Thu thập phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối nấm hirsutella citriformis ký sinh trên rầy nâu tại bốn huyện chợ mới thoại sơn châu phú và tri tôn an giang

Kết quả đã thu thập được 180 mẫu rầy bị nhiễm nấm có triệu chứng của nấm Hirsutella, trong đó đã phân lập và định danh được 41 dòng Hirsutella citriformis.. Bên cạnh đó, loài nấm Hirsute

TÓM LƯỢC

Quá trình thu mẫu rầy bị nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis được

thực hiện tại 12 xã thuộc bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú, Tri Tôn tỉnh

An Giang Kết quả đã thu thập được 180 mẫu rầy bị nhiễm nấm có triệu chứng của

nấm Hirsutella, trong đó đã phân lập và định danh được 41 dòng Hirsutella citriformis

Năm dòng nấm có hiệu quả cao đối với rầy nâu HiLK-CM 3,HiMHĐ-CM 1,HiVP-

TS 5,HiBM- CP 2,và HiTĐ- TT 4, được thực hiện trong phòng thí nghiệm để chọn ra các dòng nấm có hiệu quả cao nhất.Hiệu lực (%) đối với rầy nâu của năm dòng nấm được chọn ra vào thời điểm 12 ngày sau khi cấy lần lượt là 63,30; 60,47; 67,60; 61,57 và 60,20%

Đường kính khuẩn lạc đo được cao nhất thể hiện ở môi trường YDA, với đường kính lớn nhất vào thời điểm 12 ngày sau khi cấy của 5 dòng nấm HiLK-CM 3,

HiMHĐ-CM 1,HiVP- TS 5,HiBMCP 2,và HiTĐ- TT 4 lần lượt là 7,6; 8,6; 8,2; 8,6 và 8,0 cm

Môi trường YDA có số lượng bào tử trên ml là cao nhất, vượt trội hơn so với 4 môi trường MA, MYA, PDA, PDAY Môi trường YDA tạo được mật số với

5 dòng nấm HiLK-CM 3,HiMHĐ-CM 1,HiVP- TS 5,HiBM- CP 2,và HiTĐ- TT 4 lần lượt là 59,08 x105 bào tử/ml; 6,23 x105 bào tử/ml; 11,43 x105 bào tử/ml; 7,98 x105 bào tử/ml; 29,75 x105 bào tử/ml

Mục lục

Mục lục i

MỞ ĐẦU 1

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

I MỤC TIÊU 2

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

I ĐỐI TƯỢNG 2

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

C CƠ SỞ LÝ LUẬN, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3 I CƠ SỞ LÝ LUẬN 3

1 Đặc điểm phân loại, sự phát triển và hình thái học của nấm Hirsutella citriformis.3 1.1 Phân loại 3

1.2 Sự phân bố 3

1.3 Sự phát triển của nấm trên rầy nâu 3

1.3 Đặc điểm hình thái 3

2 Khả năng biến đổi các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme 4

3 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng 4

4 Phương thức lây nhiễm 5

5 Các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Hirsutella citriformis 5

5.1 Chất dinh dưỡng 5

5.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 5

5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 5

5.4 Ảnh hưởng của ẩm độ 5

5.5 Ánh sáng 6

6 Thành tựu và ứng dụng nấm Hirsutella citriformis 6

7 Mô tả triệu chứng rầy nhiễm nấm 6

II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

1 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị 9

2 Phương pháp 9

2.1 Thu thập các dòng nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên rầy nâu tại bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn 9

2.2 Phân lập và tách ròng các dòng nấm Hirsutella citriformis trên đĩa pêtri trong môi trường PDA

2.3 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với rầy nâu trong điều kiện phòng thí nghiệm 12

2.4 Khảo sát ảnh hưởng của năm loại môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty và sự hình thành bào tử của nấm Hirsutella citriformis 13

2.4.1 Chuẩn bị các khuẩn ty nấm nấm Hirsutella citriformis 13

2.4.2 Bố trí thí nghiệm 13

2.4.3 Chỉ tiêu đánh giá 14

2.4.4 Xử lý số liệu 15

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

1 Thu thập, phân lập các dòng nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên rầy nâu tại bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn 16

2 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với rầy nâu trong điều kiện phòng thí nghiệm

3 Khảo sát ảnh hưởng của năm môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY

và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty và sự hình thành bào tử của 5 dòng

nấm Hirsutella citriformis 26

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của năm môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty của 5 dòng nấm Hirsutella citriformis 26

3.1.1 Khả năng sinh trưởng của khuẩn ty nấm HiLK-CM 3 trên 5 môi trường dinh dưỡng 26

3.1.2 Khả năng sinh trưởng của khuẩn ty nấm HiMHĐ-CM 1 trên 5 môi trường dinh dưỡng 27

3.1.3 Khả năng sinh trưởng của khuẩn ty nấm HiVP- TS 5 trên 5 môi trường dinh dưỡng 28

3.1.4 Khả năng sinh trưởng của khuẩn ty nấm HiBM-CP 2 trên 5 môi trường dinh dưỡng 29

3.1.5 Khả năng sinh trưởng của khuẩn ty nấm HiTĐ-TT 4 trên 5 môi trường dinh dưỡng 30

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của năm môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên sự hình thành bào tử của 5 dòng nấm Hirsutella citriformis 31

3.2.1 Khả năng sinh bào tử của HiLK-CM 3 trên 5 loại môi trường thử nghiệm 31

3.2.2 Khả năng sinh bào tử của HiMHĐ-CM 1 trên 5 loại môi trường thử nghiệm 32

3.2.3 Khả năng sinh bào tử của HiVP- TS 5 trên 5 loại môi trường thử nghiệm 33

3.2.4 Khả năng sinh bào tử của HiBM- CP 2 trên 5 loại môi trường thử nghiệm 34

3.2.5 Khả năng sinh bào tử của HiTĐ-TT 4 trên 5 loại môi trường thử nghiệm 35

CHƯƠNG IV 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

4.1 Kết luận 37

4.2 Đề nghị 37

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường 15

Bảng 2 Số mẫu rầy nâu bị nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis thu thập được

từ bốn huyện trong tỉnh An Giang, tháng 05 - 07 năm 2012 16 Bảng 3 Danh sách số dòng nấm phân lập được tại 12 xã của 4 huyện, tỉnh An

