Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA có bản chất là bán kháng nguyên hapten bằng cách gắn kết độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

LÊ NGỌC VIỆN

NGHIÊN CỨU THU NHẬN KHÁNG THỂ ĐA DÒNG ĐẶC HIỆU PHỤC VỤ SẢN XUẤT BỘ KIT PHÁT HIỆN NHANH ĐỘC TỐ VI TẢO GÂY MẤT TRÍ NHỚ CHO NGƯỜI

(DOMOIC ACID)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HOÀ - 2018

NGHrtn ctru THU IvHAI\ xnAnc rHn B,q, oduc DAc

nrpfpnUcv{rsa,nr xuir Be KIT puAr HrENI{HANH

bqc rbvl rAo cAvuAr rnilyHocHtrwctrot

Quy6t illnh giao aA ta,i:

Quy6t itinh thirnh I$p IID:

Nguli hurirrrg Ofin kihoa hgc:

Cdng ngh$ sinh hgc 6042A201

55 I/QD-DHNT ngiy 2l /612017

1 96/QD-DHNT nsiy 09 /3 12018

fil4l20r8

2 TS oAo vlnr rIA

Chu tich trqi OAng:

KHANH HOA - 2018

LOI CAM DOAN

sU tdi tro cria dA tii: "llghiin cru phdt ffiAn b0 KIT phat hi€n nhanh mQt sti d\c t(i

Tac giit lupn v[n

Lor cAnn oN

Xin ch6n thdnh citmcrn TS Ddo ViCt HA - chu nhiQm dA tii c6p Nhd nudc "NghiAn

c*u phdt ffiAn bQ KIT phdt hi€n nhanh mQt sd dpc t() vi tdo trong san phdm thfiy sdn"

b6o cito 1u0n vdn.

Xin gui ldi cim on sflu sic dtin Ban Gi6m d6c Trung t6m Phrip y Kh6nh Hoi, dd tao di6u kiQn vdr cho ph6p t6i dugc di hqc d€ ndng cao trinh dQ.

Dac biQt xin dugc ghi nhd tinh cdm, sg giirp dd cua gia dinh vd bpn bd lu6n ludn

T6c gril luQn vdn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN iii

LỜI CẢM ƠN iv

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC BẢNG ix

DANH MỤC HÌNH x

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH POISONING - ASP) 5

1.1.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP 6

1.1.2 Độc tính của DA 7

1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO 8

1.2.1 Thử nghiệm sinh học trên động vật 8

1.2.2 Phương pháp hoá học 9

1.2.3 Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào 10

1.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

1.3 HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID 14

1.3.1 Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid 14

1.3.2 Quy trình gây miễn dịch 20

1.3.3 Thu nhận kháng thể từ liệu pháp miễn dịch động vật 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.1 Tạo kháng thể trên đối tượng sinh vật thử nghiệm 30

2.2.2 Thu nhận và tinh sạch kháng thể kháng DA từ huyết thanh thỏ trắng 38

2.2.3 Thử nghiệm phân tích độc tố ASP trong sản phẩm thuỷ sản bằng phương pháp

ELISA 41

2.3 HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG 43

2.3.1 Hoá chất 43

2.3.2 Thiết bị 44

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 44

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 TẠO KHÁNG THỂ TRÊN ĐỐI TƯỢNG SINH VẬT THỬ NGHIỆM 45

3.1.1 Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh domoic acid 45

3.1.2 Hoạt tính kháng thể kháng độc tố domoic acid trong huyết thanh thỏ trắng theo thời gian 51

3.2 THU NHẬN VÀ TINH SẠCH KHÁNG THỂ KHÁNG DA TỪ HUYẾT THANH THỎ TRẮNG 53

3.2.1 Thu nhận kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng 53

3.2.2 Tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ trắng 53

3.2.3 Hiệu giá kháng thể 57

3.2.4 Tính đặc hiệu của kháng thể thu nhận từ liệu pháp miễn dịch 58

3.3 THỬ NGHIỆM PHÂN TÍCH ĐỘC TỐ ASP TRONG SẢN PHẨM THUỶ SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA 59

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

ASP : Amnesic Shellfish Poisoning (Độc tố gây mất trí nhớ tạm thời)

BSA : Bovine Serum Albumin (Albumin huyết thanh bò)

CBB : Coomassie Brilliant Blue

CE : Capillary Electrophoresis (Điện di mao quản)

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

DSP : Diarrhetic Shellfish Poisoning (Độc tố gây tiêu chảy)

DSS : Disuccinimidyl Suberate

EDC : N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbant Assay (Phương pháp miễn dịch học liên

kết enzym) FCA : Freund’s Complete Adjuvant (Tá chất Freund hoàn chỉnh)

FIA : Freund’s Incomplete Adjuvant (Tá chất Freund không hoàn chỉnh) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) HPLC-UV : High Performance Liquid Chromatography with Ultra Violet detection

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím) IAC : Immunoaffinity Chromatography (Sắc ký ái lực miễn dịch)

ID : Intradermal (trong da)

IM : Intramuscular (trong cơ)

IOC : Intergovernmental Oceanographic Committee (Uỷ ban Hải dương học

LC : Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng)

LOD : Limit of Detection (Giới hạn phát hiện)

LOQ : Limit of Quantification (Giới hạn định lượng)

MBA : Mouse Bioassay (Thử nghiệm sinh học trên chuột)

mg/mL : milligam/ milli Lít

NAFIQAD : National Agro-Forestry-Fisheries Quality Assurance Department (Cục

Quản lý Chất lượng Nông Lâm sản và Thuỷ sản) NHS : N-Hydroxysuccinimide

NMDA : N-methyl-D-aspartate

NSP : Neurotoxic Shellfish Poisoning (Độc tố thần kinh)

OD : Optical Density (Mật độ quang)

OPD : Ortho-phenylenediamine

P : Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê

PBS : Phosphate Buffer Saline

Plys : Polylysin

PSP : Paralytic Shellfish Poisoning (Độc tố gây liệt cơ)

PVDF : Polyvinylidine Fluoride

RIA : Radio Immuno Assays (Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ)

SC : Subcutaneous (dưới da)

SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Điện di

Polyacrylamide với SDS) STX : Saxitoxin

TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

UV : Ultra Violet (Cực tím)

µg/g : microgam/ gam

µg/mL : microgam/ milli Lít

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thể tích tiêm tối đa của hỗn hợp kháng nguyên/tá dược trên một vị trí tiêm ở các loài động vật khác nhau 22 Bảng 2.1 Sơ đồ mô tả một phép phân tích ASP-ELISA trên bản nhựa 96 giếng 42 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá hàm lượng DA (mg) trong phức hợp DA-DSS và hiệu suất phản ứng 45 Bảng 3.2 Hàm lượng BSA (mg) trong phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA và hiệu suất phản ứng 48 Bảng 3.3 Kết quả phân tích độc tố DA trong mẫu Hàu Hương bằng kit ASP-ELISA (do

đề tài Nhà nước thử nghiệm chế tạo) 60

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid 5 Hình 1.2 Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA bằng cách sử dụng DSS làm cầu nối giữa nhóm imino của DA và nhóm cacboxyl của protein tải 17 Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate (DA-DSS) 18 Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA) 19 Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA 31 Hình 2.2 Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA 34 Hình 2.3 Sơ đồ gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand với phức hợp 36 Hình 2.4 Sơ đồ nguyên tắc thí nghiệm kiểm tra hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ bằng phản ứng ELISA 37 Hình 2.5 Sơ đồ tinh sạch kháng thể kháng DA trong huyết thanh thỏ bằng sắc ký ái lực Sepharose EAH 4B với pha rắn DA 39 Hình 3.1 Phổ tử ngoại (UV) của phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA 48 Hình 3.2 Hoạt tính kháng thể kháng độc tố DA trong huyết thanh thỏ trắng New Zealand

từ sau tháng thứ 4 đến sau tháng thứ 12 của liệu pháp miễn dịch với liều 500 µg phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA 51 Hình 3.3 Sắc ký đồ của 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand sau khi qua cột sắc

ký ái lực miễn dịch (pha rắn DA-DSS) với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2

mL 54 Hình 3.4 Sắc ký đồ kháng thể chuẩn kháng DA 1 mg/mL sau khi qua cột sắc ký ái lực miễn dịch với tốc độ dòng 1 mL/ phút, mỗi phân đoạn 2 mL (Đào Việt Hà và Phạm Xuân Kỳ, 2017) 55 Hình 3.5 Hình ảnh gel SDS-PAGE (sau khi nhuộm CBB) và màng PVDF sau Western

Blot: 1) kháng thể kháng DA chuẩn, 2) chế phẩm kháng thể thu nhận từ huyết thanh thỏ

sau tinh chế qua cột IAC 56

Hình 3.6 Hiệu giá kháng thể kháng DA của huyết thanh thỏ trắng New Zealand thu nhận bằng liệu pháp miễn dịch 57

Hình 3.7 Kết quả phản ứng ELISA giữa kháng thể kháng DA thu nhận được với DA chuẩn và một số chất có cấu trúc hoá học tương tự DA (KA: Kainic acid; Glu: Glutamic acid; Asp: Aspartic acid; GABA: Gamma-Aminobutyric acid; Pr: proline; HyPr: hydroxyproline) 58

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

Giới thiệu về đề tài và mục tiêu nghiên cứu

Các nhà khoa học đã phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA) trong các loài hai mảnh vỏ tại vùng biển Châu Á và Việt Nam, với hàm lượng vượt ngưỡng giới hạn an toàn của độc tố này trong sản phẩm thuỷ sản là 20 µg/g mô mềm (AOAC, 1990) Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) Bên cạnh những ưu điểm, MBA và HPLC có những hạn chế nhất định và cần thiết có một phương pháp thử nghiệm sinh học khác ưu việt hơn để thay thế

Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố

DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA Một khó khăn rất lớn khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động vật bậc cao chỉ sản sinh được kháng thể kháng lại những độc tố có bản chất protein Trong khi đó, DA có khối lượng phân tử thấp, không thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật không có hiệu ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp độc tố Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA

có bản chất là bán kháng nguyên (hapten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo ra vừa có tính chất kháng nguyên từ độc

tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân tử protein

Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA, sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA và kế thừa kết quả nghiên cứu của Takata (2006), nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản, chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục đích điều chế được phức hợp kháng nguyên Domoic acid - Bovine Serum Albumin (DA-BSA) có tính sinh miễn dịch từ kháng nguyên không hoàn chỉnh DA; thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng New Zealand

