Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic và thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn

Các giống vi khuẩn lactic khác nhau sử dụng sản xuất probiotic ...4 Bảng 1.2: Các sản phẩm probiotic thương mại dùng trong chăn nuôi tại Anh ...12 Bảng 1.3: Một số sản phẩm probiotic t

PHAN THỊ THU DUNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GIỐNG VI SINH VẬT CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CHẾ PHẨM PROBIOTIC ỨNG

DỤNG TRONG CHĂN NUÔI LỢN

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MÃ SỐ HỌC VIÊN :09310564

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khoá (Năm trúng tuyển) : 2009

1- TÊN ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic và thử

nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn”

2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:

- Nghiên cứu phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ hệ tiêu hóa của lợn con

- Tiến hành các thí nghiệm khảo sát và sàng lọc các chủng vi khuẩn lactic có hoạt

tính probiotic

- Định danh, lập bộ sưu tập và lưu trữ giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic cao

- Thử nghiệm tạo chế phẩm probitic ứng dụng trong chăn nuôi

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 15/7/2010

4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/12/2010

5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

- PGS TS Nguyễn Thúy Hương – Giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kiến thức giúp em hoàn thành tốt luận văn này

- PGS TS Nguyễn Đức Lượng và Bộ môn Công Nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa TP HCM đã tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn ở bộ môn

- Tất cả quý thầy cô của Trường Đại học Bách Khoa Tp HCM đã giảng dạy cho

em những kiến thức bổ ích trong suốt chương trình đào tạo bậc cao học và đại học

- Trung tâm Ứng dụng Công nghệ sinh học Đồng Nai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn này

- Các bạn và những người thân đã động viên trong suốt thời gian học tập

Tp HCM, ngày 14 tháng 01 năm 2011

Học viên

Phan Thị Thu Dung

nghiệm tao chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn”

- Học viên thực hiện: Ks Phan Thị Thu Dung

- Cán bộ hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thúy Hương

- Thời gian thực hiện: từ tháng 07/2010 đến tháng 12/2010

- Đề tài thu được một số kết quả như sau:

Phân lập được 23 chủng vi sinh vật từ hệ tiêu hóa lợn con Qua các bước khảo sát đặc điểm hình thái, chúng tôi lựa chọn được 16 chủng vi khuẩn có đầy đủ các đặc điểm

và K3 → K9

Qua sàng lọc các hoạt tính probiotic bao gồm khả năng chịu đựng điều kiện cực đoan như pH thấp, pepsine, muối mật và khả năng kháng vi sinh vật, chúng tôi lựa

Bifidobacterium bifidum Lý lịch 2 chủng trên được xây dựng với tất cả các đặc điểm,

tính chất nguồn gốc và được bảo quản tại Bộ môn Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM

hàm lượng chất bảo vệ có thể sử dụng là 20% whey protein hoặc 15% maltodextrin + 10% tinh bột Chế phẩm sau khi sấy đạt chất lượng: độ ẩm từ 4.5 - 4.8% và mật độ tế

acidophilus và Bifidobacterium bifidum trong sản phẩm là 1:1

MỤC LỤC

Mục lục i

Danh mục bảng v

Danh mục hình vii

Danh mục chữ viết tắt viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về probiotic 2

1.1.1 Khái niệm probiotic 2

1.1.2 Cơ chế hoạt động của probiotic 2

1.1.3 Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất probiotic 2

1.1.4 Khái niệm prebiotic, synbiotic 4

1.2 Ứng dụng của probiotic trong lĩnh vực chăn nuôi 6

1.2.1 Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và những nhược điểm 6

1.2.2 Probiotic thay thế cho kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng 7

1.2.3 Kiểm soát và chứng nhận các sản phẩm probiotic 9

1.2.4 Những tiêu chí lựa chọn probiotic cho động vật 9

1.2.5 Mức độ an toàn của các sản phẩm probiotic sử dụng trong chăn nuôi 10

1.2.6 Một số sản phẩm probiotic thương mại ứng dụng trong chăn nuôi 11

1.3 Tác dụng của probiotic đến hệ tiêu hóa và quá trình sinh trưởng của lợn .15

1.3.1 Quá trình tăng trưởng của lợn 15

1.3.2 Những stress lợn con gặp phải ở giai đoạn cai sữa 16

1.3.3 Cấu trúc hình thái và chức năng ruột non của lợn giai đoạn cai sữa 17

1.3.4 Tác dụng của probiotic tới hệ vi khuẩn đường ruột của lợn 21

1.3.5 Probiotic kích thích tăng trưởng và nâng cao hiệu quả chăn nuôi lợn 23

LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG

1.4 Tổng quan về kỹ thuật bao gói 25

1.4.1 Định nghĩa 25

1.4.2 Tác nhân bảo vệ 25

1.4.3 Sấy thăng hoa 26

1.4.4 Sấy phun 27

1.5 Những nghiên cứu liên quan 29

1.5.1 Nghiên cứu trong nước 29

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước 34

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu và môi trường 37

2.1.1 Giống vi sinh vật 37

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 37

2.1.3 Môi trường sử dụng 37

2.1.4 Hoá chất và thuốc thử 38

2.2 Phương pháp nghiên cứu 39

2.2.1 Qui trình thu nhận mẫu và phân lập 41

2.2.2 Cấy chuyền và làm thuần chủng vi khuẩn phân lập 42

2.2.3 Quan sát đại thể và vi thể 42

2.2.4 Khảo sát đặc tính sinh hóa của các chủng 43

2.2.5 Kiểm tra hoạt tính probiotic của các chủng vi sinh vật thu được 45

2.2.6 Định danh vi sinh vật 47

2.2.7 Khảo sát các yếu tố sinh trưởng .47

2.2.8 Sản xuất thử nghiệm chế phẩm probotic bằng phương pháp lên men 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả phân lập và chọn giống 50

3.1.1 Khảo sát hệ vi khuẩn đường ruột của lợn 50

3.1.2 Sơ chọn giống vi khuẩn probiotic dựa trên đặc điểm tế bào và hình thái khuẩn

lạc trên môi trường MRS 52

3.1.2.1 Hình thái khuẩn lạc 52

3.1.2.2 Đặc điểm tế bào qua kỹ thuật nhuộm Gram 55

3.1.2.3 Tổng hợp đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào 57

3.1.3 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các chủng 59

3.1.3.1 Đặc điểm sinh lý 59

3.1.3.2 Phản ứng catalase và khả năng sinh acid 60

3.1.3.3 Khả năng lên men các loại đường 61

3.2 Kết quả sàng lọc chủng vi sinh vật có hoạt tính probiotic cao 61

3.2.1 Khả năng chống chịu của các chủng trong điều kiện cực đoan 64

3.2.1.1 Khả năng sống sót của các chủng sau khi lý pH thấp 64

3.2.1.2 Khả năng sống sót trong môi trường có chứa pepsin 5g/lít 69

3.2.1.3 Khả năng sống sót trên môi trường có chứa 0.3 % muối mật 71

3.2.1.4 Tổng hợp các thí nghiệm sàng lọc và lựa chọn 72

3.2.2 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 73

3.3 Kết quả định danh bằng bộ kit API 50CHL 74

3.4 Kết quả khảo sát các điều kiện lên men 78

3.4.1 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối tế bào 78

3.4.2 Kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng 79

3.4.2.1 Đường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus 79

3.4.2.2 Đường cong sinh trưởng của Bifidobacterium bifidum 80

3.5 Khảo sát quá trình tạo sản phẩm probiotic 81

3.5.1 Chất lượng sản phẩm khi dùng whey protein làm cơ chất bảo vệ 81

3.5.1 Chất lượng sản phẩm khi dùng maltodextrin làm cơ chất bảo vệ 83

3.5.2 Khảo sát tỷ lệ hai chủng Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus trong chế phẩm sau sấy phun 87

LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

4.1 Kết luận 88 4.2 Kiến nghị 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 90

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các giống vi khuẩn lactic khác nhau sử dụng sản xuất probiotic 4