Giang ký sinh lên rầy nâu trên các giống lúa (ký chủ) khác nhau 20 Bảng 4 Hiệu lực (%) của các dòng nấm đối với rầy nâu trong điều kiện phòng thí

nghiệm 24 Bảng 5 Danh sách mười dòng nấm có hiệu quả cao được chọn qua thí nghiệm

trong phòng, được trữ mẫu để tiếp tục thí nghiệm sau 26 Bảng 6 Đường kính khuẩn lạc của nấm HiLK-CM 3 sau khi cấy 4, 6, 8, 10 và 12

ngày 26 Bảng 7 Đường kính khuẩn lạc của nấm HiMHĐ-CM 1 vào thời điểm 4, 6, 8, 10 và 12

ngày sau khi cấy 27 Bảng 8 Đường kính khuẩn lạc của nấm HiVP- TS 5 vào thời điểm 4, 6, 8, 10 và 12

ngày sau khi cấy 28 Bảng 9 Đường kính khuẩn lạc của nấm HiBM-CP 2 sau khi cấy 4, 6, 8, 10 và 12 ngày29 Bảng 10 Đường kính khuẩn lạc của nấm HiTĐ-TT 4 sau khi cấy 4, 6, 8, 10 và 12

ngày 30 Bảng 11 Số lượng bào tử của nấm HiLK-CM 3 trên mỗi đĩa pêtri sau khi cấy 7, 9, 11

và 13 ngày 31 Bảng 12 Số lượng bào tử của HiMHĐ-CM 1 trên mỗi đĩa pêtri sau khi cấy 7, 9, 11 và

13 ngày 32 Bảng 13 Số lượng bào tử của nấm HiVP- TS 5 trên mỗi đĩa pêtri sau khi cấy 7, 9, 11

và 13 ngày 33 Bảng 14 Số lượng bào tử của nấm HiBM- CP 2 trên mỗi đĩa pêtri sau khi cấy 7, 9, 11

và 13 ngày 34 Bảng 15 Số lượng bào tử của nấm HiTĐ-TT 4 trên mỗi đĩa pêtri sau khi cấy 7, 9, 11

và 13 ngày 36

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Nấm Hirsutella citriformis ký sinh trên rầy nâu ngoài tự nhiên 4

Hình 2 Nấm Hirsutella citriformis giai đoạn đầu nhiễm vào rầy khoảng 8 ngày có màu trắng đục (Rombach MC ctv , 1994, Humber RA, 1997) 7

Hình 3 Nấm Hirsutella citriformis giai đoạn sau có màu nâu đất (Rombach MC ctv., 1994) 7

Hình 4 Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture (Harris, J L, 1986) 11

Hình 7 Phương pháp cấy ria (cấy truyền liên tục) 11

Hình 8 Cách cấy khuẩn ty nấm Hirsutella citriformis trên đĩa pêtri 14

Hình 9 Mẫu rầy nâu nhiễm nấm được thu trực tiếp từ ruộng lúa 17

Hình 10 Mẫu rầy nâu nhiễm nấm Hirsutella citriformis ở ngoài đồng trên giống lúa IR50404 tại xã Long Điền A, huyện Chợ Mới 17

Hình 11 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Long Điền A, Chợ Mới (code HiLĐa-CM2) 17

Hình 12 Thu mẫu rầy nâu nhiễm nấm Hirsutella citriformis tại xã Vọng Đông, huyện Tri Tôn 18

Hình 13 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Tân Tuyến, Tri Tôn (code HiVĐ- TS 4) 18

Hình 14 Ruộng thu mẫu rầy nâu nhiễm nấm Hirsutella citriformis tại xã Mỹ Phú, huyện Châu Phú 18

Hình 15 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại xã Mỹ Phú, huyện Châu Phú (code HiMP- CP 2) 18

Hình 16 Ruộng thu mẫu rầy nâu tại Tân Tuyến, Thoại Sơn 19

Hình 17 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Tân Tuyến, Tri Tôn (code HiTT-TS 1) 19

Hình 18 Dạng cành bào đài của nấm Hirsutella citriformis 19

Hình 19 Bào tử nấm Hirsutella citriformis dưới KHV 40X 19

Hình 20 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Long Kiến, Chợ Mới (mặt trên và mặt dưới) 22

Hình 21 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Vĩnh Phú, Thoại Sơn (mặt trên và mặt dưới) 22

Hình 22 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Bình Mỹ, Châu Phú 22

Hình 23 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Tà Đảnh, Tri Tôn (mặt trên và mặt dưới) 23

Hình 24 Một số dòng nấm Hirsutella citriformis (mặt trên và dưới) 23

PDA Potato Dextrose agar

PDAY Potato Dextrose agar Yeast

CHƯƠNG I

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, quan điểm chiến lược bảo vệ cây trồng trên thế giới, đặc biệt là trong nước, đã được chuyển dần sang biện pháp sinh học và biện pháp quản lý côn trùng phối hợp với biện pháp hóa học để tạo ra nông sản an toàn hơn, thân thiện với môi trường Nhiều nghiên cứu về nấm ký sinh côn trùng trên cây trồng, đặc biệt là cây lúa đã được ứng dụng bước đầu vào sản xuất, ví dụ như

nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp Bên cạnh đó, loài nấm Hirsutella citriformis là nấm ký sinh trên côn trùng, đặc biệt là

rầy nâu, đã được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi tại nhiều nước trên thế giới như Úc,

Mỹ, Anh, Thái Lan,…

Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập

được các dòng nấm ký sinh Metarhizium, Beauveria trên rầy nâu hại lúa, châu chấu

hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long cũng sử dụng các dòng nấm này trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày, góp phần vào việc quản lý côn trùng gây hại, giảm lượng thuốc trừ sâu hóa học đang được báo động

như hiện nay Gần đây, cũng có một vài nghiên cứu ứng dụng nấm Hirsutella citriformis trong phòng trừ côn trùng gây hại cây trồng tại Viện Bảo vệ Thực vật

