Nghiên cứu tinh sạnh pectinase từ canh trường aspergillus ficuum và khảo sát một số đặc tính của chế phẩm thu được

DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1 Các đơn vị cấu tạo của hợp chất pectin --- 8 Hình 2 Những phân đoạn của phân tử pectin và những điểm tấn công của enzym pectinesterase ---13 Hình 3 Sự kết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

- O 0 O -

NGUYỄN VÂN NGỌC PHƯỢNG

Đề tài

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH

PECTINASE TỪ CANH TRƯỜNG ASPERGILLUS FICUUM VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ

PHẨM THU ĐƯỢC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÃ SỐ NGÀNH : 2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6 NĂM 2002

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học : PGS TS ĐỒNG THỊ THANH THU

TS LÊ VĂN VIỆT MẪN

Người chấm nhận xét 1 : TS TRỊNH THỊ HỒNG

Người chấm nhận xét 2 : TS NGUYỄN KÍNH

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN

THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

ngày tháng năm 2002

LỜI CẢM ƠN

Chân Thành Cám Ơn

Cô Đồng Thị Thanh Thu, thầy Lê Văn Việt Mẫn đã nhiệt tình hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Quý Thầy, Cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách khoa TP Hồ Chí Minh đã trang bị những kiến thức cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập trong hơn 2 năm qua

Thành thật cám ơn

Các anh, chị cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành thí nghiệm

Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Tiền Giang đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận văn này

Gửi lời chào thân ái đến các bạn học viên cao học khóa 10 đã thảo luận, ủng hộ, động viên tôi trong thời gian thực hiện luận văn

ABSTRACT

In this study, some technological parameters of the pectinase extraction and

precipetation from the Aspergillus ficuum surface culture were determined

The enzyme extraction can be carried out by the culture/water ratio 1/3 in 60 minutes with continious agitation

Absolute ethanol can precipitate 78% pectinase from the enzyme aqueous solution and specific activity of the precipitated enzyme is about 0,22 units/mg protein

The enzymes were then purified by gel filtration (Sephadex G-75), 4 peak with hight pectinase activity were observed

The pH and temperature optimum of the produced pectinases were also determined (pHopt =4,4, topt = 450C)

Pectinase application to fruit juice treatment in order to reduce the pectin quanltily in juice gave the good effect

MỤC LỤC

Trang

Danh mục các bảng - 1

Danh mục các hình - 2

Lời mở đầu - 4

PHẦN I: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 1 Khái niệm chung về enzym - 5

1.1 Định nghĩa - 5

1.2 Hoạt tính của enzym - 5

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym - 6

2 Pectin - 7

2.1 Giới thiệu - 7

2.2 Cấu tạo của pectin - 7

2.3 Tính chất của pectin - 8

3 Enzym pectinase -10

3.1 Phân loại enzym pectinase -10

3.2 Cơ chế tác dụng của enzym pectinase -12

4 Pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật và các điều kiện sinh tổng hợp enzym -17

4.1 Enzym pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật -17

4.2 Điều kiện sinh tổng hợp các enzym pectinase ở vi sinh vật -19

5 Trích ly và làm sạch chế phẩm enzym -21

5.1 Trích ly enzym từ môi trường rắn -21

5.2 Kết tủa enzym -22

5.3 Lọc gel -24

5.4 Các phương pháp khác -27

6 Ứng dụng enzym pectinase -28

6.1 Ứng dụng trong sản xuất nước quả -28

6.2 Ứng dụng trong sản xuất rượu vang -29

6.3 Ứng dụng trong trích ly các dược liệu đông y -29

6.4 Ứng dụng trong sản xuất sợi đay, gay -30

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1 Nguyên liệu -31

2 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc -32

3 Sơ đồ nghiên cứu -32

4 Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzym -34

4.1 Trích ly enzym -34

4.2 Kết tủa enzym -34

4.3 Phương pháp lọc gel Sephadex -36

5 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của enzym pectinase38 6 Ứng dụng chế phẩm pectinase làm giảm hàm lượng pectin trong nước ép trái cây -39

7 Phương pháp phân tích -40

7.1 Xác định hoạt tính enzym pectinase bằng phương pháp so màu -40

7.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry -42

7.3 Xác định hoạt tính riêng -44

7.4 Xác định mức độ tinh sạch -44

7.5 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến -44

7.6 Xác định hàm lượng pectin trong nguyên liệu -46

7.7 Xác định độ nhớt của nước ép trái cây -47

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp hệ enzym pectinase theo thời gian -48

2 Trích ly enzym -49

2.1 Xác định tỷ lệ canh trường/dung môi (nước) và thời gian trích ly tối ưu -49

2.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly enym -52

3 Kết tủa enzym -53

3.1 Bằng dung môi hữu cơ -53

3.2 Kết tủa enzym bằng polyetylenglycol -58

3.3 Kết tủa enzym bằng muối sulfat amon -60

4 Phân đoạn chế phẩm enzym PC bằng phương pháp lọc gel Sephadex G-75 65

5 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của enzym pectinase 68

5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền của enzym -68 5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền của enzym -71

5 Ứng dụng enzym pectinase -74 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

1 Kết luận -77

2 Đề nghị -78 Tài liệu tham khảo -79

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Tính chất của một vài enzym pectinase từ thực vật và vi sinh vật -12

Bảng 2 Tính chất của enzym pectinesterase -13

Bảng 3 Tính chất của enzym endopolygalacturonase -15

Bảng 4 Tính chất của enzym polygalacturonatlyase -17

Bảng 5 Khả năng sinh tổng hợp các loại enzym pectinase ở vi sinh vật -18

Bảng 6 Bản chất của lưới lọc gel -25

Bảng 7 Pha dung dịch đệm phosphat -39

Bảng 8 Hàm lượng chất khô trong dung dịch theo thời gian trích ly -50

Bảng 9 Hoạt tính của enzym pectinase khi trích ly ở các tỷ lệ canh trường/dung môi khác nhau - 51

Bảng 10 Hoạt tính và hàm lượng protein trong dung dịch khi trích ly ở các giá trị pH khác nhau -52

Bảng 11 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng cồn tuyệt đối -54

Bảng 12 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng isopropanol -55

Bảng 13 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng aceton -55

Bảng 14 Hàm lượng protein của các chế phẩm thu được khi kết tủa enzym bằng các dung môi hữu cơ với các tỷ lệ khác nhau -56

Bảng 15 Hoạt tính của chế phẩm sau khi kết tủa bằng PEG -58

Bảng 16 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng muối sulfat amon -61

Bảng 17 Độ tinh sạch của chế phẩm khi tủa bằng các tác nhân khác nhau -62

Bảng 18 Hoạt tính riêng của enzym ở một số phân đoạn sau khi qua cột gel 67

Bảng 19 Độ tinh sạch của pectinase qua các bước thí nghiệm -68

Bảng 20 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc hoạt tính enzym theo nhiệt độ -69

Bảng 21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền hoạt tính enzym -70

Bảng 22 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzym ở các giá trị pH khác nhau -72