Bảng 1.2: Các sản phẩm probiotic thương mại dùng trong chăn nuôi tại Anh 12

Bảng 1.3: Một số sản phẩm probiotic thương mại được chứng nhận bởi tổ chức The Scientific Committee for Animal Nutrition (EU) 13

Bảng 1.4: Tóm tắt tác dụng của các chủng probiotic đến hệ tiêu hoá của lợn 21

Bảng 1.5: Tác dụng của các sản phẩm probiotic đến tốc độ tăng trưởng của lợn 23

Bảng 1.6: Nguồn gốc và tổ hợp vi sinh vật được tác giả phân lập 30

Bảng 1.7: Các tiêu chuẩn hiện có tại Viện Kiểm nghiệm Tp Hồ Chí Minh 33

Bảng 1.8: Các chủng probiotic được tác giả phân lập 34

Bảng 2.1: Thành phần môi trường MRS dịch thể 38

Bảng 3.1: Sự phân bố hệ vi sinh vật trong đường ruột lợn con 50

Bảng 3.2: Mật độ tế bào vi khuẩn Lactic trong hệ tiêu hóa lợn sử dụng môi trường MRS (môi trường đặc hiệu của vi khuẩn Lactic) 51

Bảng 3.3: Đặc điểm hình thái của các chủng bằng phương pháp quan sát đại thể và vi thể 58

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát nhu cầu oxy của các chủng khảo sát 59

Bảng 3.5: Kết quả thử nghiệm catalase và khả năng sinh acid 60

Bảng 3.6: Khả năng lên men các loại đường 61

Bảng 3.7: Mật độ tế bào theo thời gian sau khi xử lý ở điều kiện pH thấp 64

Bảng 3.8: Tỉ lệ sống sót của các chủng trong môi trường chứa pepsin 5g/lít 69

Bảng 3.9: Tỉ lệ sống sót của các chủng trong môi trường chứa muối mật 71

Bảng 3.10: Tổng hợp khả chịu đựng trong môi trường cực đoan của các chủng 72

Bảng 3.11:Kết quả định danh bằng bộ kit API50 CHL 74

Bảng 3.12: Thông tin chung về chủng K6 76

LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG

Bảng 3.13: Thông tin chung về chủng K7 77 Bảng 3.14: Mật độ tế bào trong của sản phẩm sau khi sấy phun khi sử dung chất bảo vệ

là maltodextrin ở các nghiệm thức khác nhau 81

Bảng 3.15: Mật độ tế bào trong của sản phẩm sau khi sấy phun khi sử dung chất bảo vệ

là maltodextrin ở các nghiệm thức khác nhau 84

Bảng 3.16: Tỷ lệ hai chủng Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium bifidum

trong sản phẩm sau khi sấy phun .87

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Hình dạng lông nhung của ruột non ở lợn con giai đoạn cai sữa 18

Hình 1.2: Hình thái ruột non (cắt ngang) của lợn con giai đoạn cai sữa 19

Hình 2.1: Máy sấy phun hiệu Mini Spray Dryer Yamoto 48

Hình 3.1: Mẫu ruột non và ruột già lấy từ hệ tiêu hóa của lợn con 50

Hình 3.2: Đặc điểm đại thể của các chủng khảo sát 54

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái của các chủng L1 → L10 và K1 → K9 qua kỹ thuật nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi 57

Hình 3.4: Thử nghiệm mô tả khả năng lên men các loại đường của các chủng khảo sát63 Hình 3.5: Đồ thị mô tả khả năng sống sót của các chủng khảo sát sau 3 giờ trong môi trường có chứa pepsine 5g/l [Bảng 3.7] 60

Hình 3.6: Khả năng chống lại E Coli của các chủng L1, K4, K6, K7 63

Hình 3.7: Kết quả định danh 2 chủng K6, K7 bằng bộ kit API50 CHL 78

Hình 3.8: Đồ thị mô tả ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối của 2 chủng Lactobacillus acidophilus K6 và Bifidobacterium bifidum K7 sau 14 giờ 78

Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng của chủng K6 79

Hình 3.10: Đường cong sinh trưởng của chủng K7 80

Hình 3.11: Sản phẩm probiotic thu được sau sấy phun với chất bảo vệ là whey protein81 Hình 3.12: Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng chất bảo vệ whey protein trong quá trình sấy phun đến khả năng sống của vi khuẩn 82

Hình 3.13: Sản phẩm probiotic sau khi sấy phun sử dụng chất bảo vệ là maltodextrin 83 Hình 3.14: Đồ thị ảnh hưởng của hàm lượng chất bảo vệ % maltodextrin trong quá trình sấy phun đến khả năng sống của vi khuẩn 84

LUẬN VĂN THẠC SĨ PHAN THỊ THU DUNG

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Administration

Tổ chức Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

tiêu hóa

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong chăn nuôi lợn theo qui mô công nghiệp, việc điều khiển năng suất và phòng ngừa được dịch bệnh là rất quan trọng Đặc biệt, tại thời điểm tách lợn, lợn con bị stress do một số yếu tố bất lợi như dinh dưỡng, môi trường, mất cân bằng hệ đường ruột, dẫn đến hiện tượng tiêu chảy và sinh trưởng kém Do đó, kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi đang được sử dụng tràn lan và thiếu kiểm soát Dư lượng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong gia súc làm giảm chất lượng thịt và ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người tiêu dùng

Chính vì vậy, từ năm 2006, ở châu Âu đã phản đối mạnh mẽ việc sử dụng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng hóa học trong chăn nuôi Từ đó, việc chăn nuôi phục vụ cho xuất khẩu thịt lợn của nước ta gặp rất nhiều khó khăn Để giải quyết được vấn đề này, probiotic được xem là một sản phẩm có tiềm năng lớn để thay thế cho kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi Probiotic giúp kích thích tiêu hóa, tăng khả năng tiêu thụ thức ăn và khả năng miễn dịch của lợn, phòng ngừa dịch bệnh đường ruột, góp phần nâng cao được hiệu quả chăn nuôi [40]

Hiện nay, các sản phẩm probiotic được bán trên thị trường chủ yếu là nhập từ nước ngoài, chất lượng của các sản phẩm chưa được kiểm soát chặt chẽ Đồng thời giá thành các chế phẩm này là khá cao

Từ những yêu cầu cấp thiết và dựa vào những thành quả đạt được trong và ngoài nước, chúng tôi quyết định lựa chọn đề tài “Nghiên cứu phân lập giống vi sinh vật có hoạt tính probiotic và thử nghiệm tạo chế phẩm probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn” Trong nghiên cứu này chúng tôi tiếp tục phân lập và tuyển chọn probiotic trong đường tiêu hóa của lợn và thử nghiệm sản xuất probiotic ứng dụng trong chăn nuôi lợn, đặc biệt chú ý đến sản phẩm probiotic sử dụng cho lợn giai đoạn mới tách, đây là giai đoạn quan trọng nhất trong quá trình sinh trưởng của lợn

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC

1.1.1 Khái niệm probiotic

Từ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống” Tuy nhiên, định nghĩa về probiotic đã phát triển nhiều theo thời gian

Lily và Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotic như một hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác Sau đó, Parker (1974) đã áp dụng khái niệm này đối với phần thức ăn gia súc

có ảnh hưởng tốt đối với cơ thể vật chủ bằng việc góp phần cân bằng hệ vi sinh vật trong ruột Vì vậy, khái niệm probiotic được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất

mà góp phần cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột”

Năm 1992, Fuller định nghĩa probiotic là chế phẩm ảnh hưởng có lợi cho vật chủ theo hướng cải thiện cân bằng đường ruột, loại trừ các yếu tố bất lợi đến sự tiêu hóa và hấp thu các chất dinh dưỡng truyền thống

Dưới cái nhìn của một nhà thực phẩm, Lyon (2005) cho rằng probiotic là những thực phẩm chức năng khi ăn vào sẽ có ảnh hưởng rõ ràng trong điều chỉnh các quá trình chức phận của cơ thể

Hiện nay, probiotic được định nghĩa đơn giản hơn: probiotic là những vi sinh vật sống, chủ yếu là vi khuẩn lactic và Bifidobacteria có lợi cho sức khỏe được ăn

vào qua đường miệng cùng với các chất dinh dưỡng truyền thống khác trong thức

ăn (Zayed & Roos, 2003) [20]