Do vậy, cần có nhiều nghiên cứu về việc thu thập, phân lập, chọn môi trường nhân

sinh khối thích hợp đối với nấm Hirsutella citriformis trên rầy nâu, tạo các bước chuẩn bị để sản xuất chế phẩm trừ rầy vi sinh Đề tài “Thu thập, phân lập và chọn môi trường nhân sinh khối nấm Hirsutella citriformis ký sinh trên rầy nâu tại bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn, An Giang” được thực hiện

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Thu thập các dòng nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên rầy

nâu tại các huyện trồng lúa có diện tích lớn ở tỉnh An Giang như Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn

2 Phân lập và tách ròng các dòng nấm này trên đĩa pêtri trong môi trường chuẩn PDA

3 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với rầy nâu trong điều kiện phòng thí nghiệm

4 Khảo sát ảnh hưởng của năm loại môi trường dinh dưỡng MA, MAY,

PDA, PDAY và YDA lên sự hình thành và phát triển bào tử của nấm Hirsutella citriformis để chọn ra những dòng nấm có hiệu quả cao, phục vụ cho việc lưu trữ

nguồn nấm và nghiên cứu chọn môi trường nhân sinh khối thích hợp

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG

Nấm ký sinh côn trùng Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên rầy nâu

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nguồn nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên rầy nâu tại 4 huyện

Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú, Tri Tôn

Phân lập nấm trong môi trường PDA, sau đó so sánh sự hình thành và phát triển bào tử nấm với năm loại môi trường MA, MAY, PDA, PDAY và YDA trong đĩa pêtri

Hiệu lực diệt rầy của các dòng nấm phân lập được trong phòng thí nghiệm với môi trường PDA

Theo Trần Văn Mão (2002), nấm Hirsutella thuộc ngành phụ lớp nấm bất

toàn (Deuteromycotina), họ cuống bó (Stilbaceae), lớp Nấm bào tử sợi trần

1.2 Sự phân bố

Nấm Hirsutella citriformis phân bố ở Châu Phi, Châu Á, New Zealand,

Hawaii, đảo Solomon

Nấm Hirsutella citriformis phân tán rộng rãi trên các cánh đồng trồng lúa

trong khu vực Châu Á, là một nguyên nhân gây tử vong cao đối với rầy nâu qua các thời kỳ phát triển của rầy Loại nấm này có lúc đã nhiễm đến 90-95% rầy nâu trên ruộng lúa (Hodge, 2008)

1.3 Sự phát triển của nấm trên rầy nâu

Các tua của nấm Hirsutella citriformis mọc trên rầy nâu dài và có rất

nhiều, dài khoảng 1-10 mm Tua nấm có màu xám hay nâu, với nhiều nhánh bên dưới ngắn hơn (Hill, 1999) (Hình 1)

1.3 Đặc điểm hình thái

Nấm Hirsutella citriformis bó cuống bào tử đính đơn giản hoặc có nhiều

nhánh ở góc (một số loài thiếu bó cuống bào tử đính); thể bình trong suốt xuất hiện

ở trên bó sợi hoặc từ sợi nấm trên ký chủ, cuống bào tử đính bên dưới phồng lên, dần dần hẹp lại tới dài mảnh khảnh; bào tử đính trong suốt, tế bào dài tới hình ống, bào tử được bao phủ bởi một lớp chất nhầy, ký sinh trên côn trùng (Barnett and Hunter, 1998)

Đặc điểm cơ bản của nấm Hirsutella citriformis là sợi nấm xếp thành bó,

cuống bào tử mọc bên bó sợi, phía trên và dưới phình to, cuống không màu Bào tử mọc đơn trên cuống, đơn bào hình thoi hơi uống cong, có dịch nhầy che phủ (Trần Văn Mão, 2002)

Ngoài ra, nấm Hirsutella uncinata có cuống bào tử đính dài từ 200 – 400

m, các thể bình trong suốt dạng móc (21–36 x 2,5–4,0 µm) Bào tử đính không vách, trong suốt (5,5–7 x 3–4 µm), dạng hình thoi méo (Hodge, 2008) Trong khi

đó, nấm Hirsutella sinensis có bào tử đính dạng thận dài khoảng 14 m (Hodge,

2008)

4

Bào tử nấm Hirsutella citriformis được bao phủ bởi chất dịch nhầy, giúp

nó gắn chặt vào lớp biểu bì của vật chủ Bào tử nảy mầm và có thể thâm nhập vào những bộ phận của cơ thể, sự thâm nhập thông thường nhất là qua chân vật chủ

(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Hirsutella) Hình 1 Nấm Hirsutella citriformis ký sinh trên rầy nâu ngoài tự nhiên

2 Khả năng biến đổi các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Các enzyme trên mặt ngoài của thành tế bào và ở ngoài tế bào như xenlulase, amylase, lipase và kitinase,…là thành phần cấu tạo những hợp chất hoặc những sản phẩm trao đổi chất của tế bào vi nấm Từ hệ enzyme trên người ta đã phát hiện ra tuyến mỡ và các mô bị hòa tan là do các protease tiết ra trong quá trình nuôi cấy nấm cũng như trong cơ chế gây bệnh côn trùng Thông qua đặc điểm này

có thể phân biệt côn trùng bị bệnh do động vật nguyên sinh hay do nấm bậc thấp gây ra Các nhà khoa học cũng chứng minh được vai trò của hệ enzyme trong quá trình phân hủy các cơ chất hữu cơ ở lớp biểu bì, lớp mô, lớp mỡ, lympho và ruột của côn trùng (Phạm Thị Thùy, 2004)

Các nhà khoa học đã phân lập được một số enzyme có nguồn gốc từ nấm

Hirsutella citriformis như protease, hitinolytic amylase, α-esterase, proteolytic,

elastase, chitinase, chitinase deficiencies (Humber, 1997)

3 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng

Độc tố là một trong những sản phẩm thứ cấp không ổn định, sản phẩm thứ cấp là một loại hợp chất được sinh ra từ các chất trao đổi sơ cấp nhờ quá trình chuyển hóa sinh hóa đặc biệt Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm khi các nguồn thức ăn và năng lượng đã cạn dần (Phạm Thị Thùy, 2004)