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử sụng các phương pháp hoá sinh truyền thống và hiện đại như ELISA, HPLC, sắc ký ái lực miễn dịch (IAC), điện di Western Blot với các bước điều chế phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA (Domoic acid - Disuccinimidyl Suberate - Bovine Serum Albumin) có tính sinh miễn dịch hoàn chỉnh; sau đó gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng nguyên DA-BSA; thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng Đối tượng nghiên cứu là

DA; BSA và thỏ trắng (Oryctolagus cuniculus) dòng New Zealand, được nuôi theo quy

trình nuôi động vật thí nghiệm của Viện Vắc-xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang Sử dụng phần mềm Microsoft Excel xử lý số liệu thống kê trong nghiên cứu

Kết quả thu được

1) Luận văn đã xây dựng được quy trình 02 bước phản ứng và điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-DSS-BSA với hiệu suất đạt 18,42% Sản phẩm kháng nguyên cộng hợp DA-DSS-BSA có tỉ lệ gắn kết 7,8 phân tử DA với 01 phân tử BSA

2) Luận văn đã sử dụng phức hợp DA-DSS-BSA để gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand và nhận thấy với liều phức hợp sử dụng 500µg, thỏ trắng New Zealand có đáp ứng miễn dịch sau 05 tháng thí nghiệm và đạt khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất ở thời điểm sau 06 tháng thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy các cá thể thỏ trắng khác nhau có sự đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng liều DA-DSS-BSA sử dụng và có 01 trong số 09 thỏ thử nghiệm có hoạt tính kháng thể cao nhất (mức hiệu giá kháng thể: 12800)

3) Luận văn đã tiến hành tinh chế kháng thể bằng phương pháp sắc ký ái lực với pha rắn DA và thu được 1,2 mg kháng thể từ 135 mL huyết thanh thỏ trắng New Zealand

đã đáp ứng miễn dịch Kháng thể thu được có tính đặc hiệu với DA và đạt độ tinh sạch

để sử dụng làm vật liệu cho sản xuất bộ kit ELISA dùng phát hiện độc tố từ nhuyễn thể

2 mảnh vỏ

Từ khoá: Domoic acid, bovine serum albumin, ELISA, kháng thể đa dòng

LỜI MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Takata và cộng sự (2009) phát hiện sự có mặt của độc tố domoic acid (DA)

trong loài nhuyễn thể Spondylus tại vùng biển châu Á bao gồm Nhật Bản, Thái Lan,

Philippin và Việt Nam Tiếp theo, Đào Việt Hà và cộng sự (2009) cũng công bố đã

phát hiện độc tố này trong loài hai mảnh vỏ Spondylus versicolor sống tại đầm Nha

Phu, Khánh Hòa, Việt Nam với hàm lượng lên tới 150 µg/g mô mềm trong khi giới hạn an toàn của độc tố DA trong sản phẩm thuỷ sản là 20 g/g mô mềm (AOAC, 1990) Những phát hiện này cho thấy nguy cơ tích luỹ độc tố DA trong sinh vật biển, đặc biệt là các loài nhuyễn thể thân mềm, có thể dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm cho cộng đồng Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng, an toàn thực phẩm trong tất cả các công đoạn sản xuất thủy sản đang được đẩy mạnh vì đây là một trong những tiêu chuẩn cần thiết phục vụ nhu cầu thị trường quốc tế và trong nước Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng để giám sát độc tố vi tảo là thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) MBA được một số quốc gia khu vực Đông Nam Á lựa chọn là phương pháp giám sát độc tố DA quốc gia do một số ưu điểm của kỹ thuật MBA là thời gian thử nghiệm nhanh (trong vòng 24÷48 tiếng), giá thành rẻ (khoảng 20 USD/thử nghiệm) Tuy vậy, MBA cũng có khá nhiều nhược điểm như sai số khá lớn (± 20%) và phụ thuộc vào chất lượng

nguồn sinh vật giống - dòng chuột nhắt trắng Swiss swiss (được cung cấp bởi một số cơ

sở y tế như Viện Vắc-xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ…) Hiện nay, dòng chuột trắng này có nguy cơ bị thoái hóa do được giữ và nhân giống bằng phương pháp lai cận huyết trong một thời gian rất dài Trong phương pháp MBA, sức khỏe của sinh vật thử nghiệm là điều kiện quan trọng đảm bảo tính chính xác của kết quả Nghiên cứu của Đào Việt Hà

và cộng sự trong suốt 15 năm gần đây cho thấy, khi sử dụng dòng chuột nhắt trắng Swiss

swiss tại Việt Nam thường bắt gặp những kết quả không ổn định, dẫn đến sai số rất lớn

Hơn nữa, theo xu hướng hiện nay trên thế giới, nhiều quốc gia không ủng hộ việc sử dụng sinh vật sống trong các thí nghiệm độc tính cấp (gây chết cho sinh vật thử nghiệm) Mặt khác, giới hạn phát hiện của MBA đối với độc tố DA là 150 µg/g, trong khi ngưỡng

an toàn thực phẩm của độc tố này trong sản phẩm hải sản lại là 20 µg/g Do vậy, không thể sử dụng MBA để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm của độc tố DA trong các sản phẩm thuỷ sản Trong khi đó, phương pháp xác định hàm lượng DA bằng HPLC lại khá tốn kém, đòi hỏi đầu tư thiết bị chuyên biệt, người phân tích cần có kiến thức cơ bản tốt

và được huấn luyện, đào tạo trong thời gian dài (đôi khi tới vài năm) mới vận hành, sử dụng thành thạo hệ thống và cho kết quả chính xác Chính vì thế, việc tìm kiếm một phương pháp thử nghiệm sinh học khác, ưu việt hơn để thay thế MBA tại Việt Nam là cần thiết

Phương pháp miễn dịch học liên kết enzym (Enzyme Linked Immunosorbant Assay - ELISA) được cho là kỹ thuật được đánh giá là có tiềm năng cao thay thế phương pháp thử nghiệm sinh học truyền thống MBA, hứa hẹn là một trong kỹ thuật được AOAC lựa chọn là phương pháp chuẩn quốc tế do những điểm ưu việt về giới hạn phát hiện thấp, độ chính xác cao hơn hẳn MBA Việc tìm tòi, phát triển phương pháp đánh giá nhanh độc tố này là cấp thiết không chỉ với Việt Nam Để có kit thử nhanh ELISA cho độc tố DA, điều quan trọng đầu tiên là phải có nguồn kháng thể đặc hiệu kháng lại độc tố DA Trong khi đó, độc tố DA có khối lượng phân tử thấp (312 đ.v.c), không có bản chất protein nên không thể tạo hiệu ứng miễn dịch khi được đưa vào cơ thể động vật Để có được phản ứng miễn dịch tạo kháng thể kháng độc tố DA từ động vật thử nghiệm, cần phải có một kháng nguyên thích hợp mang tính chất độc tố DA và protein thích hợp cho quá trình sản sinh kháng thể Mặt khác, liều miễn dịch, cách gây miễn dịch, thời gian ủ cũng là những chỉ tiêu rất quan trọng trong cơ chế tạo miễn dịch của sinh vật thử nghiệm

Thuỵ Điển, và gần đây là Nhật Bản đã nghiên cứu phát triển bộ kit ELISA dùng cho độc tố gây mất trí nhớ tạm thời (Amnesic Shellfish Poisoning - ASP) (ASP-ELISA), nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa có sản phẩm thương mại Đối với Việt Nam, nếu sử dụng kit ELISA của nước ngoài sẽ gặp phải khó khăn do giá thành quá cao (khoảng 20 triệu đồng/ kit/ 26 - 28 mẫu) và đòi hỏi phải đặt hàng với số lượng đủ lớn để hãng sản xuất chấp nhận chi phí vận chuyển quốc tế Mặt khác, quá trình vận chuyển trong nội địa Việt Nam khó đáp ứng được yêu cầu về nhiệt độ bảo quản theo quy định (4 - 100C), gây ảnh hưởng đến tính chính xác của kết quả

Trên cơ sở chọn lọc các phương pháp đã công bố trên thế giới về sản xuất kháng thể đa dòng kháng độc tố DA, nhằm phục vụ phát triển bộ kit ELISA phát hiện nhanh

độc tố vi tảo DA trong sản phẩm thuỷ sản với giá thành dự kiến giảm một nửa so với bộ

kit thương mại có nguồn gốc nhập ngoại, đáp ứng nhu cầu thị trường Việt Nam về an

toàn thực phẩm biển một cách chủ động; từ sự tài trợ kinh phí của chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu phát triển bộ kit phát hiện nhanh một số độc tố vi tảo trong sản phẩm thủy

sản” thuộc “Chương trình trọng điểm ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông

nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020”, chúng tôi thực hiện đề tài

“Nghiên cứu thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện

nhanh độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)”

2 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu chung

Thu nhận được kháng thể đa dòng đặc hiệu phục vụ sản xuất bộ kit phát hiện nhanh

độc tố vi tảo gây mất trí nhớ cho người (domoic acid)

Mục tiêu cụ thể

- Điều chế được phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch từ

kháng nguyên không hoàn chỉnh DA

- Thu nhận được kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ

3 Nội dung của đề tài

1) Điều chế phức hợp kháng nguyên DA-protein tải có tính sinh miễn dịch hoàn

chỉnh;

2) Gây miễn dịch trên đối tượng thỏ trắng New Zealand bằng phức hợp kháng

nguyên DA-protein tải;

3) Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng độc tố DA từ huyết thanh thỏ trắng

4 Phạm vi nghiên cứu

- Điều chế phức hợp kháng nguyên bằng cách cộng hợp phân tử DA với protein

tải BSA thông qua cầu nối hoá học DSS

- Thực nghiệm gây miễn dịch trên thỏ trắng New Zealand

- Thu nhận kháng thể đa dòng đặc hiệu sau liệu pháp miễn dịch

- Thử nghiệm sử dụng kit ELISA được chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng độc tố

