Lên men lactobacillus acidophilus thu nhận sinh khối để ứng dụng trong công nghệ sản xuất probiotic

Hầu hết các chủng probiotic ñược sử dụng sản xuất thực phẩm là những loài thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria.. Trong những năm gần ñây, vi khuẩn lacti

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS THU NHẬN SINH KHỐI ðỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROBIOTIC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Tp Hồ Chí Minh, 03/2011

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ

LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS THU NHẬN SINH KHỐI ðỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PROBIOTIC

CBHD : PGS.TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG

TS NGUYỄN BÍCH HỒNG HVTH : NGUYỄN KIM THANH NHÃ MSHV : 09310577

Tp Hồ Chí Minh, 03/2011

TRƯỜNG ðẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Tp HCM, ngày 9 tháng 03 năm 2011

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Nguyễn Kim Thanh Nhã Phái: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 10/08/1982 Nơi sinh: ðồng Nai

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSHV: 0 9 3 1 0 5 7 7

I- TÊN ðỀ TÀI: Lên men thu nhận sinh khối Lactobacillus acidophilus ñể ứng dụng

trong công nghệ sản xuất probiotic

II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:

Xác ñịnh ñặc tính probiotic của giống Lactobacillus acidophilus

Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy theo quy mô phòng thí nghiệm

Khảo sát môi trường nuôi cấy cải biến

Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus

Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau

khi sấy phun

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/01/2010

IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 30/12/2010

V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Nguyễn Thu Hương

TS Nguyễn Bích Hồng

Nội dung và ñề cương luận văn thạc sĩ ñã ñược hội ñồng chuyên ngành thông qua

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN KHOA QL CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký) QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH (Họ tên và chữ ký)

(Họ tên và chữ ký)

ðẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học :

PGS, TS Nguyễn Thúy Hương

TS Nguyễn Bích Hồng

Cán bộ chấm nhận xét 1 :

Cán bộ chấm nhận xét 2 :

Luận văn thạc sĩ ñược bảo vệ tại Trường ðại học Bách Khoa, ðHQG Tp HCM ngày tháng 01 năm 2011

Thành phần Hội ñồng ñánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1

2

3

4

5

Xác nhận của Chủ tịch Hội ñồng ñánh giá LV và Bộ môn quản lý chuyên ngành sau khi luận văn ñã ñược sửa chữa (nếu có)

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn ñến quí Thầy Cô trường ðại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, ñặc biệt là những thầy cô ñã tận tình dạy bảo cho tôi suốt thời gian học tập tại trường

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc ñến Phó giáo sư – Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương và Tiến sĩ Nguyễn Bích Hồng ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Khoa Kỹ thuật hóa học ñã tạo rất nhiều ñiều kiện trong suốt khóa học

và thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn các bạn CNSH cao học khóa 2008 và 2009 ñã ñộng viên hỗ trợ trong suốt khóa học

Cuối cùng, con xin cám ơn ba mẹ ñã luôn ủng hộ, hỗ trợ và ñộng viên con trong thời gian qua

TP Hồ Chí Minh, tháng 01năm 2011

Học viên Nguyễn Kim Thanh Nhã

ðề tài luận văn: “ Lên men thu nhận sinh khối Lactobacillus acidophilus ñể ứng dụng trong công nghệ sản xuất probiotic”

Học viên thực hiện: Nguyễn Kim Thanh Nhã

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thúy Hương

TS Nguyễn Bích Hồng Thời gian thực hiện: Từ tháng 01/2010 ñến tháng 12/2010

Nội dung ñề tài

1 Xác ñịnh các ñặc ñiểm giống Lactobacillus acidophilus

2 Xác ñịnh hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy

3 Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy theo quy mô phòng thí nghiệm

4 Khảo sát môi trường nuôi cấy cải biến

5 Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

6 Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus

7 Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau khi sấy phun

Kết quả ñề tài

1 Chủng Lactobacilus acidophilus có những ñặc tính của probiotic cao: Chịu ñược pH thấp, muối mật, loại bỏ cholesterol, sinh L-acid lactic, kháng khuẩn và phân giải protein

2 Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm: Môi trường MRS với 13g sucrose và 14.55g peptone là môi trường tối ưu cho sự phát triển tạo sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

3 Lên men fed-batch

Sucrose là cơ chất lên men giới hạn trong fed-batch

Kết quả lên men fed-batch với cơ chất giới hạn là sucrose ở ba chế ñộ 3 g/l.h, 5 g/l.h, 7 g/l.h Chế ñộ sucrose 5 g/l.h sinh khối cực ñại ñạt cao nhất ñạt 2.784

CDW (g/l)

nuôi cấy L acidophilus bao gồm môi trường A( cà chua), B ( giá ñỗ), C (cải xanh) Các kết quả cho thấy trên môi trường C có khả năng tạo sinh khối cao nhất so với 2 môi trường A và B

5 Khảo sát ñiều kiện nhiệt ñộ bảo quản sinh khối L acidophilus sau khi sấy phun: Hai chế ñộ nhiệt ñộ ñược khảo sát là 4oC và 15oC Sau gần 1 tháng bảo quản thì ở nhiệt ñộ

4oC mật ñộ tế bào vi khuẩn L acidophilus vẫn duy trì ở mức cao ≈ 108 cfu/g

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

1.1 ðặt vấn ñề 1

1.2 Nội dung 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ðại cương về probiotic 3

2.2 Phương pháp nuôi cấy batch, fed-batch 25

2.3 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 29

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 37

3.2 Nguyên vật liệu 37

3.2.1 Chủng vi sinh vật 37

3.2.2.Môi trường nuôi cấy 37

3.3 Phương pháp phân tích 38

3.3.1 Xác ñịnh mật ñộ tế bào bằng phương pháp ño mật ñộ quang 38

3.3.2 Xác ñịnh lượng sinh khối khô 38

3.3.3 Xác ñịnh khả năng chịu pH thấp 39

3.3.4 Xác ñịnh khả năng chịu muối mật 39

3.3.5 Khả năng chịu cholesterol 39

3.3.6 Xác ñịnh hoạt tính kháng khuẩn 39

3.3.7 ðịnh tính acid lactic 40

3.3.8 Phương pháp ñịnh lượng acid lactic 40

3.3.9 Xác ñịnh ñồng phân dạng D, L acid lactic 41

3.3.10 Hoạt tính phân giải protein 42

3.3.11 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm yếu tố toàn phần 42

3.3.12 Phương pháp tối ưu hóa thực nghiệm ñường dốc nhất 44

3.3.13 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 45

3.3.14 Những nghiên cứu làm tiền ñề cho lên men fed-batch thu nhận sinh khối probiotic 45

3.3.15 Lên men trong fermenter 50

3.3.16 Sấy phun sinh khối probiotic 53

3.3.17 Bảo quản sinh khối probiotic 53

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Những nghiên cứu làm tiền ñề cho lên men thu nhận sinh khối probiotic 54

4.2 Lên men trong fermenter 69

4.3 Sấy phun thu sinh khối L acidophilus và theo dõi thời gian bảo quản sinh khối L acidophilus 75

4.4 Khảo sát khả năng lên men tạo sinh khối của vi khuẩn L acidophilus trên một số môi trường cải biến 76

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 78

5.2 ðề nghị 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PTN : Phòng thí nghiệm

QHTT: Quy hoạch tuyến tính

LAB: Lactic acid bacteria ( Vi khuẩn sinh acid lactic)

CDW: Sinh khối khô

DANH MỤC BẢNG VÀ ðỒ THỊ

Trang

Bảng 3.1: Thông số tối ưu thành phần môi trường 47

Bảng 3.2: Số liệu thí nghiệm leo dốc với sucrose và peptone 48

Bảng 3.3 : Thông số tối ưu ñiều kiện nuôi cấy 48

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của pH 2 lên L acidophilus 56

Bảng 4.2: Khả năng sống sót của L acidophilus ở pH 2, bổ sung 0,3% mật bò 57

Bảng 4.3: Khả năng sinh acid lactic của L acidophilus 58

Bảng 4.4: Hoạt tính kháng khuẩn thể hiện theo pH 59

Bảng 4.5: Phổ kháng khuẩn của dịch nuôi cấy 60

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitơ ñến khả năng tạo sinh khối và hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus acidophilus. 61

Bảng 4.7: Kết quả tối ưu hóa theo ñiều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực nghiệm 62

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát % giống 64

Bảng 4.9: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ nuôi cấy 64

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát pH môi trường nuôi cấy 65