1.1.2 Cơ chế hoạt động của probiotic

Các cơ chế tác động của vi khuẩn probiotic lên cơ thể con người bao gổm tạo cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bằng khả năng ức chế, cạnh tranh với các vi khuẩn có hại trong ruột; làm thay đổi hệ vi sinh vật nội tại theo hướng có lợi Khả năng này được các nhà khoa học giải thích dựa trên khả năng tranh giành vị trí bám dính trên niêm mạc, tranh giành thức ăn với vi sinh vật khác và tạo ra môi trường acid, các chất kháng khuẩn, ức chế các vi sinh vật khác Ngoài ra, chúng còn tăng

cường khả năng tiêu hóa sữa do tạo men lactase nên cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường khả năng dung nạp sữa

Ngoài những cơ chế trên, nhiều nghiên cứu đã và đang khám phá ra những hoạt động tiềm năng có lợi cho sức khỏe của nhóm vi sinh vật này như làm tăng cường khả năng miễn dịch do ức chế sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh, sản xuất kháng thể tại chỗ do kích thích làm tăng số tế bào sản xuất IgA Những vi khuẩn này có thể sản sinh ra các hợp chất chống khuẩn, biến đổi các độc tố hoặc receptor độc tố, chống sự hình thành ung thư do khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn tạo amin trong ruột và hạn chế sự hình thành những sản phẩm đồng hóa gây ung thư Đồng thời, chúng cũng làm giảm cholesterol, làm tăng và cân bằng oestrogen, phòng chống bệnh loãng xương, tránh những bệnh viêm nhiễm [4, 20, 33, 39]

1.1.3 Các chủng vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các sản phẩm probiotic

Dòng vi khuẩn phổ biến là vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) LAB đóng vai trò rất quan trọng đối với sức khỏe, được sử dụng nhiều trong công nghiệp

LAB là những vi khuẩn Gram dương, thường không di động, không sinh bào

tử, các phản ứng catalase âm, oxydase âm, nitratreductase âm Những vi khuẩn này sinh tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống rất yếu nên chúng là những vi sinh vật khuyết dưỡng đối với nhiều loại acid amin, base nucleotic, nhiều loại vitamin,… không có khả năng tổng hợp nhân heme của các porphyrine, bình thường chúng không có cytochrome Vì vậy, chúng được xếp vào nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy nghi (vi hiếu khí), có khả năng lên men trong điều kiện vi hiếu khí cũng như kỵ khí LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ và sự tích lũy các sản phẩm chuyển hóa cuối Chúng đòi hỏi các vitamin như thimine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic và các acid amin Do

đó, trong môi trường nuôi cấy LAB thường bổ sung thêm nước chiết giá, nước chiết

cà chua, cao nấm men, cao thịt,…

Nhóm vi khuẩn này rất đa dạng gồm nhiều giống khác nhau Tế bào của

chúng có dạng hình cầu như: Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như: Lactobacillus Ngày nay, nhóm vi

khuẩn lactic còn được bổ sung thêm những vi khuẩn Bifidobacteria (Kandler &

Welss, 1986) Ngoài ra, dựa vào khả năng lên men người ta chia LAB thành hai nhóm: LAB đồng hình và LAB dị hình [4; 20; 39]

Bảng 1.1 Các giống vi khuẩn lactic khác nhau sử dụng sản xuất probiotic

cộng sự, 1989

Lactobacillus Que Chuỗi lactic đồng hình và dị hình 32-53 Welss, 1986 Kandler và

Bifidobacterium Khác nhau tùy loài Nhiều dạng Lên men lactic và acetic 55-67

Kandler và Welss, 1986 Scardovi, 1986

[4] 1.1.4 Khái niệm prebiotic, synbiotic

Các prebiotic bao gồm: disaccharide, oligosaccharide, fructose và oligosaccharide, soybean-oligosaccharide, inulin và những oligosaccharide không thể tiêu hóa khác

galacto-Những tác động của prebiotic lên vật chủ:

- Tăng khả năng kháng lại những tác nhân gây bệnh cho vật chủ

- Làm giảm các nhân tố nguy hiểm liên quan đến bệnh ung thư kết tràng

- Làm giảm lượng lipid huyết thanh

- Làm tăng việc sử dụng các khoáng chất

Theo các nghiên cứu, khi thay đổi lượng nhỏ trong chế độ ăn uống bằng việc

bổ sung sucrose (15g/ngày) và oligofructose (15g/ngày) hoặc inulin có thể làm tăng

số lượng Bifidobacteria một cách đáng kể Đặc biệt, khi bổ sung oligofructose thì

làm giảm được các tác nhân gây bệnh tiềm tàng Ngoài ra, soybean-oligosaccharide

và transgalacto-oligosaccharide cũng làm tăng số lượng Bifidobacteria trong phân

ta thấy khi cho chuột dùng Bifidobacteria hoặc oligofructose thì bệnh của chuột

không giảm, nhưng cho chuột dùng đồng thời cả hai thì làm giảm được bệnh [40]

1.2 ỨNG DỤNG CỦA PROBIOTIC TRONG LĨNH VỰC

CHĂN NUÔI

1.2.1 Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và những nhược điểm

Chăn nuôi là một ngành kinh tế quan trọng đối với nước ta và một số nước trên thế giới Trong chăn nuôi việc kiểm soát được năng suất và phòng ngừa đựơc dịch bệnh là rất quan trọng Những mầm vi sinh vật gây nên dịch bệnh có thể là từ môi trường bên ngoài hoặc nhiễm vào thức ăn chăn nuôi, đi vào dạ dày động vật qua đường ăn uống [20]

Ngoài ra, một số nguyên nhân khách quan khác cũng có thể gây nên dịch bệnh về đường tiêu hóa của động vật Cụ thể, ở động vật còn non, đặc biệt là động vật giai đoạn sau khi cai sữa gặp phải rất nhiều yếu tố bất lợi gây stress như môi trường sống, thức ăn (chuyển từ sữa sang dạng thức ăn khô), quá trình vận chuyển, biến động nhiệt độ … Những yếu tố này làm ảnh hưởng xấu đến khả năng chống lại tác nhân gây bệnh của vật nuôi, tăng tỷ lệ nhiễm trùng cận lâm sàng hoặc lâm sàng Hơn nữa, sự tăng trưởng của một số vi khuẩn gây bệnh còn được kích thích bởi các hormone gây stress như norepinephrine và epinephrine Từ đó, hệ vi sinh vật đường tiêu hoá của động vật mất cân bằng, gia tăng tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy (theo Krehbiel et al, 2003) [29]

Thuốc kháng sinh ra đời và được sử dụng để điều trị các biểu hiện lâm sàng của nhiễm trùng đường tiêu hoá động vật.Kháng sinh đã có tác dụng lớn trong việc phòng ngừa dịch bệnh và nâng cao hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi Ngoài việc kiểm soát nhiễm trùng, nồng độ thấp của thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng cải thiện sức khỏe và hiệu suất về chuyển hóa thức ăn (giúp tăng trọng lượng).Vì vậy, kháng sinh đã được sử dụng như là chất kích thích sinh trưởng trong chăn nuôi gia súc từ những năm 1940 (Cromwell) Sau đó đã có rất nhiều tranh cãi về nồng độ kháng sinh sử dụng cho động vật và những tác động xấu của chúng đến sự tồn tại của hệ vi khuẩn tự nhiên trong đường tiêu hoá động vật,

cũng như ảnh hưởng của dư lượng kháng sinh đến sức khoẻ người tiêu dùng [20, 40]

Đã có rất nhiều công bố về hiện tượng kháng kháng sinh ở người của những

vi khuẩn gây bệnh có nguồn gốc xuất hiện từ gia súc Người ta bắt đầu quan tâm nhiều đến những ảnh hưởng xấu của kháng sinh đến sức đề kháng của vật nuôi và con người Tuy nhiên, việc kiểm soát mức độ sử dụng kháng sinh ở các trại chăn nuôi gia súc, gia cầm là rất khó khăn [20]