DA thu nhận được để phân tích độc tố DA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: đây là nghiên cứu hoàn toàn mới tại Việt Nam, không bị cạnh tranh trên thị trường trong nước Các quy trình công nghệ được triển khai tạo điều kiện phát triển phương pháp quản lý sử dụng tốt và nâng cao giá trị nguồn tài nguyên biển

Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài góp phần vào việc giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực phẩm từ độc tố vi tảo cho cộng đồng và tránh thiệt hại về kinh tế trong lĩnh vực xuất khẩu sản phẩm thuỷ sản

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐỘC TỐ GÂY MẤT TRÍ NHỚ TẠM THỜI (AMNESIC SHELLFISH POISONING - ASP)

Được phân lập lần đầu tiên từ loài tảo đỏ Chondria armata (Takemoto và Daigo,

1958) nhưng domoic acid (DA) chỉ được biết có nguồn gốc từ vi tảo biển khi có vụ ngộ

độc đầu tiên cho người sau do ăn Vẹm xanh Mytilus edulis xảy ra vào năm 1987, tại đảo

Prince Edwards, vùng Đông bắc Canada Đây cũng là lần đầu tiên DA được xác nhận gây ra triệu chứng ngộ độc mất trí nhớ tạm thời ở người Trong vụ ngộ độc này, 03 người chết, 19 người phải điều trị tại bệnh viện (trong đó 12 người trong tình trạng ngộ độc trầm trọng, phải chăm sóc đặc biệt) và hơn 100 người khác có các triệu chứng rối loạn tiêu hóa và thần kinh (Wright và cộng sự, 1989) Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc ASP bao gồm buồn nôn, nôn mửa, đau co thắt vùng bụng, mất trí nhớ, giảm sự tỉnh táo, lên cơn, lẫn lộn, và mất định hướng (Perl và cộng sự, 1990a, 1990b; Teitelbaum và cộng sự, 1990; Todd, 1993) DA trong vẹm xanh gây ra vụ ngộ độc nổi tiếng tại Canada

năm 1987 được xác định do loài vi tảo silic Pseudo-nitzschia multiseries (Bates và cộng

sự, 1989) Cho đến thời điểm hiện nay trên thế giới đã xác định được ít nhất 17 loài

Pseudo-nitzschia, 01 loài Nitzschia và 01 loài Amphora có khả năng sản sinh DA (IOC,

2018)

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của domoic acid, glutamic acid và kainic acid

Domoic acid (DA) là một amino acid với khối lượng phân tử 312 đ.v.c, công thức hoá học C15H21NO6, có ba nhóm cacboxyl (-COOH), tồn tại ở dạng tinh thể, tan trong nước, có tính acid Cho đến hiện nay, 10 dẫn xuất của DA đã được phát hiện (Zaman và

cộng sự, 1997; Lefebvre và Robertson, 2010), nhưng các dẫn xuất này không có độc tính DA có cấu trúc hóa học tương tự như glutamic acid và kainic acid (Hình 1.1)

1.1.1 Nhuyễn thể hai mảnh vỏ có chứa độc tố ASP

Vẹm nuôi (Mytilus edulis) được lấy mẫu trong đợt bùng phát ngộ độc ASP ở

Canada (phía đông đảo Prince Edward) trong mùa thu năm 1987 có chứa tới 790 μg DA/g mô ướt (cả con vẹm) (lên đến 1280 μg/g trong mô mềm và 1500 μg/g trong tuyến tiêu hóa) (Bates và cộng sự, 1998; Todd, 1997) Từ tháng 8-10 năm 1988, DA đã được

phát hiện ở vẹm xanh và cả trong trai vỏ mềm (Mya arenaria) ở phía tây nam Vịnh

Fundy, Canada (Martin và cộng sự, 1993)

Trong tháng 10 năm 1991, DA đã được phát hiện trong trai móng tay (Siliqua

patula) từ Oregon và Washington, Hoa Kỳ Lượng DA đạt mức cao nhất trong tuần đầu

tiên của tháng 12 năm 1991 (mức tối đa trong phần ăn được là 147 μg/g, mức trung bình

là 106 μg/g ở tất cả các bãi biển bang Washington) Lượng DA trong trai vẫn ở mức cao hơn mức quy định cấm khai thác là 20 μg/g trong thời gian ít nhất là 6 tháng Lượng DA

đã giảm xuống mức < 10 μg/g vào cuối mùa xuân năm 1992, lượng DA < 5 μg/g đối với hầu hết các khu vực lấy mẫu ven biển DA được phân bố trong nhiều bộ phận khác nhau của trai móng tay Mức cao nhất được tìm thấy ở chân, tiếp theo là cơ quan nội tạng và vòi hút (hay cổ) Mức DA ở chân trai móng tay đạt 230 μg/g (Van Apeldoorn và cộng

sự, 1999)

Sò điệp sống trong vịnh (Argopecten iradians) đã được ghi nhận là có thể hấp thu

DA lên đến mức 60 μg/g trong các tuyến tiêu hóa sau khoảng 84 giờ tiếp xúc với P

multiseries độc Lượng DA giảm xuống mức 5 μg/g sau 48 giờ của quá trình loại bỏ độc

tố (J Douglas và cộng sự, 1997) Trong mùa thu năm 1993, sò biển (Placopecten

magellanicus) ở vịnh Fundy, Canada đã bị chết mà không rõ nguyên nhân Các tuyến

tiêu hóa của sò điệp có chứa 93,4 μg DA/g Mặc dù một số nhuyễn thể hai mảnh vỏ được ghi nhận là có chứa hàm lượng DA cao mà không biểu hiện bất kỳ triệu chứng

nào, sò gai (Chlamys hastata) đã bị chết nhanh chóng (trong vòng 12 giờ) sau khi tiếp xúc với các môi trường có P multiseries độc (J Douglas và cộng sự, 1997) Lượng đáng

kể DA đã được tìm thấy thường xuyên trong tuyến tiêu hóa nhưng không có trong cơ khép của sò biển ngoài khơi ở Canada tại Georges Bank, Browns Bank và Vịnh Fundy (Stewart và cộng sự, 1998)

1.1.2 Độc tính của DA

Cơ chế tác động của DA được biết đến trên các thụ thể acid amin kích thích và sự

dẫn truyền tiếp hợp Các acid amin kích thích, đáng chú ý nhất là L-glutamate và L-aspartate, từ lâu đã được coi là những chất có khả năng dẫn truyền thần kinh cao nhất

Các acid amin này được ghi nhận là có thể tác động lên nhiều loại thụ quan, tính chất

đặc trưng nhất của chúng được đặt tên theo các tác nhân kích thích ngoại sinh chọn lọc

là N-methyl-D-aspartate (NMDA), kainate và quisqualate DA là một chất tương tự

glutamate và liên kết với các thụ quan glutamate thuộc loại quisqualate bằng ái lực cao

Glutamate cũng như phân lớp của NMDA tác động mở các kênh trên lớp màng thẩm

thấu Na+, tạo điều kiện cho các dòng Na+ có thể tràn vào và gây nên sự khử cực màng

DA có hai đối tượng tác động chính trong hệ thần kinh trung ương; sự hình thành vùng

đồi hải mã và các khu vực liên quan đến đồi hải mã là vùng liên quan đến quá trình xử

lý thông tin của bộ nhớ, và vùng thân não Chính vì vậy, triệu chứng mất trí nhớ trong

thời gian ngắn nhưng không hồi phục là biểu hiện đặc trưng của ngộ độc ASP ở người

(Perl và cộng sự, 1990b) Ở các loài gặm nhấm, DA gây ra tình trạng kém hoạt động,

lên cơn và gãi đặc trưng (Work và cộng sự, 1993) - đây là triệu chứng lâm sàng điển

hình trong phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột đối với độc tố này

Có những bằng chứng chỉ ra rằng người dân sống trên đảo của Nhật Bản đã đánh

giá các chất chiết xuất từ tảo biển có chứa DA như một loại chất có giá trị Loài tảo đỏ

Chondria armata chứa DA đã được sử dụng để điều trị bệnh giun đũa trong nhiều thế

kỷ và là thuốc trừ sâu (Higa và Kuniyoshi, 2000) Thử nghiệm này rõ ràng đã được thực

hiện để thử nghiệm các tính chất diệt giun của DA và các đơn liều 20 mg với độ tinh

khiết không xác định được dùng cho người lớn và trẻ em mà không gây ảnh hưởng có

hại (Iverson và Truelove, 1994)

Tuy nhiên, DA độc với cả phần trung tâm và ngoại vi của hệ thống thần kinh ở

người DA là một chất gây nôn nên có thể gây nôn khan cũng như ói mửa khi nó tác

động vào trung tâm gây nôn trong khu vực não thất Nó tạo ra một hội chứng trên sợi

trục thần kinh cảm giác vận động, gây mất trí nhớ, hôn mê, co giật và tử vong Do tác

động của nó vào bộ nhớ, trong số các tác động gây bệnh khác, ngộ độc DA được đặt tên

là ngộ độc mất trí nhớ do nhuyễn thể (ASP) (Todd, 1993; Watters, 1995) Trong đợt

bùng phát ngộ độc ASP đầu tiên vào năm 1987 tại đảo Prince Edward ở Canada, 107

trường hợp ngộ độc đã được báo cáo Các triệu chứng ngộ độc đầu tiên được ghi nhận

sau khi ăn vẹm 15 phút đến 38 giờ (trung bình 5,5 giờ) Các triệu chứng thường gặp nhất là buồn nôn (77%), nôn (76%), đau bụng (51%), đau đầu (43%) tiêu chảy (42%)

và mất trí nhớ (25%) (Todd, 1993)

Các ảnh hưởng do sự tiếp xúc lâu dài của con người với DA ở nồng độ thấp trong vẹm hoặc cá chưa được biết đến (Van Apeldoorn và cộng sự, 1999) Một người đàn ông

84 tuổi đã có biểu hiện động kinh sau khi nhiễm độc cấp tính DA Một năm đầu không

có biểu hiện gì, nhưng sau đó ông đã có các biểu hiện của bệnh động kinh thùy thái dương Ba năm rưỡi sau khi nhiễm độc cấp tính bệnh nhân tử vong do viêm phổi Sau khi khám nghiệm tử thi cho thấy bệnh nhân bị xơ cứng nặng cả hai bên của vùng đồi hải

mã Điều này chỉ ra rằng vùng đồi hải mã của con người là dễ bị tổn thương với các kích thích độc hại của thụ quan kainate (Cendes và cộng sự, 1995)