Bảng 4.11: Kết quả tối ưu thành phần môi trường nuôi cấy 66

Bảng 4.12 : Kết quả thí nghiệm leo dốc 69

Bảng 4.13 : Kết quả khảo sát cơ chất giới hạn 72

Bảng 4.14: Tóm tắt các chế ñộ và kết quả 74

Bảng 4.15: Nhiệt ñộ và thời gian bảo quản hoạt tính của sinh khối L acidophilus sau sấy phun 75

Bảng 4.16: Khả năng sinh acid lactic của L acidophilus trên môi trường cải biến 76

Bảng 4.17: Khả năng ức chế vi khuẩn kiểm ñịnh trên các môi trường cải biến của L acidophilus 77

ðồ thị 4.1: ðường cong sinh trưởng của Lactobacillus acidophilus 55

ðồ thị 4.2: ðộng học lên men theo mẻ không ñiều khiển pH 70

ðồ thị 4.3: ðộng học lên men theo mẻ ñiều khiển pH 6.0 71

ðồ thị 4.4: ðộng học lên men fed-batch 3g/l.h sucrose, pH 6.0 72

ðồ thị 4.5: ðộng học lên men fed-batch 5g/l.h sucrose, pH 6.0 73

ðồ thị 4.6: ðộng học lên men fed-batch 5g/l.h sucrose, pH 6.0 73

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Hệ thống phát sinh loài biểu diễn dưới dạng cây thể hiện mối quan hệ giữa các

loài trong họ Lacto-bacillaceae (L-Lactobacillus) 12

Hình 2.2: Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi 12

Hình 2.3: Lactate dehydrogenase và Racemase 14

Hình 2.4: Acid L-lactic và acid D-lactic 15

Hình 3.1: Sơ ñồ tổng quát quá trình nghiên cứu 45

Hình 3.2: Sơ ñồ lên men theo mẻ trong fermenter 50

Hình 3.3 : Lên men L acidophilus bằng fermenter tự ñộng 52

Hình 3.4: Sơ ñồ lên men fed-batch 52

Hình 4.1: Khuẩn lạc Lactobacillus acidophilus 54

Hình 4.2: Tế bào Lactobacillus acidophilus quan sát dưới kính hiển vi 54

Hình 4.3: Lactobacillus acidophilus phân giải casein trong môi trường

thạch MRS bổ sung 1% casein 58

Hình 4.4: Vòng kháng khuẩn ở pH 3 59

Hình 4.5: Sinh khối L acidophilus sau khi sấy phun 75

CHƯƠNG 1

MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe ñược bổ sung vào chế ñộ

ăn uống của cơ thể vật chủ Theoñịnh nghĩa của tổ chức y tế thế giới và tổ chức lương nông thế giới (WHO/FAO, 2001) “ Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể một lượng ñầy ñủ sẽ có lợi về mặt sức khỏe cho người sử dụng” [54] Qua nhiều thử nghiệm nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có lợi thường ñược sử dụng bao gồm: Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic như Lactobacillus (L.acidophilus, L.casein), Bifidobacterium; các chủng E.coli không gây bệnh; Clostridium butyricum; Streptococcus salvarius; các chủng Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus breve, Bacillus infantis, Bacillus longum và Saccharomyces boulardii (nấm men) Hầu hết các chủng probiotic ñược sử dụng sản xuất thực phẩm là những loài thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic như là Lactobacillus và Bifidobacteria.

Probiotic có thể ñem ñến cho cơ thể những lợi ích sau ñây: Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản trở chúng bám vào thành ruột Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn hữu hiệu hơn ðối với những người thường bị chứng bất dung nạp ñường lactose thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa chất ñường này dễ dàng hơn Giảm nguy

cơ tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh (Antibiotic Associated Diarrhea hay AAD) ðiều hòa hệ miễn dịch Ngừa ung thư ruột Giảm cholesterol trong máu Giảm thiểu hiện tượng dị ứng Ngăn chặn và xử lý nhiễm khuẩn Helicobacter pylori gây viêm loét dạ dày

Sản phẩm probiotic trên thị trường rất ña dạng, ngoài dạng probiotic thường gặp trong yogurt, kefir, phomai tươi cottage… Probiotic còn ñược bán ra dưới nhiều hình thức khác như: Probiotic cô lạnh, viên nang (capsule), viên nén, bột, yogurt trị liệu, men bia Saccharomyces bolardii

Tuy nhiên, không phải cứ bổ sung probiotic vào thực phẩm hay sữa thì ñược gọi

là probiotic Probiotic có thể bị tiêu diệt bởi các men và acid ñường ruột Do ñó, ñể ñược gọi là probiotic, một trong những ñiều kiện ñầu tiên là chủng probiotic mạnh, ñược chứng nhận lâm sàng và có số lượng lớn

Việc sản xuất probiotic ñòi hỏi chi phí và công nghệ cao nên Việt Nam vẫn chưa có nhiều sản phẩm chứa probiotic hay sản phẩm bổ sung probiotic thật sự ñược kiểm nghiệm và chứng nhận lâm sàng, nguồn probiotic trong nước chủ yếu ñược nhập khẩu, chưa ñược sản xuất theo quy mô công nghiệp

Trong những năm gần ñây, vi khuẩn lactic ñược sử dụng nhiều trong lên men thực phẩm do có ñặc tính sinh học của probiotic như khả năng chịu muối mật, acid, có hoạt tính kháng khuẩn, loại bỏ cholesterol Sinh khối của vi khuẩn lactic cũng là nguồn protein bổ sung cho con người và gia súc (Blanch và Clark, 1996) Bên cạnh ñó, các sản phẩm trao ñổi chất của vi khuẩn lactic cũng ñược ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm và thực phẩm, ví dụ như bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, khả năng chịu ñược ñiều kiện cực ñoan của môi trường dạ dày và ức chế sự tăng trưởng của

vi khuẩn gây ôi thiu thức ăn (Desmazeaud, 1996) Trong ñó, Lactobacillus acidophilus ñược sử dụng như men vi sinh bổ sung vào thực phẩm cũng như trong dược phẩm do có nhiều ưu ñiểm ñã ñược nghiên cứu và chứng minh Lactobacillus acidophilus có lợi cho sức khỏe ( Alvarez-Olmos và Oberhelman, 2001; Shanahan, 2002; Guarner Malagelada, 2003)

Trong kỹ thuật lên men có ba phương pháp chính: Lên men theo mẻ, fed-batch

và lên men liên tục Trong ñó, lên men theo mẻ ñơn giản, dễ thực hiện, tuy nhiên hiệu suất không cao do sự tích lũy cơ chất, ñộc chất Phương pháp lên men fed-batch là phương pháp lên men rút ngắn thời gian lên men và làm tăng hiệu suất của quá trình lên men, tuy nhiên sự tự ñộng hóa không cao Lên men fed-batch sẽ làm giảm chi phí sản xuất vì chỉ cần bổ sung một lượng cơ chất vừa ñủ trong suốt quá trình lên men Lên men liên tục tự ñộng hóa cao nhưng kỹ thuật phức tạp, phải tiệt trùng liên tục

Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu lên men fed-batch ñể thu sinh khối Lactobacillus acidophilus và tìm ñiều kiện tốt nhất ñể bảo quản hoạt tính probiotic của Lactobacillus acidophilus

1.2 Nội dung

Xác ñịnh các ñặc ñiểm giống Lactobacillus acidophilus

Xác ñịnh hoạt tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy

Tối ưu hóa ñiều kiện nuôi cấy theo quy mô phòng thí nghiệm

Khảo sát môi trường nuôi cấy cải biến

Lên men fed-batch thu sinh khối Lactobacillus acidophilus

Sấy phun sinh khối Lactobacillus acidophilus

Khảo sát ñiều kiện bảo quản tối ưu sinh khối Lactobacillus acidophilus sau khi sấy phun

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 ðại cương về probiotic

từ sự phân giải protein Theo Metchnikoff các hợp chất này chịu trách nhiệm cho những gì ông gọi là “ruột tự nhiễm ñộc” gây ra những biến ñổi vật lý liên quan ñến tuổi già Vào thời gian ñó ñã biết ñược sữa lên men bởi các vi khuẩn lactic ức chế sự phát triển của vi khuẩn phân giải protein do sự lên men của lactose làm giảm pH Ông cũng quan sát thấy rằng một số người dân vùng nông thôn ở Châu Âu như Bungari và vùng thảo nguyên ở Nga sống chủ yếu vào sữa lên men bằng vi khuẩn lactic sống lâu hơn Dựa trên những dữ kiện, Metchnikoff ñưa ra việc tiêu thụ sữa lên men với vi khuẩn lactic vô hại, làm giảm pH của ruột và ñiều này sẽ ngăn chặn sự phát triển của

vi khuẩn phân giải protein Metchnikoff ñã tự giới thiệu chế ñộ ăn uống của Ông với sữa chua lên men bởi vi khuẩn Ông gọi là “trực khuẩn Bungari” và ñã thấy ñược lợi ích của chúng ñối với sức khỏe của Ông Những người bạn ở Paris của Ông nhanh chóng theo gương và các bác sĩ cũng bắt ñầu chỉ ñịnh chế ñộ ăn uống sữa chua cho các bệnh nhân của họ