Bảng 23 Ảnh hưởng của pH đến độ bền hoạt tính enzym -73

Bảng 24 Sự thay đổi độ nhớt tương đối của nước ổi trong quá trình xử lý enzym -75

Bảng 25 Sự thay đổi hàm lượng pectin trong dịch quả sau 2 giờ xử lý enzym -76

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Các đơn vị cấu tạo của hợp chất pectin - 8

Hình 2 Những phân đoạn của phân tử pectin và những điểm tấn công của enzym pectinesterase -13

Hình 3 Sự kết hợp của ion Ca++ với các acid pectic để tạo thành kết tủa Ca-pectat -14

Hình 4 Sự xúc tác quá trình thủy phân bởi enzym polygalacturonase trên acid pectic -15

Hình 5 Sự phân hủy pectin bởi enzym pecticlyase -16

Hình 6 Sự phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel -24

Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu -33

Hình 8 Quy trình kết tủa enzym bằng muối sulfat amon và thẩm tích -35

Hình 9 Sắc ký lọc gel -37

Hình 10 Đồ thị biểu diễn quá trình sinh tổng hợp pectinase theo phương pháp nuôi cấy bề mặt -48

Hình 11 Sự thay đổi hàm lượng protein của dung dịch trong quá trình trích ly 50

Hình 12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường/ dung môi đến quá trình trích ly enzym pectinase -51

Hình 13 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly enzym pectinase -53

Hình 14 Hiệu suất thu hồi enzym pectinase trong quá trình tủa bằng các dung môi hữu cơ -56

Hình 15 Hoạt tính riêng của các chế phẩm thu được khi kết tủa enzym bằng các dung môi hữu cơ khác nhau -57

Hình 16 Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến hiệu suất thu hồi enzym và hoạt tính riêng của chế phẩm -59

Hình 17 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi enzym cao nhất khi sử dụng các tác nhân tủa khác nhau -62

Hình 18 Quy trình tách chiết enzym pectinase -64

Hình 19 Chế phẩm enzym pectinase PC sau khi qua cột lọc

gel Sephadex - G75 -66

Hình 20 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC)

vào nhiệt độ -69 Hình 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định hoạt tính của

enzym pectinase (chế phẩm PC) - 71 Hình 22 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC)

vào pH -72 Hình 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự ổn định hoạt tính của

enzym pectinase (chế phẩm PC) -74 Hình 24 Đồ thị biểu diễn sự giảm độ nhớt của nước ổi trong quá trình xử lý

enzym -75

LỜI MỞ ĐẦU

Trong 30 năm trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều về số lượng, đa dạng về chủng loại Enzym không thể tổng hợp bằng con đường hóa học mà chỉ tổng hợp bằng con đường sinh học Do đó, muốn thu nhận enzym chỉ có con đường duy nhất là thu nhận chúng từ cơ thể sinh vật hay nói cách khác bằng con đường sinh tổng hợp Ta có thể sinh tổng hợp enzym từ động vật, thực vật và vi sinh vật Tuy nhiên, con đường thu nhận enzym từ vi sinh vật được khai thác và sử dụng nhiều nhất vì vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng cực kỳ nhanh chóng, tạo ra được những hệ enzym vô cùng phong phú, có hoạt lực xúc tác cực kỳ mạnh mẽ và hàm lượng enzym khá cao Nguyên liệu làm môi trường nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và rẻ tiền

Một trong các chế phẩm enzym vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất là pectinase, enzym này đứng thứ ba về số lượng sản xuất sau protease và amilase Enzym pectinase được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y dược…, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm: sản xuất nước quả, nước giải khát không cồn, rượu vang…[14,24] Trong chế biến thực phẩm, pectinase nếu dùng ở dạng thô (như canh trường nuôi cấy bề mặt) sẽ cho sản phẩm có mùi vị lạ[16] Thực tế ở nước ta hiện nay, các chế phẩm pectinase hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành khá cao nên việc ứng dụng chế phẩm này để làm giảm độ nhớt của purê dịch quả, tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong các quy trình sản xuất nước quả trong từ xoài, ổi, đu đủ… còn hạn chế Trên cơ sở đó, chúng tôi bước đầu khảo sát quá trình trích ly và kết tủa nhóm enzym pectinase từ canh trường

nuôi cấy bề mặt Asp ficuum với mục đích tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzym, sau đó

xác định nhiệt độ và pH tối ưu để ứng dụng enzym pectinase phục vụ cho ngành sản xuất nước quả trong nước

1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM

1.1 Định nghĩa [14]

Enzym (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzym có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật Enzym không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hoá học nhất định trong cơ thể sinh vật (Phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “ invitro” Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzym được gọi là xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác

Rất nhiều phản ứng hoá học khó xảy ra trong điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể, để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, với chất xúc tác là acid mạnh hay base mạnh nhưng trong cơ thể, chính nhờ sự có mặt của enzym mà phản ứng xảy

ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng Cơ thể thiếu enzym thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản và phát triển bình thường được, sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại

1.2 Hoạt tính của enzym [3]

Enzym có cường lực xúc tác rất lớn, ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản ứng enzym xảy ra với tốc độ nhanh gấp 10 8 đến 10 11 lần so với những phản ứng cùng loại không có sự xúc tác của enzym, chỉ cần một lượng nhỏ enzym có thể xúc tác chuyển hóa một lượng lớn cơ chất

Hầu hết các phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao đối với bản chất hoá học của cơ chất và kiểu phản ứng được xúc tác bởi enzym

Phạm vi hoạt động của enzym khá rộng, các phản ứng được enzym xúc tác gồm nhiều loại như : các phản ứng oxy hoá khử , các phản ứng chuyển gốc hay nhóm, các phản ứng thủy phân, các phản ứng đồng phân hóa, các phản ứng phân cắt và tổng hợp

Enzym do cơ thể sống tổng hợp và hoạt động trong môi trường của cơ thể sống cho

nên bản thân của enzym cũng như sự hoạt động của nó đều chịu sự kiểm tra, điều khiển của tế bào về nhiều mặt Cuối cùng cần lưu ý rằng sự tổng hợp của những enzym và những chất có hoạt tính sinh học khác cũng đều do enzym xúc tác

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym:

1.3.1Aûnh hưởng của nhiệt độ [3]

Cũng giống như hầu hết các phản ứng hóa học , các phản ứng có enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiệt độ rất nhiều Trong các phản ứng enzym, nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng lên cực đại và cũng giống như những phản ứng hóa học nói chung, chừng nào enzym chưa bị biến tính, thì mỗi khi tăng nhiệt lên 100C, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần Khi tăng nhiệt độ đến khoảng 60-700C thì phần lớn các enzym mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tới hạn

Mỗi enzym đều một có nhiệt độ thích hợp nhất cho các hoạt động xúc tác, ở nhiệt độ đó phản ứng enzym đạt tới tốc độ cao nhất Nói chung nhiệt độ thích hợp của enzym thường gần với nhiệt độ của cơ thể Tuy nhiên nhiệt độ thích hợp của một enzym không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ thích hợp của enzym thấp dần Ngoài ra, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất cũng có thể làm thay đổi tác dụng của nhiệt độ đối với enzym