1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ĐỘC TỐ VI TẢO

1.2.1 Thử nghiệm sinh học trên động vật

Ở hầu hết các nước trên thế giới, phương pháp thử nghiệm sinh học trên chuột (Mouse Bioassay - MBA) được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu điều tra, phát hiện

và giám sát độc tố vi tảo Mặc dù quy trình của MBA rất khác biệt tùy từng loại độc tố, nhưng có chung một nguyên tắc cơ bản là đánh giá hiệu ứng của độc lực tổng số đối với sinh vật thử nghiệm Dịch chiết độc tố được tiêm vào phúc mạc chuột, sau đó quan sát triệu chứng ngộ độc lâm sàng của chúng và so sánh với chuột tiêm độc tố chuẩn (Hallegraeff, 1995) Tuy nhiên, điểm hạn chế của MBA là có sai số khá lớn (± 20%) phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe của từng sinh vật thử nghiệm và chỉ cung cấp thông tin về tổng độc lực chứ không cung cấp thông tin về thành phần và bản chất độc tố Mặt khác, gần đây có những ý kiến phản đối việc sử dụng sinh vật sống làm thí nghiệm độc tính cấp (gây chết) và tình trạng tâm lý ức chế cho người thao tác thí nghiệm khi phải giết chết một số lượng lớn sinh vật Đối với độc tố ASP, MBA còn vấp phải một hạn chế rất lớn là giới hạn phát hiện của phương pháp này 150 μg/g mô mềm trong khi giới hạn an toàn thực phẩm đối với độc tố này trong sản phẩm hải sản là 20 μg/g

Mặc dù có khá nhiều hạn chế, nhưng phương pháp này vẫn được công nhận là phương pháp truyền thống trong giai đoạn trước năm 2000 để điều tra tổng độc lực có mặt trong các sản phẩm hải sản để đánh giá mức độ an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng

1.2.2 Phương pháp hoá học

1.2.2.1 Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography-TLC) bao gồm lớp gel mỏng tráng trên bề mặt kính, hoặc nhôm, là pha cố định và hệ thống dung môi hay pha chuyển động được lựa chọn để tạo ra sự phân tách các chất chấm trên bản gel TLC thường được dùng để phân tách các chất phân tử nhỏ như các loại đường, các hợp chất polyphenol, carotenoid,… (Phan Tuấn Nghĩa, 2012)

Quilliam và cộng sự (1998) đã áp dụng thành công phương pháp TLC với sò điệp, trai móng tay và các mẫu cá cơm bị nhiễm độc tố DA, và đưa ra kết luận phương pháp này có thể áp dụng thành công để sàng lọc thường quy các mô của nhuyễn thể hai mảnh vỏ trong những phòng thí nghiệm không được trang bị hệ thống sắc ký lỏng (Liquid Chromatography - LC) TLC là một phương pháp hóa học hữu ích để xác nhận DA trong các mẫu xét nghiệm dương tính bởi các phương pháp thử nghiệm ví dụ như thử nghiệm miễn dịch

1.2.2.2 Phân tích acid amin

Các dịch chiết từ dung dịch thô của sinh vật phù du có thể được phân tích trực tiếp bởi một hệ thống phân tích acid amin Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với

DA vào khoảng 1 μg/mL, khi tiêm khoảng 50 mL dịch chiết vào cột Mặc dù giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích acid amin gần với các phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với phát hiện bằng tia cực tím (Liquid Chromatography with Ultra Violet detection - LC-UV), nó không hiệu quả đối với các mẫu có chứa nồng độ cao các acid amin tự do và thời gian phân tích thì kéo dài hơn Chất chiết xuất từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ có thể được phân tích bằng phương pháp này sau quá trình làm sạch cần thiết

và cô đặc mẫu (Wright và Quilliam, 1995)

1.2.2.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Tất cả các loại độc tố vi tảo đều có thể được phân tích về hàm lượng trong dịch chiết bằng các phân tích hóa học như sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) Nguyên tắc của phương pháp này là tách các phân tử độc tố dựa vào độ linh động di chuyển của chúng trong điều kiện đặc biệt về nhiệt độ, bản chất dung dịch đệm, vận tốc dòng chảy qua cột, áp suất và bước sóng kích hoạt, bước sóng hấp thụ đối với từng độc tố Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử, các dẫn xuất

của một độc tố sẽ có thời gian lưu khác nhau trên cột sắc ký Sự có mặt và hàm lượng của từng chất sẽ được xác định bằng cách so sánh với thời gian lưu của chúng với thời gian lưu của độc tố chuẩn (Oshima, 1995) Do vậy, HPLC sẽ cung cấp thông tin về thành phần độc tố (các dẫn xuất) và hàm lượng của chúng trong mẫu nghiên cứu HPLC là phân tích hóa học hiệu quả đối với độc tố gây liệt cơ (Paralytic Shellfish Poisoning - PSP), độc tố gây tiêu chảy (Diarrhetic Shellfish Poisoning - DSP), ASP do độ nhạy cao

so với MBA Do đó phương pháp này được ghi nhận là công cụ phân tích quan trọng trong nghiên cứu độc tố vi tảo Tuy nhiên, phương pháp hóa học đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền, thời gian thực hiện lâu, độc tố chuẩn khá đắt tiền và chỉ được cung cấp từ những phòng thí nghiệm nhất định ở một số nước như Nhật Bản, Canada, Mỹ,

1.2.2.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary Electrophoresis - CE)

Phương pháp này tương đối đơn giản cho phép phân tách nhanh chóng với độ phân giải cao các hợp chất có cực phức tạp Hai bể chứa chất lỏng được nối với nhau bằng một ống mao dẫn hẹp làm bằng thủy tinh thạch anh và trong đó được làm đầy bằng bộ đệm Sau khi một lượng nhỏ của mẫu chiết xuất (thường là 1-10 nL) được bơm vào các mao mạch, một điện áp khác biệt trong khoảng 20-30 kV được đặt tại các đầu của các mao mạch Các thành phần ion di chuyển dưới dạng các dải hẹp tới các mao mạch, cuối cùng đi qua một máy dò (hấp thụ UV, huỳnh quang) (Wright và Quilliam, 1995) Nguyen và cộng sự (1990) đã báo cáo về một giới hạn phát hiện khoảng 2 μg/g của chiết xuất đã qua xử lý của mô vẹm

1.2.3 Phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào

Thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào bao gồm miễn dịch học, enzyme và độc học tế bào, được phân chia thành 02 nhóm là thử nghiệm cấu trúc và thử nghiệm chức năng Phương pháp thử nghiệm chức năng dựa vào tính chất hóa sinh của độc tố (ví dụ, cơ chế bịt kênh trao đổi ion Na+ của độc tố PSP và độc tố thần kinh (Neurotoxic Shellfish Poisoning - NSP), từ đó độc tố được định lượng bằng mối tương quan thuận với độc tính đặc hiệu của chúng trong thử nghiệm (Cembella và cộng sự, 1995) Phương pháp thử nghiệm cấu trúc dựa vào mối tương tác giữa chất được phân tích (độc tố) và yếu tố nhận biết (ví dụ vị trí kênh trên màng tế bào thần kinh bị độc tố khoá lại) Một trong những phương pháp thử nghiệm sinh học cấp độ tế bào được phát triển và ứng dụng trong thời gian gần đây là phương pháp miễn dịch học liên kết enzyme (Enzyme Linked

dựa vào phản ứng chuyên biệt của kháng thể với kháng nguyên (độc tố) ELISA cung cấp thông tin về số lượng các phân tử độc tố trong mẫu thử nghiệm, trên cơ sở xác định

số phân tử tham gia phản ứng kết hợp với kháng thể đặc hiệu Với độ nhạy tốt, thời gian thực hiện nhanh, không đòi hỏi trang thiết bị chuyên sâu đắt tiền, ELISA là một ứng cử viên hứa hẹn sẽ đáp ứng yêu cầu về phương pháp ứng dụng trong điều tra nghiên cứu

và giám sát độc tố vi tảo trên thế giới Phương pháp này dựa trên nguyên tắc phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên (độc tố) và kháng thể do cơ thể sinh vật sản sinh ra nhằm chống lại sự xâm nhập của độc tố vào cơ thể sinh vật theo cơ chế miễn dịch

ELISA được dùng để phát hiện sự hiện diện của DA trong huyết thanh và nước tiểu của động vật có vú được phát triển bằng cách sử dụng các kháng thể đa dòng được sản sinh trên thỏ Phương pháp có hiệu quả trong việc xác định nồng độ DA trong nước tiểu chuột, với một giới hạn định lượng mức dưới là 40 ng/mL Nồng độ DA ở huyết tương chuột và khỉ không thể được xác định chính xác bằng cách sử dụng huyết thanh miễn dịch này trong phương pháp ELISA Hệ thống phát hiện này đã không được coi là đối tượng để thử nghiệm sâu rộng hay để sử dụng như là một kỹ thuật thường xuyên (Cembella và cộng sự, 1995; Smith và Kitts, 1994) Phương pháp trên có liên quan đến nhiều bước và không có giới hạn phát hiện mong muốn Ngoài ra, phương pháp phụ thuộc vào sự bất hoạt vật lý của DA trên microplate thông qua một protein vận chuyển CovaLink NH® microplates đã phát triển một dự án trong đó nhóm amin thứ cấp được dùng trong ELISA làm khớp nối peptide, steroid, oligonucleotides, và deoxyribonucleic acid (DNA) với các bề mặt microplate một cách trực tiếp và hóa học Việc sử dụng các microplate CovaLink để đơn giản hóa và cải tiến phương pháp ELISA, đã dẫn đến việc tạo ra hai phiên bản khác nhau của phương pháp ELISA, một là dựa trên tính chất vật

lý của DA, hai là dựa trên khả năng cố định hóa học của DA (Osada và cộng sự, 1995) Các phương pháp ELISA để xác định DA trong dịch cơ thể của người và các chất chiết xuất từ vẹm đã được phát triển bởi Smith và Kitts (1994, 1995) Các xét nghiệm

sử dụng một loại huyết thanh miễn dịch đa dòng được tạo ra ở chuột để kháng lại phức hợp ovalbumin-DA Thử nghiệm được sử dụng để định lượng nồng độ DA trong các dịch lỏng trong cơ thể người với domoate tinh khiết Các giới hạn định lượng thấp hơn 0,2 μg/mL trong nước tiểu; 0,25 μg/mL trong huyết tương và 10 μg/mL trong sữa Giới hạn định lượng tương đối cao trong sữa có thể là do hàm lượng chất béo cao của sữa Các tác giả cho rằng các mẫu sữa của con người có thể cần được tách chiết trước khi

phân tích (Smith và Kitts, 1994) Các thí nghiệm xác định lượng còn lại trong cả hai dịch chiết của mô trai trong dung dịch nước và dung dịch acid đã chứng minh rằng nồng