Một trong nhiều loại protein của Hirsutella citriformis là Hirsutellin A

(HtA), nó ngăn chặn sự phát triển của tế bào côn trùng và là nguyên nhân làm cho

tế bào trở nên suy dinh dưỡng, phá vỡ các nội quan bên trong tế bào và màng tế bào (Boucias và Pendland, 1998)

4 Phương thức lây nhiễm

Nấm Hirsutella citriformis cần ít nhất 4 giờ để một bào tử có thể xâm

nhập vào lớp biểu bì của vật chủ trong khi thời gian từ sự truyền nhiễm đến hình thành bào tử mới trong vòng 4 ngày ở nhiệt độ từ 25 – 300C (Humber, 1997)

Sau khi nấm xâm nhập vào cơ thể ký chủ và tiêu thụ các mô bên trong, chúng mọc ra bên ngoài tạo thành những sợi dài, lúc đầu màu trắng bẩn rồi chuyển màu Những sợi nấm này sản xuất ra các bào tử phát tán gây bệnh Nấm tiêu diệt

ký chủ bằng cách sử dụng những chất dịch trong con rầy để phát triển Nấm trên rầy xuất hiện phổ biến nhất khi mật độ rầy lên cao Trong thời gian rầy bộc phát, một lượng lớn rầy có thể bị tiêu diệt bởi một bệnh dịch, trong đó toàn bộ sâu hại trên nhiều bụi lúa đã bị nấm tiêu diệt (Humber, 1997)

5 Các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của

nấm Hirsutella citriformis

Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng như hệ sợi nấm côn trùng đó là chất dinh dưỡng, nhiệt độ, ẩm độ, độ pH trong môi trường, cũng như phương pháp nuôi cấy

5.1 Chất dinh dưỡng

Nhu cầu dinh dưỡng của nấm Hirsutella citriformis có thể thay đổi tùy vào

loài và tùy thuộc vào thể phân lập của nó

Trong môi trường nuôi cấy thì sự có mặt của hàm lượng dextrose góp phần cho sự tạo bào tử được dễ dàng và sự hình thành thể sợi nấm được tốt hơn (Humber, 1997)

5.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc (Phạm Thị Thùy, 2004)

5.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ đã được xác định cho sự sinh trưởng của nấm Hirsutella citriformis trong khoảng từ 5 – 400C Nhiệt độ tối hảo là 250C (Hodge, 2008)

Ở mỗi loài nấm khác nhau thì ngưỡng nhiệt độ cũng khác nhau

Bán kính phát triển của khuẩn lạc nấm Hirsutella uncinata sau 4 tuần trên

môi trường CMA: ở 50C là 1 mm, ở 100C là 2 đến 3 mm, ở 150C là 4 đến 5 mm, ở

200C là 8 đến 9 mm, ở 250C là 9 đến 10 mm, nó không phát triển ở 30, 35 hoặc

400C Sự hình thành bào tử xảy ra ở tất cả nhiệt độ mà nấm phát triển được (Hodge, 2008)

Đối với nấm Hirsutella sinensis thì nhiệt độ tối hảo cho sự phát triển là từ

15 – 200C, còn nhiệt độ gây ức chế là 250C (Hodge, 2008)

5.4 Ảnh hưởng của ẩm độ

Bào tử nấm Hirsutella citriformis Có thể phát triển và lây lan trong cả điều

6

5.5 Ánh sáng

Ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong sinh học, nó có liên quan đến sự hình thành bào tử và sự tồn tại của bào tử Nấm ký sinh côn trùng phát triển trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6 – 8 giờ cũng đủ cho nấm ký sinh côn trùng phát triển (Phạm Thị Thùy, 2004)

6 Thành tựu và ứng dụng nấm Hirsutella sp

Ở Mỹ đã sản xuất được chế phẩm nấm ký sinh trên côn trùng (Yasuhisa

Kunimi, 2001) đối với nấm Hirsutella thompsonii, tên thương mại là Mycar, Hãng

sản xuất Abbott, có tác dụng diệt nhện hại cam (Phạm Thị Thùy, 2004)

7 Mô tả triệu chứng rầy nhiễm nấm

- Hirsutella citriformis Speare (Speare A.T., 1920): Sợi nấm mọc dày

đặc trên cơ thể rầy nâu bị nhiễm nấm Sợi nấm lúc đầu có màu trắng, sau biến dần sang màu trắng đục (dirty white) đến màu nâu xám (dark brown) (Cioffarelli Ada

và Maria Teresa Natale, 2000, Casique Valdes R và ctv , 2011) có bề rộng 1,7-3,3

mm Sợi thường kết lại thành bó sợi đơn hoặc bó sợi phân nhánh vuông góc (Bó sợi như các tua nấm nên gọi là “Nấm tua”) Cành bào tử phân sinh mọc quanh bó sợi, một tế bào, trong suốt, thể bình phồng to ở phần gốc, đột ngột hoặc dần dần vuốt hẹp thành cành mảnh dài, ở đỉnh cành hình thành các bào tử phân sinh Bào tử phân sinh một tế bào, hình cầu hay hình que ngắn, trong suốt, có lớp nhầy bao bọc chung quanh, kích thước khoảng 2,1 x 3,3 mm (Van Winkelhoff A J và C W McCoy, 1984)

Hình 2 Nấm Hirsutella citriformis giai đoạn đầu nhiễm vào rầy khoảng 8 ngày có màu trắng đục (Rombach MC ctv , 1994, Humber RA, 1997)

Hình 3 Nấm Hirsutella citriformis giai đoạn sau có màu nâu đất (Rombach

MC ctv., 1994)