1.3.2 Ảnh hưởng của pH [3]

pH cũng là một yếu tố ảnh hưởng lên vận tốc phản ứng enzym xúc tác Tương tự nhiệt độ, mỗi enzym cũng có một giá trị pH mà tại đó vận tốc đạt Vmax , người ta gọi đó là pH tối ưu , kí hiệu là pHopt

Mỗi enzym cũng có giá trị pHopt riêng , thông thường pHopt của enzym nằm ở vùng acid yếu , kiềm yếu hay trung tính Đặc biệt có một số enzym có pH tối ưu ở vùng rất acid như Pepsin có pHopt = 1,5 – 2,5, hoặc rất kiềm như Trypsin có pHopt = 8-9

pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất hoá học , nồng độ cơ chất, nhiệt độ của dung dịch phản ứng

pH có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng là do khi pH thay đổi sẽ có ảnh hưởng đến trạng thái ion hoá của các nhóm chức có khả năng ion hoá tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm α-COOH ,ω - COOH , -NH2, -OH, vòng imidazol cũng như trạng thái ion hoá của cơ chất và phức chất trung gian ES Tại pHopt , phân tử E, S, ES chắc chắn có một trạng thái ion hoá thích hợp nhất cho hoạt động xúc tác của enzym nhờ đó mà vận tốc đạt cực đại

II.2 Cấu tạo của pectin:[22]

Pectin là hợp chất cao phân tử của acid galacturonic và các ester methoxyl hoặc acetyl của nó Hầu hết pectin trong vách tế bào có hình thức liên hợp như là một chuỗi phân tử với khung hình chính là các vùng rhamno-galacturonan Mạch chính này bao gồm các vùng “phẳng “, chủ yếu là polymer mạch thẳng của các acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α-D -1,4 và rhamnose liên kết với nhau bằng liên kết α-L -1,4 Mức độ ester hóa của các acid galacturonic với các nhóm methoxyl và acetyl rất khác nhau

Vùng “phân nhánh” của pectin là phần rhamnogalacturonan, chúng là các mạch bên có chứa các gốc đường trung tính như galactose, arabinose, xylose, gắn với mạch chính tại các nguyên tử C số 3 và số 4 trong vòng rhamnose và nguyên tử C số 2 hoặc số 3 của oligogalacturonic hoặc polymergalacturonic bằng liên kết glycosidic

Hình1 : Các đơn vị cấu tạo của hợp chất pectin

2.3 Tính chất của pectin:[15,16, 17]

Khối lượng phân tử của pectin thường xê dịch từ 20.000 đến 200.000 tuỳ thuộc vào nguồn pectin Ví dụ từ táo, mận thu được pectin có phân tử lượng khoảng 25.000 – 35.000, trong khi đó pectin lấy từ cam có phân tử lượng tới 50.000

Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác Pectin hòa tan trong nước, kiềm, cacbonatnatri, etylendiamin và trong glycerin nóng

Pectin dễ dàng bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, sulfat amon, clorua nhôm, muối đồng, muối canxi và bởi acid

Pectin hòa tan khi bị tác dụng của các chất kiềm loãng hoặc enzym pectinase sẽ giải phóng nhóm metoxy dưới dạng rượu metylic và acid pectic tự do

Acid pectic + Ca2+ -> pectat-Ca kết tủa Tính chất này được ứng dụng để định lượng pectin

Khi tăng mức độ ester hóa bằng methanol cũng như khi giảm khối lượng phân tử thì độ hòa tan của pectin ở trong nước tăng lên, khi đó độ nhớt của dung dịch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ

Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt của acid và đường nó tạo thành chất gel Vì vậy pectin được ứng dụng trong sản xuất mức kẹo Để tạo thành keo pectin có thể thêm đường saccharose với tỷ lệ 65-73% (đường bảo hòa) và tạo môi trường

pH = 3,1-3,5 nhờ các acid hữu cơ như acid citric Riêng acid pectic tự do không có khả năng tạo gel kể cả khi có đường Vì vậy, tránh dùng môi trường kiềm hay có mặt của enzym pectinase Độ bền vững của pectin trước các enzym có thể tăng lên khi có mặt các cation, đặc biệt là Al3+ và Fe3+

Chất pectin giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả Khi quả còn xanh và đang phát triển, protopectin phân tán ở thành tế bào và chiếm tỉ lệ khá cao làm cho quả cứng Khi quả bắt đầu chín, protopectin chuyển dần sang dạng pectin hòa tan dưới tác dụng của các acid hữu cơ và enzym pectinase trong quả Quả càng chín càng mềm, pectin hòa tan tăng cao, ngược lại protopectin không tan sẽ giảm dần

Đối với việc sản xuất nước quả, sự có mặt pectin là điều không mong muốn và không có lợi Do có tính chất keo nên khi ép quả, chất pectin đã làm cản trở đến quá trình trích ly, quá trình làm trong và quá trình lọc dịch quả [17]

Đối với việc trích ly dược liệu đông y có nguồn gốc thực vật thường là lá, hoa, quả, thân cây, rễ, củ sẽ phải gặp khó khăn khi có mặt của pectin vì làm cho hiệu suất trích ly thấp [9]

3.1 Phân loại enzym pectinase:

Có nhiều enzym phân giải pectin với các cơ chế phân giải khác nhau Các nhà nghiên cứu không thống nhất khi phân loại các enzym này

• 1957 A.L Demain và H.J Phaff phân loại các enzym này căn cứ theo tính đặc hiệu (enzym phân giải pectin, enzym phân giải acid pectic và acid pectinic); căn cứ vào cơ chế tác dụng (enzym phân giải liên kết đầu mạch và cuối mạch); căn cứ vào pH tác dụng tối ưu của enzym (enzym tác dụng ở pH acid và enzym phân giải ở pH kiềm)

• Năm 1966 Koller và Neukom đã dựa vào kiểu phản ứng xúc tác của enzym đã phân chia pectinase thành hai nhóm chính:

Nhóm I : Hydrolase:Xúc tác cho quá trình thủy phân

™ Pectinesterase (PE): có tên hệ thống là pectinpectilhydrolase và có mã số

+ Endo glucosidase-polymetylgalacturonase (Endo- PMG): + Exo glucosidase-polymetylgalacturonase (Exo- PMG):

♦ Polygalacturonase (PG) tác dụng lên acid pectic hoặc pectinic, gồm hai kiểu:

+ Endo glucosidase-polygalacturonase (Endo- PG) + Exo glucosidase-polygalacturonase (Exo- PG)

Nhóm II: Transeliminase:

¾ Pectin- transeliminase (PTE): Có tên hệ thống là poly-α-1,4

galacturonid -metylesteglucanoliase và có mã số (E.C.4.2.99.3) Chỉ tìm thấy ở dạng Endo-pectin transeliminase (Endo-pectinlyase) (Endo-PTE)