độ DA có thể được đo chính xác tương ứng khoảng 8% giá trị thực tế Giới hạn phát hiện là 0,25 μg/mL chất chiết xuất Giá trị này đại diện cho 0,5 μg DA/g mô vẹm khi các chiết xuất acid được phân tích (theo AOAC) (Smith và Kitts, 1995) Khi so sánh trực tiếp phương pháp xác định DA bằng LC và ELISA thấy có sự tương quan (r = 0,96), mặc dù các phương pháp ELISA cho kết quả cao hơn ở hầu hết các mẫu Điều này là do một phần DA bị mất mát trong chiết xuất pha rắn trước khi tiến hành phương pháp HPLC hoặc có thể là do sự hiện diện của các DA đồng phân Đồng phân DA không đồng nhất với DA thì sẽ không được xác định trong các phân tích LC thông thường Tuy nhiên, phương pháp ELISA có thể xác định DA tổng số bao gồm một diastereoisomer

và ít nhất hai đồng phân cis-trans (Smith và Kitts, 1995)

Garthwaite và cộng sự (1998) sử dụng các kháng thể được nuôi cấy trong cừu để kháng lại các phức hợp, liên kết thông qua các nhóm amin thứ cấp của DA, để phát triển một phương pháp ELISA cạnh tranh gián tiếp Phương pháp ELISA có giới hạn phát hiện dưới 0,1 ng/mL, giới hạn định lượng (Limit of Quantification - LOQ) 0,15 ng/mL

và phạm vi làm việc là 0,15-15 DA ng/mL LOQ tương đương với 38 μg DA/kg thịt nhuyễn thể, thấp hơn 500 lần so với giới hạn an toàn của thịt là 20 mg/kg

Phương pháp ELISA được phát triển bởi Garthwaite và cộng sự (1998) đã được thương mại hóa bởi Biosense®, được sản xuất dưới dạng một bộ kit, và chúng được dự định sử dụng trong giám sát thường xuyên hàm lượng DA trong các động vật thân mềm nuôi để kiểm tra xem có tuân thủ các giới hạn quy định hay không Theo các nhà sản xuất thì phương pháp này cũng được áp dụng để định lượng DA trong các thành phần khác So với phương pháp ban đầu được thực hiện năm 1998, LOQ của bộ kit đã được giảm xuống 10 μg/kg nhuyễn thể Trong khi đó, các kháng thể được phát triển bởi Garthwaite là kháng thể đa dòng tự nhiên, Kawatsu và cộng sự (1999) đã sản xuất được kháng thể đơn dòng kháng lại DA và áp dụng chúng trong một phương pháp miễn dịch cạnh tranh gián tiếp Phạm vi xác định định lượng DA và LOQ trong nhuyễn thể đã được ước tính là 0,15-10 DA ng/mL và tương ứng < 40 ng DA/g, do đó khá tương đồng với các đặc tính được mô tả theo phương pháp ELISA của Garthwaite và cộng sự (1998)

1.2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nghiên cứu về độc tố vi tảo được bắt đầu tại Việt Nam khoảng 20 năm gần đây, chủ yếu bởi nhóm nhà khoa học thuộc Viện Hải dương học, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển, Viện Nghiên cứu Hải sản trong khuôn khổ một số chương trình hợp tác quốc tế như ASEAN-Canada, DANIDA (Cơ quan Phát triển Quốc tế Đan Mạch - Danish International Development Agency), IOC (Uỷ ban Hải dương học Liên chính phủ - Intergovernmental Oceanographic Committee) và JSPS (Cơ quan Phát triển Khoa học Nhật Bản - Japan Society for the Promotion of Science) Những nghiên cứu này không chỉ nhằm mục đích điều tra phát hiện sự có mặt của độc tố vi tảo trong đối tượng hai mảnh vỏ, mà còn là cơ sở ban đầu cho việc tìm hiểu cơ chế tích luỹ độc tố của chúng trong mối tương quan với mật độ các loài vi tảo độc có mặt trong môi trường Kotaki và

cộng sự (2000) đã tìm thấy domoic acid được sản sinh từ loài Nitzschia navis-varvingica

phân lập từ đầm nuôi tôm ở Đồ Sơn Gần đây, Đào Việt Hà và cộng sự (2014, 2015) đã

chứng minh các loài vi tảo Pseudo-nitzschia cf caciantha và Pseudo ‐nitzschia fukuyoi

là nguồn gốc sản sinh độc tố DA tại đầm Nha Phu, Khánh Hòa, Việt Nam Kết quả nghiên cứu trên đã gợi ý khả năng tích luỹ độc tố ASP của các sinh vật biển và khả năng bùng phát các hiện tượng ngộ độc ở người trong các khu vực đó Tuy nhiên, mối quan

hệ giữa việc xuất hiện các loài tảo độc và việc tích luỹ độc tố trong thâm mềm hai mảnh vỏ vẫn chưa được hiểu biết rõ ràng do thiếu hệ thống quan trắc có tính hệ thống trong các vùng này Bên cạnh đó, phòng thí nghiệm sinh vật phù du của Viện Tài nguyên và Môi trường Biển trong khuôn khổ hợp tác JSPS với Nhật Bản cũng đã tiến hành quan trắc biến đổi hàm lượng độc tố trong một số đối tượng nuôi trồng thủy sản có giá trị kinh

tế tại khu vực Hải Phòng bằng phương pháp ELISA trong giai đoạn 2002-2004 Cũng thời gian này, sự xuất hiện của các loài tảo tiềm tàng độc hại ở vùng biển Việt Nam đã được thống kê và báo cáo (Larsen và Nguyen, 2004) Đào Việt Hà và cộng sự (2006,

2009) đã phát hiện hàm lượng cao của độc tố DA trong loài hàu hương Spondylus

versicolor thu tại đầm Nha Phu, Khánh Hoà Mặt khác, cũng vào thời điểm này, Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng chương trình giám sát hàm lượng độc

tố tảo trong các loài hai mảnh vỏ xuất khẩu, được thực hiện bởi NAFIQAD Hiện nay, việc kiểm soát chất lượng, an toàn thực phẩm trong tất cả các công đoạn sản xuất thuỷ sản đang được đẩy mạnh vì đây là những tiêu chuẩn cần thiết phục vụ nhu cầu thị trường quốc tế và nội địa

Tại Việt Nam, cho đến thời điểm hiện nay, phương pháp phổ biến sử dụng cho mục đích giám sát độc tố là thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) và phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

1.3 HƯỚNG NGHIÊN CỨU VỀ MIỄN DỊCH HỌC ĐỘC TỐ DOMOIC ACID

Trong những thập niên gần đây, hướng nghiên cứu miễn dịch học nhằm phục vụ phát triển phương pháp thử nghiệm nhanh (ELISA) đối với độc tố DA đã và đang được quan tâm nhiều Một khó khăn rất lớn khi tạo kháng thể kháng độc tố DA là động vật bậc cao chỉ sản sinh được kháng thể kháng lại những độc tố có bản chất protein Trong khi đó, DA có khối lượng phân tử thấp, không thuộc nhóm protein nên cơ thể sinh vật không có hiệu ứng miễn dịch khi bị tiêm trực tiếp độc tố Muốn tạo được hiệu ứng miễn dịch của sinh vật thử nghiệm đối với DA, trước tiên phải điều chế một phức hợp kháng nguyên từ DA có bản chất là bán kháng nguyên (hapten) bằng cách gắn kết độc tố này với một loại protein thích hợp, sao cho trong phức chất tạo ra vừa có tính chất kháng nguyên từ độc tố (DA), vừa có tính sinh miễn dịch của một phân tử protein Khi phức chất độc tố - protein được đưa vào cơ thể sinh vật với liều lượng an toàn, không gây tử vong cho sinh vật trong thời gian nhất định, sinh vật sẽ sản sinh kháng thể kháng lại độc

tố này dưới dạng cấu trúc của một phân tử protein Do đó, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào cơ chế, điều kiện sản sinh kháng thể kháng độc tố DA trên đối tượng động vật thử nghiệm khác nhau - đây là hướng nghiên cứu về kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies)

Theo nguyên tắc của phương pháp ELISA, kháng thể sẽ nhận biết đặc hiệu một chất nhất định Đối với độc tố ASP, mặc dù hiện nay có khoảng 10 đồng phân của DA

đã được ghi nhận trong tự nhiên nhưng chúng hoàn toàn không có độc tính, nên các phương pháp phát hiện, đánh giá tiêu chuẩn an toàn thực phẩm đối với độc tố ASP chỉ tập trung vào một thành phần độc tố có mặt trong mẫu thử nghiệm là DA Do đó, bộ kit phát hiện nhanh độc tố ASP cũng có nghĩa là bộ kit phát hiện nhanh DA Vào thời điểm năm 2001, Thuỵ Điển và gần đây là Nhật Bản đã và đang tiến hành nghiên cứu bộ kit dùng cho độc tố DA (DA-ELISA), nhưng cho đến hiện nay vẫn chưa tạo thành sản phẩm thương mại

Hiện nay, hãng ZeuLab (Tây Ban Nha) đã thương mại hoá bộ kit ELISA (Domotest) phát hiện nhanh độc tố DA từ các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ như hàu, sò

thời gian 1 giờ MaxSignal® Domoic Acid (ASP) ELISA Test Kit của hãng Bioo

Scientific (Mỹ) có thể phân tích định lượng DA trong các mẫu nhuyễn thể, vi tảo và

mẫu nước dựa trên phương pháp ELISA cạnh tranh, trong đó kháng thể thứ hai đặc hiệu

với kháng thể thứ nhất kháng DA (the second antibody against Anti-Domoic Acid

Antibody) được phủ giếng, mẫu được cho vào giếng cùng với cộng hợp DA-HRP và

kháng thể thứ nhất kháng DA Nếu DA tồn tại trong mẫu, nó sẽ cạnh tranh với cộng hợp

