là trên cơ chất casein và azocasein, còn albumin

của máu bò thì kém hơn nhiều

2.3.4) Cơ chế tác động của enzym bromelin [10]

Hiện nay, chưa có tài liệu nào mô tả cấu hình trong không gian của bromelin nên chưa biết được 2 tâm hoạt động của nó sắp xếp ra sao Tuy nhiên, trong cấu trúc bậc 1, histidin và cystein ở xa nhau (cách nhóm imidazol của histidin 5A0 ), nhưng có lẽ chúng đứng gần nhau trong cấu hình không gian, nên đều có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của bromelin

Tuy nhiên hầu hết các tác giả đều thừa nhận rằng vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole hay nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelin Thật vậy, nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với các nhóm cacboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptit bị cắt) Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid α và chuyểån cho nước hoặc sang nhóm anion

của chất nhận khác Cầu -S-S- có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelin

Dựa theo pKa của cystein và histidin, pH của bromelin nằm trong khoảng 7,3÷8,8 nhưng kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính của bromelin thể hiện ở 3 đỉnh :

Bromelin thô có tác động như một cacboxyl-peptidase (từ dịch tụy) thủy phân lên các liên kết peptit tận cùng cạnh nhóm cacboxyl tự do của cơ chất, nhất là khi acid amin tận cùng có nhân thơm

Khi thủy phân protein, bromelin tác động nhiều nhất vào những nối có glyxin, alanin, lơxin, valin, phenylalanin, tyrosin

2.3.5) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym bromelin [2,10]

Giống như mỗi loại chất sinh học khác, bromelin cũng chịu ảnh hưởng bởi các yếu tố như: nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, phương pháp trích ly, phương pháp tinh sạch

Hoạt tính phân giải protein của bromelin phụ thuộc vào nhiều yếu tố Nói chung

ở dung dịch loãng không có cơ chất thì bromelin kém bền đối với nhiệt độ, ở trạng thái khô hoặc có cơ chất thì khá bền Nguyên lý này có ý nghĩa quan trọng trong khi ứng dụng và bảo quản

Chế phẩm bromelin có hoạt tính cực đại trong khoảng nhiệt độ 50 – 600C Bromelin có biên độ pH3 – 10 nhưng pH thích hợp cho hoạt tính còn tùy thuộc vào từng cơ chất ( pH5 – 6 đối với gelatin và hemoglobin, pH7 – 8 đối với casein)

Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym

Như đã biết bromelin thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có chứa nhóm –SH, do vậy các chất có chứa nhóm –SH đều là chất hoạt hóa bromelin Ngược lại, bromelin bị ức chế bởi các muối thủy ngân, iodaxetat

Bảûng 5: Aûnh hưởng của các chất hoạt hóa lên chế phẩm bromelin [2]

Tên chất hoạt hóa

Nồng độ (M )

Hoạt tính của bromelin (%)

Bảng 6: Một số chất ức chế hoạt động của bromelin [2]

Hoạt tính của bromelin phụ thuộc nhiều vào trạng thái và điều kiện bảo quản nguyên liệu Nguyên liệu tươi mặc dù được giữ ở 40C, nhưng hoạt tính thủy phân giảm đi gần 50%, còn nguyên liệu được sấy khô ở 400C thì có thể bảo quản lâu dài hơn

Bảng 7: Hoạt tính bromelin theo điều kiện bảo quản [2]

Hoạt tính đặc hiệu UI/mg proteinĐiều kiện bảo quản

Dịch chiết Đông khô

Bảo quản ở 400C (5 ngày) 830 630

Tên chất ức chế Nồng độ (M) Hoạt tính bromelin (%)

2.4) CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CỦA BROMELIN

2.4.1) Sử dụng bromelin trong quá trình làm đông tụ sữa[2,10,27,28,29,32,33]

Thông thường để sản xuất các sản phẩm phomát, người ta sử dụng enzym đông tụ là renin thu nhận từ dạ dày bê Tuy nhiên, cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp chế biến sữa, lượng renin không đủ đáp ứng cho nhu cầu sản xuất phomát

Do đó trong những năm trở lại đây, xu hướng sử dụng protease thực vật trong công nghiệp sản xuất phomát ngày càng phát triển Hiện nay, ngoài enzym ficin (từ các loại cây cọ ficus), các nghiên cứu còn quan tâm đến việc sử dụng enzym bromelin vào mục đích này Các nghiên cứu cho thấy hoạt độ đông tụ sữa của bromelin xấp xỉ papain và kém hơn ficin 1/3 lần Bromelin thường được sử dụng để sản xuất phomát mềm được ăn ở dạng tươi

2.4.2) Sử dụng bromelin để thủy phân protein[2,10]

Các enzym thương mại có mức độ ứng dụng rất đa dạng và hiệu quả trong lĩnh vực y dược và công nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm, protease là công cụ xác định cấu tạo, khả năng hòa tan và những tính chất chức năng khác nhau của thịt và cá

Kế đến enzym protease còn dùng để biến đổi protein phế liệu thành dịch thủy phân giàu acid amin phù hợp với sự tiêu thụ của người hay làm thức ăn gia súc