Cần phân biệt với nấm

- Entomophthora sp.: Trên bề mặt rầy nâu hình thành lớp nấm trắng mịn, đó

là lớp cành bào nang (Sporangiophore) Cành bào nang hình trụ, không phân nhánh, bề ngang 14-24 mm, dài 60-200 mm, ở đỉnh hình thành các tiểu bào tử nang (Sporagiole) Tiểu bào tử nang hình trứng hoặc hình bầu dục, kích thước 28-45 x 23-35 mm Nấm hình thành bào tử tiếp hợp (Zygospore) trong cơ thể rầy nâu, hình cầu, đường kính 29-46 mm Khi thân rầy chết nứt vỡ, các bào tử này được giải

phóng, phát tán, nảy mầm xâm nhập hình thành cơ thể nấm mới (Guptaa R K ctv.,

8

- Paecilomyces spp.: Sợi nấm có bề rộng 3-5 mm, ban đầu có màu trắng đục

sau chuyển xám nâu đến tím, nấm phát triển chìm trong cơ thể rầy nâu có thể phồng to đến 16 mm Cành bào tử phân sinh nhiều nhánh, nhẵn, mọc trên bề mặt rầy nâu, sợi nấm có bề rộng 3-5 mm, phát triển chìm trong cơ thể rầy nâu có thể phồng to đến 16 mm Cành bào tử phân sinh phân nhiều nhánh, nhẵn, mọc trên bề mặt rầy nâu, kích thước 4-7 x 30-120 mm Ở đỉnh các nhánh có nhiều thể bình mọc thành cụm vòng Thể bình dài 2-7 mm, phần gốc phình to hình ellip, phần cổ hình trụ dài Phần đỉnh thể bình lần lượt kéo dài phân chia thành các bào tử phân sinh một tế bào, hình trứng kích thước 2,5-4,0 x 3,5-5 mm, trong suốt, bề mặt sù sì

nhiều gai nhỏ, kết thành chuỗi hướng từ gốc lên ngọn (Siti Subandiyah và ctv.,

2000, Okolo J C và ctv., 1998)

Nấm Paecilomyces spp các tơ nấm dần chuyển sang màu tím than từ nhạt

đến đậm (khoảng từ 5-7 ngày sau khi cấy, nên còn có tên là nấm tím) Sợi nấm có

bề rộng 3-5 mm, ban đầu có màu trắng đục sau chuyển xám nâu đến tím, nấm phát triển chìm trong cơ thể rầy nâu có thể phồng to đến 16 mm Cành bào tử phân sinh nhiều nhánh, nhẵn, mọc trên bề mặt rầy nâu, sợi nấm có bề rộng 3-5 mm, phát triển chìm trong cơ thể rầy nâu có thể phồng to Rầy nâu chết có tơ nấm màu đen, nâu

nhạt, thậm chí có màu vàng rơm có thể là nấm Paecilomyces spp (Hình 5) Sự đa

dạng về hình thái bên ngoài này cũng từng được Phạm Thị Thùy mô tả năm 2001

khi thu thập, phân lập các dòng nấm Paecilomyces spp ngoài tự nhiên

Chương III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Vật liệu, dụng cụ, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

- Các mẫu rầy nhiễm nấm thu thập được từ 04 huyện Chợ Mới, Thoại Sơn,

Châu Phú, Tri Tôn

- Môi trường nuôi cấy PDA được pha sẵn trong phòng thí nghiệm (cho 1 lít môi trường) gồm:

- Rầy nâu tuổi 3 nuôi cách ly trong mùng lưới, thu rầy thế hệ 2

- Đĩa pêtri, Beaker, bình tam giác, nước cất, cồn 70%, cồn 99%

- Gòn không thấm, gòn thấm, giấy thấm, giấy kissme, kẹp inox, cọ lông, kéo, keo dán, bút lông, bọc nylon,

- Chai thủy tinh, hóa chất để nấu môi trường nuôi cấy nấm

- Ống nghiệm, tube eppendorf

- Đĩa pêtri, micropipet

- Kính hiển vi chụp ảnh, lame đếm, micropipette, máy lắc vortex, cân điện

tử

- Tủ cấy, tủ úm, nồi khử trùng áp suất (autoclave), micropipet, lò viba, đũa cấy,

- Mùng lưới, dây nilon, dây chì, chậu sành,…

- Thước kẹp, nước cất thanh trùng,…

- Hóa chất: KH2PO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, Pepton, Yeast extract, Malt extract,…

- Địa điểm nghiên cứu: phân lập và các thí nghiệm tại Đại học An Giang

2 Phương pháp

2.1 Thu thập các dòng nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên

trên rầy nâu tại bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn

- Chọn điểm thu thập những mẫu rầy: tỉnh An Giang chọn 4 huyện, mỗi huyện chọn 3 xã, nơi có diện tích trồng lúa tương đối lớn, mỗi xã chọn 3 ruộng (diện tích mỗi ruộng từ 3000 m2 trở lên), mỗi ruộng thu ít nhất 05 mẫu rầy bị nhiễm

10

giảm - 3 tăng hoặc 1 phải - 5 giảm, nơi ít sử dụng thuốc trừ sâu sẽ dễ thu mẫu rầy

bị nhiễm nấm ký sinh

- Thu thập được thực hiện trong vụ 3, từ tháng 6 đến tháng 09 năm 2011

05 mẫu/ruộng x 1 loại nấm x 3 ruộng x 3 xã x 4 huyện = 180 mẫu rầy

- Cách lấy mẫu rầy nhiễm nấm: Dùng kẹp đặt các mẫu rầy nhiễm nấm ngoài tự nhiên (quan sát được bằng mắt thường) vào trong tuýp có sẵn bông gòn thấm ướt tạo ẩm độ Ghi nhãn nơi thu thập

Mẫu rầy nâu được mang về phòng thí nghiệm đặt vào trong đĩa pêtri có lót giấy thấm và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho sợi nấm mọc mạnh thì tiến hành chuyển sang môi trường nuôi cấy chuẩn PDA

Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm ngoài tự nhiên: Quan sát bằng mắt thường, nhận diện hình thái bên ngoài nấm trên cơ thể côn

Các loài vi nấm này đều có mặt rất phổ biến trên đồng ruộng Ngoài rầy nâu, chúng còn ký sinh trên nhiều loài côn trùng khác, giữ vai trò quan trọng trong việc điều hòa số lượng côn trùng, bảo đảm sự cân bằng của hệ sinh thái (Phạm Thị Thùy, 2004)

Rầy bị nhiễm nấm có tơ nấm xuất hiện trên cơ thể, nếu nhiễm vi khuẩn thì không có tơ nấm và thường ẩm ướt, có mùi hôi Sâu bị chết do thuốc sâu cũng không có tơ nấm trên thân hoặc màu sắc, hình dạng không đặc trưng