Từ năm 2006, ở châu Âu đã chính thức cấm sử dụng kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng trong thức ăn chăn nuôi Vì thế, ngành chăn nuôi gặp nhiều khó khăn về dịch bệnh đường tiêu hoá Đặc biệt là các trại chăn nuôi gà và lợn, tỷ lệ lợn con, gà con bị tử vong do bệnh đường tiêu hóa cao [20, 40]

Vấn đề đặt ra là phải có những biện pháp thay thế chất kháng sinh, kiểm soát được dịch bệnh trong chăn nuôi Một số biện pháp đã được sử dụng để phòng ngừa dịch bệnh như sử dụng vaccine, ví dụ vaccine ngừa bệnh tiêu chảy cho gia súc mới sinh và sau khi cai sữa nhằm ngăn ngừa sự phát triển của E coli, hoặc biện pháp

tiêm vaccine ngừa Salmonella ở gia cầm, …Một số trang trại sử dụng biện an toàn

sinh học như cách ly chăn nuôi, thiết kế lại chuồng trại, hạn chế những tiếp xúc bên ngoài đối với vật nuôi, có chế độ khử trùng, thay đổi không khí, làm sạch chuồng trại hoặc biện pháp làm acid hóa thức ăn để giảm mầm bệnh …Những biện pháp nêu trên đều đưa lại hiệu quả chưa cao, song chi phí lại quá lớn [20]

1.2.2 Probiotic thay thế cho kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng

trong chăn nuôi

Như đã giới thiệu ở trên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi đã

bị cấm ở châu Âu từ năm 2006 Do đó, yêu cầu đặt ra là cần phải có giải pháp thay thế nhằm ngăn chặn dịch bệnh, giảm tỷ lệ tử vong và nâng cao hiệu quả chăn nuôi Trên cơ sở đó, prebiotic, probiotic hoặc synbiotics được xem là phụ gia tiềm năng

có thể thay thế được cho các chất kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng nói trên

Probiotic được sử dụng rộng rãi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm và nuôi trồng thuỷ sản, tác dụng giảm dịch bệnh và kích thích tăng trưởng [20]

Việc sử dụng probiotic trong chăn nuôi dựa trên cơ sở: khi hệ vi sinh vật đường ruột của động vật khoẻ mạnh thì sẽ đề kháng được bệnh [20] Probiotic thường được sử dụng trong chăn nuôi gia súc, gia cầm như gà con, lợn con và bê, đặc biệt là giai đoạn cai sữa Probiotic giúp cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật, các vấn đề về stress và kháng sinh được giải quyết, kích thích hệ miễn dịch giúp động vật có khả năng chống lại các loại bệnh truyền nhiễm Probiotic là vi khuẩn có lợi và đảm bảo an toàn cho người sử dụng Như vậy việc sử dụng probiotic trong chăn nuôi còn có mục đích hướng tới sự an toàn trong sản phẩm thịt Theo nhiên cứu của Surawicz (2008), probiotic còn có thể kết hợp với kháng sinh trong thức ăn để ngăn chặn mầm bệnh, phục hồi hệ vi sinh vật có lợi trong đường tiêu hoá, giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy [41] Những lợi ích của các chế phẩm probiotic cho động vật được liệt kê sau:

- Cải thiện tiêu hóa

- Cải thiện tỷ lệ chuyển hóa thức ăn

- Tăng sức đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm

- Giảm ô nhiễm thịt, nâng cao chất lượng thịt

- Tăng tốc độ tăng trưởng vật nuôi

- Tăng sản lượng sữa (bò sữa)

- Tăng cường sản xuất trứng (gà mái)

- Cải thiện chất lượng trứng (gà mái)

- Giảm tỷ lệ tử vong cho gia súc, gia cầm

Tuy nhiên, khả năng phòng ngừa bệnh đường tiêu hóa của probiotic vẫn chưa được xem xét cụ thể Vì thế, cần thiết phải có thêm nhiều nghiên cứu thực nghiệm

để xác định rõ hiệu quả của các chế phẩm probiotic đối với đường tiêu hóa của động

vật Đồng thời cũng cần xác định độ ổn định hoạt tính của chủng theo thời gian [20, 41]

1.2.3 Kiểm soát và chứng nhận các sản phẩm probiotic

Ở châu Âu, tất cả phụ gia dùng trong thức ăn chăn nuôi (bao gồm cả các loại nấm men và vi khuẩn) đều được qui định rất chặt chẽ Từ tháng 5/2003, việc xem xét và đánh giá tác động của các chất phụ gia trong chăn nuôi là trách nhiệm của Ủy ban Khoa học về sinh dưỡng vật nuôi (Scientific Committee of Animal Nutrition, viết tắt là SCAN), theo báo cáo của Anadon và cộng sự (2006) và Wright (2005) [14] Sau đó, tổ chức An toàn thực phẩm châu Âu (the European Food Safety Authority, viết tắt là EFSA) thay thế chức năng của SCAN, tổ chức này quản lý và phê duyệt quyền sử dụng của các sản phẩm probiotic [20]

Tại Hoa Kỳ, chủng vi sinh vật được sử dụng là chất phụ gia thức ăn cần phải

có chứng nhận của Tổ chức Thực phẩm và Dược phẩm (Food and Drug Administration, viêt tắt là FDA)

Theo qui định hiện hành của châu Âu, để có một sản phẩm probiotic mới là chất phụ gia bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, bắt buộc phải định danh và xác định đặc tính ở mức độ loài, cung cấp thông tin về hiệu quả và mục đích sử dụng sản phẩm Sản phẩm đó được sử dụng cho động vật chủ nào (không có tác động xấu đến sức khỏe), sản phẩm phải an toàn cho người sử dụng (tức là không có tác dụng phụ khi tiếp xúc), không ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng thịt của động vật Ngoài ra, sản phẩm probiotic không được chứa kháng sinh trong đó (theo EFSA, năm 2005; SCAN, 2001, 2003) [20]

1.2.4 Những tiêu chí lựa chọn probiotic cho động vật

Việc đánh giá hiệu quả của các loại sản phẩm probiotic, cũng như liều lượng

và cách thức sử dụng chúng là những yếu tố quan trọng trong việc sử dụng các chế phẩm probiotic (Carita, 1992) [15] Theo khuyến cáo của các nhà sản xuất, tùy theo loài vi sinh vật và hoạt tính, probiotic thường sử dụng với mật độ tế bào trong khoảng 1x108 – 1x1010 cfu/kg thức ăn cho gia súc Hiện nay, có rất ít bằng chứng

thực tế chứng tỏ hiệu quả của probiotic từ những nghiên cứu invitro Thông thường, probiotic được lựa chọn dựa vào những chứng nhận theo qui định hiện hành và dựa những hoạt tính cơ bản của probiotic, bao gồm:

- Khả năng bám dính của các tế bào probiotic trên bề mặt thành biểu mô ruột, giúp cho chúng tồn tại lâu trong ruột non của động vật

- Các chủng probiotic phải có khả năng sống sót trong điều kiện cực đoan như chịu được acid, nhiệt độ, điều kiện sản xuất, bảo quản và có khả năng sống sót trong môi trường dạ dày nhân tạo của lợn (De Angelis và cộng sự, 2006) [19]

- Các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự lựa chọn của probiotic bao gồm: mục đích sử dụng và khả năng thích nghi cho động vật mục tiêu, sản phẩm probiotic

là đơn chủng hay tổ hợp nhiều chủng

Vi sinh vật là probiotic có thể là một chủng của một loài, hoặc nhiều chủng trong một loài, hoặc nhiều loài kết hợp với nhau Probiotic có nhiều chủng (tổ hợp

vi sinh vật probiotic) thường bao gồm nhiều chủng khác nhau của cùng một chi hoặc nhiều chi, ví dụ L plantarum, Bifidobacterium breve và Pedicoccus acidilacti

(Timmerman và cộng sự, 2004) [42]

