Thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá tra pangasianodon hypophthalmus giai đoạn giống tại tỉnh an giang

iii TÓM TẮT Thử nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi khuẩn gâ bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giống được thực hiện, nhằm mục tiêu t m ra giải pháp mới c thể tha

UBND TỈNH AN GIANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

-oOo -

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KH&CN CƠ SỞ

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG BACTERIOCIN TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) GIAI ĐOẠN

GIỐNG TẠI TỈNH AN GIANG

NGUYỄN THỊ THÚY HẰNG

An Giang, tháng 5 năm 2018

UBND TỈNH AN GIANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

-oOo -

BÁO CÁO TỔNG KẾT NHIỆM VỤ KH&CN CƠ SỞ

THỬ NGHIỆM SỬ DỤNG BACTERIOCIN TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

(Pangasianodon hypophthalmus) GIAI ĐOẠN

GIỐNG TẠI TỈNH AN GIANG

i

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Nhiệm vụ khoa học và công nghệ “Thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giai đoạn giống tại tỉnh An Giang” do nhóm tác

giả Nguyễn Thị Thúy Hằng, Phan Thị Thanh Vân và Trịnh Thị Lan, công tác tại khoa Nông nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên thực hiện Nhóm tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày 4 tháng 5 năm 2018

ii

LỜI CẢM TẠ

Chủ nhiệm nhiệm vụ và các thành viên chân thành cám ơn: Ban Giám Hiệu, Sở Khoa học – Công nghệ tỉnh An Giang, Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Kế hoạch – Tài vụ, Ban Chủ Nhiệm Khoa Nông nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên, Lãnh đạo Bộ môn Thủy sản, Quản lý Khu thí nghiệm thực hành Nuôi trồng Thủy sản của Trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện cho việc thực hiện đề tài này

An Giang, ngày 14 tháng 5 năm 2018 Người thực hiện

Nguyễn Thị Thúy Hằng

iii

TÓM TẮT

Thử nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi khuẩn gâ bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giống được thực hiện, nhằm mục tiêu t m ra giải pháp mới c thể tha thế được thuốc kháng sinh để điều trị hiệu quả cho t m cá và an toàn cho sức kh e của con người Kết quả phân lập và định danh của cá Tra có dấu hiệu bơi lờ đờ, b ăn, xuất huyết bên ngoài da, đầu, thân…đặc biệt có dấu hiệu bệnh lý đặc trưng: gan, thận và tỳ tạng có những đốm trắng thì phân lập và định danh được vi

khuẩn E ictaluri là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá Tra Kết quả xác định tính nhạy của bacteriocin đối với vi khuẩn E ictaluri bằng phương pháp khuếch tán

giếng thạch cho thấy rằng bacteriocin đều c khả năng tạo v ng kháng khuẩn ở các thể tích 20, 30, 40, 50 và 60 μl với đường kính v ng v trùng tương ứng 8,57 mm ± 0,55; 17,87 mm ± 0,95; 18,17 mm ± 0,98; 20,20 mm ± 0,35 và 22,97 mm ± 1,15.Trong khi đ , ở giếng đối chứng được bơm nước muối sinh l tiệt trùng (NaCl 0,85%) th kh ng tạo v ng v trùng xung quanh giếng Đồng thời, kết quả thử

nghiệm điều trị của bacteriocin trên cá Tra được gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri

với mật số 6,8 x 107 CFU/mL, cho thấy tỉ lệ sống và hiệu quả điều trị (RPS) (%) của NT1.4 – 40mL/Kg thức ăn, đạt cao nhất tương ứng 92,22 % và 91,86% đối với thí nghiệm trong trại thực nghiệm và thí nghiệm điều trị trong ao lần lượt là 98,38 % và 79,14 %

o n ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus

ABSTRACT

Evaluation the resistance of bacteriocin to bacteria causing the infectious Enteric septicaemia disease of fingerling catfish was conducted, aiming to find a new solution that can replace antibiotics to treat effectively Shrimp and fish are safe for human health The results of isolation and identification of catfish have signs of swimming sluggish, eliminating eating, haemorrhage outside the skin, head, body especially signs specific pathological diseases: liver, kidney and spleen with white

spots, isolated and identified E ictaluri as the causative agent of Enteric septicaemia

disease Results of bacteriocin susceptibility analysis for E ictaluri by

well-diffusion method, showed that the bacteriocin was capable of producing zone of inhibition diameter with different volumes of 20, 30, 40, 50 and 60 μl with of 8,57

mm ± 0,55; 17,87 mm ± 0,95; 18,17 mm ± 0,98; 20,20 mm ± 0,35 and 22,97 mm ± 1,15, respectively While, at the control well, the sterile saline solution (NaCl 0,85%) was injected without sterile loop around the well At the same time, the bacteriocin

treatment test result on catfish was infected with E ictaluri with a density of 6,8 x

107 CFU/mL, indicating survival and ralative survival rate (RPS) of NT1.4 - 40mL/Kg feed, reaching the highest respectively 92,22% and 91,86 % And experimental and experimental treatments in ponds were 98.38% and 79,14%, respectively

Key words: bacteriocin, E ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus

iv

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam kết đâ là c ng tr nh nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả và số liệu trong công trình nghiên cứu nà được ghi nhận và xử lý rõ ràng đúng phương pháp Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu nà chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

An Giang, ngày 14 tháng 5 năm 2018 Người thực hiện

Nguyễn Thị Thúy Hằng

v

MỤC LỤC

Trang

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

CAM KẾT KẾT QUẢ iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

CHƯƠNG 1 1

GIỚI THIỆU 1

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2

1.4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2 3

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

2.1 ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN E ictaluri 3

2.2 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN CÁ TRA 3

2.3 TỔNG QUAN VÀ NHỮNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN 5

2.3.1 Tổng quan về bacteriocin và tình hình nghiên cứu ứng dụng của bacteriocin trong thực phẩm 5

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng của bacteriocin trong nuôi trong thủy sản 6 2.4 HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC KHÁNG SINH ĐỐI VỚI BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA 8

vi

CHƯƠNG 3 10

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

3.1 MẪU NGHIÊN CỨU 10

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU 10

3.2.1 Hệ thống ao/thùng thí nghiệm 10

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 10

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU 13

3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU 14

CHƯƠNG 4 15

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN E.ictaluri GÂY BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA GIỐNG 15

3.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA BACTERIOCIN ĐỐI VỚI VI KHUẨN E ictaluri GÂY BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA GIỐNG 18

3.3 KẾT QUẢ ÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ 50 % ID50 CỦA VI KHUẨN E ictaluri 20

3.4 KẾT QUẢ ĐIỀU TRỊ BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA DO VI KHUẨN E ictaluri G RA TRONG TRẠI THỰC NGHIỆM 24

CHƯƠNG 5 34

KẾT LUẬN V KHU ẾN NGHỊ 34

5.1 KẾT LUẬN 34

5.2 KHU ẾN NGHỊ 34

T I LIỆU THAM KHẢO 35

PHỤ LỤC 39

vii

DANH SÁCH BẢNG

Trang Bảng 1: Kết quả định danh vi khuẩn bằng bộ định danh API 20E 17

Bảng 2: Đường kính v ng v trùng của bacteriocin đối với vi khuẩn E.ictaluri trong

ph ng thí nghiệm 20

Bảng 3: Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn bằng bộ định danh API20E 23