2.2 Phân lập và tách ròng các dòng nấm Hirsutella citriformis trên đĩa

pêtri trong môi trường PDA

Phương pháp phân lập: Mẫu thu về được trữ trong đĩa pêtri có lót giấy thấm và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất hiện tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường PDA Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture (Harris James L., 1986) (Hình 6) để quan sát bào tử và cành bào đài Tiến hành theo các bước sau:

- Chuẩn bị một miếng môi trường Agar đặt trên đĩa pêtri, có diện tích 5

Hình 4 Nuôi cấy nấm theo phương pháp Slide Culture (Harris, J L, 1986)

- Chọn những khuẩn lạc nào phát triển mạnh cấy truyền ra đĩa khác từ 2 đến 3 lần cho nấm mọc thuần Cấy truyền ra đĩa pêtri các mẫu nấm này bằng môi trường PDA Cách làm: dùng que cấy, cấy truyền ra đĩa theo đường zigzac theo

phương pháp cấy ria liên tục (Meyer Jason M và ctv., 2007)

Chấm đầu que cấy vào khuẩn lạc và trượt đều que cấy lên một nửa bề mặt thạch theo một đường zigzac liên tục (Hình 7)

Không đưa que cấy ra khỏi đĩa, không quay bề mặt đầu que cấy, quay đĩa thạch 900 và tiếp tục tạo đường zigzac liên tục như đã làm trên vùng thạch trước

12

- Các mẫu nấm một phần nhân nuôi ra làm thí nghiệm, phần còn lại mang đi trữ nguồn trong các tuýp Glycerol 10% (đã thanh trùng), đặt trong ngăn đá tủ lạnh Nếu đặt ở -40 0C có thể trữ được 2 năm (Smith D., 2002)

- Định danh các mẫu nấm thu được theo hệ thống phân loại nấm ký sinh của Humber RA (2005) và tham khảo kinh nghiệm phân lập nấm ký sinh từ bộ môn Bảo vệ Thực vật, Đại học Cần Thơ

- Quan sát, ghi nhận một số đặc điểm sinh học trong quá trình phân lập như

sự phát triển khuẩn ty của sợi nấm, màu sắc và hình dạng của khuẩn lạc để bước đầu ghi nhận những dòng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối (Casique

Valdes R và ctv., 2011, Trần Văn Mão, 2002)

2.3 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với rầy nâu trong điều kiện phòng thí nghiệm

Trồng nhiều chậu lúa (Jasmine 85) trong chậu để làm nguồn nuôi rầy Trồng mật độ dầy và bón nhiều đạm

Nuôi nhân rầy nâu trong lồng lưới: nuôi rầy nở ra đến tuổi 3, chọn rầy đồng

Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm

Sử dụng các dòng nấm được phân lập và tách ròng từ các mẫu rầy bị ký sinh ngoài tự nhiên, cấy nguồn nấm vào môi trường PDA khoảng 15 ngày cho sợi nấm phát triển và sinh một lượng bào tử nhất định (Cioffarelli Ada và Maria Teresa Natale, 2000) Sau đó tiến hành cạo nấm thu lấy bào tử, đếm mật số bào tử và pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 106 bào tử/ml

Chỉ tiêu

Ghi nhận số rầy sống sau 4, 6, 8, 10 và 12 ngày sau khi xử lý đối với nấm

Mỗi lần lấy chỉ tiêu đều đo nhiệt độ và ẩm độ Tính độ hữu hiệu (%) bằng công thức Abbott (Abbott W.S , 1925)

T: (%) rầy còn sống ở nghiệm thức có xử lý nấm (treatment)

Tổng hợp số liệu bằng Microsoft Excel Số liệu được phân tích thống kê với phần mềm thống kê sinh học MSTATC

2.4 Khảo sát ảnh hưởng của năm loại môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty và sự hình

thành bào tử của nấm Hirsutella citriformis

Khảo sát sự sinh trưởng của khuẩn lạc và khả năng sinh bào tử của nấm

Hirsutella citriformis trên 5 môi trường MA, MYA, PDA, PDAY và YDA Kết quả

được đánh giá bằng đường kính khuẩn lạc (ĐKKL) (cm) ghi nhận vào các thời điểm 4, 6, 8, 10 và 12 ngày sau khi cấy (NSKC) và số lượng bào tử/ml ở các thời điểm 5, 7, 9, 11 và 13 NSKC

2.4.1 Chuẩn bị các khuẩn ty nấm Hirsutella citriformis

Sử dụng các dòng nấm Hirsutella citriformis đã được phân lập và tách ròng

từ các mẫu rầy bị ký sinh ngoài tự nhiên tại phòng thí nghiệm qua thử nghiệm hiệu quả trên rầy nâu Cấy nguồn nấm vào đĩa pêtri có chứa 10 ml môi trường cho sợi nấm phát triển đầy trên đĩa, sau đó dùng dụng cụ đục lỗ với đường kính 10mm, lấy từng khoanh khuẩn ty để chuẩn bị cho thí nghiệm

2.4.2 Bố trí thí nghiệm

Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 05 nghiệm thức tương ứng với 05 loại môi trường MA, MYA, PDA, PDAY và YDA cho mỗi loại nấm và 3 lần lặp lại Mỗi lần lặp lại tương ứng với 5 đĩa pêtri chứa 10ml môi trường thử nghiệm

Ngẫu nhiên hóa sơ đồ bố trí thí nghiệm bằng phần mềm IRRITAT 5.0 (phụ chương 2)

Ở mỗi đĩa, đặt 1 khoanh khuẩn ty nấm Hirsutella citriformis có đường kính

10mm vào giữa đĩa (Hình 8) Sau đó, ủ đĩa pêtri ở điều kiện nhiệt độ phòng, nơi mát, không có ánh sáng trực tiếp, từ 26 - 300C