DA-HRP để gắn kết với kháng thể thứ nhất kháng DA Tiếp theo, kháng thể thứ nhất

kháng DA sẽ gắn với kháng thể thứ hai đặc hiệu đã được phủ giếng Sau bước rửa giải

các thành phần không gắn kết, cơ chất TMB được cho vào giếng và tạo sản phẩm có

màu khi phản ứng với HRP Cường độ màu đo được tỷ lệ nghịch với nồng độ DA có

trong mẫu MaxSignal® Domoic Acid (ASP) ELISA Test Kit có thể phân tích 42 mẫu

trong 1,5 giờ; độ nhạy 0,125 ppb; giới hạn phát hiện 30 ppb đối với nhuyễn thể và 6 ppb

đối với mẫu nước; tuy nhiên giá thành bộ kit này rất cao (khoảng 600 euro/kit) Ngoài

ra còn có Domoic Acid Test Kit của hãng Mercury Science Inc với cùng phương pháp

phân tích như hãng MaxSignal®, có giá thành khoảng 250 USD/kit

1.3.1 Điều chế phức hợp kháng nguyên từ domoic acid

Dựa vào cấu trúc phân tử của độc tố DA (có chứa 03 nhóm -COOH, 01 nhóm

-NH2), người ta có thể có 03 cách để tạo phức giữa DA và protein tải như sau:

- Cách thứ nhất: tạo phức giữa DA và protein tải bằng cách tạo liên kết nối giữa

nhóm -NH2 của protein tải và nhóm -COOH của DA trong sự có mặt của sodium bis (2-ethylhexyl) sulfosuccinate (Branaa và cộng sự, 1999)

Cách thứ hai: tạo phức giữa DA và protein tải bằng cách tạo liên kết giữa gốc

-NH2 của DA với nhóm -COOH của protein tải trong sự có mặt của EDC

(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) và NHS (N-hydroxysuccinimide) (ký hiệu là

C-DA-DSS-protein) (Yu và cộng sự, 2004)

- Cách thứ ba: tạo phức giữa DA và protein tải bằng cách trước tiên tạo liên kết

giữa nhóm =NH của DA và nhóm -NO3 của DSS (Disuccinimidyl Suberate) Sau đó,

tiến hành cho phức hợp trên kết hợp với protein tải thông qua liên kết giữa nhóm -COOH

của DA với nhóm -NH2 của phân tử protein tạo thành phức hợp kháng nguyên

DA-DSS-protein (ký hiệu là N-DA-DSS-DA-DSS-protein)

1.3.1.1 Gắn nhóm cacboxyl của DA với gốc amin của acid amin lysin nằm trên vùng ưa nước của phân tử protein tải

Công bố đầu tiên trong lĩnh vực này là của Newsome và cộng sự (1991) khi ông thành công tạo kháng nguyên DA-BSA (Bovine Serum Albumin - BSA) nhờ tính chất vật lý bám dính của phân tử DA trên bề mặt phân tử protein mang (BSA) trong môi trường có độ ion hóa cao Tuy nhiên, lượng kháng thể sản sinh khi sử dụng kháng nguyên này rất thấp và thiếu tính đặc hiệu do cấu trúc kém bền vững của phức hợp kháng nguyên

và tính ngẫu nhiên khi phân tử DA gắn kết với BSA Smith và Kitts (1994), Osada và cộng sự (1995) đã cải tiến bằng cách gắn kết DA và BSA với sự có mặt của Ethyl dimethylaminopropyl carbondiimide (EDC) và N-hydroxy succinimide (NHS) đóng vai trò hoạt hóa nhóm amin thứ cấp của phân tử protein BSA, sau đó gắn với gốc cacboxyl của phân tử DA thông qua liên kết kiểu peptide Branaa và cộng sự (1999) tạo phức hợp DA-BSA bằng cách liên kết nhóm (-NH2) của BSA và nhóm (-COOH) của DA với sự

có mặt của AOT (sodium bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate) Vì DA có 03 gốc cacboxyl, các gốc này kết hợp ngẫu nhiên với phân tử protein tải nên kháng thể sản sinh sẽ ở dạng hỗn hợp 03 kháng thể tương ứng với 03 điểm tiếp nhận khác nhau của phân tử DA Mặt khác, hàm lượng kháng thể tạo ra từ kháng nguyên được điều chế bằng phương pháp này cũng rất ít và lẫn nhiều tạp chất không mong muốn

1.3.1.2 Gắn gốc amin của DA với gốc cacboxyl của protein tải

Nhằm cải thiện chất lượng kháng thể (có tính đặc hiệu hơn), Garthwaite và cộng

sự (1998) đã phát triển phương pháp tạo kháng nguyên bằng cách gắn gốc amin của DA với gốc cacboxyl của protein tải Ở phương pháp này, với 01 gốc amin tự do duy nhất của DA, kháng nguyên hoàn toàn tương đồng về điểm tiếp nhận của DA do đó sẽ giảm thiểu được tạp chất không mong muốn trong sản phẩm miễn dịch Mặc dù vậy, do các protein tải thường có rất nhiều nhóm cacboxyl trên bề mặt phân tử, chất lượng kháng thể còn phụ thuộc vào tỉ lệ gắn kết thành công giữa số lượng phân tử DA nhất định với một phân tử protein tải Bằng phương pháp này, kháng thể sản sinh ra có sản lượng và tính đặc hiệu cao hơn hẳn so với Smith và Kitts (1994) Tuy nhiên, do DA chỉ có nhóm amin thứ cấp (=NH) nên cần phải chuyển đổi sang dạng amin sơ cấp (-NH2) trước khi tạo phức kháng nguyên có thể làm hao hụt đi phần nào kháng nguyên sau điều chế nên quy trình thực hiện này lại quá phức tạp và tốn kém

Một phương pháp khác có thể sử dụng để điều chế phức hợp kháng nguyên là gắn kết gốc amin sơ cấp của phân tử DA với chính gốc amin sơ cấp của phân tử protein tải (Hình 1.2)

Hình 1.2 Sơ đồ điều chế phức hợp kháng nguyên từ DA bằng cách sử dụng DSS làm cầu nối giữa nhóm imino của DA và nhóm cacboxyl của protein tải

Để thực hiện được phản ứng gắn kết này, cần có sự tham gia của hợp chất mang tính cầu nối giữa 02 phân tử Disuccinimidyl Suberate (DSS, C16H20N2O8) là một hợp chất có khả năng liên kết giữa nhóm amin sơ cấp của DA và nhóm nitrate (-NO3) của phân tử DSS (Hình 1.3), sau đó phức này được kết hợp với nhóm amin sơ cấp của phân

tử protein thông qua nhóm cacboxyl của phân tử DSS tạo thành phức hợp kháng nguyên DA-DSS-protein (Hình 1.4) Phương pháp này đơn giản và ít tốn kém hơn so với Garthwaite và cộng sự (1998) Mặt khác, do tính duy nhất của gốc amin sơ cấp trong phân tử DA, kháng nguyên sẽ chỉ có đồng nhất 01 dạng epitopi (điểm tiếp nhận), do đó

sẽ cho sản phẩm kháng thể tương ứng với độ đặc hiệu cao hơn các phương pháp trước đây

Hình 1.3 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp Domoic acid - Disuccinimidyl suberate

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tạo phức hợp DA-DSS với Bovine serum albumin (BSA)

Nhằm khắc phục hạn chế của kháng thể đa dòng về sản lượng và độ đặc hiệu, và

để phát triển ứng dụng kháng thể kháng độc tố trên nhiều phương diện như sản xuất các kit chẩn đoán nhanh sự có mặt của độc tố, kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) cũng đã được thử nghiệm sản xuất tại một số phòng thí nghiệm trên thế giới Nguyên tắc sản xuất kháng thể đơn dòng là chọn lọc những dòng kháng thể có hoạt tính cao nhất

từ kháng thể đa dòng, lai với tế bào tuyến tụy của chuột, sau đó chọn lọc dòng tế bào lai vừa có tính kháng thể mạnh vừa có khả năng sản sinh nhanh nhất để nhân bản lên trong thời gian ngắn nhằm thu nhận lượng kháng thể lớn và có tính đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi những phòng thí nghiệm chuyên biệt với trang thiết bị hiện đại nên khó thực hiện một cách rộng rãi Thay vào đó, phương pháp truyền thống hiện nay vẫn là sản xuất kháng thể đa dòng theo hướng tăng sản lượng và đảm bảo tính đặc hiệu cao với độc tố cần nghiên cứu

1.3.2 Quy trình gây miễn dịch

1.3.2.1 Chuẩn bị kháng nguyên

Chất lượng của kháng nguyên phải được quan tâm hàng đầu Kháng nguyên phải không độc, vô trùng và không gây sốt, giảm thiểu tối đa sự nhiễm tạp chất của bất kì một gốc hóa học, nội độc tố hoặc tạp nhiễm gây độc và cần được điều chỉnh trong khoảng pH sinh lý (Canadian Council on Animal Care, 2002) Do bản thân độc tố DA

là kháng nguyên không hoàn chỉnh nên để tạo nên đặc tính đáp ứng miễn dịch DA đã được gắn kết với BSA để tạo thành phức hợp kháng nguyên có đặc tính như một kháng nguyên Bovine Serum Albumin (BSA) hay còn gọi là “Fraction V” là một albumin có nhiều chức năng sinh hóa học, đặc biệt là chức năng trong cơ chế miễn dịch của cơ thể BSA là protein có trong huyết thanh bò, do đó đối với cơ thể thỏ, nó là 1) Một protein lạ: khi protein này được đưa vào cơ thể thỏ (gây miễn dịch), nó sẽ kích thích cơ thể thỏ sản sinh kháng thể; 2) Khối lượng phân tử đủ lớn: Các kháng nguyên thông thường có khối lượng phân tử trên 6.000 đvc Với khối lượng phân tử 65.000 đvc, BSA đủ điều kiện trở thành một kháng nguyên mạnh; 3) Cấu trúc phức tạp: Bất kì một chất sinh miễn dịch nào cũng phải có cấu trúc phân tử tương đối phức tạp Các chất có cấu trúc càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao, BSA cũng thỏa mãn tính chất này vì nó có bản chất là protein Cấu trúc của nó phức tạp do nó cấu tạo từ các acid amin sắp xếp theo các tổ hợp khác nhau Như vậy, với các đặc điểm trên, BSA có tính sinh miễn dịch mạnh Do đó, trong kỹ thuật miễn dịch, BSA hay được lựa chọn sử dụng làm protein tải của các bán kháng nguyên, ví dụ các độc tố vi tảo bản chất không phải protein và khối lượng phân tử thấp (saxitoxin-STX, DA…) Trong trường hợp sử dụng kháng nguyên

có bản chất là BSA gắn kết với một kháng nguyên không hoàn chỉnh ví dụ như độc tố