Bảng 4: Hiệu quả điều trị của bacteriocin đối với cá Tra đã cảm nhiễm vi khuẩn E

ictaluri 27

Bảng 5: Tỉ lệ sống TB của cá ở các NT trong 10 ngà cho ăn bacteriocin 30

Bảng 6: Hiệu quả điều trị - giá trị RPS của bacteriocin đối với vi khuẩn E.ictaluri

gâ bệnh gan,thận mủ trên cá Tra sau 10 ngà cho ăn bacteriocin 31

Bảng 7: Kết quả theo d i các ếu m i trường trong thời gian thí nghiệm 34

viii

DANH SÁCH HÌNH

Trang Hình 1: Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài (A) và bên trong của cá Tra bệnh gan, thận mủ

B ; Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn E ictaluri (C).; Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn

E ictaluri (D) 17

Hình 2: Kết quả định danh vi khuẩn E.ictaluri bằng phương pháp API 20E 18

Hình 3: Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi khuẩn

E.ictaluri A ; Phương pháp xác định đường kính v ng v khuẩn B 20

H nh 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm A ; Kiểm tra cá kh e trước khi tiêm cảm nhiễm B ;

Các nồng độ vi khuẩn tiêm cảm nhiễm (C ; Vị trí tiêm cảm nhiễm D ; Dấu hiệu bên ngoài cá sau khi cảm nhiễm E ; Dấu hiệu bên trong cá sau khi cảm nhiễm F : gan,

thận và tỳ tạng c đốm trắng 24

H nh 5: Tỉ lệ sống của các nghiệm thức trong thời gian thí nghiệm 25

H nh 6: Tỉ lệ sống của các nghiệm thức sau khi kết thúc thí nghiệm (14 ngà ) 26

H nh 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm A ; Cá trước khi cảm nhiễm B ; Kết quả tái phân

lập vi khuẩn đối chứng dương C ; Cá sau khi cảm nhiễm (D), thận sung to c đốm

trắng và gan có màu sắc tái nhạt; Kết quả tái định danh vi khuẩn E ; Kết quả tái

phân lập vi khuẩn ở đối chứng âm F 29

H nh 8: Tỉ lệ sống TB của cá trong 10 ngà điều trị của 2 NT 30

H nh 9: Tỉ lệ sống TB của cá trong 14 ngà điều trị của 2 NT 31

H nh 10: Bố trí cá vào v o A ; Cá trước khi cảm nhiễm vi khuẩn B ; Trộn vi khuẩn

vào thức ăn C ; Biểu hiện của cá sau khi cảm nhiễm D ; Kết quả tái định vi khuẩn

những cá bệnh sau cảm nhiễm E ; Quan sát và phân lập vi khuản sau khi kết thúc thí nghiệm 33

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cá Tra là đối tượng được nuôi phổ biến ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu long như Cần Thơ, An Giang và Đồng Tháp, Tuy nhiên, trong những năm gần đâ , nghề nuôi

cá Tra đang phải đối mặt với nhiều kh khăn và thách thức Một trong những khó khăn đ là dịch bệnh, các nhà khoa học đã xác định vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm là 3 tác nhân gây bệnh truyền nhiễm thường hay xuất hiện trên cá Tra nuôi ở

ĐBSCL, bao gồm các bệnh do vi khuẩn (Edwardsiella ictaluri, Aeromonas

hydrophila, Flavobacterium columnare), nấm Fusarium sp, ký sinh trùng ngoại

ký sinh (Trichodina spp., Ichthyophthirius multifiliis, Apinosoma spp., Epistylis sp.), nội ký sinh (Microsporidian, Myxobolus spp., Henneguya spp.,…và các hội chứng vàng da, bệnh trắng gan, trắng mang (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2008; Nguyễn Thị Thu Hằng và cs., 2008; Từ Thanh Dung và cs., 2012) Đặc biệt trong các bệnh này, thì bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E ictaluri và bệnh xuất huyết

do vi khuẩn A hydrophila trên cá Tra là các bệnh có thể gây thiệt hại lớn về kinh tế

cho người nuôi cá Tra thâm canh Chính vì thế, để kiểm soát tốt dịch bệnh th người nuôi cần phải sớm nhận biết được các dạng bệnh khác nhau, hiểu được ngu ên nhân

và điều kiện xuất hiện bệnh, nắm được phương pháp ph ng bệnh thì mới có thể

ngăn chặn được bệnh xảy ra, giảm thiệt hại Bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E

ictaluri gây ra trên cá Tra ngày càng phổ biến và khả năng kháng thuốc kháng sinh

ngày càng cao (trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2017)

Theo kết quả kháng sinh đồ của 50 chủng vi khuẩn E.ictaluri với các loại kháng sinh

đã cho thấy rằng vi khuẩn E ictaluri giảm tính nhạy trên nhiều loại kháng sinh

như cefazoline 2% , cefalexin 2% , neom cin 6% , amoxicillin + clavulanic acid 8% và ampiciline 14% Trong khi đ , đa số vi khuẩn đã kháng flumenquin, trimethoprim + sulfamethoxazol và kháng với enroflocxacin (93%),

chloramphenicol (82%), streptomycin (80%) (Từ Thanh Dung và cs, 2012) Ngày

nay, việc ứng dụng các hoạt chất từ thảo dược hoặc các sản phẩm được sinh ra từ vi khuẩn có tính kháng khuẩn cao, để ức chế và tiêu diệt được vi khuẩn gây bệnh trên người cũng như gâ bệnh trên các loài thủy sản đang được khuyến khích sử dụng, nhằm mục tiêu bảo vệ sức kh e con người và m i trường Trong đ , bacteriocin là sản phẩm được sinh ra từ vi khuẩn lactic để chống lại vi khuẩn gây bệnh khác và bản chất của bacteriocin là một đoạn peptid có tính kháng khuẩn, kháng được vi khuẩn

gram dương và vi khuẩn gram âm gây ngộ độc trong thực phẩm như Escherichia

coli, Salmonella typhymurium, Staphylococccus aureus (Renata Bromberg và cs,

2004) Ngoài ra, một số tác giả đã nghiên cứu và cho thấy tiềm năng ứng dụng của bacteriocin trong việc phòng và trị bệnh trong nuôi trồng thủy sản Đồng thời,

2

bacteriocin không gây ra phản ứng dị ứng cho con người và các vấn đề về sức kh e,

bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase (Parada và cs, 2007) Do đ , việc thử

nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra do vi khuẩn

E ictaluri gây ra, sẽ mở ra hướng mới tích cực hơn trong việc điều trị bệnh nhiễm

khuẩn trên các loài thủy sản (Suphan Bakkal và cs, 2012) Vì vậy, nhiệm vụ nghiên

cứu khoa học ―Thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ

trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai đoạn giống tại tỉnh An Giang‖

là rất cần thiết

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Thử nghiệm sử dụng bacteriocin trong điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra

(Pangasianodon hypophthalmus giai đoạn giống tại tỉnh An Giang nhằm tìm ra

hướng điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên các loài thủy sản hiệu quả hơn, tích cực hơn và đặc biệt bảo vệ sức kh e của con người và m i trường

1.3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Cá Tra giai đoạn giống có khối lượng khoảng 20 – 35 g/con, màu sắc tươi sáng,

phản ứng linh hoạt được mua từ Trung Tâm Giống An Giang Cá được sử dụng bố trí

trong các thí nghiệm của đề tài

- Mẫu cá Tra bệnh được thu từ các hộ nuôi của huyện Phú Tân và trại Bình Thạnh của Trung tâm giống Thủy sản An Giang để phân lập và định danh vi khuẩn

E.ictaluri

1.4.NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập và định danh vi khuẩn E.ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giai

- Đ ng g p về mặt khoa học: kết quả nghiên cứu khoa học sẽ cung cấp những số liệu

về liều lượng sử dụng bacteriocin trong việc phòng và trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giai đoạn giống nói riêng và ứng dụng thử nghiệm trên một số bệnh nhiễm khuẩn khác của động vật thủy sản