10mm

Sự phát triển của khuẩn ty theo thời gian: đo ĐKKL vào các thời điểm: 4, 6, 8,

10 và 12 NSKC trên mỗi loại môi trường nuôi cấy

Số lượng bào tử quan sát và đếm được vào các thời điểm: 7, 9, 11 và 13 NSKC Ở mỗi thời điểm cho 10ml nước cất đã thanh trùng vào mỗi đĩa, dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu bào tử, lọc lấy huyền phù nấm, pha loãng huyền phù bằng nước cất đã thanh trùng ở 10-1 rồi đếm mật số bào tử trên lame đếm, xác định số lượng bào tử cho từng nghiệm thức môi trường nuôi cấy

Cách đếm: dùng micropipete hút lấy huyền phù có chứa bào tử nấm, nhỏ vào lame đếm, đậy lamelle lại, đưa vào kính hiển vi để đếm bào tử ở 5 điểm chéo góc

Bảng 1 Tỷ lệ khoáng chất của các loại môi trường

Môi trường Môi

trường

MA

Môi trường MYA

Môi trường PDA

Môi trường PDAY

Môi trường YDA

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Thu thập, phân lập các dòng nấm Hirsutella citriformis ký sinh tự nhiên trên

rầy nâu tại bốn huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn

Qua quá trình đi thu thập các mẫu côn trùng bị nhiễm vi nấm ngoài tự nhiên

trên đồng ruộng, chúng tôi nhận định rằng rầy nâu bị nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis nhiều khi chúng hiện diện ở mật số trung bình đến cao, từ 300 con/m2 hoặc

ở những ruộng ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật như 3G – 3T, 1P – 5G, ít khi tìm được mẫu rầy nhiễm nấm khi chúng có mật số thấp trên ruộng

Một trăm tám mươi mẫu rầy nâu nhiễm nấm thu thập được từ những ruộng lúa của nông dân thuộc 12 xã của 04 huyện Chợ Mới, Thoại Sơn, Châu Phú và Tri Tôn, An Giang Các dòng nấm được mã hóa, ghi nhãn, có chỉ số dưới là tên xã và huyện như ở Bảng 2

Bảng 2 Số mẫu rầy nâu bị nhiễm nấm ký sinh Hirsutella citriformis thu thập được từ

bốn huyện trong tỉnh An Giang, tháng 05 - 07 năm 2012

nhiễm (con) Nhiệt độ / ẩm độ TB

1 Long Kiến Chợ Mới HiLK-CM 15 29,20C / 79,4%

2 Long Điền A Chợ Mới HiLĐa-CM 12 29,40C / 78,5%

3 Mỹ Hội Đông Chợ Mới HiMHĐ-CM 20 28,10C / 82,5%

12 Châu Lăng Tri Tôn HiCL- TT 12 26,60C / 79,6%

Hi: Hirsutella citriformis; Chỉ số dưới của mỗi dòng nấm viết tắt theo tên chữ cái đầu của

xã và huyện ở cột 4

Số mẫu rầy thu được có triệu chứng của nấm Hirsutella citriformis không đều

nhau ở mỗi xã, thấp nhất là 12 mẫu rầy ở xã Long Điền A (Chợ Mới), Bình Mỹ (Châu Phú) và Châu Lăng (Tri Tôn); số mẫu cao nhất thu được ở Mỹ Phú (Châu Phú, 18 mẫu), Vọng Động (Thoại Sơn, 18 mẫu) và Mỹ Hội Đông (Chợ Mới, 20 mẫu) (Bảng 2)

Ngoài tự nhiên, các dòng nấm Hirsutella citriformis đôi khi không tìm được

màu sắc tơ nấm đặc trưng ở giai đoạn cuối mà chỉ thấy tơ nấm có màu trắng không sáng hơi nhạt, các sợi tơ sắp xếp thành khối rất xốp, đôi khi bị nhiễm nấm ký sinh khác thì chúng có màu khaki nhạt, vàng nhạt hoặc màu xanh lục (Hình 9) Các mẫu

rầy có triệu chứng đặc trưng của nấm Hirsutella citriformis thì mới thu mẫu, khi đó,

xác xuất phân lập thành công sẽ cao hơn

Hình 7 Mẫu rầy nâu nhiễm nấm được thu trực tiếp từ ruộng lúa

Nấm Hirsutella citriformis phát triển mạnh ở điều kiện ẩm độ không khí cao

70 – 80%, nhiệt độ trung bình 25-28 0C nên thời gian thu thập mẫu tốt nhất là trước 8h sáng Thời gian thu thập mẫu thích hợp vào buổi sáng, ẩm độ và nhiệt độ thích hợp cho nấm

Hình 8 Mẫu rầy nâu nhiễm nấm Hirsutella

citriformis ở ngoài đồng trên giống lúa

IR50404 tại xã Long Điền A, huyện Chợ

Hình 9 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm

nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Long

Điền A, Chợ Mới (Hi )

Hình 10 Thu mẫu rầy nâu nhiễm nấm

Hirsutella citriformis tại xã Vọng Đông,

huyện Tri Tôn

Hình 11 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm

nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Tân

Tuyến, Tri Tôn (HiVĐ- TS 4)

Hình 12 Ruộng thu mẫu rầy nâu nhiễm

nấm Hirsutella citriformis tại xã Mỹ Phú,

huyện Châu Phú

Hình 13 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm

nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại xã

Mỹ Phú, huyện Châu Phú (HiMP- CP 2)

Hình 14 Ruộng thu mẫu rầy nâu tại Tân

Tuyến, Thoại Sơn

Hình 15 Mẫu rầy nâu đã chết do nhiễm

nấm ký sinh Hirsutella citriformis tại Tân Tuyến, Tri Tôn (HiTT-TS 1)

Hình 16 Dạng cành bào đài của nấm

Hirsutella citriformis

Hình 17 Bào tử nấm Hirsutella citriformis

dưới KHV 40X

* Phân lập và tách ròng các dòng nấm Hirsutella citriformis trên đĩa pêtri

trong môi trường PDA

Các dòng nấm sau khi thu thập được ngoài đồng (trữ trong các tuýp đã chuẩn

bị sẵn, dán nhãn và ghi nơi thu thập, thời gian thu thập) được mang về phòng thí nghiệm để phân lập trong các đĩa pêtri với môi trường nấm PDA