Henry Tissier, cũng từ viện Pasteur, là người ñầu tiên phân lập ñược Bifidobacterium Ông ñã phân lập vi khuẩn từ hệ thực vật ñường ruột của một trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và ñặt tên là Bacillus bifidus communis, sau ñó ñược ñổi tên thành Bifidobacterium bifidum Tissier chỉ ra rằng Bifidobacteria chiếm ưu thế trong hệ thực vật ñường ruột của trẻ sơ sinh bú sữa mẹ và Ông ñề nghị sử dụng Bifidobacteria ñiều trị cho trẻ bị tiêu chảy Cơ chế hoạt ñộng là Bifidobacteria sẽ thay thế vi khuẩn phân giải protein gây bệnh

Vào năm 1917, giáo sư người ðức Alfred Nissle ñã phân lập ñược chủng Escherichia coli từ phân của những người lính trong chiến tranh thế giới thứ nhất, họ

bị viêm ruột non kết trong thời gian bùng nổ bệnh lỵ trực khuẩn (shigellosis) Ở thời ñiểm ñó, thuốc kháng sinh chưa ñược phát hiện và Nissle sử dụng chủng này và thành công ñáng kể trong trường hợp viêm nhiễm ñường ruột cấp tính (salmonellosis và shigellosis) Escherichia coli Nissle 1917 vẫn còn ñược sử dụng và là một trong vài ví

dụ về probiotic không phải là vi khuẩn lactic

Vào năm 1920, Rettger chứng minh rằng “trực khuẩn Bungari” của Metchnikoff, sau ñó gọi là Lactobacillus bulgaricus không thể sống trong ruột người

và hiện tượng thực phẩm lên men biến mất ở bên ngoài Lý thuyết của Metchnikoff ñược bàn cãi ở giai ñoạn này và có những nghi ngờ lý thuyết về sự sống lâu của ông

Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt ñộng của trung tâm ñược chuyển tới Mỹ Có luận ñiểm cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn trong ñường ruột có nhiều khả năng cho việc sản xuất hiệu quả mong muốn trong ñường ruột và vào năm

1935 một số chủng Lactobacillus acidophilus ñược tìm thấy có tác dụng tích cực cho ñường tiêu hóa của con người Các thử nghiệm ñã ñược thực hiện trên chủng vi sinh vật này, kết quả thu ñược rất khả quan ñặc biệt trong việc ñiều trị táo bón mãn tính

Thuật ngữ “probiotic” lần ñầu tiên ñược Kollath ñưa ra vào năm 1953 Trái ngược với thuốc kháng sinh, probiotic ñược xác ñịnh là yếu tố bắt nguồn từ vi khuẩn kích thích sự tăng trưởng của vi sinh vật khác Năm 1989 Roy Fuller ñưa ra một ñịnh nghĩa của probiotic ñã ñược sử dụng rộng rãi : “ Vi sinh vật sống có lợi cho vật chủ ñược bổ sung vào thức ăn giúp cải thiện cân bằng hệ vi khuẩn ñường ruột của vật chủ” ðịnh nghĩa của Fuller nhấn mạnh các yêu cầu của tính khả thi cho probiotic và giới thiệu một số khía cạnh của một số tách dụng có ích trên cơ thể vật chủ

Trong những thập niên tiếp theo loài Lactobacillus bao gồm Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casein, và Lactobacillus johnsonii chúng là những loài vi khuẩn có ích cho ñường ruột [54]

2.1.2 Một số ñịnh nghĩa probiotic

Probiotic là những thực phẩm chức năng khi ăn vào sẽ có ảnh hưởng rõ ràng trong sự ñiều chỉnh các quá trình chức phận cơ thể (Lyon, 2005)

Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe ñược ăn vào qua ñường miệng cùng với các chất dinh dưỡng truyền thống trong thức ăn (Zayed & Roos, 2003)

Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe ñược bổ sung vào chế

ñộ ăn uống của cơ thể vật chủ Theo tổ chức y tế thế giới: ‘‘Probiotic là các vi sinh vật sống mà khi tiêu thụ vào cơ thể một lượng ñầy ñủ sẽ có lợi về sức khỏe cho người sử dụng” [54]

2.1.3 Vai trò của probiotic

Qua nhiều thử nghiệm nghiên cứu về các chủng vi khuẩn có lợi thường ñược

sử dụng bao gồm: Các chủng vi khuẩn sinh acid lactic như Lactobacillus (L.acidophilus, L casein), Bifidobacterium; các chủng E.coli không gây bệnh; Clostridium butyricum; Streptococcus salvarius; các chủng Bacillus như Bacillus subtilis, Bacillus breve, Bacillus infantis, Bacillus longum và Saccharomyces boulardii (nấm men) Trong ñó vi khuẩn sinh acid lactic hiện nay ñược sử dụng phổ biến nhất trong công nghiệp sản suất probiotic Probiotic có thể ñem ñến cho cơ thể những lợi ích sau ñây:

Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản trở chúng bám vào thành ruột

Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn hữu hiệu hơn ðối với những người thường bị chứng bất dung nạp ñường lactose thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa chất ñường này dễ dàng hơn Hầu hết dân số trên thế giới không dung nạp lactose sau khi cai sữa là do sự giảm khoảng 90 – 95% lượng enzyme lactase sinh ra Lactase là enzyme thuỷ phân lactose thành glucose và galactose Sự hiện diện của lactose làm thay ñổi sự cân bằng thẩm thấu trong khoang ruột kết Vì vậy xuất hiện những triệu chứng như trương bụng trương phồng lên, co thắt, ñầy hơi và kéo theo là tiêu chảy ðể giảm sự không dung nạp lactose người ta chứng minh ñược rằng nên tiêu thụ sản phẩm probiotic Và trên những kiểm nghiệm lâm sàng gần ñây người ta khuyên nên dùng LAB Giảm nguy cơ tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh (Antibiotic Associated Diarrhea hay AAD) ðiều hòa hệ miễn dịch Ngừa ung thư ruột Những tác nhân gây ung thư có thể ñược ñưa vào hay ñược tạo thành bởi hoạt ñộng chuyển hoá của vi sinh vật cư trú trong

ñường ruột Những cơ chế hoạt ñộng của probiotic chống lại khối u có thể tóm tắt như sau: Khử ñộc những chất gây ung thư ñược ñưa vào Thay ñổi môi trường của ruột và hoạt ñộng chuyển hoá của vi khuẩn có thể tạo thành những chất gây ung thư Tạo thành những sản phẩm chuyển hoá (butyrate) mà những sản phẩm này thay ñổi khả năng của tế bào chết khi nó chết Sản sinh ra những chất ức chế sự phát triển của những tế bào tạo khối u Kích thích hệ thống miễn dịch Giảm cholesterol trong máu [39]

Có hai cơ chế khi tiêu thụ LAB làm giảm cholesterol Cơ chế thứ nhất cho rằng, cholesterol ñược sử dụng trong sản xuất những acid mật, tăng sự dị hoá và bài tiết của những acid mật có thể làm giảm cholesterol Những acid mật chủ yếu ñược tạo thành bởi gan là acid chenodeoxycholic Những acid này thường kết hợp với glycine hay taurine tạo thành acid glycocholic và acid taurocholic, nhưng có thể ñược tách ra bởi enzyme vi sinh vật là BSH (bile salt hydrolase) Sự tách những muối mật này ngăn sự gia tăng cholesterol ðiều này chứng tỏ rằng vi sinh vật trực tiếp hấp thụ cholesterol [26]

Có nhiều nguyên nhân gây ra bệnh tiêu chảy vì vậy rất khó khăn cho việc ñánh giá ảnh hưởng của probiotic trên bệnh tiêu chảy Trên toàn thế giới, bệnh tiêu chảy ñã giết chết phần lớn trẻ em và rotavirus là nguyên nhân chính Sự phát triển của Bifidobacteria trong ñường ruột tạo nên pH thấp trong ruột già bằng cách sản sinh ra acid lactic và acid acetic, vì vậy chúng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gram âm kỵ khí tuỳ ý gây ra bệnh tiêu chảy