Những nghiên cứu gần đây cho thấy, việc sử dụng tổ hợp nhiều probiotic có khả thi và hiệu quả hơn so với một chủng riêng biệt trong việc ngăn chặn mầm bệnh (Casey và cộng sự, 2007) [16] Bên cạnh đó, Timmerman và cộng sự (2004) đã mô

tả những lợi ích và một số bất lợi kèm theo khi sử dụng tổ hợp probiotic so sánh với việc sử dụng một chủng probiotic [42] Tuy nhiên, hiện tại rất ít bằng chứng thực tế

so sánh hiệu quả của hai dạng này khi bổ sung vào thức ăn gia súc

1.2.5 Mức độ an toàn của các sản phẩm probiotic sử dụng trong chăn

nuôi

Những lo ngại về sự an toàn của chế phẩm probiotic bao gồm: sự kích hoạt trao đổi chất có hại, kích thích miễn dịch thái quá và chuyển gen độc lực và gen kháng kháng sinh giữa các vi sinh vật (Agostoni et al.(2004)) [16] Tổ chức y tế đã

chỉ đạo xuất bản các hướng dẫn cho việc lựa chọn các chế phẩm probiotic và mức

độ an toàn cho phép của chúng được liệt kê sau đây:

- Chủng probiotic sản xuất chất độc không được phép

- Chủng probiotic sản xuất các yếu tố độc lực không được phép

- Chủng probiotic sản xuất các chất kháng sinh có ý nghĩa lâm sàng hoặc thú y không được phép [20]

1.2.6 Một số sản phẩm probiotic thương mại ứng dụng trong chăn nuôi

Từ năm 1973, Nurmi và Rantala đã nghiên cứu chế phẩm probiotic đầu tiên dạng lỏng được sử dụng cho gà (Nurmi và Rantala, 1973) Sau đó, đã có nhiều nghiên cứu bổ sung probiotic vào thức ăn chăn nuôi, bao gồm: các dạng bột, dạng viên nang, dạng hạt …(Fuller, 1992) Bên cạnh đó, đã có nghiên cứu công bố về ứng dụng hệ thống giọt để kiểm soát lượng probitoic cho gà con sử dụng, áp dụng

để bổ sung probiotic qua đường uống (Carita, 1992) [20]

Đối với đa số gia súc (đặc biệt là lợn) và gia cầm, chế phẩm probiotic thường được bổ sung trực tiếp qua dạ dày Đối với một số động vật nhai lại, việc bổ sung probiotic sẽ khó khăn hơn do nguồn thức ăn chính là cỏ tươi Theo nghiên cứu của Krehbiel và cộng sự (2003), ở động vật nhai lại, các loại nấm men và nấm mốc phát triển mạnh, sử dụng probiotic chứa vi khuẩn Lactobacilli và Enterococcus faecium

giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột hiệu quả Nói chung, việc lựa chọn dạng sản phẩm khác nhau tùy thuộc vào mục đích, mức độ sử dụng probiotic và loại vật nuôi (Fuller, 1992) [20]

Hiện nay, đã có nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất dựa trên nhiều công thức tổ hợp khác nhau ứng dụng trong chăn nuôi Đa số các sản phẩm sử dụng từ các chủng vi khuẩn sau: vi khuẩn lactic, chủ yếu là Lactobacilli, một số sản phẩm

chứa Bacillus và Streptococcus …

Một số sản phẩm probiotic thương mại trong chăn nuôi sử dụng trong chăn nuôi tại Anh đã được chứng nhận bởi tổ chức Uỷ ban Khoa học về Dinh dưỡng động vật (SCAN) là sản phẩm an toàn, được liệt kê tại bảng 1.2 [20]

Bảng 1.2: Các sản phẩm probiotic thương mại sử dụng trong chăn nuôi tại Anh Nhà sản xuất Tên sản phẩm Chủng probiotic Động vật mục tiêu

Protexin

Protexin

Protexin

Protexin Pro-soluble1 Enterococcus faecium

(NCIMB 10415) EC No 13 Gia súc, lợn, gà Bioplus 2B1 Bacillus licheniformis,

Bacillus subtilis Lợn thịt, lợn nái, lợn con, cá Probio precise1 Enterococcus faecium

Saccharomyces cerevisiae Động vật nhai lại

Christian

Hansen

Lactiferm

Lactiferm

Provita lacteal1 Lactobacillus acidophilus,

Enterococcus faecium,

Provita New Born piglet1

[2]

Ngoài ra, ở châu Âu còn một số sản phẩm probiotic thương mại khác được chứng nhận bởi The Scientific Committee for Animal Nutrition (EU), được liệt kê ở bảng 1.3

Bảng 1.3: Một số sản phẩm probiotic thương mại được chứng nhận bởi

The Scientific Committee for Animal Nutrition (EU)

Tên sản phẩm Loài Ký hiệu giống Động vật sử dụng

NCIMB 30096

1.3 TÁC DỤNG CỦA PROBIOTIC ĐẾN HỆ TIÊU HÓA VÀ

QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA LỢN

1.3.1 Quá trình tăng trưởng của lợn

1.3.1.1 Giai đoạn cai sữa ở lợn

Lợn con thường được cai sữa vào khoảng 18-25 ngày tuổi Mục đích của việc cai sữa sớm là để tối ưu hóa hiệu quả sinh sản của lợn nái [40] Khi cai sữa, lợn con thường hấp thụ thức ăn kém và tăng trưởng chậm trong khoảng 1-2 tuần đầu tiên sau khi cai sữa, ngoài ra tỷ lệ lợn bị tiêu chảy và tử vong cao (nguyên nhân của hiện tượng này sẽ được trình bày kỹ hơn ở phần sau) [20, 22, 27, 40]

Do đó, lợn con sau cai sữa phải có chế độ chăm sóc và môi trường sống đặc biệt tối ưu Một số phụ gia thực phẩm như chất kích thích sinh trưởng, kháng sinh được sử dụng để kích thích ăn uống và tăng trưởng Tuy nhiên, hiện nay kháng sinh

đã bị cấm sử dụng trong chăn nuôi [22, 40]

1.3.1.2 Đặc điểm tăng trưởng của lợn sau khi tách

Sự tăng trưởng của lợn có tầm quan trọng đến hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi Tốc độ tăng trưởng của lợn là một trong những chỉ số quan trọng ảnh hưởng đến lợi nhuận chăn nuôi lợn thịt Cải thiện tốc độ tăng trưởng và tỷ lệ tiêu hóa thức

ăn sẽ giúp tăng sản lượng thịt và giảm chi phí thức ăn [40]

Sau khi cai sữa, hoạt động của enzyme trong hệ tiêu hóa của lợn con giảm, lượng thức ăn hấp thụ kém, tốc độ tăng trưởng giảm Đây là giai đoạn thích nghi, đối với lợn cai sữa càng sớm thì giai đoạn này càng kéo dài

Độ tuổi và trọng lượng của lợn lúc tách ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của lợn trong các giai đoạn tiếp theo ( theo Quiniou và cộng sự (2002), Lê Dividich (1999)

và Tokach (1992)) Ví dụ, trọng lượng lợn lúc tách tăng thêm 1 kg sẽ cho kết quả lợn đạt đến trọng lượng giết mổ sớm hơn ít nhất là 10 ngày (Cole và Close, 2001) Lợn con thường tăng 225 g/ngày trong tuần đầu tiên sau khi cai sữa [40]

1.3.1.3 Mức độ tăng trưởng của lợn

Trọng lượng của lợn sau 25 – 45 ngày tuổi đạt 7,5 – 13,0 kg Tiềm năng trọng lượng của lợn con có thể tăng lên từ 10,2 đến 22,7 kg ở cùng độ tuổi khi có chế độ chăm sóc đặc biệt [40]

Hàm lượng chất khô ở khẩu phần ăn của lợn trong tuần đầu tiên ảnh hưởng đến trọng lượng của lợn trong vòng 28 ngày sau khi tách, dinh dưỡng được hấp thụ chỉ bằng khoảng 60 – 70% so với trước khi tách Biện pháp cho lợn con sử dụng thức ăn lỏng có thể góp phần gia tăng khả năng tiêu thụ thức ăn của lợn Tuy nhiên, hiệu quả của biện pháp này là rất thấp, không giải quyết vấn đề thay thế cho chất kháng sinh và chất kích thích sinh trưởng