- Đ ng g p về công tác giảng dạy: kết quả nghiên cứu có giá trị phục vụ cho giảng dạy học phần Bệnh học thủy sản

- Ứng dụng: Bộ môn Thủy sản và Trung tâm giống Thủy sản An Giang

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN E ictaluri

Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri là tác nhân gây ra bệnh mủ gan trên cá Tra Ngoài

ra, bệnh mủ gan còn có tên gọi khác là bệnh trắng gan; gan, thận mủ hoặc bệnh ung

thư gan Vi khuẩn E ictaluri là loài vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceace, gram âm,

hình que ngắn, di động yếu hoặc kh ng di động khi nhiệt độ >30oC Catalase dương

tính, oxidase âm tính và lên men đường glucose Vi khuẩn E ictaluri phát triển trên

m i trường triptic soy agar (TSA) chậm từ 36-48 giờ ở nhiệt độ 28-30o

C (Từ Thanh

Dung và cs, 2005) Vi khuẩn E ictaluri lên men trong m i trường O/F glucose,

phản ứng catalase dương tính, phản ứng cytochrome oxidase âm tính Nhìn chung,

các đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn E ictaluri cho hầu hết các phản ứng âm tính, chỉ

có 2 phản ứng dương tính là L sine và Glusose (Từ Thanh Dung, 2017) Bên cạnh

đ , theo kết quả phân lập và định danh bằng kit API 20E của Đồng Thanh Hà, (2009)

cũng cho rằng vi khuẩn E.ictaluri c các đặc điểm: hình que, gram (-), không sinh

bào tử, yếm khí tùy tiện và các đặc điểm sinh hóa cho kết quả âm tính với các phản ứng, ngoại trừ 2 phản ứng lysine và glucose Với các đặc điểm này cho thấy

E.ictaluri c đăc điểm sinh h a tương tự với các chủng E ictaluri chuẩn phân lập

từ cá nheo Mỹ (Ictalurus sp) của Hawke (1981), các chủng E ictaluri phân lập

từ cá Tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi ở Việt Nam của nhóm nghiên cứu của Trường đại học Cần Thơ và đại học Stirling (Crumlish và cs, 2002), và chủng E

ictaluri phân lập từ cá Tra bị bệnh gan, thận mủ ở Indonesia (Kei Yuasa và cs, 2003)

và chủng E ictaluri trong hệ thống phân loại của Bergey

Vi khuẩn E ictaluri xuất hiện đầu tiên trên cá Nheo (Ictalurus furcatus) ở Mỹ (Hawke 1976), cá Trê trắng (Clarias batrachus) ở Thái Lan (Kasornchandra, 1987)

Ở Việt Nam bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên vào năm 1998 trên cá Tra, thỉnh thoảng trên cá Basa, xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá Tra Tỉ lệ hao hụt lớn nhất ở cá giống (10-90% , nhưng gâ thiệt hại về kinh tế lớn nhất ở giai đoạn cá lứa

cỡ 300-500 g (Từ Thanh Dung và cs, 2005) Ngoài ra, bệnh này còn gây thiệt hại

trong ao nuôi cá Tra ở giai đoạn cá hương cỡ 4-6 cm đến 5-6 tháng tuổi, tỉ lệ tử vong

từ 60-70 % (Bùi Quang Tề, 2006)

2.2 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH TRÊN CÁ TRA

Cá Tra (Pangasianodon hyphophthalmus) hiện na đang là một trong các đối tượng

thủy sản nuôi chủ lực ở nước ta Theo báo cáo của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển

N ng Th n NN&PTNT , tính đến ngày 30/11/2016, diện tích nuôi cá Tra thương phẩm đạt 4.552 ha, sản lượng đạt 1,047 triệu tấn, ước tính tổng giá trị xuất khẩu đạt 1,67 tỷ USD Theo Từ Thanh Dung, 2017 cho rằng ký sinh trùng, nấm và vi khuẩn là

4

3 tác nhân gây bệnh thường xu ên trên cá Tra nu i Trong đ tác nhân do vi khuẩn là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng, là trở ngại chủ yếu kìm hãm sự phát

triển và mở rộng sản xuất trong nuôi trồng thuỷ sản Bao gồm bệnh xuất huyết do A

hydrophyla gây ra và bệnh gan, thận mủ do vi khuẩn E.ictaluri gâ ra, đây là 1oại

bệnh có thể gây thiệt hại từ 10 % – 50 % tùy vào khả năng kỹ thuật chăm s c và quản lý ao nuôi mà tỉ lệ chết có thể cao hơn, xuất hiện quanh năm và xuất hiện tất cả các giai đoạn phát triển của cá

Bệnh nhiễm trùng máu đường ruột hay bệnh gan, thận mủ trên cá Tra do vi khuẩn

gram âm E.ictaluri là bệnh gây thiệt hại quan trọng cho nghề nu i cá da trơn Bệnh

xả ra trên cá da trơn trong điều kiện cá bị stress, chế độ ăn kh ng hợp lý, môi trường c hàm lượng ammoniac và nitrit cao, hàm lượng oxy hòa tan thấp Tỉ lệ cá

nhiễm bệnh và chết từ 10 % đến 50 % Nghiên cứu cho thấy vi khuẩn E.ictaluri xâm

nhập chính qua đường ruột Thức ăn sau khi đi vào dạ dà đến ruột, vi khuẩn có thể

đi qua biểu mô ruột vào máu và di chuyển đến thận Bệnh thường xuất hiện vào mùa xuân khi nhiệt độ nước khoảng từ 20 °C đến 28 °C (John P Hawke, 2015) Đâ là một bệnh xả ra quanh năm, đặc biệt là mùa mưa, vào mùa lạnh, nhiệt độ thấp gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi cá Tra, Basa ở ĐBSCL, tỷ lệ chết cao có thể 100% đối với cá bột ương giống, từ 30 - 50% đối với cá thịt và đã làm giảm năng suất đáng kể trong các hệ thống nuôi Bệnh mủ gan được phát hiện lần đầu tiên năm

1998, chỉ xuất hiện trên cá da trơn, đặc biệt là cá Tra, Basa; tuy nhiên, hiện đang xảy

ra trên tất cả các loại cá nu i như: cá L c, Điêu hồng, cá Rô, Ếch… (Thủy sản Việt Nam, 2016) Theo kết quả khảo sát của Đoàn Kim Ngân 2010 cho thấy tình hình dịch bệnh ở cá Tra nuôi thâm canh trong ao hiện nay khá phức tạp và c xu hướng tăng tần số xuất hiện Có bốn loại bệnh thường gặp trên cá Tra nuôi ở Thoại Sơn -

An Giang là bệnh gan, thận mủ chiếm (100%), bệnh phù đầu xuất huyết chiếm (96,7%), trắng gan trắng mang (90%) và bệnh k sinh trùng Trong đ c hai bệnh nguy hiểm nhất, gây thiệt hại nhiều nhất và khó trị nhất cho nghề nuôi là bệnh gan thận mủ và phù đầu xuất huyết Thêm vào đ , theo kết quả giám sát tình hình nuôi và điều kiện phát sinh bệnh gan, thận mủ trên cá Tra nuôi thâm canh ở tỉnh An Giang cho thấy rằng bệnh gan, thận mủ và phù đầu xuất huyết có tần số xuất hiện cao nhất chiếm 21 % - 22 % Đỗ Quang Tiền Vương và Trương Hồng Việt, 2012)

Bên cạnh đ , kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên Ếch Thái Lan nuôi và cá Lóc giống cũng ghi nhận được có sự hiện diện của vi khuẩn E.ictaluri (Lê