DA, STX; kháng thể sẽ được sinh ra do tính kháng nguyên của protein này, nhưng lại

có tính đặc hiệu của phân tử độc tố gắn kết với BSA Hiện nay, phương pháp sử dụng phức hợp BSA và kháng nguyên không hoàn chỉnh để gây miễn dịch trên động vật (cừu, ngựa, bò, thỏ, chuột lang, chuột nhắt…) đã được thực hiện khá phổ biến

1.3.2.2 Lựa chọn tá chất

Các tá chất được sử dụng với mục đích tăng cường đáp ứng miễn dịch, chính vì vậy khi sử dụng, mức kháng thể phải tăng và được duy trì Cần lựa chọn tá chất thích hợp nhất cho kháng nguyên cùng với quy trình hoà trộn giữa kháng nguyên và tá chất

nguyên tại vị trí tiêm, dẫn đến sự giải phóng chậm duy trì kích thích với hệ thống miễn dịch Tá chất cũng có thể trợ giúp quá trình vận chuyển kháng nguyên tới lách và/ hoặc các hạch bạch huyết nơi mà xảy ra nhiều sự tương tác tế bào - tế bào trong đáp ứng miễn dịch Chúng có thể hoạt hoá trực tiếp hoặc gián tiếp các tế bào liên quan đến đáp ứng miễn dịch

Các tá chất được sử dụng phố biến bao gồm tá chất Freund hoàn chỉnh (Freund’s Complete Adjuvant - FCA), tá chất Freund không hoàn chỉnh (Freund’s Incomplete Adjuvant - FIA), Quil A, RibiTM, TiterMaxTM và một số tá chất có thành phần khoáng - nhôm hydroxide, nhôm phosphate và calcium phosphate Tuy nhiên trong số khoảng

100 loại tá chất được biết, vẫn chưa có bất kỳ loại nào hội tụ đầy đủ các đặc tính mong muốn (Craig và Bayans, 1999) Hiện nay loại tốt nhất hay dùng là tá chất FCA (Lê Văn Hiệp, 2006) Tá chất này bao gồm hỗn hợp huyền dịch dầu khoáng trong nước với vi

khuẩn Mycobacterium đã bị giết Huyền dịch dầu khoáng tạo ra sự lan toả định khu và kéo dài của kháng nguyên trong cơ thể gây miễn dịch Vi khuẩn Mycobacterium bị giết

có tác dụng làm hấp dẫn các đại thực bào và những loại tế bào thích hợp khác của hệ miễn dịch đến vị trí tiêm để làm tăng cường đáp ứng miễn dịch Tá chất FCA sử dụng cho mũi tiêm đầu Các mũi tiêm nhắc lại tiếp theo chỉ sử dụng FIA (Đỗ Ngọc Liên, 2004)

1.3.2.3 Đường tiêm và vị trí tiêm

Đường tiêm phổ biến nhất là dưới da (subcutaneous-SC), trong cơ IM), trong da (intradermal-ID), trong màng bụng (intraperitoneal-IP) hoặc trong tĩnh mạch (intravenous-IV) (Diehl và cộng sự, 2001)

(intramuscular-Tiêm tĩnh mạch (IV) là đường tiêm được lựa chọn đối với các kháng nguyên hạt nhỏ vì kháng nguyên sẽ được phân bố dọc theo cơ thể, do đó khả năng bắt giữ bởi các

tế bào lympho cao Đường IV không nên sử dụng với các tá chất dạng gel nhớt hoặc có dầu đối với kháng nguyên hạt lớn vì có nguy cơ gây tắc mạch phổi Tiêm dưới da (SC) được sử dụng đối với các tá chất dạng gel nhớt hoặc dầu để làm giảm tối đa sự hình thành các áp xe Tiêm trong cơ (IM) không nên sử dụng các tá chất dạng gel hoặc nhớt

có dầu và hạn chế sử dụng với các trường hợp không thật sự cần thiết Với thỏ và các động vật lớn hơn khi tiêm qua đường tiêm trong da (ID) thì thể tích tiêm nên nhỏ (0,25 mL) (Halliday và cộng sự, 2000) Tiêm trong màng bụng (IP), các hỗn hợp tá chất

là không thật sự cần thiết đối với sản xuất kháng thể đa dòng vì nó gây ra các phản ứng

viêm, viêm màng bụng và thay đổi sinh hoạt cho động vật Các vị trí tiêm được lựa chọn không làm ảnh hưởng đến lấy máu sau này Các đường này có lợi thế kích thích đáp ứng IgA và cũng ít gây đau đớn cho động vật (Coste và cộng sự, 2000; Falero-Diaz và cộng

sự, 2000; Nally và cộng sự, 2001)

1.3.2.4 Liều lượng kháng nguyên, thể tích và số lượng vị trí tiêm

Đối với bất kỳ một loại kháng nguyên nào cũng cần phải có kết hợp tối ưu giữa lượng, đường tiêm và quy trình gây miễn dịch thì mới tạo miễn dịch hiệu quả nhất, liều kháng nguyên quá thấp hoặc quá cao đều không thể tạo nên được đáp ứng miễn dịch Thể tích tiêm càng nhỏ càng tốt và nên giữ trong giới hạn cho phép và giới hạn số

vị trí tiêm Tuy nhiên, trong một số trường hợp cần giảm thiểu thể tích tiêm do vậy cần tiêm ở nhiều vị trí Để giảm thiểu các phản ứng bất lợi, thể tích tiêm được khuyến cáo trên một vị trí tiêm đối với kháng nguyên hay tá chất nhỏ hơn thể tích cần tiêm nói chung (Canadian Council on Animal Care, 2002)

Bảng 1.1 Thể tích tiêm tối đa của hỗn hợp kháng nguyên/tá dược trên một vị trí

tiêm ở các loài động vật khác nhau

Loài động vật thử nghiệm Thể tích/vị trí tiêm Tiêm lần đầu Tiêm nhắc

Chuột nhắt, chuột đồng 0,05 mL IM+ IM+

Cừu, dê, lừa, lợn 0,25 - 0,5mL SC, IM

(Canadian Council on Animal Care, 2002)

*: Không sử dụng cho sản xuất kháng thể đa dòng;

+: Nhìn chung không nên sử dụng, đặc biệt đối với tá dược nhớt

Dựa vào những đặc tính trong hàm lượng tiêm kháng nguyên vào cơ thể vật tiếp

kháng nguyên, thể tích tiêm kháng nguyên lớn (1 mL) hơn so với kháng nguyên đơn thuần là protein

1.3.2.5 Lịch tiêm và lấy máu

Nếu đưa kháng nguyên vào cơ thể chỉ một lần thì thường chỉ kích thích sinh ra được đáp ứng miễn dịch với cường độ thấp Tuy nhiên, khi tiêm lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài tuần thì lại gây được đáp ứng miễn dịch với cường độ cao vì chúng kích thích các tế bào lympho T và B đặc hiệu với kháng nguyên tăng sinh mạnh hơn Các lần tiêm nhắc lại ở gần vị trí mà không có dấu hiệu phản ứng ở lần tiêm đầu tiên sẽ có lợi thế thiết lập các tế bào ghi nhớ Các vị trí tiêm nên đủ tách biệt để tránh sự kết hợp của các thương tổn do viêm, các thương tổn này có thể phá huỷ nguồn cung cấp máu kèm theo hình thành các áp xe đôi khi là các vết thương Tuy nhiên nếu có dấu hiệu phản ứng tại chỗ thì các lần tiêm nhắc lại nên tiêm ở vị trí cách các vị trí tiêm của lần trước và không tiêm tại các vị trí u hạt hoặc sưng gây ra bởi lần tiêm trước Kỹ năng của nhân viên thực hiện quy trình là nhân tố quan trọng Kim lấy máu nên vừa với kích thước mạch máu Thể tích máu tối đa lấy ra không nên vượt quá 10% tổng thể tích máu của động vật (~1% trọng lượng cơ thể) nếu 2 tuần lấy một lần và không quá 15% tổng thể tích máu nều 4 tuần lấy một lần Máu sau khi lấy để đông tự nhiên, ly tâm để thu huyết thanh Các kháng thể có thể được tinh sạch hoặc không tuỳ thuộc vào mục đích

sử dụng (Canadian Council on Animal Care, 2002)

hiện sự có mặt của kháng thể hay định lượng kháng thể dựa vào mối tương tác với kháng nguyên luôn cho độ chính xác cao Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để xác định mối tương tác kháng nguyên-kháng thể như phản ứng kết tủa (precipitation test), phản ứng ngưng kết (agglutinaton test), phản ứng kết hợp bổ thể, miễn dịch điện di, kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch (immunofluorescent technique), thí nghiệm miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay-RIA), phương pháp miễn dịch học liên kết enzyme (ELISA) Các

kỹ thuật này đều dựa vào sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể để xác định sự

có mặt và định lượng kháng thể trong mẫu nghiên cứu

Phương pháp Ouchterlony (khuyếch tán miễn dịch kép)