Bromelin còn được dùng để thủy phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ dạng ống Gan được xư ûlý bằng enzym bromelin trong 10 giờ ở 550C, sau đó xử lý bằng nhiệt ở 100oC trong 3 - 5 phút Dịch thủy phân được lọc, sấy thăng hoa

2.4.3) Sử dụng bromelin để thu nhận các chất ức chế protease [2]

Trong tế bào cơ quan động thực vật tồn tại các chất ức chế enzym, trong đó có chất ức chế protease Các chất ức chế trong tế bào thường có bản chất protein như enzym Hiện nay trong công nghiệp và trong y tế thường sử dụng rộng rãi các chất ức chế này Chế phẩm bromelin được sử dụng để thu nhận các chất ức chế protease có chứa nhóm –SH

2.4.4) Các lĩnh vực ứng dụng khác [2,7,10]

Ngoài các ứng dụng đã nêu ở trên, bromelin còn được ứng dụng trong sản

xuất thực phẩm như làm mềm thịt, thủy phân trong sản xuất nước mắm, sản

xuất bột cá, làm trong rượu bia

Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hóa protein, bromelin được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hóa tự nhiên Những dược phẩm chứa bromelin và các protease khác như lipase, amylase và những chất bổ hay chất sinh tố

Trong giải phẩu thẩm mỹ người ta thường dùng bromelin để giảm những mô phù, bầm hay biến chứng sau khi mổ

Trong da liễu, người ta còn dùng bromelin để điều trị các vết thương ngoài da hay những đụng chạm làm chảy máu, bầm, phù, làm độc đau đớn, phỏng nặng có thể được làm sạch bằng cách thoa kem có bromelin, làm cho mau lành

Người ta biết rằng tiêm bromelin thường thúc đẩy sự tạo thành kháng thể, nên nó được sử dụng nhiều trong huyết miễn dịch học

3) GIỚI THIỆU CÂY DỨA [3,6,10]

3.1) NGUỒN GỐC CÂY DỨA

Cây dứa thuộc họ Bromeliaceae (lớp đơn tử diệp) và chính xác hơn là thuộc giống Ananas, giống này cùng với giống lân cận Pseudananas, khác biệt với các giống khác trong họ ở chỗ “quả “ dứa là một quả kép (gồm nhiều quả nhỏ hợp lại với các lá bắt ở dưới và trục hoa) trong khi đó ở các giống khác, các quả nhỏ đứng rời tự do Hiện nay các giống đang trồng đa số thuộc loài Ananas Comosa

Dứa là một loại cây thảo quanh năm Sau khi thu hoạch quả, các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước: cũng cho một quả thứ hai thường bé hơn quả trước; các mầm nách của cây con lại phát triển lên và cho một quả thứ ba

3.2) QUẢ DỨA

Trong quả dứa chứa rất nhiều nước ( khoảng 80÷86%) Ngoài ra còn rất nhiều các thành phần khác: 10÷18% cacbohydrate (trong đó 60÷67% đường sacarose,

30÷40% đường glucose và fructose); 2÷3% protein; 0.3% tro; 0.03÷0.6% sắc tố; 0.1÷1.6% acid hữu cơ (trong đó có 87% là acid citric và 13% là acid maleic) và các hợp chất phenolic (tạo màu); nhiều pectin ester hóa; các hợp chất tạo mùi (ester: aliphatic, fumaric, terpenic)

Trong quả dứa còn chứa nhiều sinh tố: vitamin A (0.3mg caroten/100g nước dứa), vitamin B1 và vitamin C (8.5mg/100g nước dứa) nhưng không có vitamin D

Ngoài ra trong quả dứa còn có sự hiện diện của enzym bromelin, là enzym thủy phân protein Vì vậy quả dứa dùng để ăn tươi, cắt lát đóng hộp, làm mứt hay làm bánh kẹo rất tốt, dứa còn giúp tiêu hóa dễ dàng

Cây dứa sau khi thu hoạch quả thì thân và lá có thể sử dụng vào nhiều mục đích khác như :

+ Làm giấy, phân bón hay lấy sợi để dệt

+ Thu nhận enzym bromelin từ thân hay chồi ngọn dứa (trung bình 378 lít nước ép rút từ thân dứa thu được 3.6 kg bromelin)

+ Trích ly vitamin C từ chùm lá non của ngọn

+ Dùng trong chăn nuôi: trung bình 1 tấn quả dứa sau khi ép lấy nước cốt còn lại bã có thể chế biến thành 30 kg thức ăn gia súc Ngọn quả dứa, các lá khô hoặc tươi hay toàn bộ thân cây dứa sau thu hoạch có thể xay thành bột, làm thức ăn cho gia súc rất tốt

Bảng 8 : Thành phần các thuộc phẩm khác nhau của dứa

dùng làm thức ăn gia súc

Thành phần chồi ngọn Tươi Ủ hầm

Thành phần bột toàn cây

4) TỔNG QUAN VỀ SỮA

4.1) ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA SỮA [13, 17, 25]

Sữa là chất lỏng sinh lý do các tuyến sữa tổng hợp được từ các hợp chất có

trong máu Sữa có đầy đủ các chất dinh dưỡng cấn thiết cho sự phát triển của cơ thể Những chất này có khả năng đồng hóa cao vì vậy từ lâu con người đã biết sử dụng sữa như một loại thực phẩm quý rất bổ dưỡng cho cơ thể nhất là trẻ sơ sinh