¾ Polygalacturonat- transeliminase (PGTE): Có tên hệ thống poly

α-1,4-D galacturonid-glucanolyase, mã số (E.C.4.22.99.3), PGTE lại được chia thành:

+ Endo- Polygalacturonat- transeliminase pectatlyase) PGTE):

(Endo-+ Exo- Polygalacturonat- transeliminase pectatlyase) PGTE)

(Exo-Ngoài ra, trong phức hệ enzym pectinase còn có enzym protopectinase, enzym này tách araban và galactan khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất metyl của acid galacturonic (tức pectin hòa tan)

Bảng 1:Tính chất của một vài enzym pectinase từ thực vật và vi sinh vật [22]

Loại enzym/

nguồn gốc Khối lượng phân tử PI

Hoạt tính riêng (U/mg protein enzym)

100.000 44.000 46.000 – 48.00047.000 42.000 – 49.000

10,0 11,0 10,2 3,9 3,65 3,75

8,6 9,4 6,1

4,7- 4,8 6,0- 6,4

4,5 4,5 4,0

4,0- 5,0 4,0

0,083 0,0046 0,041

3 5,0 0,9

3.2 Cơ chế tác dụng của enzym pectinase: [24]

Tác dụng của các enzym pectinase tới pectin khác nhau về cách phá vỡ liên kết (thủy phân hoặc lyase) và về đặc điểm của sự phá vỡ (hai đầu mút hoặc bên trong mạch) Cơ chế tác dụng của pectinesterase và polygalacturonase lên pectin đã được nghiên cứu khá nhiều

3.2.1 Enzym pectinestease (PE) (E.C.3.1.1.11) [16,23]

Enzym này xúc tác thủy phân liên kết ester phức tạp của pectin, sản phẩm tạo thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid polygalacturonic

Pectin + H2O -> metanol + Acid pectinic (acid polygalacturonic)

Hình2: Những phân đoạn của phân tử pectin và những điểm tấn công của

Na+, Ca2, K+ hoạt hoá enzym pectinesterase còn các ion dưới dạng muối (Hg(NO3)2, Pb(NO3)2, FeCl3) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase [16]

Bảng 2: Tính chất của enzym pectinesterase[18]

lượng riêng U/mg Hoạt tính

protein

pHopt Km theo

pectin (mg/ml)

408

305 7.0 9.0

Pectinesterase tách gốc metyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm cacboxyl rất hoạt động, dễ kết hợp với các ion kim loại (thí dụ Ca++) để tạo thành các muối không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng [11]

Hình 3 : Sự kết hợp của ion Ca ++ với các acid pectic để tạo thành

kết tủa Ca-pectat 3.2.2 Enzym polygalacturonase (PE) (E.C.3.2.1.15)

Tham gia quá trình thủy phân liên kết α-1,4 - D galactozit giữa các gốc acid galacturonic trong pectin và trong các acid polygalacturonic khác, tách các gốc acid D -galacturonic thành các phân tử D –galacturonic tự do

™ Enzym endo-polygalacturonase: thủy phân phân tử pectin (endo- PMG)

hoặc phân tử acid pectic (endo –PG) thành các mạch ngắn hơn galacturonan hoặc oligogalacturonic, làm cho độ nhớt dung dịch pectin giảm đi nhiều

™ Enzym exo-polygalacturonase: có khả năng phân cắt dần dần từng gốc acid

galacturonic một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch Enzym này không làm giảm rỏ rệt độ nhớt của dung dịch pectin khi xúc tác nhưng làm tăng năng lực khử của nó

Bảng 3:Tính chất của endopolygalacturonase [19]

4,1 3,8 4,5 5,0 5,0 5,5 5,0 5,0 4,0 – 5,0 4,0 – 5,0 4,0 – 5,0

-

-

- 7,0 7,0

- 6,8 7,1 6,1 6,1 5,8

Ngoài ra, một số endo và exo-polygalacturonase còn thể hiện tính đặc hiệu cao, chúng có thể tác dụng được trên pectin đã metyl hóa, do đó có tên là endo và exo- polymetylgalacturonase

Endo-polygalacturonase còn gọi là polygalacturonase “dịch hóa”, còn polygalacturonase còn gọi là polygalacturonase “đường hóa”

exo-Hoạt độ của enzym này tăng lên khi cơ chất được xử lý sơ bộ bằng enzym pectinesterase [17]

Hình 4 : Sự xúc tác quá trình thủy phân bởi enzym polygalacturose

trên acid pectic

pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau tùy thuộc vào nguồn thu nhận và cơ chất Polygalacturonase chủ yếu bền vững ở pH từ 4,0 – 6,0, nhiệt độ tối ưu ở

40 – 450C và bị vô hoạt ở 55 – 650C Các polygalacturonase cũng giống như pectinesterase được hoạt hóa bởi các cation của kim loại kiềm [16]

3.2.3 Transeliminase:[24]

Các công trình nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng sự phá vỡ mối liên kết α-1,4 của pectin có thể tiến hành bằng con đường phi thủy phân Kết quả sự phá vỡ này là tạo thành các acid galacturonic monomer không no (acid 4-dioxi-5xetongalacturonic) Các enzym xúc tác phản ứng này được gọi tên là transeliminase (lyase)

Hình 5: Sự phân hủy pectin bởi enzym pecticlyase

Enzym pectintranseliminase phá vỡ liên kết không no của acid digalacturonic, bắt đầu từ đầu khử của mạch acid polygalacturonic Khi ấy xảy ra quá trình thủy phân pectin nhưng không thủy phân tới cùng Enzym không thủy phân pectin kết hợp mà trực tiếp xúc tác làm đứt mạch các cơ chất pectin bằng cơ chế transeliminase hóa tạo pectin hòa tan trong nước

a Pectintranseliminase (PTE): Là những enzym tác dụng trên pectin và acid

pectinic Các enzym này có tên hệ thống là poly α-1,4 methylesteglucanolyase

galacturonic-Endopectintranseliminase : Làm đứt mạch không trật tự liên kết α-1,4 D galacturonit trong pectin, với sự tạo thành nối đôi

b Polygalacturonatranseliminase (PGTE): Là những enzym tác dụng trên acid

pectinic và acid pectic Các enzym này có tên hệ thống là poly α-1,4 D galacturonicglucanolyase Các enzym này chia thành hai nhóm:

* Endoenzym: với cơ chế tác dụng không theo trật tự, làm đứt mạch phân tử polygalacturonic ở các vị trí khác nhau trong nội mạch với sự tạo thành galacturonic không no và oligogalacturonic

* Exoenzym : làm đứt mạch không trật tự liên kết α-1,4 - D galacturonit trong pectat, trong galacturonit với sự tạo thành Δ -4,5 degalacturonic acid

Bảng 4 :Tính chất của enzym polygalacturonatlyase [19]

Vi sinh vật Khối lượng phân

- 24.000 37.000

- 42.300 41.000

10 9,5 8,5 8,0

10 9,0 9,1 8,5 9,4

10

-

- 9,85

4 PECTINASE CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI SINH VẬT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYM

4.1 Enzym pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật:[17]

Nấm mốc, vi khuẩn, nấm men đều có khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase

4.1.1 Nấm mốc: Các loài nấm mốc sau đây tổng hợp pectinase với hàm lượng cao

Pen glaucum, Pen chrlichi, Asp awamori, Asp foetidus, Asp niger, Asp Terrus

, Asp saitoi Các loài nấm mốc khác nhau thường sinh tổng hợp các kiểu enzym

pectinase không giống nhau như Asp niger thường chủ yếu tạo ra enzym

pectinesterase, ngược lại Pen Citrimim và Asp cangestris lại không tạo ra được

enzym này Asp.fonseanes tạo ra enzym pectintranseliminase Pen Citrimim

thường tạo ra enzym polygalacturonase

4.1.2 Vi khuẩn: Các loài vi khuẩn sau đây sinh tổng hợp nhiều enzym pectinase:

Erwinia caralovora, Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Bacillus

felseneus Các vi khuẩn Erwinia carotovora, Bacillus polymyxa, Flavobacterium

pectinovorum thường tạo ra enzym pectinhydrolase

4.1.3 Nấm men: Sacharomyces fragilis chỉ tạo ra được một enzym phân giải duy

nhất là enzym endopolygalacturonase

Hầu hết các vi sinh vật sinh tổng hợp enzym pectinase thuộc các loài hiếu khí song

gần đây, người ta đã tìm ra được một số vi sinh vật vốn là yếm khí nghiêm ngặt

nhưng lại có khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase

Bảng 5: Khả năng sinh tổng hợp các loại enzym pectinase ở vi sinh vật

(Rombouts & pilnik)[21]

+

++

+ + ++

+ + ++

+ + +

+

Ghi chú : +++ : Rất nhiều; ++:Nhiều; + :Ít hơn

PAL: pectate lyase

PL :pectin lyase

4.2 Điều kiện sinh tổng hợp các enzym pectinase ở vi sinh vật [16]

Sự sinh trưởng tốt của vi sinh vật trên môi trường này hay môi trường khác không phải luôn luôn gắn liền với quá trình sinh tổng hợp một enzym cần thiết nào đó Quá trình sinh tổng hợp enzym phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau:

4.2.1 Aûnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn cacbon

Hệ enzym pectinase một mặt là enzym “bản thể” nhưng mặt khác cũng là enzym

“cảm ứng” như những hydrolase khác Do đó, một trong những yếu tố quan trọng của sự sinh tổng hợp enzym pectinase là chọn đúng cơ chất đặc hiệu cho chủng vi sinh vật sử dụng, cảm ứng sinh tổng hợp pectinase

Pectin được thêm vào môi trường sẽ cảm ứng hóa quá trình sinh tổng hợp phức hệ enzym pectinase Như vậy sự có mặt của pectin trong môi trường dinh dưỡng là điều kiện bắt buộc Chất pectin cảm ứng có thể dùng là bột cà rốt, bột táo, vỏ bưởi Nguồn cacbon thông dụng là các polysaccharide, disaccharide, monosaccharide Nếu sử dụng phối hợp pectin và polysaccharide sẽ cho phép tăng hoạt độ pectinase ngoại bào lên 4-6 lần so với môi trường có cùng nguồn cacbon và cùng nồng độ nhưng không có pectin

Đối với một số loài vi sinh vật, khi nguồn cacbon là saccharose với hàm lượng cao trong môi trường nuôi cấy (trên 2%) sẽ ức chế sự tổng hợp cảm ứng enzym pectinase Việc bổ sung glucose vào môi trường chứa hỗn hợp lactose và pectin cũng kìm hãm sự sinh tổng hợp enzym pectinase Tương tự như glucose, việc bổ sung fructose, saccharose, maltose và glyceryl cũng gây ra hiện tượng tương tự

4.2.2 Aûnh hưởng của nguồn nitơ:

Nguồn thức ăn nitơ cũng có vai trò quan trọng trong sự sinh tổng hợp enzym

pectinase bởi vi sinh vật Tuy nhiên không thể tìm một nguồn nitơ duy nhất cho

cho mọi vi sinh vật Người ta đã chứng minh được rằng các vi sinh vật thường

sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để tổng hợp nên enzym pectinase Nguồn nitơ vô cơ chủø yếu thường dùng dưới dạng nitrat và muối amon

Vi sinh vật cũng có khả năng sử dụng các dạng nitơ hữu cơ Trong thực tế khi nuôi cấy nấm mốc người ta thường dùng nước chiết từ bột (lạc), nước chiết ngô, đậu, cám, cây hòa thảo, pepton Sử dụng các dạng nitơ hữu cơ phối hợp với các dạng nitơ vô cơ ở tỷ lệ thích hợp sẽ có tác dụng thuận lợi đến sự tổng hợp enzym pectinase ở vi sinh vật Tỉ lệ C:N thích hợp nằm trong khoảng từ 7:1 đến 13:1

4.2.3 Aûnh hưởng của các yếu tố khác:

Các nguyên tố vô cơ cũng có ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các enzym pectinase mà trước tiên là đến trạng thái sinh lý của vi sinh vật, trong số đó phospho là cấu tử vô cơ cần thiết của môi trường Nói chung hàm lượng phospho trong môi trường phải không được ít hơn 8 – 10 mg%, khi sử dụng nguồn nitơ phosphatdiamon nhu cầu về phospho của nấm mốc hoàn toàn được thỏa mãn

Các yếu tố khác như pH của môi trường dinh dưỡng, phương pháp nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian nuôi cấy và các điều kiện nuôi cấy, độ ẩm đều ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym pectinase Các yếu tố này phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật

4.2.4 Nấm mốc Aspergillus ficuum trong sinh tổng hợp enzym pectinase [7]

Họ : Aspergillaceae Bộ : Moniliales Lớp : Fungi imperfecti

Aspergillus ficuum Dạng khuẩn lạc: mép khuẩn lạc sợi chìm, trắng có màu đen hơi

nâu ở mặt phải và màu trắng hơi vàng, nhăn nhúm thành tia ở mặt trái Có nhiều đầu, sắp xếp không chặt, không có hạch nấm, không có thể quả Đầu mọc từ cơ chất có màu đen, nâu có hình cầu, tỏa tia khi còn non, già tạo thành khối không rõ nét Cuống dài tới 3.000μm, cổ hơi thót lại, có màu nâu vách nhẵn, dày 1,8- 4.0μm

Bọng có hình cầu, gần cầu, kích thước từ 0 đến 55μ m sinh sản khắp mặt.Đa số các

chủng thuộc loài Asp ficuum thể bình có hai lớp, thỉnh thoảng có đầu nhỏ một lớp

thể bình Cách sắp xếp như sau: Lớp một có hình tam giác ngược, kích thước 13× 2,5-3,5μ m Lớp hai có hình chai kích thước 5-10 x 2,5μm Bào tử nấm có hình cầu, có gai thưa, có khi có màu nâu đen, kích thước 3,5-5μm