Thị Mỹ, 2017 và Lê Thị Kim Mai, 2018 Điều này cho thấy rằng vi khuẩn E.ictaluri

không chỉ gây bệnh trên cá Tra n i riêng và cá da trơn n i chung mà c n xuất hiện trên các loài cá có vảy khác, từ đ t nh h nh gâ bệnh của vi khuẩn nà trên các đối tượng thủy sản có thể tăng cao Tuy nhiên, theo thông tin của tổng cục Thủy sản về công tác giám sát dịch bệnh trên cá Tra nuôi, sẽ giám sát tập trung chủ yếu là bệnh

gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất hu ết do vi

tiên là colicin vì nó có khả năng tiêu diệt E.coli (trích dẫn bởi Gillor và cs, 2008)

Theo nghiên cứu của Shinichi Kawamoto and Jun Shima (2004), bacteriocin có bản chất protein đơn giản và có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh Nhiều vi khuẩn acid lactic có khả năng sản sinh các bacteriocin khác nhau Kết quả nà cũng trùng

hợp với kết quả nghiên cứu của Geir Mathiesen và cs (2005) cho rằng vi khuẩn lactic

có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh do sản sinh được những peptide có khả năng kháng khuẩn và được gọi là bacteriocin Sự sản sinh bacteriocin từ những dòng vi

khuẩn Lactococcus lactis được tìm thấy ở nhiều sản phẩm lên men khác nhau

Những bacteriocin được sản sinh cho thấy rằng có khả năng kháng khuẩn cao bao

gồm các vi sinh vật phân hủy và mầm bệnh tấn công vào thực phẩm như Bacillus

coagulans, Listeria monocytogenes và Bacillus cereus (Michel Bakar Diop và cs,

2007)

Bacteriocin gồm nhiều loại khác nhau như nisin, colistin và microcin Trong đ , microcin là một sản phẩm dùng thay thế thuốc kháng sinh, để ph ng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn cho tôm, cá trong nuôi trồng thuỷ sản, kh ng để lại dư lượng trong thành phẩm, không ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người và m i trường microcin có thành phần chính là reuterin - một loại kháng sinh tự nhiên được sản

sinh bởi vi khuẩn Lactobacillus reuteri qua quá trình lên men yếm khí glycerol

Reuterin là hỗn hợp các monomeric, hydrate monomeric và cyclic dimeric của hydroxypropionaldehyde (3-HPA), có phổ kháng khuẩn rộng bao gồm vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm, nấm men, nấm mốc, bào tử trùng, kí sinh trùng, thậm chí

β-cả virus (Lê Xuan Thành và cs, 2012)

Đồng thời, tiềm năng sử dụng các dòng vi khuẩn sinh bacteriocin như là một chế phẩm sinh học và bảo vệ sinh học đã được quan tâm hơn, như là một phương pháp

điều trị mới cho con người, vật nuôi và thủy sản (Gillor và cs, 2008) Bên cạnh đ ,

theo Cursino và cs 2006 cũng cho rằng colicin và microcin có khả năng ức chế sự

phát triển của một số vi khuẩn như Enterobacter, Escherichia, Klebsiella,

Morganella, Salmonella, Shigella, và Yersinia Theo Grinter và cs (2012); Cotter và

6

cs 2013 đều cho rằng bacteriocin ức chế được các mầm bệnh gây bệnh trên cây

trồng và vật nu i như E coli, Staphylococcus aureus, Agrobacterium và Brenneria

spp Thêm vào đ , kết quả nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn của bacteriocin cụ thể là reuterin hoặc reuterin kết hợp với nisin có tính kháng cả vi khuẩn gram âm và

vi khuẩn gram dương gâ bệnh có trong sữa Reuterin (8AU/ml) có hoạt tính kiềm

hãm vi khuẩn Listeria monocytogenes cao, ngược lại thì yếu với vi khuẩn

Staphylococcus aureus và cao nhất là đối với vi khuẩn Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Choleraesuis, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila và Campylobacter jejuni Khi reuterin kết hợp với nisin (100 IU/ml) thì ảnh hưởng có ý

nghĩa đối với L monocytogenes và ảnh hưởng yếu đối với S aureus sau 24 h ở 37 °C (Arques và cs, 2004)

Bacteriocin là một sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong bảo quản thực phẩm vì bacteriocin là những phân tử peptid do vi khuẩn sinh tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn gây hại (Nguyễn Thú Hương và Trần Thị Tưởng An, 2008) Bên cạnh đ , trong nhiều thế kỷ qua vi khuẩn lactic được con người sử dụng để bảo quản thực phẩm và có sản sinh ra các hợp chất có khả năng kháng khuẩn như acid lactic, h drogen peroxide và

bacteriocin (Geir Mathiesen và cs, 2005 Đồng thời, kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin từ Lactococcus lactis đối với một số chủng vi

khuẩn chỉ thị, đặc biệt là những vi khuẩn gây bệnh thường tìm thấy trong thịt heo cho

thấy dịch bacteriocin từ Lactococcus lactis chủng có phổ kháng khuẩn khá rộng, có hoạt tính ức chế vi khuẩn Gram dương và ức chế một số vi khuẩn Gram âm gây bệnh như S typhimurium và E.coli (Nguyễn Thú Hương và Trần Thị Tưởng An, 2008)

Bacteriocin hoạt động theo cơ chế có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm tha đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn c ng vào peptidogl can để làm suy yếu thành

tế bào Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trên những tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào Đ là ngu ên nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K+ và phốt phát v cơ đi ra kh i tế bào Trong sự nỗ lực để tái tích

lũ lại những ion này, những hệ thống hấp thu phụ thuộc ATP dẫn tới thủy phân của ATP bên trong Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan trọng tế bào, những chức năng tế bào bị phá vỡ và tế bào dần dần mất năng lượng và chết

2.3.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng của bacteriocin trong nuôi trong thủy sản

Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin và tiềm năng sử dụng chúng như một chế phẩm sinh học được nhiều nghiên cứu quan tâm và hướng đến sử dụng trong tương

lai Theo Tapasa Kumar Sahoo và cs (2014) đã nhấn mạnh về vai trò kháng khuẩn

của bacteriocin, có khả năng kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản và là chất kháng khuẩn có thể thay thế thuốc kháng sinh Ngoài ra, bacteriocin có thể sử dụng

7

như là một chế phẩm sinh học được các nhà nghiên cứu Ấn Độ Karthikeyan và

Santhosh 2009 đã sản xuất từ dòng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được phân

lập từ ruột của tôm sú Các tác giả đã ghi nhận được bacteriocin này có hoạt phổ kháng khuẩn rộng với các mầm bệnh trong thực phẩm Đồng thời, nghiên cứu cho thấ điều kiện tối ưu để sản xuất bacteriocin là ở 50 oC, pH=4 và m i trường có nồng

độ muối 0.9% Nhóm nghiên cứu cũng đã tiết lộ rằng có thể sử dụng bacteriocin như một chế phẩm sinh học

Bacteriocin cũng được hướng đến sử dụng để phòng và trị bệnh cho các loại bệnh

thường gặp ở tôm cá nuôi Theo nghiên cứu ứng dụng của Suphan Bakkal và cs

(2012) về bacteriocin để thay thế thuốc kháng sinh và có thể điều trị một số bệnh vi

khuẩn thường gặp trong nuôi trồng thủy sản như Aeromonas, Vibrio, Streptococcus

và Edwardsiella

Hiện nay, các nhà nghiên cứu Việt Nam cũng đã thực hiện các thí nghiệm về khả năng kháng khuẩn của bacteriocin với các vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên những