Về phương diện lý học, sữa là một hệ thống phức tạp, là một huyền phù các hạt keo trong pha phân tán là nước Các hạt thường bao gồm các cầu béo (có đường kính 3-5μm) và các mixen protein (có đường kính khoảng 0.1μm) vốn được tạo ra

do tương tác giữa casein và các protein khác, giữa các protein và các muối vô cơ có mặt trong pha nước Chính những hạt lơ lửng này đã tạo ra độ đặc và màu trắng của sữa Màu trắng sữa là do sự khuếch tán ánh sáng bởi các mixen protein

4.2) THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA SỮA [13, 17, 25 ]

Sữa là một hỗn hợp nhiều chất phân bố ở trạng thái khác nhau Thành phần hóa học của sữa gồm có: khoảng 87% là nước và 13% là chất khô Chất khô là các chất lơ lửng hay hòa tan vào trong nước Chất khô thường có trong sữa là protein, chất béo, đường sữa, chất khoáng, enzym, chất khí, đặc biệt có một số chất miễn dịch và hormon kích thích… Tỉ lệ giữa các thành phần quyết định chất lượng của sữa và nó phụ thuộc vào loài, điều kiện nuôi, mùa, tính chất địa lý, tình trạng sức khỏe, chu kỳ tiết sữa… Các thành phần có trong sữa được ước lượng như sau:

+ Chất béo: khoảng 4%

+ Đường lactose: khoảng 4,7%

+ Protein: khoảng 3.5% (casein chiếm 3/4)

+ Chất khoáng: 0,65% bao gồm Ca, P, Mg, K, Zn…

+ Acid: 0,18% bao gồm citrate, acetate, formate, lactate, oxalate… + Enzym: Lipase, Esterase, Catalase, Phosphatase, Peroxydase… + Vitamin: A, B1, B2, C,D, Riboflavin…

+ Khí: oxygen, nitrogen…

4.2.1) Protein [13, 17]

Protein là nhóm hợp chất hữu cơ quan trọng nhất của sữa Protein của sữa là những protein hoàn thiện Trong thành phần protein của sữa có 19 loại acid amin khác nhau, trong đó có đủ những acid amin không thay thế

Protein sữa gồm có: casein, lactoalbumin, lactoglobulin

Trung bình 1 lít sữa có từ 30÷35 g protein Gần 80% lượng protein này tồn tại dưới dạng phức cao phân tử có chứa canxi photphat gọi là mixen Các casein chủ yếu là ở dạng mixen có chứa gần 8% hợp chất vô cơ, trong đó lượng canxi chiếm 27% tổng lượng canxi có mặt trong sữa (1,2 g/l) Có thể tách Ca2+ ra bằng ly tâm hoặc bằng kết tủa đẳng điện ở pH 4,6

4.2.1.1) Casein [13, 17, 31, 34, 35, 36]

Casein là nhóm protein chủ yếu trong protein của sữa Nó bao gồm nhiều loại casein khác nhau: αs-casein, β-casein, κ-casein α-casein là thể phức hợp phosphoryl gồm có: αs1,αs2, αs3, αs4, αs5, αs6-casein β-casein là thành phần chủ yếu có trong sữa bò nhưng lại là thứ yếu trong sữa người κ-casein là một glycoprotein và nó hiện diện khắp nơi trong thể mixen casein chính vì vậy mà mixen ở trạng thái ổn định Ngoài ra còn có γ-casein, đây là một dạng proteose pepton của sữa Các dạng casein trong sữa kết hợp với nhau tạo thành dạng keo casein Các hạt keo casein có dạng hình cầu đường kính từ 500 ÷3000 A0, đường kính phổ biến là từ 1020 ÷1600 A0 Xung quanh các hạt keo mixen casein có các protein β lactoglobulin cùng carbohydrate bao quanh Cấu trúc của một hạt keo mixen casein có thể mô tả như sau: Các dạng casein kỵ nước kết hợp với nhau tạo thành một khối cầu tạo thành lõi kỵ nước, trên bề mặt của khối cầu có κ-casein là protein háo nước bám vào có nhiệm vụ tạo sự hòa tan của các hạt keo Cũng có các hạt keo mà trên bề mặt không có lớp κ-casein bao bọc và chúng nằm ở trong các mixen casein Các hạt keo mixen liên kết với nhau bởi cầu nối calcium phosphate tạo ra dạng siêu mixen keo Kích cỡ của các hạt siêu mixen keo tùy thuộc vào số hạt keo, thông thường hạt siêu mixen keo chứa khoảng 400

Hình 3: Cấu tạo thể casein của sữa

Một số dạng casein chính có trong sữa:

+ Casein αs1: cóù 199 gốc axitamin Do sự phân bố các phần tích điện và các phần

ưa béo không đồng đều do đó phân tử có tính chất một lưỡng cực: một cực cầu và một cực tích điện Trong αs1-casein có ba đoạn ưa béo (1-44, 30-113 và 132-199) và một phần được phosphoryl hóa mang điện tích âm (gốc 41-80)