Khu hệ sinh thái ñường ruột ổn ñịnh, nó hoạt ñộng như một hàng rào vật lý và sinh lý chống lại vi khuẩn gây bệnh và những kháng nguyên từ khoang ruột Những nghiên cứu cho thấy rằng, những trẻ em bị tiêu chảy do rotavirus thì phục hồi nhanh hay giảm những triệu chứng tiêu chảy khi sử dụng probiotic Nghiên cứu ở những ñứa trẻ (1 - 36 tháng tuổi) sử dụng Lactobacillus casei GG liều lượng 1x 1011 CFU trong 5 ngày bệnh tiêu chảy rút ngắn từ 3.8 ngày còn 2.7 ngày

Nhiều nghiên cứu cho rằng các chế phẩm probiotic có chứa L.rhamnosus GG giúp hạn chế hội chứng dị ứng thực phẩm Những ñứa trẻ bị dị ứng với protein thịt bò

và bị nổi vết chàm khi ñược cho ăn váng sữa ñã thuỷ phân có bổ sung L.rhamnosus

GG cho thấy sự cải thiện ñáng kể những vết chàm dị ứng trên da, ñồng thời giảm tiết

α1- kháng trypsin và interferon – α, so với những ñứa trẻ chỉ ñược cho ăn sữa ñã thuỷ phân

Trong một cuộc thử nghiệm tại bệnh viện công nương Magarett (Úc), việc cho trẻ dùng các chế phẩm probiotic có chứa Lactobacillus trong chế ñộ ăn uống vời liều dùng 2 lần/ngày trong sáu tháng ñầu ñời cho thấy khả năng tăng cường sự miễn nhiễm, làm giảm một nửa số trẻ mắc bệnh viêm da

Probiotic ngăn chặn và xử lý nhiễm khuẩn Helicobacter pylori gây viêm loét

dạ dày H pylori là một trong số một vài vi khuẩn có khả năng sống ñược trong niêm mạc dạ dày Trong một số trường hợp chúng gây viêm loét hoặc ung thư dạ dày Sử dụng probiotic là liệu pháp thường ñược kết hợp với liệu pháp kháng sinh truyền thống trong ñiều trị nhiễm khuẩn H pylori Các thử nghiệm in vitro và in vivo cho thấy các chủng L acidophilus LB tiết ra các chất kháng H.pylori Chúng cũng làm giảm sự kết bám, và số lượng của H felis trong chuột và của H.pylori trên dòng tế bào ruột người HT29-MTX (Coconier và ctv.,1995) Khi nghiên cứu trên những người tình nguyện nhiễm H.pylori ñược ăn loại sữa lên men LC1 chứa L jonhsonii La1, thấy rằng có sự giảm mật ñộ H pylori và giảm các triệu chứng viêm loét dạ dày (Felley và ctv.,2001) [50]

2.1.4 Các chế phẩm probiotic thông dụng

Tại Canada và Mỹ, probiotic chỉ ñược xếp vào loại thực phẩm bổ sung Ở dạng viên hoặc dạng bột probiotic phải chịu sự chi phối của cơ quan FDA thông qua luật Dietary Supplement Health and Education Act Standards… Trường hợp dùng ñể lên men yogurt, kefir thì probiotic ñược xem nằm trong thành phần bình thường của sản phẩm Trong kỹ nghệ muốn sử dụng một vi khuẩn nào ñó như một probiotic ñể thêm vào sản phẩm, vi khuẩn này phải ñược FDA xét duyệt và nằm trong nhóm vi khuẩn an toàn gọi là GRAS (Generally Recognized as Safe)

Ngoài các probiotic thường gặp trong yogurt, kefir, bơ, pho mai, nước trái cây… Probiotic có thể thấy bán ra dưới nhiều hình thức khác nhau như:

Probiotic cô lạnh: Khi hạ nhiệt ñộ xuống thật thấp vi khuẩn sẽ trở lên khô như bột nhưng không bị hủy diệt Chúng sẽ sống lại khi ñược uống vào

Viên nang (Capsule): Mỗi viên chứa từ 2 - 6 tỉ vi khuẩn Thường có 2 hay 4 loại vi khuẩn phối hợp lại với nhau Các vi khuẩn thường ñược sử dụng là Lactobacillus casein, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus lactis, Bifidobaterium longum

Bột: Dạng bột ñể pha trong nước Nhờ lưu lại bao tử trong thời gian ngắn nên khi ñến ruột một lượng lớn vi khuẩn vẫn còn sống

Yogurt trị liệu: Nên uống trước khi ăn Có thể chứa một tỷ lệ probiotic rất cao (50 tỉ cho một liều)

Men bia, có 2 loại: Men bia Saccharomyces boulardii, còn gọi là men sống hay men có hoạt tính ðược sấy khô ở nhiệt ñộ không quá 40 0C Có tính năng trị liệu rất tốt Men không có hoạt tính thường là phế phẩm của kỹ nghệ bia, giá rẻ Probiotic không có hoạt tính vì ñã bị sấy khô ở nhiệt ñộ cao [43]

2.1.5 Những yêu cầu về an toàn thực phẩm của probiotic

- Probiotic phải ñảm bảo an toàn cho cơ thể vật chủ

- Không gây bệnh trong ñường ruột của người khỏe mạnh

- Có thể sống và hoạt ñộng trao ñổi chất trong ñường tiêu hóa vật chủ

- Phải còn sống và ổn ñịnh trên mỗi vị trí của ñường tiêu hóa

- Không có ảnh hưởng ngược lại trên thuộc tính cảm thụ cơ thể (receptor)

- Không gây dị ứng cho cơ thể

Những năm gần ñây, việc sử dụng sinh vật probiotic và các acid hữu cơ như chất thay thế kháng sinh trong thực phẩm ñang rất ñược quan tâm Sự thích nghi tự nhiên của nhiều vi khuẩn lactic (LAB) ñối với môi trường ruột và những chất kháng khuẩn ñược chúng tạo ra (acid hữu cơ và bacteriocin) ñã cho LAB một thuận lợi cạnh tranh so với những vi sinh vật khác khi ñược dùng làm probiotic

Tiêu chuẩn lựa chọn vi khuẩn lactic là probiotic bao gồm : có trong cơ thể người, ñộ an toàn, khả năng sống sót/ ñộ acid trong phương tiện vận chuyển, tính chịu acid và mật, bám vào biểu mô ruột, khả năng nhân rộng trong ñường ruột, sản xuất L-

lactic acid, sản xuất những cơ chất kháng vi trùng, khả năng kích thích hệ thống miễn dịch của vật chủ và khả năng ảnh hưởng ñến hoạt tính biến dưỡng như là sản xuất vitamin, ñồng hoá cholesterol và lactose

Theo Salminen và Ouwehand khả năng của các chủng probiotic ảnh hưởng tới sức khoẻ có thể bao gồm những cơ chế sau :

- Bám chặt vào màng nhầy ruột và vi sinh vật

- Sản sinh những cơ chất kháng sinh vi sinh vật

- Chống lại những nhân tố gây bệnh và chất gây ung thư

- Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh

- Tương tác với tổ chức lympho ñường tiêu hoá (thay ñổi khả năng miễn dịch)

- Những thành phần có hại trong ñường ruột (liên kết với những ñộc tố và quy ñịnh hoạt ñộng chuyển hoá của vi sinh vật ñường ruột) [43]

2.1.6 Khái quát vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB) ñóng một vai trò quan trọng, chúng ñược sử dụng nhiều trong công nghiệp Về mặt hình thái chúng có nhiều dạng khác nhau : hình cầu, hình que, hình oval Về mặt sinh lý, LAB thuộc nhóm vi khuẩn gram dương, không di ñộng, không tạo bào tử, hiếu khí tuỳ ý, không gây bệnh và không sản sinh các chất có ñộc và ñộc tố LAB chủ yếu là loài ưa ấm, nhưng một số

ưa lạnh và một số thì ưa nhiệt Chúng có thể kháng ñược với acid yếu (pH 3.5 – 6.5) Nhận năng lượng nhờ sự phân giải carbohydrate và sản sinh acid lactic chiếm sản lượng khoảng 90% LAB là loài lên men bắt buộc không chứa cytochrom và catalase [43]

LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, phụ thuộc vào những yếu tố môi trường như pH, nhiệt ñộ và sự tích luỹ các sản phẩm chuyển hoá cuối Chúng ñòi hỏi các vitamin như: thiamine, biotin, acid pantotemic, acid nicotinic và các acid amin Vì vậy, môi trường nuôi cấy thường bổ sung thêm: nước chiết cà chua, nước chiết giá, cao nấm men, cao thịt… LAB có mặt ở khắp mọi nơi và phổ biến là ở ñường ruột

người và ñộng vật Vai trò quan trọng nhất của LAB là chống lại vi khuẩn gây bệnh, làm tăng hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chữa các bệnh tiêu chảy, táo bón

Dựa vào khả năng lên men người ta chia làm hai nhóm là LAB ñồng hình và LAB dị hình

Vi khuẩn len men lactic ñồng hình tạo acid lactic là sản phẩm chính của quá trình lên men glucose, các sản phẩm phụ là ethanol, acid acetic, CO2, acetone Lên men ñồng hình phân giải glucose theo con ñường Embden-Mayerhoff Các vi khuẩn thuộc nhóm này : L.delbrueckii, L.acidophilus, L.casei, L bulgaricus, Enterococcus…

Vi khuẩn lên men lactic dị hình thì ngoài sản phẩm acid lactic còn có một lượng lớn acid acetic, CO2, ethanol… Sự lên men nhóm này khá phức tạp Các loài vi khuẩn tiêu biểu nhóm này là : Leuconostoc, L brevis, L lycopessici, S cumoris, S lactic, S thermophilus [11]

Theo khoá phân loại Bergey (1986) LAB ñược xếp vào :

di ñộng Di ñộng khi có sự hiện diện của tiêm mao Trên môi trường agar, Lactobacillus tạo khuẩn lạc lồi, ñục, mép trơn, ñường kính 2 – 5 mm

Lactobacillus là vi khuẩn kỵ khí tuỳ ý, ñôi khi hiếu khí, thỉnh thoảng có chủng ñòi hỏi ñiều kiện kỵ khí bắt buộc khi phân lập Chúng phát triển kém trên môi trường có không khí nhưng phát triển tốt trên môi trường khử oxi Ở ñiều kiện kị khí

5 – 10% CO2, Lactobacillus phát triển mạnh trên môi trường agar Trắc nghiệm catalase, cytochrome và bazidine âm tính Thu năng lượng từ sự lên men carbohydrate

và sản phẩm chuyển hoá cuối cùng chiếm hơn 50% lactate, còn lại là acetate, format, succinate, CO2, ethanol

Lactobacillus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp về amino acid, peptide, các dẫn xuất nucleic acid, vitamin, muối, acid béo, ester và một số nguồn carbohydrate Nhiệt ñộ phát triển trong khoảng 5 – 350C, nhiệt ñộ phát triển tối ưu là 30 – 400C Chúng phát triển tốt ở pH 5.0 và pH tối ưu là 5.5 – 5.8 Lactobacillus ít gây bệnh và ñược tìm thấy trong các sản phẩm từ sữa, thịt, hạt, nước, nước thải, bia, rượu vang, nước ép trái cây, hoa quả, dưa chua cũng như ở miệng, âm ñạo, hệ thống dạ dày-ruột người và nhiều loài ñộng vật [28]

Các loài Lactobacillus ñược chia thành ba nhóm dựa trên ñặc ñiểm lên men : (1) nhóm lên men ñồng hình bắt buộc, (2) nhóm lên men dị hình tuỳ ý, (3) nhóm lên men dị hình bắt buộc (Pot và ctv., 1994; Hammes và Vogel,1995) [28]

Có nhiều loài của giống Lactobacillus ñược tìm thấy trong những môi trường khác nhau, từ những sản phẩm sữa, trong hệ thống ñường ruột người Những loài của giống Lactobacillus ñược phân lập từ ruột người là : L acidophilus, L fermentum, L planturum, L brevis, L casei, L leichmanii và L mintus Lactobacillus thì có khả năng sống trong môi trường acid pH 4 – 5 hay thấp hơn

Hình 2.1: Hệ thống phát sinh loài biểu diễn dưới dạng cây thể hiện mối quan hệ giữa các loài trong họ Lacto-bacillaceae (L-Lactobacillus) [43]

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

Hình 2.2: Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi [50]

“Lacto” có nghĩa là sữa và “bacillus” có nghĩa là hình gậy, “acidophilus” có nghĩa là ưa acid L acidophilus là một trong những loài vi khuẩn thuộc họ Lactobacteriaceae, họ phụ Lactobacillaceae, giống Lactobacillus, có dạng hình que, kích thước khoảng 0.6 – 0.9 x 1.5 µm L.acidophilus là vi khuẩn Gram dương kị khí tuỳ ý, sống trong môi trường acid, không tạo bào tử, có thể di ñộng Trên môi trường thạch có khuẩn lạc màu trắng ñục, tròn, lồi, có bờ thành viền xung quanh

L acidophilus tìm thấy khắp mọi nơi, ñặc biệt là trong thực phẩm : sữa, hạt ngũ cốc, thịt và cá Nó ñược tìm thấy trong ñồ uống lên men, trong ñường ruột người, trong ñường miệng giúp cho quá trình tiêu hoá thức ăn Trong suốt quá trình lên men

nó sản sinh ra lactate và acetate L acidophilus sinh ra acid làm thực phẩm có vị chua, giúp bảo vệ thực phẩm Người ta thấy rằng khả năng gây bệnh ở trong giống Lactobacillus thì hiếm gặp L acidophilus có thể sử dụng ñể duy trì mức pH của ñường ruột thông qua việc sản sinh acid lactic L.acidophilus có thể sử dụng trong ñiều trị hội chứng viêm ruột, bệnh hen suyễn, sự không dung nạp lactose, làm giảm cholesterol, tiêu chảy… L acidophilus còn ñược sử dụng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi vì nó giúp tiêu hoá thực phẩm thông qua việc sản sinh ra enzyme Trường ñại học Nebraska ñã nghiên cứu và cho thấy khi sử dụng L acidophilus bổ sung vào thức

ăn của vật nuôi ñã làm giảm 80% E.coli trong phân của chúng [44]

L acidophilus là một phần của âm ñạo bình thường Acid ñược sản sinh bởi

L acidophilus trong âm ñạo có thể giúp kiểm soát sự tăng trưởng của nấm Candida albicans, do ñó tránh ñược viêm nhiễm âm ñạo Nó cũng có tác ñộng có lợi trong trường hợp nhiễm trùng răng miệng và tiêu hóa bởi Candida Thuốc diệt tinh trùng và một số kem tránh thai có thể giết chết L acidophilus trong âm ñạo, dẫn ñến việc dễ dàng nhiễm nấm ở âm ñạo

Một số chủng L acidophilus ñã ñược nghiên cứu rộng rãi có tác ñộng tích cực ñối với sức khỏe như cải thiện chức năng tiêu hóa, làm tăng hệ thống miễn dịch và giảm một số bệnh viêm nhiễm nấm ở âm ñạo L acidophilus làm giảm triệu chứng khó tiêu và tiêu chảy Nhiều sản phẩm lên men từ sữa có sử dụng L acidophilus, sữa acidophilus ngọt và sữa chua là sản phẩm quen thuộc với người Mỹ Sữa acidophilus ngọt ñược tiêu thụ bởi những người không có khả năng dung nạp ñường lactose, xảy

ra khi enzyme lactase không thể phá vỡ lactose (ñường sữa) trong ruột Sự không tiêu hóa ñường lactose gây triệu chứng khó chịu, chuột rút và tiêu chảy Trường ñại học Nebraska nghiên cứu cho thấy việc bổ sung L acidophilus vào thức ăn gia súc kết quả

ñã giảm 61% Escherichia coli 0157.H7 Nghiên cứu ñã chỉ ra L acidophilus có lợi trong việc làm giảm cholesterol trong huyết thanh

Uống thuốc kháng sinh cũng sẽ tiêu diệt vi khuẩn có lợi, kể cả L acidophilus Sau khi ñiều trị thuốc kháng sinh bệnh nhân thường ñược hướng dẫn ñể có một ñợt ñiều trị L acidophilus ñể lấn át vi khuẩn có hại, hồi phục lại ñường tiêu hóa ðể có hiệu quả L acidophilus thường ñược bán trong các cửa hàng y tế ở dạng thuốc viên hoặc dạng bột như là một loại bổ sung dinh dưỡng Phương pháp ñiều trị này ñã ñạt ñược là có một hệ tiêu hóa tốt hơn nhờ sự hồi phục của hệ vi sinh vật ñường ruột, tiếp ñến là giảm táo bón, một số bệnh như nhiễm nấm men ñường tiêu hóa (ñặc biệt là nấm men Candida albicans), các rối loạn tiêu hóa và hệ thống miễn dịch bị suy yếu [50]