1.3.2 Những yếu tố gây stress cho lợn con trong giai đoạn cai sữa

Sau khi cai sữa, lợn con thường gặp phải nhiều yếu tố gây stress như dinh dưỡng, tâm lý, vi sinh vật, môi trường sống, mất miễn dịch thụ động từ mẹ và những thay đổi về đặc điểm hình thái của đường ruột Ở mục này, chúng tôi sẽ tập trung đến 3 vấn đề bao gồm dinh dưỡng, môi trường sống và tâm lý, hệ vi sinh vật đường ruột [20, 25, 40]

1.3.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố dinh dưỡng

Khi lợn được tách, chế độ thức ăn của lợn bị thay đổi, từ sữa mẹ chuyển sang dạng thức ăn rắn có mùi, vị và nhiệt độ thức ăn khác hoàn toàn sữa mẹ Do đó, lợn con thường không ăn trong vài ngày đầu sau khi cai sữa Sự tăng trưởng của lợn trong giai đoạn này rất chậm, thậm chí còn bị sút cân Điều này có liên quan đến sự thay đổi bất lợi của ruột như teo lông nhung (villous), giảm chức năng tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng, dẫn đến hội chứng kém hấp thu dinh dưỡng của lợn mới tách

1.3.2.2 Ảnh hưởng của môi trường sống và tâm lý

Lợn con lúc cai sữa sẽ bị tách biệt hoàn toàn khỏi lợn mẹ, lợn con mất chức năng miễn dịch từ sữa mẹ Ngoài ra, sau khi tách ra chúng thường được nuôi chung

với các lứa lợn của nhiều mẹ khác nhau, môi thường sống thay đổi, điều này cũng

có thể gây stress cho lợn

1.3.2.3 Hệ vi sinh vật đường tiêu hoá của lợn

Hệ vi sinh vật đường tiêu hoá của lợn thường bao gồm các chủng vi sinh vật sau: Lactobacilli, Bifidobacteria, Streptococcus, Bacteriodes, Perfringes Clostridium và E coli, tỷ lệ hệ vi sinh vật này thay đổi theo độ tuổi của lợn [25, 32,

34, 40]

Theo Mul và cộng sự (1994), phải mất 4 – 6 tuần để thiết lập một hệ vi sinh vật ổn định, do khi lợn con cai sữa, vi sinh vật đường ruột của lợn bị thay đổi Khi lợn đang bú sữa mẹ, sữa có chứa thành phần globulin miễn dịch tự nhiên, có tác dụng ngăn ngừa sự gia tăng của các tế bào E coli Khi lợn cai sữa tế bào E coli gia

tăng đáng kể trong ruột non, đây là tác nhân gây bệnh tiêu chảy cho lợn sau khi tách [36]

Theo (Modler et al, 1990) hỗn hợp prebiotic và probiotic trong chế độ ăn của lợn mới tách giúp ổn định cân đối vi sinh vật đường ruột bằng cách kích thích sự phát triển của các vi khuẩn có lợi như Bifidobacteria và Lactobacilli [40] Prebiotics

chứa Fructooligosaccharide (FOS) và oligofructose được chuyển hóa bởi

Bifidobacteria và Lactobacilli trong ruột già, kích thích tăng trưởng của chúng

Chủng probiotic thông dụng nhất là Lactobacillus, Bifidobacterium và Streptococcus [25, 31, 40, 43]

1.3.3 Cấu trúc hình thái và chức năng ruột non của lợn ở giai đoạn cai

sữa 1.3.3.1 Cấu trúc và chức năng của ruột non lợn khoẻ mạnh

Đường tiêu hóa là cơ quan hấp thụ chất dinh dinh dưỡng ở động vật, sự hiện diện của lông nhung và vi nhung mao giúp cho ruột non có diện tích bề mặt hấp thụ cao Hình dạng của lông nhung ở lợn khỏe mạnh giống như ngón tay Theo S.B Shim và cộng sự (2009), tổng diện tích bề mặt hấp thụ trong ruột non của lợn con

(10 ngày tuổi) là 114 m2 [40] Trong nghiên cứu này, cấu trúc hình thái của ruột non được thể hiện trong hình 1.1 và 1.2

Hình 1.1: Hình dạng lông nhung của ruột non ở lợn con giai đoạn cai sữa

Hình 1.2: Hình thái ruột non (cắt ngang) của lợn con giai đoạn cai sữa

1.3.3.2 Sự thay đổi về hình thái và chức năng ruột non của lợn giai

đoạn cai sữa

a Hình thái ruột non

Trước đây, đã có nhiều nghiên cứu mô tả về hiện tượng giảm chiều cao lông nhung và tăng độ sâu của các khe hốc ở ruột của lợn con sau khi cai sữa như Hampson (1986); Miller và cộng sự, 1986 … [13]

Nghiên cứu của Hampson (1986) đã mô tả sự thay đổi về cấu trúc và hình thái ruột thể hiện rõ sau khi cai sữa sau 14 hơn ngày, sau 28 ngày sự thay đổi về hình thái là không nhiều Tại thời điểm 21 ngày tuổi, chiều cao lông nhung giảm 75% trong vòng 24 giờ (từ 940-694 pm) Sau đó chiều cao của lông nhung tiếp tục giảm cho đến ngày thứ năm sau khi cai sữa, lúc đó chiều cao tối đa của lông nhung chỉ khoảng 50% [13]

Miller và cộng sự (1986) đã công bố kết quả tương tự như trên, đồng thời tác giả đã khảo sát tiếp giai đoạn sinh trưởng sau đó của lợn con Kết quả là từ 5 – 8 ngày sau cai sữa, chiều cao của lông nhung bắt đầu tăng lên Hall và Byrne (1989)

cho rằng lông nhung còi cọc là do cơ thể giảm sản xuất của các tế bào mới Ngoài

ra, tác giả cũng công bố về tỷ lệ tế bào ruột bị mất đi từ bề mặt của các lông tơ Từ những thay đổi này đã làm ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tiêu thụ thức ăn và sự tăng trưởng của lợn [13, 40]

b Giảm hiệu quả tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng

Theo Miller et al (1986) và Hampson (1986), sự suy giảm nhanh chóng hoạt động của các enzyme phân hủy đường như sucrase, isomaltase và lactase giảm 50% sau 5 ngày lợn cai sữa Sau 11 ngày hoạt động lactase vẫn tiếp tục giảm, tuy nhiên hoạt động của enzyme sucrase đã được phục hồi

Hiện tượng giảm chiều cao lông nhung và tăng độ sâu của khe hốc ở ruột non, kết hợp với giảm hoạt động của các enzyme ở lợn sau khi cai sữa là nguyên nhân làm suy giảm khả năng hấp thu dinh dưỡng ở ruột non, từ đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của lợn

Ngoài ra, vi sinh vật gây bệnh từ môi trường bên ngoài xâm nhập vào đường ruột lợn, ảnh hưởng đến cấu trúc và hình thái, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ dinh dưỡng của ruột Trong vòng 3 – 10 ngày sau khi cai sữa, lợn rất dễ dàng gặp phải nguy cơ bị tiêu chảy Hiện tượng tiêu chảy là do sự gia tăng của các tế bào

vi khuẩn E coli và một số vi khuẩn gây bệnh khác trong đường ruột lợn Điều này

ảnh hưởng lớn đến năng suất chăn nuôi và gây tổn thất về kinh tế

1.3.3.3 Nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và chúc năng của ruột lợn con sau khi cai sữa

Cho đến nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc

và chức năng của ruột lợn giai đoạn cai sữa, sau đây là một số yếu tố cơ bản mà các nghiên cứu gần đây đã công bố [13, 20, 40]:

 Hệ vi khuẩn gây bệnh đường ruột và các tương tác của chúng trong ruột non

 Những căng thẳng của lợn con ở giai đoạn cai sữa

 Lợn con tách rời lợn mẹ

 Sự thay đổi về chế độ ăn uống

 Sự phân chia tế bào tăng kích thước đường ruột

1.3.4 Tác dụng của probiotic tới hệ vi khuẩn đường ruột của lợn

Probiotic có thể được sử dụng như dạng phụ gia thức ăn tiềm năng, thay thế cho các chất kích thích sinh trưởng, giúp cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột của lợn [40] Các chủng probiotic đang được sử dụng hiện nay là Lactobacillus, Bifidobacterium, spp Bacillus, Streptococcus, nấm men Saccharomyces cerevisiae