+ Casein αs2: có 207 gốc axitamin, là casein háo nước nhất trong họ casein vì trong phân tử chứa nhiều nhóm phosphoryl nhất (10-13 gốc/mol) và cũng nhiều các gốc cation nhất Các gốc phosphoryl nhóm lại thành ba cực (gốc 8-16, 56-61, và 129-133) còn phần ưa béo nằm ở đầu cuối C (160-207) và nằm ở giữa (90-120) Trong cấu trúc như thế các tương tác tĩnh điện rất quan trọng, rất nhạy với ion Ca2+ cũng như rất phụ thuộc vào pH

+ Casein β: có 209 gốc axit amin, là một casein có tính ưa béo nhất Số gốc prolin nhiều và lại phân bố đồng đều khiến cho phân tử có cấu trúc kém trật tự

+ Casein κ: có 169 gốc axitamin nhưng chỉ có một gốc phosphoryl do đó liên kết được ít ion Ca2+ và độ hòa tan không bị ảnh hưởng bởi ion này

Casein κ cũng có đặc tính lưỡng cực: đầu cuối N ưa béo trong khi đầu cuối C chứa gluxit thì lại rất ưa nước

Khi casein κ bị tác động bởi enzym làm đông tụ sữa có tên là chymozin thì việc đầu tiên là enzym này sẽ phân cắt một liên kết peptit giữa gốc Phe105 và gốc Met106 để giải phóng ra đầu cuối N rất ưa béo (từ gốc 1-105) gọi là paracasein κ và đầu cuối C háo nước (từ gốc 106-169) có chứa gốc phosphoryl và glucozyl

Paracasein κ rất ưa béo và có trật tự, đặc biệt là các vùng cấu trúc lá xếp rất thuận lợi cho chimozin tác dụng cũng như dễ đông tụ do tương tác ưa béo gây ra

4.2.1.2) Lactoglobulin [17]

Lactoglobulin hay còn gọi là globulin sữa có trong sữa khoảng 0,1% theo khối lượng và chiếm tỉ lệ 3% so với lượng protein chung Globulin sữa có nhiều trong sữa non, thuộc loại protein đơn giản và là protein hoàn thiện Trong sữa, globulin tồn tại dưới dạng keo và có độ phân tán kém hơn so với albumin sữa Lactoglobulin có trọng lượng phân tử khoảng 18.000

Globulin có ba dạng đồng phân: β lactoglobulin, epglobulin và pseudoglobulin Chúng khác nhau về khả năng hòa tan trong nước và tính kháng trùng

β lactoglobulin không tan trong nước, hòa tan tốt trong dung dịch muối loãng, epglobulin tan trong nước khi có mặt của muối Pseudoglobulin hòa tan trong

nước nguyên chất

4.2.1.3) Lactoalbumin [17]

Lactoalbumin hay còn gọi là albumin sữa có trong sữa ở dạng dung dịch keo Về cấu tạo thuộc loại protein đơn giản, trong phân tử không chứa canxi và phốt pho, chứa nhiều liên kết -S-S-

Lactoalbumin có ba dạng đồng phân: α, β, và γ

Hàm lượng latoalbumin khoảng 0,5 – 1% theo khối lượng, và chiếm 14% so với lượng protein chung, có nhiều trong sữa non Khác với casein nó tồn tại trong sữa

ở dạng hòa tan, dưới tác dụng nhiệt cao bị kết tủa Trong môi trường acid, khi gia tăng nhiệt độ thì mức độ đông tụ nhanh Các enzym làm đông tụ casein không có khả năng làm đông tụ lactoalbumin Khi đun nóng sữa đến nhiệt độ lớn hơn 700C, albumin sữa sẽ bị kết tủa Sự keo tụ của albumin sữa phụ thuộc vào nhiệt độ và thời gian đun nóng Nếu thời gian đun nóng kéo dài, sự đông tụ có thể xảy ra ngay ở nhiệt độ 600C Trọng lượng phân tử của lactoalbumin vào khoảng 15.000 Trong sữa nó có độ phân tán cao hơn casein vì các tiểu phân keo albumin tồn tại

ở trạng thái phân tử Lactoalbumin hòa tan tốt trong nước và các dung dịch acid hoặc bazơ yếu Khả năng đồng hóa của lactalbumin cao hơn so với casein Độ đồng hóa của lactoalbumin là 97%, của casein là 95%

Lactoalbumin không bị đông tụ bởi enzym đông tụ sữa

4.2.1.4) Các dạng protein còn lại

+ Immunoglobulin tham gia vào hệ thống miễn dịch, có chứa các dạng IgG1,

IgG2, IGA và IGM

+ Lactoferrin là thành phần kháng vi khuẩn

+ Lysosyme có nhiệm vụ phân giải carbohydrate polymer của tế bào vi khuẩn

Bảng 9: Tính chất sinh hóa một số loại protein sữa

Protein Tỉ lệ % trên

sữa tách béo

Điểm đẳng điện Trọng lượng phân tử

Số lượng axit amin

4,100-4.2.2) Chất béo trong sữa [17, 30]