10-5 TRÍCH LY VÀ LÀM SẠCH CHẾ PHẨM:

Trong sản xuất thực phẩm và trong một số lĩnh vực khác như hóa học, y học, phân tích người ta thường sử dụng chế phẩm enzym sạch (tinh khiết), nghĩa là chế phẩm trong đó phần lớn các tạp chất đã được tách ra

Để loại bỏ các tạp chất trong dung dịch enzym cần dùng nhiều biện pháp phối hợp Để loại bỏ protein phi enzym và các chất có phân tử lượng cao có thể dùng phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ hay bằng muối trung tính, sắc ký, điện di

Để loại bỏ muối và các chất phân tử thấp thường dùng các biện pháp như thẩm tích

Cho đến nay vẫn chưa tìm được phương pháp tách và làm sạch enzym chung cho mọi enzym Khi cần tách và làm sạch một enzym nào đó cần chọn và phối hợp các phương pháp khác nhau để xây dựng một quy trình phù hợp nhất

5.1 Trích ly enzym từ môi trường rắn:[1,5,10]

Để chiết rút enzym từ môi trường rắn người ta dùng nước hoặc các dung dịch muối trung tính Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này cho kết quả tốt và dễ được dùng rộng rãi trong sản xuất Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzym trên 90- 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không hòa tan Nước thường dùng khuếch tán ở nhiệt độ 25-

280C Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10-15% chất khô hòa

tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 –120C

5.2 Kết tủa enzym:[10]

5.2.1 Phương pháp lắng tủa theo nồng độ muối bảo hoà:[18]

Là một trong những phương pháp lắng tủa được sử dụng rộng rãi nhất Bản chất của nó là tạo tủa protein nhờ sự bổ sung vào dung dịch protein muối trung tính ở nồng độ cao Vì protein tồn tại trong dung dịch nhờ sự cân bằng giữa các lực tĩnh điện và các tương tác kỵ nước Do đó, khi bổ sung muối ở nồng độ cao vào thì sự cân bằng trên sẽ bị vi phạm, các phân tử protein sẽ kết tụ lại với nhau tạo thành khối lớn, tách khỏi dung dịch

Các phân tử protein trong dung dịch đều ngậm nước, khối lượng nước có thể lớn hơn nhiều lần bản thân protein Lượng nước này che chắn một cách hữu hiệu các phân tử kỵ nước trên bề mặt của protein và cản trở tương tác giữa các phân tử protein với nhau Khi xuất hiện nồng độ ion muối cao, lượng nước ngậm bị giảm di, mở ra khả năng tương tác lẫn nhau giữa các phân tử protein, điều này dẫn đến sự lắng tủa protein

Để lắng tủa protein người ta sử dụng một số loại muối khác nhau nhưng được sử dụng rộng rãi hơn cả là muối (NH4)2SO4 vì nó có độ hoà tan cao ngay cả ở nhiệt độ thấp Nồng độ (NH4)2SO4 sử dụng cho sự lắng tủa thường ở khoảng 50-80% độ bão hoà.(NH4)2SO4 được bổ sung vào dung dịch protein ở dạng bột hoặc ở dạng dung dịch bảo hòa, dạng bột thường được sử dụng khi không muốn làm tăng thể tích dung dịch Còn dịch bảo hoà sử dụng có hiệu quả nhất ở giai đoạn tinh sạch cuối cùng Việc bổ sung muối hoặc dung dịch bảo hòa bao giờ cũng kèm theo sự khuấy trộn, phần bột tiếp theo chỉ bổ sung sau khi phần bổ sung trước đã tan hoàn toàn Lần bổ sung cuối cùng phải khuấy kỹ ít nhất là 15 phút để đạt được sự phân đoạn rõ rệt

Chú ý khi thực hiện quá trình lắng tủa bằng (NH4)2SO4 cần phải tách kim loại nặng, đặc biệt là sắt ra khỏi muối Để làm điều đó trước khi tủa bằng muối

ammonia phại boơ sung vaøo dung dòch taùc nhađn gaĩn kim loái nhö EDTA Cheâ phaơm enzym sau khi taùch chieât baỉng muoâi trung tính thöôøng coù hoát löïc cao hôn so vôùi vieôc taùch baỉng dung mođi höõu cô Tuy nhieđn cheâ phaơm thu ñöôïc coù laên muoâi sulfat amon, vì vaôy caăn phại quy ñònh cú theơ töøng ñoâi töôïng söû dúng hoaịc muoân söû dúng roông raõi caăn phại loái muoâi baỉng caùch thaơm tích qua maøng baùn thaâm

5.2.2 Keẫt tụa enzym baỉng caùc dung mođi höõu cô:[8,10,18]

Khi söû dúng dung mođi höõu cô, ngöôøi ta döïa vaøo nguyeđn taĩc caùc dung mođi höõu cô laøm giạm ñöôïc haỉng soâ ñieôn mođi cụa mođi tröôøng Löïc huùt vaø löïc ñaơy tónh ñieôn tư leô nghòch vôùi haỉng soâ ñieôn mođi Do vaôy, trong dung dòch röôïu-nöôùc caùc protein enzym vaø toaøn boô caùc protein khaùc cuõng nhö táp chaât phađn töû lôùn khaùc deê bò keât tụa vaø laĩng xuoâng Caùc yeâu toâ nhö noăng ñoô röôïu , nhieôt ñoô, phạn öùng mođi tröôøng, löïc ion cụa dung dòch vaø thuoôc tính cụa protein enzym coù ạnh höôûng nhieău ñeân chaât löôïng enzym keât tụa Thođng thöôøng ngöôøi ta theđm 3 –4 theơ tích coăn vaøo moôt theơ tích nöôùc chieât enzym Ñeơ traùnh maât hoát tính cụa enzym taât cạ phại ñöôïc laøm lánh xuoâng 3-50C, khi troôn coăn vaøo dung dòch enzym caăn phại khuaây ñeău ñeơ ñoăng nhaât noăng ñoô dung dòch moôt caùch nhanh choùng Khi caùc enzym keât tụa laĩng xuoâng döôùi caăn taùch tụa baỉng phöông phaùp ly tađm ngay Enzym ñöôïc röûa 2-3 laăn baỉng coăn cao ñoô roăi ñöa vaøo bình huùt aơm hoaịc maùy saây chađn khođng, sạn phaơm thu ñöôïc seõ coù dáng boôt Hoên hôïp coăn-nöôùc sau khi taùch enzym ñöôïc caât lái ñeơ duøng cho laăn sau

Duøng isopropanol keât laĩng enzym chư caăn 1-2 theơ tích dung mođi /1 theơ tích dòch chieât Caịn enzym taùch ra seõ ôû dáng söõa ñaịc quaùnh raât khoù saây Duøng aceton vôùi tyû leô nhö khi duøng isopropanol nhöng kyõ thuaôt traùnh chaùy noơ trong sạn xuaât laø raât khoù khaín

Chaât ñoôn cho cheâ phaơm dáng boôt: thöôøng duøng laø gelatin, casein, glucose, saccharose, lactose, tinh boôt hoøa tan, muoâi, diatomit