… Đây là các chủng vi sinh vật có lợi, Gram dương, không gây bệnh và có khả năng chống lại các mầm bệnh như E coli Ngoài ra chúng có độ ổn định và độ bám

dính vào niêm mạc ruột (Pal, năm 1999) [37]

1.3.4.1 Ảnh hưởng của probiotic đến hệ vi khuẩn đường ruột

Một trong những tác dụng chính của probiotic là ổn định hệ tiêu hoá, ngăn cản vi khuẩn gây bệnh [22, 45] Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh hệ vi khuẩn lactic có khả năng kích thích sự tăng trưởng của 2 loại vi khuẩn Bifidobacteria và Lactobacilli (Xuan và cộng sự, 2001) [38, 45] Những tác động của probiotic đến hệ

vi khuẩn đường ruột được mô tả trong bảng 1.4

Bảng 1.4: Tóm tắt tác dụng của các chủng probiotic đến hệ tiêu hoá của lợn

Lợn con B thermophilum và

B pseudolongum Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, phòng ngừa tiêu chảy

Kimura et al.,

1983 Lợn mới

sinh 2 ngày

tuổi L reuteri Tăng giảm Lactobacilli (↑), E coli (↓) Ratcliffe et al., 1986

Lợn con Strectococci, Ent

L acidophilus dạ dày đều tăng, nhưng không Lactobacillus và E coli trong

ảnh hưởng đến đường tiêu hóa

Pollman et al., 1980b Lợn cai sữa Lactobacillus Kích thích tiêu hóa Hale and Newton 1979

Lợn cai sữa Bacillus cereus,

Lactobacillus spp

Streptococccus

Không ảnh hưởng đến tỷ lệ tử vong và các triệu chứng lâm sàn về đường tiêu hóa

Cupere et al.,

1992

Lợn cai sữa Bifidobacterium globosum A Khả năng miễn dịch, ngăn ngừa vi sinh vật gây bệnh đường ruột Apgar et al., 1993 Lợn sắp

xuất chuồng Bacillus spp Không ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột Spriet et al., 1987

Lợn cai sữa Bacillus subtilis Streptococci và Bifidobacteria (↑); vi sinh vật gây bệnh giảm

(↓)

Ozawa et al.,

1983

Lợn con Lactobacillus Coliforms (↓), Lactobacillus (↑), không ảnh hưởng đến

đường tiêu hóa

Newman, 1990

Lợn con cai

sữa Bifidus bifidum ID Tỷ lệ lợn mắc bệnh rất thấp Ervolder et al., 1985

[40] Bên cạnh đó, cũng có một số nghiên cứu cho kết quả ngược lại Ví dụ như Harper và cộng sự (1983) đã không tìm thấy bất kỳ tác động có lợi của probiotic (Lactobacillous) về mức độ tiêu thụ thức ăn, hấp thụ dinh dưỡng và khả năng tăng

trưởng của lợn con Theo phân tích, nguyên nhân chính làm ảnh hưởng đến hiệu quả của probiotic là do sự hiện diện của kháng sinh và thuốc chống mycoplasma trong thức ăn của lợn (Pal, 1999) Vì vậy, probiotic được khuyến cáo là nên sử dụng sau khi ngừng điều trị kháng sinh [40]

1.3.4.2 Cơ chế hoạt động của probiotic trong hệ tiêu hoá của lợn

Một số cơ chế hoạt động của probiotic có tác dụng giúp ổn định hệ tiêu hóa của lợn được công bố:

(1) Theo Rolfe, 2000 và Lee et al, 1999, probiotic sản xuất một số chất ức chế như các axit hữu cơ, hydrogen peroxide và bacteriocins Những chất này có thể hạn chế các vi khuẩn có hại trong ruột

(2) Sự ức chế cạnh tranh đối với các vi khuẩn (như E coli) bám dính trên bề

mặt biểu mô đường ruột (Conway et al 1987), giúp cho probiotic nhanh chóng chiếm ưu thế trong đường ruột

(3) Probiotic có thể là rào cản dinh dưỡng đối với vi khuẩn gây bệnh

(4) Một nghiên cứu khác của Fukushima (1998) kết luận rằng probiotic có khả năng bảo vệ, ngăn ngừa bệnh đường ruột bằng cách kích thích miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu [40]

1.3.5 Probiotic kích thích tăng trưởng và nâng cao hiệu quả chăn nuôi

lợn

Khi hệ vi sinh vật đường ruột được ổn định bằng cách sử dụng chế phẩm probiotic, sức khỏe của lợn con được cải thiện và tăng hiệu quả chăn nuôi Tùy thuộc vào các chủng khác nhau mà mức độ tác động của probiotic đến khả năng tăng trưởng của lợn con cũng khác nhau [20, 40] Dựa theo kết quả của một số nghiên cứu, những tác dụng có lợi của probiotic đến tốc độ tăng trưởng của lợn được mô tả chi tiết ở bảng 1.5

Bảng 1.5: Tác dụng của các sản phẩm probiotic đến tốc độ tăng trưởng của lợn Vật nuôi Probiotic Tác dụng Nguồn tài liệu

Lợn cai sữa Lactobacillus sp Tỷ lệ chuyển hóa thức ăn (↑), Tỷ lê chất xơ và nitơ (↑), Newton 1979 Hale and

Lợn cai sữa L bulgaricus

S faecium Độ tăng trưởng và FCR (↑), Độ tăng trưởng (↓)

Pollmann et al, 1980a Lợn cai sữa L acidophilus Độ tăng trưởng bình thường Harper et al, 1983

Ogle and Inborr,

1987 Lợn cai sữa L reuteri Tăng trưởng giảm và FCR thấp Ratcliffe et al, 1986

licheniformis Độ tăng trọng lượng (↑),

Collinder et al.,

2000

độ tăng trưởng tăng (↑), Lợn cai sữa Bacillus toyoi Tỷ lệ tiêu chảy và tử vong giảm

hoặc Bacillus toyoi

Tiêu thụ thức ăn và độ tăng trưởng tăng (↑), Hiệu suất chuyển hóa (không ảnh hưởng)

Fialho et al.,

1998

[40] Ghi chú: FCR (Feed conversion ratio): Tỷ lệ tiêu thụ thức ăn

Prebiotic và Probiotic có thể thay thế cho thuốc kích thích sinh trưởng nói trên Vì prebiotic có chứa carbohydrate không bị tiêu hóa, cung cấp dinh dưỡng cho

hệ vi khuẩn đường ruột, giúp cải thiện hệ vi khuẩn đường tiêu hóa Việc bổ sung thêm probiotic giúp tiêu hóa ổn định, cản thiện sự sinh trưởng của lợn con [40]

- Prebiotic (nondigestible oligosaccharides như FOS) có thể là tiềm năng giúp tăng được trọng lượng của lợn con (Russell và cộng sự, 1996)

- Nghiên cứu của Abe và cộng sự (1995) đã mô tả hiệu quả cải thiện tăng trọng và hấp thụ thức ăn của lợn con khi sử dụng probiotic

- Ngoài ra, Nemcova và cộng sự (1999) đã phát triển chế phẩm synbiotics, là

sự kết hợp prebiotic (FOS) và probiotic (Lactobacillus paracasei) giúp tăng vi

khuẩn có lợi và giảm vi khuẩn có hại ở hệ tiêu hóa của lợn con sau khi tách [40]

1.4 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT BAO GÓI

1.4.1 Định nghĩa

Kỹ thuật bao gói là kỹ thuật gói các chất rắn, lỏng hay khí (chất nền) vào một lớp vỏ bao cực mỏng, lớp vỏ này sẽ giữ và bảo vệ chất nền không bị biến đổi làm giảm chất lượng (đối với những chất nền mẫn cảm với nhiệt độ) hay hạn chế tổn thất (đối với chất dễ bay hơi), nó chỉ giải phóng chất nền này ra ngoài trong một số điều kiện đặc biệt