đối tượng nuôi có giá trị kinh tế như cá Tra Theo Lê Xuân Thành và cs 2002 đã

sản xuất thành công microcin có thành phần chính là reuterin từ chủng vi khuẩn

Lactobacillus reuteri Các tác giả cho rằng reuterin có phổ kháng khuẩn rất rộng và

hoạt tính cao, ức chế sự phát triển của hầu hết các vi sinh vật có hại: vi khuẩn Gram dương, Gram âm, nấm men, nấm mốc, bào tử trùng, kí sinh trùng và thậm chí cả

virus Reuterin có nhiều ứng dụng quan trọng trong đời sống như ph ng - trị bệnh

cho người, động vật; bảo quản và chế biến thực phẩm; tiền chất của rất nhiều chất hóa học trong công nghệ hoá học và công nghệ sinh học, …Ứng dụng trong việc phòng trị bệnh cho động vật thủy sản nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm microcin đối

với từng tác nhân gây bệnh do 5 chủng vi khuẩn nước ngọt: Aeromonas hydrophila,

Pseudomonas fluorescens , Edwardsiella tarda, Pleisiomonas shigelloides, Streptococcus sp và 5 chủng vi khuẩn nước mặn/lợ: Vibrio parahaemolyticus, V harveyi, V alginolyticus , V anguillarum, V.vulnificu,…Kết quả thử kháng sinh đồ

với các vi khuẩn gây bệnh ở nước ngọt và nước lợ cho thấy ở các lượng microcin thử

từ 10-60 l đều có tác dụng hạn chế vi khuẩn phát triển v đường kính các vòng vô khuẩn đều lớn hơn 12 mm, microcin c tác dụng mẫn cảm cao với 2 vi khuẩn

Edwardsiella tarda và Streptococcus sp, các lượng thử từ 20 - 60 l đều cho đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 20 mm; lượng thử từ 30 - 60 l microcin mẫn cảm cao

với 2 vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Pleisiomonas shigelloides; còn

Pseudomonas fluorescens mẫn cảm cao với lượng microcin từ 50 -60 l Vibrio

harveyi mẫn cảm cao với microcin có liều lượng từ 20- 60 l, cho đường kính vòng

vô khuẩn lớn hơn 20mm; ba loài V parahaemolyticus, V alginolyticus, V

anguillarum mẫn cảm cao với liều thử từ 30 - 60 l; loài V vulnificus mẫn cảm cao với liều thử 50 - 60 l Đồng thời, sau 2 tháng nu i cá được kiểm tra sinh trưởng, tỷ

lệ sống cao Bên cạnh chức năng kháng khuẩn của reuterin nó còn có khả năng làm tăng tỉ lệ sống của tôm cá Kết quả thử nghiệm cho ăn microcin sau khi cảm nhiễm vi

8

khuẩn Aeromonas hydrophila, Streptococcus sp, vi khuẩn Edwardsiella tarda thấy

rằng tỉ lệ sống rất cao gần 100% Điều nà c nghĩa là microcin giúp cho động vật thủy sản có khả năng kháng được bệnh cao

Theo Nguyễn Văn Thành và Ngu ễn Ngọc Trai 2012 đã thí nghiệm sử dụng

bacteriocin trong điều trị bệnh đốm đ do vi khuẩn A hydrophyla và bệnh gan, thận

mủ do E ictaluri gây ra trên cá Tra cho thấy rằng 45 dòng Lactobacillus sp có có những đặc tính tốt để sản xuất probiotics và bacteriocin Tất cả chúng đều ức chế A

hydrophila nhưng chỉ 43 dòng có khả năng ức chế E ictaluri khi được kiểm tra bằng

phương pháp nh giọt Trong đ d ng Lactobacillus suntoryeus LH5 sinh bacteriocin 5μl dung dịch vi khuẩn Lactobacillus suntoryeus LH5) là dòng ức chế cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh trên cá Tra A hydrophyla với đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 22,7 mm và E ictaluri với đường kính vòng vô khuẩn lớn nhất là 18,7 mm Kết quả này cho thấy bacteriocin nhạy với A hydrophyla hơn so với E ictaluri Tuy nhiên, việc sử dụng sinh vật đối kháng và bacteriocin để ức chế lại E ictaluri là vấn đề

tương đối mới vì hiện na chưa t m thấy nghiên cứu nào được thực hiện trong và

ngoài nước sử dụng Lactobacillus sp hay bacteriocin do vi khuẩn nà sinh ra để ức chế lại E ictaluri Từ đ cho thấy tiềm năng sử dụng dòng Lactobacillus suntoryeus

LH5 để điều trị bệnh gan thận mủ cũng như bệnh đốm đ cho cá Tra là rất lớn

2.4 HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC KHÁNG SINH ĐỐI VỚI BỆNH GAN, THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

Hiện na người nuôi sử dụng thuốc kháng sinh để trị bệnh gan, thận mủ trên cá tra rất phổ biến, nhưng dần dần những loại thuốc kháng sinh cũng sẽ giảm tác dụng hoặc

không còn tác dụng đối với vi khuẩn E.ictaluri như streptom cine, cefalexine và amoxiline (Từ Thanh Dung và cs, 2012) Tuy nhiên, một số loại thuốc kháng sinh còn rất nhạy với vi khuẩn E.ictaluri như florphenicol và dox c line Theo Vũ Dũng

Tiến và cs 2013 đã đưa ra qu tr nh điều trị bệnh gan, thận mủ bằng thuốc kháng sinh florphenicol cho người nuôi Nhóm nghiên cứu cũng khẳng định florphenicol là

loại kháng sinh đặc trị bệnh gan, thận mủ do vi khuẩn E.ictaluri gây ra Sử dụng

thuốc từ 7 - 10 ngày sẽ cho hiệu quả tốt, cá sẽ hồi phục nhanh khi người nuôi thực hiện tốt khâu vệ sinh diệt mầm bệnh trong khu vực nu i và trong m i trường nước Đồng thời, florfenicol c độ tồn dư thấp trong m cơ Dùng thuốc liều 10mg/kg thể trọng liên tục 12 ngà , khi ngưng sử dụng 7 ngày mức tồn dư trong cơ cá Tra còn 0,222 - 0,109 ppm (mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1ppm) Khi trộn thuốc với thức ăn xong hoặc pha thuốc vào một ít nước rồi phun đều lên thức ăn , đợi khoảng 10-15 phút cho thuốc ngấm vào thức ăn rồi mới cho cá ăn Tu nhiên, để đạt kết quả tốt hơn, nên áo bao bọc) thức ăn bằng vime - lecithin để tăng khả năng dung nạp (vime - lecithin có tác dụng bao bọc viên thức ăn để thuốc không bị thất thoát ra môi trường ngoài, đồng thời kích thích cá ăn nhiều, tiêu hóa tốt Có thể dùng 1 lít vime – lecithin trộn với 75-100kg thức ăn, để yên 15 phút rồi mới cho cá ăn Ngoài ra, theo Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương 2012 đã đưa ra kết quả thử

9

nghiệm điều trị của thuốc kháng sinh Erythromycin thiocyanate với liều lượng 60mg/Kg cá để trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra Bên cạnh đ , kết quả khảo sát của Đoàn Kim Ngân 2010 cũng cho rằng các loại thuốc, hóa chất được sử dụng phổ biến để phòng và trị bệnh trên cá Tra như: CuSO4 (83,3%), Enrofloxacin (96,7%), Amoxcillincillin (80%), Colistin (83,3%), Florfenicol (73,3%) và một số loại thuốc hóa chất khác Tuy nhiên, những nghiên cứu khác cũng đã cho rằng vi khuẩn E

ictaluri kháng với nhiều loại thuốc kháng sinh theo thời gian sử dụng Cụ thể, kết

quả nghiên cứu của Waltman and Shotts (1986) cho thấy phần lớn vi khuẩn E

ictaluri phân lập trên cá Nheo Mỹ nhạ đối với nhóm cephalosporin, penicillin,

quinolone, tetracycline, chloramphenicol và nitrofurantoin Nghiên cứu tiếp theo của