Chất béo trong sữa chứa triglycerit, di-glycerit, mono-glycerit, acid béo, sterol,

caroten, vitamin hòa tan trong chất béo… Trong đó triglycerit chiếm 98 - 99%

còn 1 - 2% là của các chất còn lại

Trong sữa chất béo tồn tại ở dạng nhũ tương, đó là dạng những hạt sữa béo phân

tán trong huyết thanh sữa Đường kính của những hạt đó từ 0,1 đến 20 μm, trung

bình là 3 đến 4 μm và có khoảng 15 tỉ hạt béo trên 1 ml Chất béo tồn tại trong

sữa ở dạng nhũ tương là do các hạt béo được bao bọc bởi một lớp màng rất mỏng

(dày từ 5- 10nm) Lớp màng này bao gồm phospholipid, lipoprotein, cerebroside,

protein, axit-nucleic, enzym, các nguyên tố kim loại và một lượng nước hạn chế, nếu lớp màng này bị phá vỡ thì tính liên kết với nước của béo bị mất đi và các hạt béo sẽ bị nổi lên trên mặt nước do có khối lượng riêng nhẹ hơn nước

Với tính chất hút bám của các hạt sữa béo đối với protein mixen nhất là casein mixen đã một phần nào giải thích lý do về hoạt độ đông tụ sữa của enzym đông tụ thấp khi cơ chất là sữa béo

4.2.3) Carbohydrate [17]

Thành phần carbohydrat trong sữa chủ yếu là đường lactose, đường lactose là một disaccarit, nó được tạo thành do sự kết hợp của hai loại đường đơn là D-glucose và D-galactose qua cầu nối β-1,4 glucozit Ngoài ra còn có các đường

đơn khác chiếm tỉ lệ thấp như glucose, fructo và galactose

Lactose chỉ có ở trong sữa nên còn được gọi là đường sữa Lactose thuộc loại đường dễ tiêu hóa và có độ đồng hóa cao, tới 98% Lactose bị thủy phân dưới tác dụng của axit, nhiệt độ và enzym lactaza

Trong sản xuất phomat hầu hết lượng đường lactose còn lại tan trong dung dịch lactoserum

4.2.4) Chất khoáng và vitamin [17]

Trong sữa, thành phần khoáng rất phong phú, có tới 25 nguyên tố trong nhóm đa lượng và 40 nguyên tố trong nhóm vi lượng Các nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần của enzym, vitamin và các chất miễn dịch Các nguyên tố đa lượng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất trong cơ thể nhất là phốt pho và canxi

Hàm lượng vitamin trong sữa không nhiều nhưng có đầy đủ các vitamin cần thiết cho sự tồn tại và phát triển của cơ thể Trong sữa có hầu hết các vitamin hòa tan trong nước như: B1, B2, B12, E và các vitamin hòa tan trong chất béo như A, D Hàm lượng các vitamin tan trong chất béo trong sản phẩm phomát phụ thuộc vào hàm lượng béo và hàm lượng vitamin tan trong chất béo

Bảng 10: Thành phần khoáng và vitamin trong sữa

Nguyên tố

vi lượng

Hàm lượng (mg/kg sữa)

Nguyên tố

đa lượng

Hàm lượng (mg%)

Vitamin Hàm lượng

4.2.5) Hệ enzym có trong sữa [17]

Thành phần enzym trong sữa rất đa dạng gồm các loại nằm trong nhóm thủy

phân như: lipaza, fotfataza, amilaza; nhóm oxy hóa khử: oxydaza, peroxydaza;

nhóm phân hủy catalaza

4.2.6) Các chất miễn dịch có trong sữa [17]

Ở trong sữa có rất nhiều chất miễn dịch khác nhau Sữa non có nhiều chất miễn

dịch hơn sữa thường Các chất miễn dịch không bền vững Ở nhiệt độ 60 – 700C

hầu hết các chất miễn dịch bị phá hủy

4.2.7) Các chất khí [17]

Trong sữa tươi thường có chứa một số các chất khí, như khí nitơ, khí cacbonic, khí

oxy… Hàm lượng các chất khí trong sữa không nhiều, trung bình khoảng 70ml/1

lít sữa Sự có mặt của chất khí gây trở ngại cho quá trình gia nhiệt, làm sản phẩm

dễ bị trào bọt khi thanh trùng và khử trùng

4.3) CẤU TRÚC MIXEN CỦA CASEIN [13]

4.3.1) Khuynh hướng tự liên kết của các casein

Do sự phân bố không đồng đều các điện tích và các mạch bên không cực dọc

theo chuỗi polypeptit nên các casein tự thân đã có một độ tập hợp rất cao (ngay

cả khi vắng mặt các ion vô cơ), cao hơn cả các protein hình cầu

Casein β có khả năng tự liên kết cao nhất Nhiệt độ có ảnh hưởng rất đáng kể: dưới 40C, casein β hoàn toàn bị khử trùng hợp là do có nhiều tương tác ưa béo bị phá hủy

Casein κ tự liên kết với nhau khá dễ dàng để tạo ra những mixen hình cầu với

đường kính 11 nm, có độ trùng hợp là 30, có cấu trúc rất nhiều nước và rất chùng,

chứng tỏ các mixen khá hòa tan

Casein αs có khả năng tự liên kết rất mạnh nhưng không tạo được mixen Các liên hợp tạo ra ở đây là do tương tác ưa béo hoặc là do tương tác tĩnh điện trong trường hợp với casein αs2 ( do sự phân bố không đồng đều các điện tích dương và âm trong mạch)