2.1.6.1 Sản phẩm acid lactic

Các vi khuẩn lactic khác nhau về khả năng sản sinh ra acid D-, L- và DL- lactic, chúng phụ thuộc vào sự hiện diện của lactate dehyrogenase và racemase

Hình 2.3: Lactate dehydrogenase và Racemase[43]

Lacic acid có hai ñồng phân quang học vì nguyên tử carbon trung tâm liên kết với 4 nhóm khác Một là L-(+)- lactic acid hay (S)-lactic acid và ñồng phân còn lại là D-(-)- lactic acid [8]

Hình 2.4: Acid L-lactic và acid D-lactic[43]

Acid L - lactic là một ñồng phân quan trọng về mặt sinh học

2.1.6 2 Con ñường biến dưỡng ở vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic sử dụng con ñường biến dưỡng glucose EMP ñể sản xuất ra lactic (ñồng lên men) Con ñường biến dưỡng pentose với kết quả là lactic acid, thêm vào các sản phẩm khác như acetic acid, ethanol và CO2 (dị lên men) [43]

a Lên men ñồng hình

Vi khuẩn lên men ñồng hình gần như chuyển hoá hoàn toàn ñường mà chúng

sử dụng, ñặc biệt glucose thành lactic acid Con ñường lên men ñồng hình bao gồm các phản ứng thuỷ phân glucose mà ñầu tiên là từ hexose thành pyruvate Chất nhận electron ñích trong con ñường này là pyruvate (pyruvate là chất bị khử thành lactic acid) [27]

Trong quá trình lên men, pyruvate bị khử ñể hình thành ethanal, ethanal là chất nhận ñiện tử cuối cùng bị khử thành ethanol [43]

b Lên men dị hình

Trong con ñường này, NADPH ñược sinh ra khi glucose bị oxi hoá thành những phân tử sinh học quan trọng như là ATP, CoA, NAD+, FAD, RNA và DNA NADPH là chất vận chuyển năng lượng trong tế bào (NADPH ñược sử dụng trong chuỗi hô hấp ) Con ñường này xảy ra trong cytosol

Sau khi ñược vận chuyển vào trong tế bào, glucokinase phosphoryl hoá glucose thành glucose 6-P (glucose 6-phosphate) Có 2 phản ứng oxi hoá xảy ra: ñầu tiên là glucose 6-P dehydrogenase khử glucose 6-P và phản ứng thứ hai là sự khử

carbon hình thành ribulose 5-P Trong mỗi phản ứng này thì một phân tử NADP+ ñã

bị khử Sau ñó ribulose 5-P có thể chuyển hoá thành ribose 5-P hoặc xylulose 5-P

Xylulose 5-P sau ñó tách ra thành acetyl phosphate và glyceraldehyde phosphate Glyceraldehyde 3-phosphate bị biến ñổi thành lactic acid theo con ñường tương tự như trong con ñường ñồng hoá Acetylphosphate có 2 khả năng ñược tạo ra tuỳ thuộc vào ñiều kiện môi trường

3-Xylulose 5-P có thể bị khử thành ethanal và ethanol, các phân tử coenzyme NADPH ñược hình thành trong 2 phản ứng oxi hoá glucose ở ñầu con ñường dị hoá bị oxi hoá trong phản ứng này Sản phẩm cuối cùng là lactate hoặc ethanol Hoặc acetyl-phosphate có thể sản xuất acetate (acetic acid) thông qua enzyme acetate kinase Phản ứng này cũng sinh ra phân tử ATP Sản phẩm cuối cùng của con ñường này là lactate

và acetate

Vi khuẩn thuộc giống Leuconostoc sản xuất lactate và ethanol nhiều trong môi trường ít hiếu khí và sản xuất lactate và acetate trong môi trường hiếu khí [27]

2.1.7 Các hợp chất kháng khuẩn từ vi khuẩn lactic

LAB có hoạt tính kháng khuẩn trên diện rộng Trong số các hoạt tính này, khả năng sản xuất lactic acid và acetic acid ñược xem là quan trọng nhất Tuy nhiên gần ñây người ta biết thêm là LAB còn sản xuất ethanol, acid formic, acid béo, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterin, và reutericyclin Nhiều chủng còn sản xuất bacteriocin và các phân tử có hoạt tính kháng khuẩn giống bacteriocin, một số LAB có khả năng tổng hợp các peptide kháng khuẩn khác cũng có thể góp phần bảo quản thực phẩm [43]

Trong một số thí nghiệm, các nhà khoa học ñã phát hiện Lactobacilli ñược phân lập từ hồi tràng của người có khả năng kháng với một chuỗi vi sinh vật chỉ thị như : Listeria, Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus, Clostridium, Pseudomonas, E.coli, [43]

2.1.7.1 Khả năng sinh Bacteriocin

Bacteriocin là kháng sinh ñược sản xuất từ vi khuẩn, có bản chất protein tự nhiên, chống lại các loài vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi Bacteriocin ñược sinh tổng hợp bởi cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm

Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm, nhưng chúng khác với vi khuẩn Gram âm ở hai ñiểm sau: Việc tạo bacteriocin không cần thiết gây phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn Gram âm

Sự khác biệt của bacteriocin với kháng sinh ở những ñiểm chủ yếu sau:

- Bacteriocin ñược tổng hợp nhờ ribosome

- Tế bào chủ miễn dịch với chúng

- Phương thức hoạt ñộng khác biệt với kháng sinh

- Phổ kháng khuẩn hẹp vì vậy thường chỉ có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất

Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong ñó LAB ñược quan tâm nhiều nhất do bacteriocin có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng ñược dùng làm chất bảo quản thực phẩm[43]

2.1.7.2 Khả năng sinh L-lactic, các acid hữu cơ dễ bay hơi và ethanol

Tác nhân probiotic tốt, ngoài yếu tố không gây bệnh, không ñộc hại, chịu ñược môi trường pH thấp ở dạ dày, chịu ñược các acid mật, sản xuất các chất kháng khuẩn, ñồng hoá cholesterol, lên men lactose và tạo vitamin …[43], giúp củng cố và khôi phục sự cân bằng hệ vi khuẩn ở ruột, còn phải có khả năng sinh ra L (+) lactic acid Acid này dễ dàng ñược hấp thu hoàn toàn và có khả năng kích thích phản ứng miễn dịch

Ở tế bào người và ñộng vật tồn tại dạng L (+) lactic acid, nên chỉ tìm thấy enzyme L-lactatdehydrogenase tương ứng Do ñó, cấu hình của lactic acid có vai trò rất quan trọng về mặt dinh dưỡng Sự hấp thu một lượng lớn D (-) lactic acid hay DL-lactic có thể gây nên sự tích luỹ D (-) lactic trong máu, làm dư acid trong nước tiểu Phát hiện này ñã buộc WHO phải giới hạn sự tiêu thụ D (-) lactic acid ở mức 100mg/kg/ngày

Vài trường hợp nhiễm ñộc acid D-lactic acid ñã ñược miêu tả ở bệnh nhân có trải qua phẫu thuật ñường ruột Một số triệu chứng biểu hiện liên quan ñến hệ thần kinh như ñau ñầu, suy nhược, loạn thị, choáng váng và rối loạn Các triệu chứng này

có thể kéo dài vài giờ ñến vài ngày Sự nhiễm ñộc D-lactic acid gây ñộc cho não

Ngộ ñộc D-lactic acid là biến chứng không phổ biến của “hội chứng ruột ngắn”, ñược miêu tả như là bệnh của người vào năm 1979, mặc dù trước ñó nó ñã ñược xem như là bệnh của ñộng vật nhai lại hàng thế kỉ trước [16]

Từ những vấn ñề trên, hiện nay việc chọn lọc các chủng vi khuẩn lactic chỉ sản xuất L-lactic acid ñể ứng dụng vào các sản phẩm probiotic có ý nghĩa vô cùng to lớn

Vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sinh ra lactic acid, acid béo, peroxide và hợp chất kháng khuẩn bacteriocin Trong các thí nghiệm in vitro, các vi khuẩn lactic ngăn cản sự phát triển của Staphylococcus, Shigella, Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella và các chủng E.coli gây bệnh [11]