Reger et al., 1993 cũng cho thấy vi khuẩn E ictaluri nhạy với enrofloxacin,

gentamicin và doxycycline Gần đâ nhất, theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Thiện Nam và cs., (2010) cho thấy hầu hết vi khuẩn E ictaluri kháng với

streptomycin, chloramphenicol (95%), florfenicol, enrofloxacin (77,5%) và dox c cline 67,5% Đặc biệt, nghiên cứu nà đã xác định 97,5% chủng vi khuẩn

biểu hiện sự đa kháng thuốc Đồng thời, nghiên cứu của Phạm Thanh Hương và cs., (2010) cho thấ c đến 96% các chủng vi khuẩn E ictaluri thể hiện sự đa kháng

thuốc

Việc sử dụng thuốc kháng sinh lâu dài dẫn đến nhiều bất lợi như: dễ bị lờn thuốc và tạo ra d ng vi khuẩn kháng thuốc, thuốc kháng sinh c thể tồn lưu trong thịt cá gâ ảnh hưởng đến sức kh e của người sử dụng sản phẩm thủ sản và cần phải c thời gian cho thuốc đào thải ra kh i cơ thể động vật thủ sản và mất đi trong m i trường

ao nu i Ngược lại, bacteriocin c nhiều ưu điểm hơn so với thuốc kháng sinh như bacteriocin không gây ra phản ứng dị ứng cho con người và các vấn đề về sức kh e,

bị phân hủy nhanh bởi enzym protease, lipase (Parada và cs., 2007) Điều này cho

thấy rằng tiềm năng sử dụng bacteriocin trong phòng và trị bệnh trên động vật thủy sản trong tương lai là rất cao

10

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 MẪU NGHIÊN CỨU

- Cá Tra giai đoạn giống có khối lượng khoảng 20 – 35 g/con, màu sắc tươi sáng,

phản ứng linh hoạt được mua từ Trung Tâm Giống Thủy sản An Giang Cá được sử dụng bố trí trong các thí nghiệm của đề tài

- Mẫu cá Tra bệnh được thu từ các hộ nuôi của huyện Phú Tân và Trại Bình Thạnh của Trung tâm giống Thủy sản An Giang để phân lập và định danh vi khuẩn

E.ictaluri Thời gian thu mẫu cá từ tháng 6 đến tháng 7 năm 2018

- Bacteriocin được mua từ Công ty TNHH Công nghệ sinh học Dược Nanogen, TP

HCM Thành phần chính 3-HPA (3-H drox propionaldeh de được chiết xuất từ vi

khuẩn Lactobacillus reuteri qua quá trìn lên men yếm khí glycerol

3.2 THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU

3.2.1 Hệ thống ao/thùng thí nghiệm

- Các thí nghiệm trong trại thực nghiệm được sử dụng thùng 160L và có sục khí liên

tục Các nghiệm thức trong mỗi thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại

- Thí nghiệm điều trị ngoài ao được bố trí 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức với 3 lần lặp lại

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Phân lập và định danh vi khuẩn E.ictaluri

(Định danh theo phương pháp sử dụng Kit API20E của BioMerieux)

Thu 25 mẫu cá Tra, trong đ gồm 20 mẫu cá bệnh và 5 mẫu cá kh e Sau đ , vận chuyển sống về phòng thí nghiệm của Khu thí nghiệm Trường Đại học An Giang để phân lập và định danh

- Ghi nhận những dấu hiệu bất thường bên ngoài của cá, cân khối lượng

- Giải phẩu mẫu cá bệnh Phân lập vi khuẩn trên 3 cơ quan gan, thận và tỳ tạng

- Sau khi giải phẫu tiệt trùng bề mặt các nội quan gan, thận và tỳ tạng Dùng dao tiệt trùng rạch một đường nh trên cơ quan cần phân lập Sau đ lấy que cấy tiệt trùng lấy một ít mẫu vật cấ lên đĩa m i trường TSA đã chuẩn bị sẵn

- Đem đĩa petri đã cấy vi khuẩn ủ ở nhiệt độ 28-30 oC trong 48 giờ

11

- Sau 48 giờ vi khuẩn đã phát triển và tiến hành tách ròng vi khuẩn Chọn 1 khuẩn lạc đại diện từ đĩa petri ban đầu cấ sang đĩa m i trường TSA mới, lập lại 2-3 lần cho đến khi vi khuẩn thuần

- Sau đ , nhuộm Gram xác định hình dạng vi khuẩn và định danh vi khuẩn bằng Kit API20E

- Nuôi tăng sinh vi khuẩn: Sau khi vi khuẩn đã thuần tiến hành lấy vài khuẩn lạc bằng que cấy tiệt trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 ml m i trường BHI tiệt trùng và lắc trong 48 giờ Sử dụng 1ml dung dịch vi khuẩn đã tăng sinh

và 0,5 mL dung dịch paraffin tiệt trùng cho vào ống eppendof trữ trong tủ âm

80 oC

3.2.2.2 Xác định tính kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi khuẩn E.ictaluri trong điều kiện phòng thí nghiệm Theo Phương pháp khuếch tán giếng thạch của

Aly and Abo-Amer, 2007)

Nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả năng ức chế của bacteriocin Vi khuẩn

E ictaluri được nu i tăng sinh trong m i trường BHI (Brain Heart Infusion) trong 48

giờ, pha loãng đến mật số khoảng 9x108 CFU/mL (dựa vào ống chuẩn số 3 McFarland)

Hút 0,2 mL dung dịch vi khuẩn trải đều trên đĩa petri c chứa m i trường Trypticase Soy Agar (TSA để ráo, đục lỗ thạch c đường kính 5 mm (4 lỗ/đĩa petri Mỗi thể tích của bacteriocin được bơm lần lượt từ 20, 30, 40, 50 và 60 μL vào 3 lỗ (mỗi thể tích được lặp lại 3 lần) và 1 lỗ còn lại bơm nước cất v trùng vào để làm lỗ đối chứng Ủ ở 28 °C trong 48 giờ

Bacteriocin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh sẽ tạo vòng vô khuẩn xung quanh

lỗ thạch Đo đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính nhạy của bacteriocin đối với

vi khuẩn gây bệnh Nếu đường kính vòng vô khuẩn nh hơn 12 mm, được gọi là có tính kháng (R) hay nếu đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 12 mm, được gọi là mẫn cảm (S); mẫn cảm trung b nh đường kính vòng vô khuẩn từ 12-20 mm; mẫn cảm cao

c đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 20 mm (Lê Xuân Thành và cs, 2002)

3.2.2.3 Thử nghiệm điều trị bệnh gan, thận mủ trên cá Tra giống do vi khuẩn E.ictaluri gây ra (Theo Phương pháp của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn

Thanh Phương, 2012)

- Thí nghiệm xác định ID50 (Inhibitory Dose 50%)

Thí nghiệm cảm nhiễm thăm d được bố trí với 5 nghiệm thức trong15 thùng nhựa

có thể tích 160L, mỗi thùng bố trí 10 con cá với 3 lần lặp lại, cá được gây cảm nhiễm bằng cách tiêm vi khuẩn tại gốc vi ngực (0,1ml vi khuẩn/cá với các nồng độ 103, 104,

105, 106 và 107 CFU/ml) Vi khuẩn E ictaluri được nu i tăng sinh trong m i trường

BHI trong 48 giờ Sau đ , dung dịch vi khuẩn được chuyển sang các ống eppendorf

2 mL để li tâm 4000 vòng ở 4 o

C trong 15 phút B phần dung dịch phía trên và vi

12

khuẩn được rửa 3 lần với nước muối sinh lý tiệt trùng và hòa tan vi khuẩn sau li tâm với nước muối sinh lý tiệt trùng ác định mật độ dung dịch vi khuẩn bằng phương pháp so với độ đục của ống chuẩn McFarland số 3 độ đục tương đương với 108CFU/mL Sau đ pha loãng dung dịch vi khuẩn từ nồng độ 103