Nguyên lý của phương pháp là dựa vào sự ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên

và kháng thể xảy ra khi chúng di chuyển trên gel agarose khi cho kháng nguyên và kháng thể ở độ loãng thích hợp (nồng độ đủ để xảy ra phản ứng ngưng kết) (Đỗ Ngọc Liên, 2004) Nếu kháng thể và kháng nguyên ngưng kết đặc hiệu sẽ cho cùng kết tủa màu trắng và ngược lại, sẽ không có kết tủa nếu kháng nguyên và kháng thể không ngưng kết đặc hiệu Ưu điểm của phương pháp này là kỹ thuật đơn giản nhất, ít tốn kém do không phải sử dụng nhiều máy móc, hóa chất Tuy nhiên, phương pháp này lại đòi hỏi thời gian thí nghiệm khá dài (3-4 ngày), sự phát hiện kháng thể chỉ mang tính định tính, không định lượng và độ nhạy kém (chỉ xác định khi hàm lượng kháng thể rất lớn (từ 20-

30 µg/mL) Do đó, khuyếch tán miễn dịch kép được ứng dụng trong nghiên cứu chẩn đoán bệnh, trong những trường hợp xuất hiện kháng nguyên lạ

Phương pháp điện di miễn dịch đối lưu

Kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật Ouchterlony nhưng thay cho khuyếch tán tự nhiên, người ta dùng một lực điện di để hướng dẫn kháng nguyên và kháng thể gặp nhau nhanh hơn trên gel agarose nên rút ngắn thời gian thí nghiệm còn khoảng 1 giờ Trong phương pháp này, kháng thể IgG và IgM sẽ di chuyển về phía cực âm, dưới tác dụng của dòng điện, kháng nguyên và kháng thể gặp nhau trên gel (Đỗ Ngọc Liên, 2004; The Royal tropical Institute, 1987) Cũng giống phương pháp Ouchterlony, phương pháp này chỉ mang tính định tính; tốn chi phí nhiều hơn vì phải sử dụng thêm máy móc, hoá chất

Phương pháp miễn dịch học liên kết enzyme

ELISA là một kỹ thuật sinh hoá được sử dụng chính trong lĩnh vực miễn dịch học

để tìm ra kháng thể hoặc kháng nguyên trong máu với độ chính xác cao ELISA được

(Đỗ Ngọc Liên, 2004) Vì ELISA có thể xác định được lượng kháng nguyên và kháng thể trong máu nên nó là một công cụ hữu ích để xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh (Nguyễn Thị Nguyệt Thu, 2002) Nó còn được dùng để tìm kháng nguyên (Phạm Văn Ty, 2004) Trong công nghiệp thực phẩm, ELISA được ứng dụng để tìm các chất gây dị ứng có trong một số loại thực phẩm như sữa, lạc, quả óc chó, quả hạnh và trứng…

Nguyên lý của ELISA là sự kết hợp kháng nguyên-kháng thể đã được gắn enzyme Khi cho cơ chất thích hợp, enzyme sẽ thủy phân cơ chất tạo ra một chất có màu Thông qua cường độ này sẽ biết được nồng độ kháng thể hay kháng nguyên cần phát hiện Đây

là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng thể/kháng nguyên ở nồng độ rất thấp So với kỹ thuật phóng xạ thì ELISA rẻ và an toàn hơn nhưng vẫn bảo đảm độ chính xác tương đương Tuy nhiên, quy trình thực hiện ELISA phải trải qua nhiều bước khác nhau, cần nhiều hóa chất Kỹ thuật này đòi hỏi việc thực hiện chính xác các thao tác kỹ thuât, thời gian và nồng độ các chất Phản ứng ELISA rất nhạy nên từng bước thực hiện sẽ quyết định kết quả thu được

1.3.3.2 Các phương pháp xác định tính đặc hiệu của kháng thể

Western blot

Western blot là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng thể

để phát hiện protein được điện di trên gel SDS-PAGE (sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis) và chuyển lên màng lai Western blot cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương pháp lai thấm protein Kỹ thuật này bao gồm các bước sau:

sulfate Điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide, thông thường là dùng SDSsulfate PAGE

SDS Chuyển thẩm hay thẩm tách các băng protein lên màng nitrocellulose hoặc màng polyvinyl difluoride (PVDF) Việc chuyển thẩm hay thẩm tách được thực hiện nhờ một

hệ thống chuyển thẩm (transblot) Gel được đặt lên màng đã lót sẵn giấy thấm và sau đó đặt giấy thấm lên trên gel và đưa vào cassette của hệ thống chuyển thẩm Đệm sử dụng trong chuyển thẩm là Tris-HCl, pH 8,1-8,4 (1,93 g Tris, 9 g Glycine pha với nước thành

1 L, có thể bổ sung methanol đến nồng độ 20 % để tăng khả năng bám của protein lên

màng) Dòng điện được cung cấp qua một bộ nguồn điện di, có thể chuyển thẩm qua đệm với điện thế thấp (khoảng 30 volt đối với bản gel 10 x 7 cm), hoặc ở điện thế cao hơn (100 volt) trong thời gian 1-2 giờ Lưu ý khi đặt cassette vào trong buồng chuyển thẩm phải đảm bảo cực âm ở phía có gel protein, còn cực dương ở phía có màng để protein sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương (từ gel sang màng) và đặt thêm dụng cụ làm lạnh hoặc chuyển thẩm trong tủ lạnh 40C

- Ủ màng với dung dịch sữa gầy (sữa tách bơ) 3 % chứa casein hay BSA 1 % hoặc gelatin 1 % trong thời gian 30 phút để cố định các protein lên màng, đồng thời hạn chế các tương tác không đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể sau này

- Ủ màng với kháng thể sơ cấp, chính là kháng thể kháng lại protein kháng nguyên quan tâm, được tạo ra bằng cách sử dụng kháng nguyên để gây miễn dịch ở một động vật thí nghiệm nào đó (ví dụ như chuột hay thỏ) Kháng thể dùng trong thẩm tách miễn dịch tốt nhất là kháng thể đơn dòng Nồng độ kháng thể tuỳ thuộc vào hiệu giá của nó, thông thường các kháng thể tốt phải có hiệu giá 1 : 10000 trở lên và cần pha kháng thể

ra 10000 lần Thời gian ủ màng với kháng thể từ 15-20 phút Qua bước ủ này, các protein kháng nguyên sẽ gắn đặc hiệu với kháng thể

- Rửa bỏ kháng thể sơ cấp thừa bằng cách ngâm màng vào dung dịch đệm kết hợp với lắc nhẹ, trong vài giờ, cứ khoảng 30 phút thay đệm mới

- Ủ màng với kháng thể thứ cấp, là kháng thể kháng lại IgG của động vật đã dùng gây ra kháng thể sơ cấp Kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme Một trong hai enzyme được dùng phổ biến trong thẩm tách miễn dịch là peroxidase của củ cải ngựa (HRP), hoặc phosphatase kiềm (AP) Qua bước này, các kháng thể sơ cấp trong phức hợp gắn với protein kháng nguyên sẽ gắn với kháng thể thứ cấp để hình thành nên phức hợp: kháng nguyên - kháng thể sơ cấp - kháng thể thứ cấp gắn enzyme

- Rửa bỏ kháng thể thứ cấp thừa bằng cách ngâm màng vào dung dịch đệm kèm theo lắc nhẹ, trong vài giờ, cứ khoảng 30 phút thay đệm mới

- Hiện băng protein kháng nguyên bằng cách ủ màng với dung dịch cơ chất, khi enzyme gắn trên kháng thể thứ cấp là AP thì cơ chất sẽ là hỗn hợp 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate (BCIP) và nitroblue tetrazolium (NBT), còn khi enzyme gắn là HRP thì cơ chất sẽ là 4-chloro-1-naphtol (khử) + H2O2 Các băng protein kháng nguyên sẽ hiện ra dưới dạng các băng màu gạch thẫm, đó chính là do enzyme trong phức hệ kháng

nguyên - kháng thể sơ cấp - kháng thể thứ cấp đã chuyển hoá cơ chất thành sản phẩm kết tủa có màu nằm ngay vị trí protein kháng nguyên

- Làm ngừng quá trình hiện màu bằng cách tráng kỹ màng 3 lần bằng một thể tích

dư nước cất, mỗi lần ngâm 5 phút, kết hợp lắc nhẹ Nếu không làm ngừng quá trình hiện màu thì toàn bộ màng thẩm tách sẽ chuyển thành màu sẫm như các băng protein kháng nguyên, vì lượng kháng thể thứ cấp gắn enzyme rất nhỏ sót lại trên màng đủ để chuyển

cơ chất thành sản phẩm có màu khi thời gian phản ứng kéo dài (Phan Tuấn Nghĩa, 2012)

Phương pháp miễn dịch học liên kết enzyme (ELISA)

Các kháng thể sử dụng trong phương pháp ELISA được gắn với enzyme bằng liên kết đồng hoá trị Kháng nguyên được gắn với giếng plastic và kháng thể liên kết với enzyme được gắn với kháng nguyên Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rửa trôi

đi, enzyme được giữ lại và lượng kháng thể gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho thêm vào một cơ chất làm thay đổi màu do hoạt tính của enzyme Ðộ màu tạo thành là

tỉ lệ với lượng enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên Tính nhạy của ELISA là do sự khuyếch đại bởi hoạt tính enzyme Mỗi một phân tử enzyme bám vào kháng thể có thể tạo ra hàng ngàn phân

tử màu do hoạt tính enzyme Trước khi các kháng thể gắn enzyme có thể được sử dụng rộng rãi, các kháng thể phóng xạ đã được sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassays - RIA) Kỹ thuật RIA như là một đột phá có ý nghĩa và người sáng tạo ra nó là Rosalyn Yalow đã được nhận giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học vào năm

1977

Phân tử kháng thể có tính đặc hiệu rất cao, nhưng cũng có trường hợp kháng thể của kháng nguyên A lại tác dụng với kháng nguyên B, ta gọi là phản ứng chéo Nguyên nhân của phản ứng chéo có thể là do trên hai kháng nguyên này có hai điểm tiếp nhận giống nhau hoặc ít nhất là cũng tương tự nhau

Kháng thể trong huyết thanh thu nhận được bằng phương pháp gây miễn dịch trên động vật thử nghiệm là kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies), nên tính đặc hiệu của kháng thể rất quan trọng Thông thường, kháng thể phải được kiểm tra, xác nhận tính đặc hiệu bằng khả năng gắn kết của nó với kháng nguyên, phản ứng của nó với các chất/kháng nguyên khác có cấu trúc hóa học tương tự để tạo thành những liên kết không đặc hiệu làm giảm độ nhạy của nghiệm pháp Do đó, độ đặc hiệu của kháng thể kháng