Sự tự liên kết này có vai trò rất quan trọng nhưng không phải là duy nhất trong việc hình thành và ổn định của mixen casein Do cấu trúc rất chùng của mixen casein κ mà người ta cho rằng các casein khác không hòa tan được khi có mặt canxi sẽ được vùi trong lòng của mixen casein κ

4.3.2) Khuynh hướng cố định các ion của các casein

Một trong những tính chất quan trọng nhất của casein αs và casein β là khả năng cố định các cation hóa trị hai ( chủ yếu là canxi) rồi sau đó kết tủa Tỉ lệ cố định phụ thuộc vào số vùng để cố định, vào nồng độ ion canxi của môi trường, vào nhiệt độ, pH và lực ion Khả năng cố định Ca2+ sẽ giảm khi pH giảm và khi lực ion tăng Hầu hết Ca2+ được đính chủ yếu vào các nhóm phosphoryl Khi nồng độ canxi cao, nó cũng có thể được đính vào các nhóm cacboxyl đã ion hóa

Người ta thấy có một nồng độ giới hạn của canxi mà ở ngoài nồng độ này phức casein-Ca2+ sẽ kết tủa Khi đính ion Ca2+ vào sẽ giảm sự tích điện âm và do đó làm giảm lực đẩy tĩnh điện

Với casein αs1, việc thêm Ca2+ sẽ làm giảm điện tích âm và bắt đầu kết tủa khi hình thành các tiểu phần octame

Casein β cố định Ca2+ và kết tủa ở ngưỡng nồng độ Ca2+ bé hơn nhiều so với casein αs1 và cũng phụ thuộc vào mức độ liên hợp của protein (rất ưa béo) Nhiệt độ có ảnh hưởng đến hiện tượng này do làm ảnh hưởng đến các tương tác ưa béo

Casein κ thường làm suy giảm các phản ứng này, tránh kết tủa và cũng làm vai trò chất ổn định Khi có mặt một lượng nhỏ canxi thì casein κ có thể tự liên hợp với các casein αs và β để tạo ra những mixen tổng hợp rất giống với những mixen tự nhiên nhưng kém bền hơn Kích thước của những mixen này phụ thuộc vào tỉ lượng casein κ và nồng độ canxi

4.3.3) Cấu trúc của mixen tự nhiên

Trong sữa các casein tương tác với nhau và với các ion hoặc với các muối (đặc biệt là canxi phosphat ) để tạo ra các phức hợp mixen có đường kính thay đổi từ 20-300 nm phụ thuộc vào các nhân tố khác nhau (loài, giống, giai đoạn lấy sữa ) Các mixen tự nhiên này thường chứa 8% muối (chủ yếu là canxi và phospho) và các hợp phần protein khác nhau: casein αS1, αS2, β và κ với tỷ lệ 3:1:3:1

Các mixen này lại được tạo ra từ các siêu mixen hình cầu có đường kính từ 15 đến 20 nm sắp xếp lại thành hình một quả dâu Mỗi siêu mixen là kết quả tương tác ưa béo giữa các hợp phần Ơû mỗi mixen hình như không có muối vô cơ trừ ở trên bề mặt có các ion canxi đính vào gốc phosphoseril Các siêu mixen dính kết với nhau nhờ canxi phosphat và magiê phosphat là chất kết dính trong đó có tỷ lệ (Ca + Mg)/P =1.58 Dưới dạng vô định hình này, canxi được casein làm bền nên không bị biến hình thành hiđroxyapatit

Mỗi siêu mixen chứa gần một chục hợp phần casein và có khối lượng phân tử trung bình là 250,000

Casein κ thường được định vị chủ yếu ở trên bề mặt các mixen vì khi xửû lý các mixen bằng pepxin hoặc chimozin không hòa tan (không thể xâm nhập vào lòng mixen được ) thì gần như toàn bộ casein κ bị thủy phân, còn các casein khác thì không hề bị biến đổi

Các casein αS và β được phân bố ở trong lòng các mixen dưới dạng liên kết với canxi phosphat keo, có điều là người ta chưa biết được cách sắp xếp của chúng

một cách chính xác Cấu trúc của mixen khá mềm đến mức một đại phân tử đồ sộ như cacboxypeptidase A vẫn có thể chui được vào trong mixen để tấn công lên các casein αS và β Thêm nữa, bề mặt của mixen rất thấm vì những thay đổi

nhỏ nhất của môi trường xung quanh đều dẫn đến sự trao đổi các chất vô cơ hoặc các protein giữa tâm của mixen và môi trường này Các nghiên cứu bằng nhiễu xạ tia X cũng cho thấy canxi phosphat có mặt ở mixen dưới dạng vô định hình

4.3.4) Độ bền của mixen

Các mixen có thể chịu được nhiệt độ trên 1000C cùng là sự đồng hóa rất nghiêm ngặt nhưng lại dễ dàng bị khử bền khi thành phần huyết thanh có sự thay đổi chút

ít

4.3.4.1) Ảnh hưởng của nhiệt độ và môi trường

Khi bảo quản sữa ở nhiệt độ thấp (40C đến 70C ) các mixen tự phân ly từng phần thành các siêu mixen và sau 24 giờ có thể giải phóng ra tới 50% casein β Khi được gia nhiệt, casein β sẽ tự liên kết trở lại một cách chậm chạp với các mixen này Có điều là người ta chưa biết nó có kết hợp vào vị trí ban đầu hay không Nếu nâng nhiệt độ lên thì casein hòa tan (cấu hình chính của casein β ) sẽ bị giảm liên tục Do đó khi đã sử dụng sữa đã được làm lạnh để làm phomat sẽ làm tổn thất casein hòa tan và hiệu suất sản phẩm