5.3 Lọc gel:[23]

Phương pháp sắc ký lọc gel (gel exclusion chromatography = gel filtration = molecular sieve chromatography = gel permeation chromatography) dựa vào bản chất vật lý là kích thước phân tử để thực hiện việc tách chiết Kỹ thuật này có khả năng tách chiết các phân tử có trọng lượng từ 10.000 đến 100.000 Sắc ký gel là một phương pháp rất quan trọng trong việc tinh sạch hàng ngàn loại protein, acid nucleic, polysaccharide và các phân tử sinh học khác Thêm vào đó kỹ thuật này

có thể áp dụng để xác định trọng lượng phân tử

5.3.1 Lý thuyết về lọc gel:

Việc hoạt động của cột gel được mô tả như sau

(A) Mẫu được đưa vào có chứa những phân tử có kích thước lớn, nhỏ

(B) Những phân tử có kích thước lớn không thể xâm nhập vào bên trong hệ thống matrix của gel vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột gel

(C) Sự phân tách những phân tử lớn

Pha cố định bao gồm các phân tử trơ, có chứa những lỗ nhỏ có kích thước đã được kiểm soát Một dung dịch chứa các chất hòa tan có kích thước khác nhau đi qua cột dưới ảnh hưởng của dòng dung môi liên tục qua cột với tốc độ khác nhau Những phân tử kích thước lớn hơn kích thước lỗ gel thì không thể đi vào bên trong hạt gel

vì thế chúng được giới hạn ở khoảng không gian giữa các hạt, những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong và bên ngoài của những hạt gel, vì vậy chúng sẽ tạo ra một thể tích tiếp xúc lớn Các hạt có kích

Hình 6: Sự phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel

thước trung gian di chuyển qua cột ở vận tốc giữa các phân tử có kích thước lớn và nhỏ Do đó, trật tự rửa giải của các phân tử hoà tan có liên quan trực tiếp đến kích thước không gian của các phân tử

5.3.2 Thành phần hóa học của gel

Có 4 loại gel căn bản có thể sử dụng là dextran, polyacrylamide, agarose và hỗn hợp dextran-polyacrylamide

Loại thứ nhất được xây dựng trên cơ sở của dextran và có tên thương mại là Sephadex Người ta không thể sản xuất ra loại gel có khả năng lọc những phân tử có kích thước lớn hơn 600.000 daltons có bản chất là dextran tự nhiên

Gel polyacrylamide là những sản phẩm của quá trình polymer hóa của acrylamide và nó được liên kết với tác nhân N,N’ – methylacrylamide Mức giới hạn lọc từ 1.800 đến 400.000 daltons

Gel agarose được hợp thành từ polyacrylamide tự nhiên của agar là những hợp chất được biến đổi từ những đơn vị galactose và anhydrogalactose

Bảng 6: Bản chất của lưới lọc gel

Tên Phạm vi phân tách

đối với protein (theo trọng lượng phân tử)

Sự trương nướcml/ g gel khô Thể tích hạt gel sau khi hấp thu nước

1,0 ± 0,1 1,5 ± 0,2 2,5 ± 0,2 5,0 ± 0,3 7,5 ± 0,5

10 ± 1,0

15 ± 1,5

20 ± 2,0

2-3 2,5-3,5 4-6 9-11 12-15 15-20 20-30 30-40

5.3.3 Những điều kiện kỹ thuật khi lọc gel:

** Kích thước cột gel:

Tùy theo mục đích thí nghiệm mà chọn lựa kích thước cột khác nhau

- Theo kiểu phân đoạn, thì sử dụng những cột dài hơn 100cm, tỷ lệ chiều dài cột với chiều rộng cột vào khoảng 25-100

- Theo kiểu chiết tách, chiều dài cột không quá 50 cm và tỷ lệ thích hợp giữa chiều dài và chiều rộng là 5-10

** Dung dịch đệm chiết xuất:

Gel dextran và polyacrylamide có pH ổn định là 1-10, trong khi gel Agarose có mức giới hạn pH là 4-10 Do đó , pH của dung dịch đệm nên chọn trên cơ sở của phạm vi ổn định của các đại phân tử cần được chiết tách

Mỗi loại gel có một phạm vi tốc độ khác nhau

- Gel có kích thước nhỏ :15- 25ml/giờ

- Gel có kích thước lớn : 5- 10ml/giờ

** Protein sau khi đã tách chiết và làm sạch có thể định lượng được Nếu protein mà ta nghiên cứu là enzym thì ta định lượng thông qua xác định hoạt độ của enzym (theo quy ước quốc tế : 1 đơn vị hoạt độ E là lượng enzym biến đổi 1μ mol cơ chất trong 1 phút ở 250C trong các điều kiện tối ưu), hoặc ta xác định hoạt độ riêng (là số đơn vị enzym trên 1mg protein) Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein thì ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ enzym và đặc biệt là hoạt độ riêng tăng rất cao Quá trình tinh sạch protein được kết thúc nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của enzym nữa.[2]

5.4 Các phương pháp khác:

** Phương pháp điện di để phân tách protein:

Phương pháp điện di là ứng dụng tính lưỡng tính của protein, dựa trên cơ sở sự dịch chuyển của các phân tử protein mang điện trong điện trường Phương pháp điện di thường không được sử dụng để tách chiết và làm sạch protein với một số lượng lớn Nó chỉ được sử dụng như một phương pháp phân tách để xác định nhanh thành phần các protein trong một hỗn hợp dung dịch ở quy mô phòng thí nghiệm

Phương pháp điện di có thể dùng để xác định mức độ tinh sạch của protein đã chiết tách và làm sạch, hoặc có thể dùng để xác định một số tính chất của protein như xác định điểm đẳng điện hay pI của protein hoặc xác định trọng lượng phân tử của protein.[2]

** Phương pháp sắc ký trao đổi ion:

Phương pháp này được sử dụng để tách chiết protein dựa trên cơ sở sự tích điện của protein

Ngoài ra còn phương pháp sắc ký khác để tinh sạch protein là dựa vào sự kết hợp đặc hiệu (ái lực)

6 ỨNG DỤNG ENZYM PECTINASE [9,11,17]

Trong công nghiệp rượu vang quả, pectinase làm tăng nhanh quá trình sơ chế các loại quả nho, táo, dứa, chuối, cam làm dễ dàng quá trình ép dịch, làm trong dịch, tạo hương thơm mạnh và dịu cho rượu vang

Trong sản xuất nước quả: sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm giảm độ nhớt dịch quả, tăng hiệu suất trích ly và làm trong dịch quả, tạo điều kiện tốt khi cô đặc nước quả, mứt không cháy khét

Trong chế biến cà phê: pectinase có khả năng tách lớp keo trên hạt cà phê, tạo độ bóng và tăng độ hòa tan

Trong sản xuất dược liệu đông y: pectinase giúp giải phóng dược chất dễ dàng và rút ngắn thời gian chiết xuất

6.1 Ứng dụng trong sản xuất nước quả:

Từ nguyên liệu quả, người ta thường chế biến thành các loại nước quả trong, nước quả đục, song để có được nước quả thành phẩm, trước tiên phải chiết tách được dịch quả từ mô cơ bản, mô bì Do đó hiệu xuất rút chiết dịch quả phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, độ nhớt của dịch quả, độ chắc của thịt quả

Trong quả có một lượng pectin đáng kể, khi ép các chất pectin sẽ còn giữ lại một phần trong nước quả và pectin có lẫn trong nước ép quả sẽ làm dịch quả vẩn đục, có độ keo cao, khó lọc được trong

Trong quả nước chiếm khoảng 70- 90% Nếu chỉ xử lý bình thường (nghiền nhỏ và ép) thì chỉ thu được nước ép khoảng 60-70% là tối đa Để phá vỡ các mô của quả bằng cách cho thêm chế phẩm pectinase vào, nước sẽ được giải phóng ra khỏi tế bào dễ dàng hơn và hiệu suất nước ép thu được sẽ tăng trung bình 15-30%, có khi tới 49% Lượng enzym cho vào khối quả nghiền là từ 0,5-2% (nếu canh trường nấm mốc) hoặc 0,03-0,05% chế phẩm enzym tinh khiết Quá trình xử lý enzym thường thực hiện ở nhiệt độ 43-450C trong khoảng 4-8 giờ (tùy từng loại quả)[10] Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì trong chế phẩm pectinase cần có

enzym endo, exo-polygalacturose, pectinesterase và protease vì enzym endo và exo-polygalacturose sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn pectinesterase góp phần vào tác dụng của hai enzym này, proteinase của chế phẩm sẽ thủy phân protein của vỏ nguyên sinh tế bào, là chất liên kết với pectin tạo lớp kết dính giữa các tế bào trong quả, kết quả làm cho dịch quả thoát ra dễ dàng khi ép

6.2 Ứng dụng trong sản xuất rượu vang:

Rượu vang được sản xuất từ nước ép quả nho, táo, dâu

Quá trình sản xuất rượu vang gồm 3 giai đoạn chủ yếu:

Chiết ép dịch quả

Lên men dịch quả

Xử lý và tàng trữ

Trong giai đoạn thu dịch quả người ta sử dụng enzym pectinase để tăng hiệu suất trích ép dịch quả cũng như làm trong trước khi cho lên men

6.3 Ứng dụng trong trích ly các dược liệu đông y:

Các dược liệu đông y thường là hoa, lá, quả, vỏ và thân cây Pectin là một trong các thành phần phổ biến ở các mô thực vật, tuy nhiên hàm lượng của chúng trong các dược liệu không giống nhau

Sắc thuốc là nhằm mục dích trích ly các hoạt chất ở trong dược liệu ra, song do có pectin nên làm cho quá trình trích ly khó khăn, không trích ly hết được hoặc nước trích ly bị đục Để tiết kiệm công sức tránh phiền phức và tổn thất khi sắc thuốc, đồng thời trích ly được triệt để và tạo khả năng pha chế thuốc theo đơn, người ta có thể dùng chế phẩm pectinase Dưới tác dụng của phức hệ pectinase, pectin bị phân giải, mô thực vật bị phá hủy do đó các hoạt chất được giải phóng dễ dàng

Các chế phẩm pectinase dùng trong trích ly các dược liệu đông y phải thoả mãn những điều kiện tối thiểu sau:

ƒ Chế phẩm phải có độ tinh khiết cao để không lẫn các tạp chất có thể làm giảm chất lượng thuốc

ƒ Chế phẩm phải có hoạt độ cao để chỉ cần sử dụng với một lượng tối thiểu

6.4 Ứng dụng trong sản xuất sợi đay, gai:

Theo phương pháp thông thường, người ta ngâm đay, gai trong hồ nước để dễ tách và làm sạch sợi, phương pháp này cần thời gian dài và gây ô nhiễm môi trường Khi ngâm đay, gai có bổ sung enzym pectinase và cellulase vào thì rút ngắn được thời gian và giảm sự ô nhiễm môi trường

1 Nguyên liệu:

1.1 Vi sinh vật: Sử dụng loài nấm mốc Aspergillus ficuum được phân lập từ vỏ bưởi

trong bộ sưu tập giống của phòng thí nghiệm Sinh hóa, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM Nấm mốc được bảo quản theo phương pháp cấy chuyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng PGA ở nhiệt độ 6 -8 C0 [4]

1.2 Hóa chất:

- Cơ chất pectin: Hãng Prolabo

- Cám gạo, trấu: Do nhà máy xay xát số 1 Mỹ Tho, Tiền Giang cung cấp

- Một số hóa chất khác như: Antrone, albumin (Hãng Merck), aceton, isopropanol, (polyetylenglycol) PEG, muối citratnatri (hãng AR Trung quốc), cồn tuyệt đối (Việt nam)

1.3 Môi trường giữ giống và nuôi nấm mốc:

1.3.1 Môi trường giữ giống PGA:[12]

• Cách pha chế:

Khoai tây được gọt vỏ, cắt lát, nấu lấy nước chiết Lọc lấy nước trong, cho agar vào nấu đến khi tan hoàn toàn Kiểm tra lại lượng nước cho đủ theo công thức Đun sôi trở lại cho glucose vào khuấy vừa tan và bắt xuống Chỉnh pH về 6,5

Chia môi trường vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng (3-5ml)

Tiến hành khử trùng ở 1 atm /30 phút Sau đó lấy ra để nguội, tiến hành cấy nấm mốc

1.3.2 Thành phần môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp hệ enzym pectinase [11]

1.4 Nơi thực hiện thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh Bộ môn

Công nghệ thực phẩm , Trường Đại Học Bách Khoa TPHCM

2 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc

Đầu tiên ta giữ giống trên môi trường PGA, sau đó nuôi trên môi trường [mục 1.3.2] để tạo canh trường giàu pectinase

Tiến hành như sau: Thêm vào mỗi ống giống thạch nghiêng 5ml nước cất đã khử trùng ở 1210C trong 30 phút, dùng que cấy đã vô trùng lướt nhẹ trên mặt thạch, đánh nhẹ cho bào tử ở dạng huyền phù, đổ vào bình tam giác đã chuẩn bị môi trường , rồi trộn đều

Quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp enzym được thực hiện theo phương pháp lên men bề mặt, sử dụng erlen 1000 ml chứa khoảng 100g canh trường, nhiệt độ nuôi khoảng 300C

3 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 7: SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Khảo sát quá trình sinh tổng hợp enzym pectinase theo thời gian

Trích ly enzym(Xác định tỷ lệ canh trường/nước và thời gian trích ly tối ưu, khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly

enzym)

Tinh sạch enzym(Tủa enzym bằng các dung môi hữu

cơ, PEG, muối (NH4)2SO4 , lọc gel)

Xác định topt, pHoptcủa chế phẩm thu được Khảo sát sự ảûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của hoạt tính

enzym

Nghiên cứu thử ứng dụng chế phẩm pectinase thu được để làm giảm hàm lượng pectin trong nước ép trái cây