2.1.7.3 Lên men lactose

Sự không dung hoà lactose là tình trạng sinh lí xảy ra ở những người thiếu khả năng sản xuất enzyme lactase hay β-galactosidase Lactase cần thiết ñề ñồng hoá lactose trong sữa, cắt chúng thành các phân tử ñường glucose và galactose ñơn giản Các cá thể thiếu lactase sẽ không tiêu hoá ñược sữa và thường gây ra những khó khăn cho trẻ sơ sinh Người không dung hoà lactose thường bị khó chịu ở bụng, tiêu chảy,

bị vọp bẻ, ñầy hơi, nôn và buồn nôn, khi dùng sữa Một vần ñề khác có liên quan ñến việc không dung hoà lactose là tình trạng thiếu calcium vì người không dung hoà lactose thường ñược khuyên không nên dùng sữa Ngoài ra, vi khuẩn khu trú trong ruột kết không lên men tiêu hoá ñược lactose sẽ sản xuất acid và khí, gây ra các triệu chứng như ñau bụng, sưng phù và tiêu chảy [43]

Các dòng probiotic ñã ñược chứng minh là cũng có thể giải quyết vấn ñề không dung hoà ñược lactose

Việc sử dụng probiotic cho kết quả làm giảm tình trạng không dung hoà lactose nhờ các chủng LAB có khả năng sản xuất lactase và tăng nồng ñộ β- galactosidase ở ruột non

Do vậy, nếu các bệnh nhân không dung hoà lactose ñược cho dùng probiotic, các dòng probiotic sẽ thuỷ phân lactose trong sữa và lactose sẽ ñược ñồng hoá cũng như calcium cũng ñược hấp thu [43]

2.1.7.5 Carbon dioxide

Carbon dioxide là sản phẩm chính của quá trình lên men dị hình và cũng ñược tạo thành rất ít trong sự hình thành các sản phẩm phụ của quá trình lên men ñồng hình Ngoài ra còn ñược tạo thành từ sự decarboxyl của amino acid…

Carbon dioxide làm giảm pH trong và ngoài tế bào, phá hủy màng tế bào Do

ñó, nó có khả năng ức chế rất nhiều loại vi khuẩn [43]

2.1.7.6 Diacetyl

Diacetyl (2,3-butanedione) là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng ñược tổng hợp

từ pyruvate trong lên men hiếu khí cũng như yếm khí Thực ra, nó ñược tạo thành từ

sự lên men citrate bởi vi khuẩn lactic Sự có mặt của citrate cùng với sự chuyển hóa năng lượng tạo nên sự thừa pyruvate Sự thừa pyruvate ñược chuyển hóa thành diacetyl và acetoin Khi dùng hexose làm nguồn carbon trong lên men thì không có diacetyl hay acetoin ñược sinh ra Diacetyl có khả năng kháng vi khuẩn Gram âm, nấm men, nấm mốc tốt hơn là vi khuẩn Gram dương [43]

2.1.8 Những tiêu chí trong tuyển chọn các chủng probiotic

Các tiêu chí chọn giống vi sinh vật làm chế phẩm probiotic có thể bao gồm những khía cạnh về sự an toàn, chức năng và kỹ thuật

2.1.8.1 Về sự an toàn

- Có nguồn gốc từ người

- Chúng ñược phân lập từ ñường ruột người

- Không gây bệnh và không có ñộc tố

- Thích nghi với khu hệ vi sinh vật ñường ruột

- Vi khuẩn probiotic cạnh tranh chất dinh dưỡng, gia tăng hệ thống miễn dịch trong vật chủ

- Sản sinh cơ chất kháng sinh, vitamin và giải phòng các enzyme có lợi giúp cho việc tiêu hoá ñược dễ dàng

2.1.8.3 Về kỹ thuật

- Có chất lượng cảm quan tốt

- Chống chịu với các chất kháng khuẩn

- Khả năng sống sót trong suốt quá trình bảo quản

- Ổn ñịnh trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản [11]

2.1.9 Phương pháp nghiên cứu chọn các chủng probiotic

2.1.9.1 Chọn giống

Sản phẩm probiotic ñáng tin cậy yêu cầu ghi tên những chủng sử dụng và số lượng tế bào sống lên thông tin trên nhãn Những chủng ñược ñịnh danh sử dụng

những phương pháp sinh học phân tử hiện ñại như trình tự 16S rDNA, lai DNA/DNA,

sự phân loại theo danh pháp hiện ñại [11]

2.1.9.2 Những ñặc ñiểm sinh lý

Có nhiều phương pháp ñược dùng ñể nghiên cứu những ñặc ñiểm sinh lý của những chủng probiotic Phương pháp lên men carbohydrate và hoạt ñộng enzyme ñược sử dụng rộng rãi Quan trọng là chọn những cơ chất chuyên biệt hay những hoạt ñộng enzyme liên quan ñến những ảnh hưởng chức năng mong ñợi của chúng Những phương pháp kiểm tra như thuỷ phân muối mật hay sản sinh các cơ chất kháng kháng sinh có liên quan ñến mục ñích sử dụng chủng ñó [43]

2.1.9.3 Chống chịu ñược những ñiều kiện ñường ruột

Khả năng sống sót của những chủng probiotic ñược xem như là quan trọng ñể ñảm bảo chức năng tốt nhất Sau khi tiêu hoá, những vi khuẩn vượt qua ñược hàng rào sinh học chính, môi trường acid dạ dày và sự tiết dịch mật trong tá tràng ðể ñảm bảo khả năng sống sót trong suốt quá trình di chuyển trong ñường ruột các chủng probiotic phải chống chịu ñược với pH acid và dịch mật Những vi khuẩn khác nhau thì khả năng chống chịu với ñường ruột khác nhau Có nhiều phương pháp khác nhau phục vụ cho mục ñích này nhưng nhìn chung khả năng chống chịu với những ñiều kiện ñường ruột thì thấp [43]

2.1.9.4 Sự bám dính

Sự bám dính với màng nhầy ruột là một trong những tiêu chí quan trọng ñể chọn chủng probiotic Nó làm cho thời gian cư trú của probiotic trong ñường ruột kéo dài Có nhiều phương pháp hiện ñại khác nhau ñể ñánh giá sự bám dính của probiotic như sự bám dính với màng nhầy ruột và sự bám dính với tế bào biểu mô Sự ảnh hưởng của các ñiều kiện ñường ruột (pH, dịch mật, enzyme tiêu hoá ) và sự kháng acid và dịch mật

Những chủng có khả năng bám dính cao như Bifidobacterium lactic Bb12 và L.rhamnosus GG thì ảnh hưởng trên sự bảo vệ và ñiều trị bệnh tiêu chảy cấp tính ở trẻ

em [43]

2.1.10 Những khía cạnh an toàn của probiotic

Có nhiều phương pháp ñể ñánh giá sự an toàn của probiotic

- Nghiên cứu những thành phần bên trong của chủng probiotic

- Nghiên cứu trên ñược di truyền học của chủng probiotic

- Nghiên cứu trên sự tương tác giữa chủng probiotic và vật chủ

Theo những nghiên cứu thì probiotic nên chứa ñủ số lượng vi khuẩn sống trong ñường ruột tối thiểu 106/g hay 106/ml của sản phẩm tại thời ñiểm tiêu thụ ñể ảnh hưởng tốt trên người tiêu thụ Hầu hết probiotic thì ổn ñịnh trong một thời gian ngắn nhất ñịnh khi ñược bảo quản dưới ñiều kiện lạnh ñông hay sấy khô Khả năng sống của vi khuẩn thì phụ thuộc vào hình thức sản xuất (dạng bột, dạng viên hay dạng nang) cũng như việc ñóng gói (dạng chai hay túi nhôm…) Khi những vi khuẩn này bị ñặt trong những ñiều kiện có O2, ñộ ẩm nhiệt ñộ sẻ ảnh hưởng lên tế bào vi sinh vật Probiotic dạng lỏng thì không ổn ñịnh bằng dạng bột

Vì vậy, việc quan trọng là cần kiểm tra khả năng sống sót và sức chịu ñựng của probiotic trong suốt quà trình sản xuất và bảo quản Kiểm tra việc tạp nhiễm các

vi sinh vật không mong muốn vào sản phẩm probiotic Việc kiểm tra phải ñảm bảo ñặc tính ổn ñịnh và ñặc tính kỹ thuật của probiotic:

- Giữ ñược chất lượng cảm quan tốt

- Giữ ñược khả năng bám dính trong thành ruột sau quá trình sản xuất và bảo quản

- Loại trừ vi sinh vật tạp nhiễm không mong muốn

- Có khả năng ổn ñịnh trong suốt quá trình sản xuất và bảo quản

- Duy trì ñược tính acid nhẹ trong suốt quá trình bảo quản

2.1.11 Phương pháp bảo quản chế phẩm probiotic

Việc bảo vệ vi sinh vật bằng phương pháp ñông khô và sấy khô ñã ñược sử dụng phổ biến trong những thập niên qua Những phương pháp này thích hợp cho việc vận chuyển và bảo quản một số lượng lớn vi sinh vật Chúng có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm và áp dụng cho nhiều loài vi sinh vật

khác nhau Trong ñó, LAB ñặc biệt là những giống Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus và Pediococcus ñóng vai trò trung tâm vì nó có nhiều ứng dụng trong ñời sống có lợi cho sức khoẻ con người

Trong công nghiệp, LAB có thể ñược bảo quản và phân phối ở dạng lỏng, lạnh ñông, ñông khô, sấy phun Tuy nhiên những phương pháp này phải ñảm bảo sao cho tỉ lệ sống cao và ổn ñịnh trong thời gian dài mà vẫn ñảm bảo chức năng hoạt ñộng tốt [23] Sự giảm khả năng sống sót khi sử dụng những phương pháp sấy khô là do hậu quả của tế bào bị tổn thương tại nhiều vị trí mục tiêu, ñặc biệt là thành tế bào, màng tế bào và DNA cũng như do màng tế bào bị oxi hoá [43]

Sự sống tối ña của LAB trong suốt quá trình sấy khô và bảo quản có ý nghĩa quan trọng cả về mặt kinh tế và kỹ thuật Sự sống sót của vi sinh vật trong quá trình sấy khô và bảo quản phụ thuộcvào nhiều yếu tố như :

- Pha phát triển và nồng ñộ ban ñầu

- Môi trường phát triển

- Môi trường sấy khô

- Phương pháp sấy khô

- Quá trình ñóng gói và bảo quản

2.1.11.1 Pha phát triển và mật ñộ tế bào

Sự phát triển của vi sinh vật gồm 4 pha : Pha thích nghi, pha phát triển, pha

ổn ñịnh và pha suy vong Pha ổn ñịnh gồm nhiều trạng thái sinh lý khác nhau trong tế bào, thông thường sự thiếu nguồn carbon và sự cạn kiệt những nguồn dinh dưỡng gây nên trở ngại cho sự sống sót của quần thể tế bào Sự sống sót trong pha ổn ñịnh có thể bảo vệ tế bào trong những ñiều kiện không thuận lợi khác như quá trình sấy khô và nhiệt ñộ không thuận lợi Theo báo cáo của Corcoran năm 2004 khi thu sinh khối Lactobacillus rhamnosus ở pha ổn ñịnh thì thu ñược tỉ lệ sống cao nhất 31 – 50%, thu

ở pha phát triển 14% sống sót và chỉ có 2% sống sót khi thu tế bào ở pha thích nghi

Mật ñộ tế bào khi ñem sấy khô nên lớn hơn 1 x 108 tế bào/ml Tuy nhiên theo Costa (2000) ñã cho rằng nồng ñộ tế bào ban ñầu tối ưu phụ thuộc vào môi trường bảo vệ sử dụng Khi sử dụng sucrose thì mật ñộ tế bào 1010 CFU/ml là tối ưu cho sự

phục hồi cao nhất Mặt khác, nếu sữa gầy là môi trường bảo vệ thì mật ñộ tế bào ban ñầu là 108 CFU/ml [43]

2.1.11.2 Môi trường phát triển

Cho tới nay, chưa có quan niệm rõ ràng cho rằng môi trường phát triển ảnh hưởng lên sự sống sót của vi sinh vật Những nghiên cứu tập trung vào cơ chất ñược

bổ sung vào Nghiên cứu của Streeter và cộng sự (2003) cho rằng khi thêm trehalose vào môi trường phát triển cho phép tế bào gia tăng khối lượng của trehalose trong tế bào chất làm chắc chắn màng tế bào chất trong suốt quá trình sấy khô [11]

2.1.11.3 Môi trường sấy khô

Môi trường sấy khô là yếu tố quan trọng nhất Sự lựa chọn môi trường sấy khô thích hợp cho LAB là rất quan trọng Nó có thể gia tăng tỉ lệ sống sót trong suốt quá trình làm khô và bảo quản Những chất bảo quản có thể phụ thuộc vào vi sinh vật Tuy nhiên có những chất bảo quản thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật như : Sữa gầy, huyết thanh, trehalose, glycerol, betaine, adonitol, sucrose, glucose, lactose và những polymer như dextran và polyethyleneglycol [41]

Cách ñây hơn 20 năm những cơ chất ñường như trehalose và sucrose ñược báo cáo là làm tăng sự chống chịu với ñông khô của ña số vi sinh vật do nó ổn ñịnh màng và protein bằng cách hình thành liên kết hydro giúp duy trì cấu trúc protein bậc

ba trong sự vắng mặt của nước Những nghiên cứu trước ñây cho rằng ñiểm nhiệt ñộ

Tg (glass- transition temperature) cao sẽ làm tăng khả năng bảo vệ trong quá trình sấy khô Những polypeptide của những cơ chất ñường có thể biến ñổi những thành phần tinh thể của ñường trong khi ñó những protein ổn ñịnh hơn vượt quá ñiểm nhiệt ñộ Tg của chúng hơn những cơ chất ñường ðiều này cho rằng những protein hơn những cơ chất ñường thể hiện vai trò quan trọng trong sự hình thành tinh thể ðiều này có thể giải thích tại sao huyết thanh và bột sữa gầy có tác dụng bảo vệ tốt trong quá trình sấy khô

Bột sữa gầy ñược chọn là môi trường tốt nhất cho quá trình sấy khô vì :

- Bảo vệ tế bào khỏi bị tổn thương bằng cách ổn ñịnh cấu trúc màng tế bào

- Tạo cấu trúc lỗ trong sản phẩm ñông khô ñể khử nước dễ dàng

- Chứa protein cung cấp một lớp bảo vệ cho tế bào

2.1.11.4 Phương pháp sấy phun

Sấy phun (spray-drying) là một quá trình tạo thành những hạt nhỏ từ dung dịch sền sệt bằng sự phun với tốc ñộ cao bên trong một buồng chân không Không khí bên trong buồng có thể ñạt 2000C Sự phun những giọt nhỏ ñã ñược làm khô trước khi

va vào thành buồng

Sấy phun là một phương pháp ñược sử dụng phổ biến trong công nghiệp sữa

Nó có thể ñược sử dụng ñể sản xuất khối lượng lớn sữa với chi phí tương ñối thấp, ñược so sánh với ñông khô Sấy phun tạo ra những bột dạng hạt mịn khô từ dung dịch sền sệt Không khí bên trong buồng sấy phun có thể nâng lên tới nhiệt ñộ 2000C Nhiệt ñộ ở ñầu ra là nhiệt ñộ của sản phẩm khi nó rời khỏi buồng sấy phun, nó liên quan ñến thời gian giữ những sản phẩm trong buồng sấy phun Phương pháp sấy phun này có thể sử dụng cho những sản phẩm polymer, chất có hoạt tính, muối vô cơ, sắc

tố và một vài loại thực phẩm như sữa, ngũ cốc,… [22]

Theo Desmond (2002) ñã báo cáo 100% vi khuẩn Lactobacillus pracasei sống sót sau khi sấy phun và sau ñó bảo quản ở nhiệt ñộ 40C và 150C Tuy nhiên, số tế bào sống ñã giảm 20 – 80% sau bốn tuần ở cả hai nhiệt ñộ trên [44]

2.1.11.5 Phương pháp ñóng gói và bảo quản

Sản phẩm ñược bảo quản nên tránh những tác nhân như : Oxy, ñộ ẩm, ánh sáng, tạp nhiễm vi sinh vật, nhiệt ñộ ðối với sản phẩm ñông khô nên bảo quản trong ống hay lọ nhỏ bằng thuỷ tinh ñược hàn kín ðối với sản phẩm sấy phun nên bảo quản trong bao nhôm và hút chân không [22]

2.2 Phương pháp nuôi cấy batch, fed-batch

2.1.1 Batch

Khái niệm

Nuôi cấy batch là nuôi cấy trong hệ kín có chứa một lượng ban ñầu giới hạn các chất dinh dưỡng