Độ bền của mixen với nhiệt độ sẽ tăng lên khi hàm lượng casein κ tăng hoặc khi hàm lượng canxi phosphat keo giảm

Khi đưa pH của các casein đến pI (trung bình 4,6) sẽ làm tăng lực hút tĩnh điện trong cùng một phân tử và giữa các phân tử protein mà chung qui là để khử bền phần khoáng của mixen Casein đẳng điện và đã khử khoáng này sẽ trở nên không tan Việc khử canxi bằng các tác nhân tạo phức như citrate, phosphat hoặc EDTA sẽ chọc thủng các mixen casein Nếu khử một phần canxi, sẽ gây tổn thất casein β và làm tăng kích thước của các mixen Do đó người ta giả thiết rằng mixen gồm một mạng lưới casein αs và κ trong đó casein β chỉ đóng vai trò chất

làm đầy Còn sự tăng kích thước chỉ có thể giải thích là do các ion Ca2+ đã gây ra một hiệu ứng co bằng cách hình thành các cầu ion Các chất hữu cơ như etanol cũng có thể khử bền các mixen, nhất là khi ở pH < 6,1

4.3.4.2) Tác dụng của protease đông tụ

Độ bền của mixen phụ thuộc vào tỉ lệ casein κ Do đó khi những enzym như chimozin, pepxin hoặc một số protease có nguồn gốc động vật, thực vật và vi sinh vật tấn công đặc hiệu lên casein này sẽ dẫn đến khử bền các mixen:

liên kết với mixen Phe Met hòa tan

Vị trí tấn công của chimozin

Khi protease hoạt động cắt liên kết Phe105 – Met106 của κ casein thì sẽ giải phóng

ra một glucopeptid hòa tan và một phần para – casein κ không tan liên kết ngay với các mixen gốc và tạo ra một tập hợp đông tụ Phần glucopeptid là phần chứa các aminoacid từ 106 đến 169, trong đó chiếm ưu thế là các aminoacid có cực và cacbohydrate Phần para-casein bao gồm các aminoacid từ 1 đến 105

Sự đông tụ có thể được giải thích là do loại bỏ phần caseino-glucopeptid, làm giảm sự tích điện bề mặt của mixen đi gần một phần ba và do đó làm giảm lực đẩy tĩnh điện giữa các mixen Bề mặt của các mixen trở nên rất ưa béo do sự chiếm ưu thế của para-casein κ và do đó mà các mixen liên hợp lại một cách dễ dàng hơn Các tương tác ion cũng có thể xãy ra giữa phần tích điện dương của para-casein κ và phần tích điện âm của casein αs và β Các cầu canxiphosphat cũng có thể được thiết lập giữa các mixen

Người ta thừa nhận rằng sự đông tụ chỉ xãy ra khi có trên 80% casein κ của mixen bị thủy phân bởi enzym Nói chung thời gian đông tụ ở 350C tương ứng với thời gian phản ứng của enzym Nếu nhiệt độ bé hơn 150C thì thời gian sẽ phụ

thuộc vào hiện tượng tập hợp mixen là chính

5) SẢN PHẨM PHOMÁT

5.1) ĐỊNH NGHĨA [28]

Phomát là khối đông tụ từ nguyên liệu sữa, là một loại vật chất hình thành từ quá

trình đông tụ sữa, sau đó có sự tách nước từ khối đông và được cho vào khuôn ép

5.2) NGUỒN GỐC VÀ LỊCH SỬ PHOMÁT [37]

Việc chế biến phomát lần đầu tiên cách đây 8000 năm tại vùng thung lũng Tigris-Euphrates (nay thuộc quốc gia Iraq) do sự tình cờ dùng các túi đựng nước làm bằng bao tử cừu, heo, bò để đựng sữa của những người dân du mục Chính sự kết hợp ngẫu nhiên của hệ vi sinh vật có trong sữa, tuyến enzym bên trong bao tử cùng với nhiệt độ ấm đã tạo ra phomát nguyên thủy Về sau do sự khám phá ra nhiều châu lục mới cùng với các cuộc di dân, phomát trở thành sản phẩm phổ biến trên thế giới Tuy nhiên việc sản xuất phomát chỉ phát triển mạnh mẽ vào cuối thế kỷ 19, khi những nhà máy lớn sản xuất phomát đồng loạt được xây dựng nhất là ở Thụy Sĩ, Pháp, Đức, Ý, Hà Lan, bán đảo Hà Lan cũng như Anh, Mỹ, Canada và Úc

5.3) PHÂN LOẠI PHOMÁT [37]

Ngày nay có khoảng 2000 loại phomát nhưng chỉ có khoảng 400 loại là được mô tả chính thức vào năm 1972 và đến năm 1999, các loại phomát được mô tả chính thức là 625 loại Do sự đa dạng của các loại phomát vì vậy có một hệ thống phân loại phomát FAO (the Food and Agrcultural Organisetion: tổ chức nông lương thế giới) và thị trường phomát đã phân chia phomát thành hai hệ thống như sau:

5.3.1) Dựa theo tính chất lý hóa của phomát

+ Phomát mềm (soft chesse): có độ ẩm từ 50-80% Ví dụ như Cottage, Baker,s, Quarg hàm lượng chất béo thấp

+ Phomát hơi mềm (semi- soft cheese): có độ ẩm từ 39-50% Ví dụ như Blue, Limburger, Pasta Filata…

+ Phomát cứng (hard cheese): có độ ẩm tối đa là 39% Ví dụ như Cheddar, Swiss, Stilton…

+ Phomát rất cứng ( very hard cheese): có độ ẩm tối đa là 34% Ví dụ như Asiago Old, Parmesan, Romano…

+ Dạng plasma Filata và dạng dai Ví dụ như Provolone, Mozzrella, Cacciocavallo…

+ Phomát làm từ lactoserum (lactoserum cheese): protein tủa của huyết thanh sữa (lactoserum) được xử lý bằng nhiệt hoặc bằng acid có độ ẩm vào khoảng 60% Ví dụ như Ricotta

Ngoài ra còn có các loại phomát đặc biệt khác như Caraway, Noekkelost, Kuminost… được làm từ enzym đông tụ sữa có nguồn gốc từ thực vật

5.3.2) Dựa theo tiến trình của kỹ nghệ sản xuất phomát

+ Tác nhân gây đông tụ là acid Ví dụ như phomát Cottage, Baker,s, Cream, Neufchatel

+ Tác nhân gây đông tụ sữa là các loại protease Ví dụ như phomát Cheddar, Pamesan, Pasta filata…

+ Theo công nghệ Ví dụ phomát theo công nghệ Swiss, Cheddar…

5.4) QUY TRÌNH SẢN XUẤT PHOMÁT [14,16, 39]

Phomát là sản phẩm lên men được chế biến từ sữa (sữa bò, sữa dê … ) với sự

tham gia của một số nhóm vi sinh vật Đây là một thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, bảo quản được lâu Trong phomát chứa: protein 20% ( dưới dạng pepton, acid amin), lipid 30%, các muối khoáng, và các vitamin (A, B1, B2, C…) Phomát có mùi vị thơm ngon, kích thích quá trình tiết dịch tiêu hóa, làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn cho cơ thể Phomát tuy chưa được sử dụng phổ biến ở Việt Nam, nhưng là một thực phẩm rất phổ biến và hợp khẩu vị của người châu Aâu,

châu Mỹ

QUI TRÌNH SẢN XUẤT PHOMÁT

Trộn Muối

Đổ khuôn, nén, ép

Để chín

Sản phẩm phomát

5.4.1) Giai đoạn làm đông sữa

5.4.1.1) Thanh trùng sữa

Sữa được thanh trùng bằng phương pháp Pasteur ở nhiệt độ 63-650C trong khoảng 15-16 giây Mục đích của việc thanh trùng là để tiêu diệt phần lớn các vi sinh vật gây hại cho người và làm hỏng phomát Thời gian và nhiệt độ thanh trùng tùy thuộc vào từng loại phomát

5.4.1.2) Bổ sung các chất và làm đông sữa

Sữa sau khi được thanh trùng sẽ được làm nguội ngay và cho thêm vào sữa những chất cần thiết như:

+ Cấy vi khuẩn lactic: mục đích là để tạo môi trường acid cho sữa, tạo điều kiện cho enzym hoạt động tốt hơn, ức chế vi khuẩn propionic phát triển trong quá trình

ủ chín phomát để tạo hương vị cho phomát

+ Các loại khoáng như CaCl2 : do Ca2+ bị hao hụt trong quá trình thanh trùng sữa + Các chất màu thực phẩm như: annato, β caroten hoặc paprika mục đích là tạo màu cho phomát đồng nhất vì màu của sữa thay đổi tùy theo mùa thu hoạch + Bổ sung thêm lipase trích từ dê con vì lượng lipase hao hụt trong quá trình thanh trùng và để thủy giải lipid để tạo mùi đặc trưng

Cho enzym đông tụ sữa vào với lượng vừa đủ, có thể sử dụng các loại enzym có nguồn gốc khác nhau (từ động vật, thực vật và từ vi sinh vật) Dưới tác dụng của enzym, casein và paracasein của sữa sẽ bị phân giải tạo pepton và amino acid (tyrosin, triptophan…) tập trung trong cục đông còn huyết thanh sữa ở bên ngoài cục đông tồn tại ở dạng dung dịch

5.4.2) Giai đoạn khử nước (ép tách huyết thanh sữa)

Quá trình tiến hành trong 20 – 24 giờ, ở nhiệt độ 35 – 500C Trong thời gian này, quá trình lên men lactic vẫn tiếp tục Sau khi tách huyết thanh , số lượng tế bào vi khuẩn trong 1 gam phomát đạt đến hàng tỉ Phomát lúc này có thành phần chủ yếu là casein và lipid Khi ép phần huyết thanh bị loại ra ngoài cục đông sữa có thành phần gồm đường lactose, lactoalbumin, lactoglobulin…

5.4.3) Giai đoạn muối phomát

Ngay sau khi tách huyết thanh sữa, phomát được ngâm vào bể nước muối NaCl