Bao gói trong công nghệ sinh học là quá trình bẫy hoặc nhốt tế bào vi sinh vật bằng các chất gói, vỏ bọc hydrocolloid thích hợp để:

- Cách ly tế bào với môi trường xung quanh

- Giảm sự tổn thương cũng như sự thất thoát tế bào

- Ổn định, tăng giá trị cảm quan và phân bố tế bào đồng đều trong sản phẩm

- Tăng khả năng sống của probiotic

1.4.2 Tác nhân bảo vệ

Chất bảo vệ sử dụng trong sấy phun phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

- Độ tan tốt: nếu chất bảo vệ kém tan trong nước thì chúng sẽ không phân bố đều trong dịch lỏng, làm cho khả năng tiếp xúc với chất nền bị hạn chế, dẫn đến hiệu quả bảo vệ sẽ thấp Hơn nữa, độ tan kém sẽ làm nghẽn đầu phun trong quá trình phun sương Ngược lại nếu chất bao tan tốt trong nước, chúng dễ dàng hòa trộn đồng đều trong dịch lỏng, hiệu quả bảo vệ sẽ đạt được kết quả tốt hơn

- Khả năng tạo màng tốt: để quá trình bao gói đạt hiệu quả tốt thì chất bao phải có khả năng tạo màng tốt Nhờ vậy mà khi liên kết với chất nền, chất bao này

có thể hình thành một lớp màng bao ngoài chắc chắn và bảo vệ chất nền bên trong

- Khả năng tách nước tốt: trong quá trình sấy phun có giai đoạn tách nước trong các hạt được phun sương vào buồng sấy Nếu chất bao tách nước kém thì độ

ẩm của bột thành phẩm sẽ cao do thời gian lưu trong buồng sấy rất ngắn, lúc đó các

hạt thành phẩm có khuynh hướng kết dính lại với nhau, dẫn đến hiện tượng chúng

sẽ bám vào thành thiết bị, gây khó khăn cho quá trình thu hồi sản phẩm

- Dung dịch chất bao trong nước có độ nhớt thấp: độ nhớt của hệ nhũ tương quyết định chất lượng bao gói của sản phẩm khi sấy phun Nếu dịch nhũ tương có

độ nhớt cao sẽ gây trở ngại cho quá trình phun sương, dẫn đến các hạt thành phẩm không đồng đều về kích thước và hiệu quả bao gói thấp Các chất bao sử dụng trong công nghiệp thực phẩm bao gồm các loại gum tự nhiên, cacbonhydrate, sáp, protein sữa Trong đó protein sữa và gum được sử dụng nhiều nhất, do đạt được hầu hết các yêu cầu trên, nhưng chỉ có tính không tan là không tốt lắm

Một số hợp chất thường được sử dụng bảo vệ tế bào: aginate và phức hợp của aginate, tinh bột, hỗn hợp xanthan-gelan, carrageenan và hỗn hợp, gelatin, kết hợp gelatin và aginate, cellulose acetate phethalate (CAP), chitosan, whey protein và các hợp chất khác,… Trong đó, whey protein đạt được hầu hết các yêu cầu trên

1.4.3 Sấy thăng hoa

Phương pháp đông khô là quá trình trong đó nguyên vật liệu đã làm khô thông qua quá trình thăng hoa của băng Quá trình bao gồm ba bước: làm đông, thăng hoa

và chống hấp thụ Đầu tiên nguyên vật liệu được làm đông, gây nên sự tách nước ở trạng thái băng khỏi vật liệu Giai đoạn hai là quá trình thăng hoa tinh thể băng thành dạng hơi Để thực hiện quá trình này, năng lượng cần cung cấp ở dạng nhiệt Quá trình loại bỏ hơi nước cần có quá trình truyền khối, sai biệt về áp suất và trong thực tế thường sử dụng buồng ngưng tụ ở nhiệt độ - 50OC Theo sau quá trình loại

bỏ tinh thể băng, phần còn lại của sản phẩm là pha hòa tan dạng đậm đặc ở cuối quá trình đông khô ở dạng nguyên vật liệu đông khô Pha hòa tan này còn một lượng đáng kể nước không bị đông liên kết Phần lớn các vi sinh vật sẽ ở trạng thái không bền cấu trúc và hóa học nếu lượng nước này vẫn còn nguyên vật liệu, do đó cần thiết tiến hành quá trình loại nước hấp thụ

Phương pháp đông khô thích hợp để sản xuất giống vi khuẩn đậm đặc và rất thích hợp để lưu trữ và vận chuyển ở nhiệt độ thường Tuy nhiên, quá trình đông

khô gây vỡ màng tế bào, và do đó làm giảm mật độ tế bào trong quá trình xử lý và lưu trữ Mức độ chịu được quá trình đông khô khác nhau tùy từng loại vi khuẩn, môi trường đông khô, tính chất sinh lý của tế bào, tốc độ làm đông, các thông số trong quá trình đông khô, điều kiện rã đông và mật độ tế bào ban đầu

Tình trạng sinh lý của tế bào được thay đổi bằng cách thu hoạch tế bào ở các pha khác nhau hoặc tạo ra điều kiện không tối ưu cho sự phát triển của tế bào Thông thường tế bào thu hoạch ở pha tĩnh có khả năng sống sót qua quá trình xử lý đông khô cao hơn tế bào thu hoạch ở pha phát triển log Xử lý nhiệt bằng sốc nhiệt hoặc sốc lạnh tạo nên đáp ứng sốc tế bào và do đó kích ứng tế bào tạo ra các protein chịu sốc

1.4.4 Sấy phun

Trong quá trình sấy phun cần phải có các chất bảo vệ tế bào khỏi tác động của quá trình xử lý, tăng cường độ ổn định trong quá trình bảo quản và tạo sự dễ dàng trong quá trình hydrat hóa tế bào khi sử dụng Các chất thường được sử dụng để bao gói như: đường, polysaccharide, amino acid, protein và môi trường phức tạp như sữa gầy

Định nghĩa: sấy phun là quá trình làm bốc hơi nước ra khỏi vật liệu dưới tác dụng của nhiệt Trong quá trình sấy phun, nước được tách ra khỏi vật liệu nhờ sự khuếch tán do:

- Chênh lệch độ ẩm giữa bề mặt và bên trong vật liệu

- Chênh lệch áp suất hơi riêng phần của nước tại bề mặt vật liệu và môi trường xung quanh

Quá trình sấy phun gồm ba giai đoạn cơ bản sau:

- Giai đoạn phun sương là giai đoạn phân tán dòng nhập liệu thành những hạt sương nhỏ li ti vào trong buồng sấy

- Giai đoạn trộn nguyên vật liệu cần sấy với không khí nóng, khi đó sẽ diễn ra quá trình bốc hơi nước trong nguyên vật liệu

- Giai đoạn thu hồi sản phẩm sau sấy từ dòng khí thoát ra nhờ cyclon thu hồi sản phẩm

Ưu điểm của phương pháp sấy phun:

- Thời gian tiếp xúc giữa các hạt lỏng và tác nhân sấy trong thiết bị rất ngắn,

do đó nhiệt độ của mẫu nguyên liệu đem sấy không tăng quá cao Nhờ đó, sự tổn thất các hợp chất dinh dưỡng mẫn cảm với nhiệt độ có trong mẫu là không đáng kể

- Sản phẩm sấy phun thu được là những hạt nhỏ có hình dạng và kích thước tương đối đồng nhất Tỷ lệ khối lượng giữa các cấu tử không bay hơi trong sản phẩm tương tự trong mẫu lỏng ban đầu

- Thiết bị sấy phun trong thực tế sản xuất thường có năng suất cao và làm việc theo nguyên tắc liên tục Điều này góp phần làm hiện đại hóa các quy trình sản xuất công nghiệp

Nhược điểm của phương pháp sấy phun:

- Sản phẩm thu được bị giới hạn, không thể sử dụng mẫu nguyên liệu có độ nhớt quá cao hoặc sản phẩm thu được có tỷ trọng cao

- Vốn đầu tư thiết bị sấy phun khá lớn khi so sánh với các thiết bị sấy bị liên tục khác [23, 24]