CFU/mL, 104CFU/mL, 105 CFU/mL, 106 CFU/mL và 107 CFU/mL Mật độ vi khuẩn được xác định lại bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc Sử dụng các nồng độ nà để tiêm cảm nhiễm cho cá kh e

Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 7 ngày Những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt được thu để giải phẫu quan sát dấu hiệu bệnh mủ gan và tái phân lập và định danh vi khuẩn từ thận

- Thí nghiệm cảm nhiễm và điều trị:

Thí nghiệm được thực hiện tại trại Thủy sản Trường Đại học An Giang Hệ thống thùng nhựa (160L được khử trùng bằng chlorine và xà phòng, rửa lại bằng nước sạch Sau đ cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục 5 ngà để loại hết chlorine, các chỉ tiêu m i trường được kiểm tra trước khi thí nghiệm gồm pH, oxy hòa tan, nhiệt độ, NH3/NH4+ và NO2-

Cá Tra được chọn làm thí nghiệm có trọng lượng 15-20g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt Cá được bố trí ngẫu nhiên 30 con/bể chứa nước 2/3 thể tích bể và thuần hoá 7 ngày cho quen dần với m i trường nước thí nghiệm Trước khi gây cảm nhiễm, chọn ngẫu nhiên 10 con cá ở các NT của thí nghiệm để kiểm tra ký sinh trùng

và phân lập vi khuẩn từ thận để xác định cá không nhiễm ký sinh trùng và vi khuẩn

Thí nghiệm cảm nhiễm và điều trị trong Trại Thủy sản:

Thí nghiệm được bố trí gồm bốn nghiệm thức (NT), mỗi NT lặp lại 3 lần:

- NT 1: Thí nghiệm điều trị với các nồng độ bacteriocin khác nhau từ 10 ml/1kg thức ăn NT1.1 , 20 ml/1kg thức ăn NT1.2 , 30 ml/1kg thức ăn (NT1.3) và 40 ml/1kg thức ăn (NT1.4): Cá được gây cảm nhiễm vào ngày 0

và được cho ăn thức ăn trộn với bacteriocin từ ngà đầu tiên có biểu hiện bệnh lý (từ 48 giờ sau khi tiêm vi khuẩn và cho ăn liên tục trong 5 ngày

- NT 2: đối chứng 1 ĐC dương : Cá được gây cảm nhiễm vào ngà 0 và được cho ăn thức ăn kh ng trộn bacteriocin

- NT 3 đối chứng 2: Cá được tiêm dung dịch 0.85% NaCl vào ngà 0 và được cho ăn thức ăn kh ng trộn bacteriocin

- NT 4 đối chứng 3: Cá kh ng được gây cảm nhiễm vào ngà 0 và được cho ăn thức ăn kh ng trộn bacteriocin

Trong quá trình thí nghiệm pH, DO, NH3/NH4+ và NO2- và nhiệt độ được ghi nhận hàng ngày vào hai buổi sáng (lúc 5 - 6 giờ) và chiều (lúc 14 – 16 giờ) Số lượng và tỷ

lệ cá chết hoặc sắp chết cũng được ghi nhận mỗi ngày

13

Cá bệnh được mổ khám và quan sát bệnh tích, phân lập, định danh vi khuẩn E

ictaluri bằng Kit API20E Tất cả cá còn sống sau thí nghiệm cũng được phân lập vi

khuẩn xác nhận tình trạng nhiễm khuẩn Thời gian thí nghiệm là 14 ngày

Thí nghiệm cảm nhiễm và điều trị bệnh do vi khuẩn E ictaluri trong vèo tại ao

nuôi:

Trước khi bố trí thí nghiệm ao được dọn sạch c , sử dụng zeolite với liều lượng 1,5

kg cho 100 m2 để xử l đá áo Sau đ , cấp nước vào ao và kiểm tra các chỉ tiêu môi trường như ox h a tan, nhiệt độ, pH, NO2-

và NH3/NH4+ Các yếu tố m i trường ổn định và phù hợp thì tiến hành căn v o và bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm điều trị được tiến hành trên 2 ao có diện tích khoảng 2500 – 3000m2, mỗi

Thí nghiệm được tiến hành với hai nghiệm thức Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần

(3 vèo) Các nghiệm thức được cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri với mật số 6,8x 107

CFU/mL bằng cách trộn vi khuẩn vào thức ăn

- NT 1: Nghiệm thức đối chứng cho cá ăn thức ăn kh ng c trộn bacteriocin

- NT 2: Nghiệm thức cho cá ăn thức ăn c trộn bacteriocin (sử dụng nồng độ bacteriocin điều trị hiệu quả nhất ở trại thực nghiệm)

Thí nghiệm điều trị bắt đầu từ ngà đầu tiên cá có biểu hiện bệnh l và được chẩn đoán là bệnh gan, thận mủ Thời gian điều trị 10 ngày

Trong quá tr nh điều trị, kiểm tra hằng ngày các chỉ tiêu oxy hòa tan, pH, NH3/NH4+

và NO2- và nhiệt độ nước Mỗi ngày kiểm tra 2 lần vào 5 - 6 giờ sáng và 14 - 16 giờ chiều

Tỉ lệ cá chết trong 10 ngày kể từ ngà đầu tiên sử dụng bacteriocin điều trị được ghi nhận Cá bệnh được thu để mổ khám và quan sát bệnh tích cũng như phân lập xác

định cá nhiễm vi khuẩn E ictaluri Khi kết thúc thí nghiệm, thu 10 con cá/NT còn

sống phân lập vi khuẩn xác nhận tình trạng nhiễm khuẩn E ictaluri

3.3 CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU

Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, đĩa petri, ống nghiệm, que cấ , đ n cồn, que trãi thủy tinh, cốc thủy tinh, micropipet, chai nấu m i trường, thùng nhựa 160L, vèo, dây sục khí… Thiết bị: Kính hiển vi, tủ cấy, tủ sấy, nồi thanh trùng, tủ ủ, máy li tâm …

Hóa chất và môi trường: Cồn 70o , TSA (Tryptic Soy Agar), NaCl, m i trường l ng

BHI Brain Heart Infusion ,…

14

3.4 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU

Sử dụng phần mềm microsoft word và excel để viết báo cáo và tính hiệu quả điều trị bệnh Đồng thời, sử dụng kiểm định T- Test và Ducan để so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức

Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ sinh tồn tương đối (relative survival rate – RPS) Giá trị RPS (%) theo công thức (Ellis, 1998):

RPS (%) = [1 - (% cá chết ở nghiệm thức sử dụng bacteriocin /% cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương ] x 100

15

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trong quá trình thực hiện nhiệm vụ khoa học, nhóm tác giả đã c một số tha đổi về nội dung thực hiện đã được sự đồng ý của Chủ tịch Hội đồng Khoa học Trường Đại học An Giang và Sở Khoa học và Công nghệ An Giang Nội dung nghiên cứu được giảm phần thực hiện kháng sinh đồ của thuốc kháng sinh flophenicol đối với vi

khuẩn E ictaluri trong phòng thí nghiệm và thực hiện điều trị ngoài ao như đề cương

đã được duyệt Tuy nhiên, các kết quả thu được cũng như sự tha đổi một số nội dung này không ảnh hưởng đến kết quả của nghiên cứu vì nhóm tác giả đã tham khảo, trích dẫn được những kết quả của các nghiên cứu khác c liên quan để là cơ sở biện luận thay thế cho nội dung được tha đổi

3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN E.ictaluri GÂY BỆNH GAN, THẬN MỦ

TRÊN CÁ TRA GIỐNG

Kết quả phân lập 25 mẫu, trong đ bao gồm 10 mẫu cá bệnh có biểu hiện bệnh l đặc trưng, 10 mẫu cá chưa biểu hiện bệnh l đặc trưng nhưng thận sưng rất to và 5 mẫu

cá kh e Kết quả của những mẫu cá kh e có những đặc điểm như màu sắc tươi sáng, đồng đều, vây và da không bị tổn thương, các nội quan gan, thận, tỳ tạng không có những đốm trắng giống như bệnh gan, thận mủ và xoang bụng không có dịch vàng

(Hình 1A) không phân lập được vi khuẩn E ictaluri Ngược lại, những mẫu cá bệnh

có dấu hiệu bất thường bên ngoài như xuất huyết những đốm li ti trên da, đầu và vùng bụng, cá gầ , bơi lội không linh hoạt Sau khi giải phẩu và quan sát thấy rằng xoang bụng có dịch vàng, dạ dà đầ hơi, gan c màu sắc nhợt nhạt, thận sưng to và những mẫu cá có biểu hiện bệnh l đặc trưng như c nhiều đốm trắng nh trên gan,

thận và tỳ tạng (Hình 1B, mũi tên đen) thì phân lập và định danh được vi khuẩn E

ictaluri

16

Hình 1: Dấu hiệu bệnh lý bên ngoài (A) và bên trong của cá Tra bệnh gan, thận

mủ (B); Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn E ictaluri (C).; Hình dạng khuẩn lạc

Hình 2: Kết quả định danh vi khuẩn E.ictaluri bằng phương pháp API 20E

Ghi chú: (-) âm ín ; (+) dương ín ; ONPG g l os d s ; ADH g n n decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; UREA: ure; IND: indole; VP: phản ứng voges- proskauer; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; ARA: arabinose; SAC: sucrose; O/F

18

Qua kết quả kiểm tra các đặc điểm về màu sắc khuẩn lạc, hình dạng vi khuẩn và chỉ

tiêu sinh l và sinh h a của vi khuẩn E.ictaluri ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng

bằng bộ kít API 20E Bảng 1 cho thấ rằng những đặc điểm của vi khuẩn rất tương

đồng và giống với vi khuẩn E.ictaluri, là vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục (Hình

1C), gram âm, h nh que ngắn (Hình 1D), c khả năng di động, phát triển trên môi trường sau 48 giờ nuôi cấy, cho kết quả dương tính ở phản ứng catalase và glucose,

c khả năng lên men và oxi h a đường trong điều kiện hiếu khí và k khí O/F , c khả năng thủ phân l sine LDC và cho kết quả âm tính ở các phản ứng c n lại Ngoài ra, kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải mã trình tự AND cũng được thực hiện (Phụ lục) Kết quả định danh này nhằm hổ trợ cho kết quả định danh bằng phương pháp API 20E, xác định chính xác tác nhân gây bệnh gan, thận mủ là vi

khuẩn E ictaluri

Kết quả nà cũng được ghi nhận bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Ngu ễn Trúc Phương (2010) Đồng thời, theo kết quả nghiên cứu của Đồng Thanh Hà 2009 về đặc điểm

h nh thái, các chỉ tiêu sinh l và sinh h a của vi khuẩn E ictaluri cũng được ghi

nhận rằng vi khuẩn phát triển trong 48 giờ nu i cấ trên m i trường TSA, khuẩn lạc

c đường kính 1-2 mm, có màu trắng hơi đục, rìa bằng, hơi lồi Đâ là dạng vi khuẩn gram âm, hình que, thon mảnh, tr n hai đầu, kích thước biến thiên từ 1-65 m Ngoài ra, kết quả định danh bằng kít API 20E cũng cho kết quả tương đồng với kết

quả nà Thêm vào đ , theo Từ Thanh Dung 2005 cũng cho rằng vi khuẩn E

ictaluri là vi khuẩn Gram âm, có dạng que, mảnh và c kích thước biến đổi

(0,75x1,5-2,5µm), phát triển tốt ở 26-28 oC, di động yếu hoăc kh ng di động khi nhiệt độ lớn hơn 30 oC Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E cũng thấ rằng vi

khuẩn E ictaluri lên men trong m i trường O/F glucose, phản ứng catalase dương

tính, phản ứng cytochrome oxidase âm tính Nh n chung, các đặc điểm sinh hoá của

vi khuẩn E ictaluri cho hầu hết các phản ứng âm tính, chỉ có 2 phản ứng dương

tính là LDC (Lysine) và GLU (Glusose) Theo Ferguson et al., (2001 và Crumlish et

al.,( 2002), vi khuẩn E ictaluri là tác nhân chính gây ra bênh gan thận mủ và

gâ bệnh chủ yếu ở cá da trơn nu i thâm canh trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2017

3.2 KẾT QUẢ KIỂM TRA KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA

BACTERIOCIN ĐỐI VỚI VI KHUẨN E ictaluri GÂY BỆNH GAN, THẬN

MỦ TRÊN CÁ TRA GIỐNG

Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi khuẩn E ictaluri

bằng phương pháp kháng sinh đồ để xác định đường kính v ng v trùng được thể hiện cụ thể trong Bảng 2

19

Bảng 2 Đường kính v ng vô trùng của bacteriocin đối với vi khuẩn E.ictaluri

trong ph ng thí nghiệm

Cơ quan Thể tích

Đường kính

TB (mm)

Độ lệch

Qua kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của bacteriocin ở các thể tích khác

nhau từ 20 µL, 30 µL, 40 µL, 50 µL và 60 L đối với vi khuẩn E ictaluri trong

phòng thí nghiệm Bảng 2 cho thấy rằng bacteriocin đều c khả năng tạo v ng kháng khuẩn ở thể tích thử nghiệm với đường kính trung bình v ng v trùng tương ứng 8,57 mm ± 0,55 ; 17,87 mm ± 0,95; 18,17 mm ± 0,98; 20,20 mm ± 0,35 và 22,97 mm ± 1,15 Trong khi đ , ở giếng đối chứng được bơm nước muối sinh l th

kh ng tạo v ng v khuẩn xung quanh giếng mũi tên đen H nh 3)

Hình 3: Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của bacteriocin đối với vi

khuẩn E.ictaluri (A) Phương pháp xác định đường kính v ng vô khuẩn (B)

Theo kết quả phân tích và đánh giá của Lê uân Thành và cs 2002 đã kết luận:

đường kính vòng vô khuẩn nh hơn 12 mm, được gọi là có tính kháng (R) hay nếu đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 12 mm, được gọi là mẫn cảm (S); mẫn cảm trung bình đường kính vòng vô khuẩn từ 12 - 20 mm; mẫn cảm cao c đường kính vòng vô khuẩn lớn hơn 20mm Như vậ , qua kết quả thử nghiệm trên cho thấ sản phẩm bacteriocin ha microcin c khả năng kháng khuẩn từ 30 - 60 L, trong đ thể tích

microcin mẩn cảm cao đối với vi khuẩn E ictaluri ở 2 thể tích 50 L và 60 L; mẩn

cảm trung b nh ở 2 thể tích 30 L và 40 L Đồng thời, kết quả thử nghiệm nà cũng tương đồng với kết quả thử kháng sinh đồ của một số vi khuẩn gây bệnh ở nước ngọt

và nước lợ cho thấy ở các lượng microcin thử từ 10 - 60 l đều có tác dụng hạn chế

vi khuẩn phát triển với đường kính các vòng vô khuẩn đều lớn hơn 12 mm, microcin

có tác dụng mẫn cảm cao với 2 vi khuẩn Edwardsiella tarda và Streptococcus sp khi