Kết quả phân lập được 41 dòng nấm Hirsutella citriformis (Bảng 3) Hiệu suất

phân lập không cao, khoảng 23%, do dấu hiệu nhận dạng nấm này ngoài tự nhiên ở giai đoạn sớm dễ bị nhầm với nấm khác, nhưng nếu thu ở giai đoạn trễ (có dạng đặc trưng) thì lại dễ bị nhiễm nấm tạp, sợi nấm sinh trưởng yếu Kết quả các dòng nấm cụ thể như sau:

- Huyện Chợ Mới (8 dòng): Long Kiến (HiLK-CM) 3 dòng, Long Điền A (Hi

LĐa Huyện Châu Phú (10 dòng): Bình Mỹ (HiBM- CP) 3 dòng, Đào Hữu Cảnh (HiĐHC- CP) 3 dòng và Mỹ Phú (HiMP- CP) 4 dòng

- Huyện Tri Tôn (10 dòng): Tân Tuyến (HiTT- TT) 2 dòng, Tà Đảnh (HiTĐ- TT) 4 dòng và Châu Lăng (HiCL- TT) 4 dòng

Về giống lúa – ký chủ của rầy nâu: số mẫu rầy nhiễm nấm Hirsutella citriformis được thu thập trên các giống lúa cao sản ngắn ngày chủ lực của tỉnh An

Giang trong vụ Hè Thu 2012 như IR50404, OM2514, OM4218, OM4900, OM5451, OM6976 (Bảng 3)

Bảng 3 Danh sách số dòng nấm phân lập được tại 12 xã của 4 huyện, tỉnh An Giang

ký sinh lên rầy nâu trên các giống lúa (ký chủ) khác nhau

(Giống lúa)

Số dòng nấm phân lập được

2 Long Điền A Chợ Mới HiLĐa-CM 1,2 IR50404 2

3 Mỹ Hội Đông Chợ Mới HiMHĐ-CM 1,2,3 IR50404 3

4 Vĩnh Trạch Thoại Sơn HiVT-TS 1,2,3 OM4900 3

5 Vĩnh Phú Thoại Sơn HiVP- TS 1,2,3,4,5,6 OM2514 6

6 Vọng Đông Thoại Sơn HiVĐ- TS 1,2,3,4 OM4218 4

8 Đào Hữu Cảnh Châu Phú HiĐHC- CP 1,2,3 OM5451 3

12 Châu Lăng Tri Tôn HiCL- TT 1,2,3,4 OM2514 4

Ghi chú: Hi: Hirsutella citriformis Các chữ ở chỉ số dưới được đặt tên viết tắt theo chữ cái đầu của xã – huyện nơi thu thập mẫu Số dòng nấm phân lập được trong cùng một xã

có cùng ký hiệu thì được đánh số khác nhau

Khoảng 3-4 ngày đầu các sợi tơ nấm đều có màu trắng nhạt nên nếu không

quan sát kỹ có thể nhầm lẫn với nấm Paecilomyces hoặc Entomophthora Những mô

tả về đặc điểm hai nấm ký sinh này đã được mô tả ở phần cơ sở lý luận

 Đặc điểm của các dòng nấm Hirsutella citriformis tại các địa phương

HiVP- TS 5

- Tơ nấm màu trắng và phát triển dày hơn nấm Hirsutella citriformis ở Chợ

Mới, bề mặt không có khía và không có những chấm màu vàng

- Mặt đáy có màu vàng cam nhạt hơn nấm Hirsutella citriformis ở Chợ Mới và các khía xoay xung quanh khoanh khuẩn lạc, nhưng không đều như nấm Hirsutella citriformis ở Chợ Mới và các khía cũng nhỏ hơn nhưng kéo dài hơn

HiBM- CP 2 và HiTĐ- TT 4

- Tơ nấm màu trắng, bề mặt nấm phát triển giống với nấm HiVP- TS 5

- Mặt đáy có màu vàng cam nhạt hơn nấm HiLK-CM 3, nhưng đậm hơn HiVP-TS 5, các khía nhỏ và xoay đều khoanh khuẩn lạc, các khía kéo dài khoảng 2/3 đường kính của khuẩn lạc nấm (Hình 21-23)

Nấm Hirsutella citriformis sau khi cấy 3-4 ngày bắt đầu phát triển Ban đầu

những sợi tơ nấm mọc theo các đường cấy, sợi tơ nấm ngắn có màu trắng nhạt nên dễ

nhầm lẫn với loại nấm Beauveria bassiana Tuy nhiên, nấm Hirsutella citriformis

ngoài tự nhiên tương đối khó tìm hơn với màu sắc đặc trưng Giai đoạn sau khi nấm tấn công vào cơ thể côn trùng, các sợi nấm nẩy chồi và bao phủ cơ thể côn trùng thì các loại nấm có màu sắc, hình dạng đặc trưng

Khoảng 7-10 ngày sau khi cấy mặt trên đĩa pêtri xuất hiện những sợi nấm màu trắng dài, khá mịn và lan tỏa ra khắp mặt đĩa, mặt dưới đĩa có màu vàng cam nhạt, bào

tử đơn bào, hình que ngắn, cành bào tử mảnh dài

Sau khi cấy nấm được 12-15 ngày những sợi tơ nấm mọc dài và dày hơn những ngày trước Mặt trên đĩa pêtri bao phủ bởi 1 lớp màu trắng mịn, mặt dưới đĩa

có màu vàng cam Bào tử đơn bào, có hình que ngắn phát triển dày đặc hơn so với nấm ở giai đoạn 9 ngày, thể bào tử trong suốt, cành bào tử mảnh dài

Hình dạng, màu sắc, đặc điểm của khuẩn ty sợi nấm ở mặt trên và mặt dưới

các đĩa pêtri của các dòng nấm Hirsutella citriformis phân lập được mô tả giống với

tài liệu định danh của các tác giả Trần Văn Mão (2002), Phạm Thị Thùy (2004) và Harris James L (1986)

Hình 18 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Long Kiến, Chợ Mới (mặt

Hình 21 Nấm Hirsutella citriformis phân lập được ở xã Tà Đảnh, Tri Tôn (mặt

trên và mặt dưới)

Hình 22 Một số dòng nấm Hirsutella citriformis (mặt trên và dưới)

Hình 23 Nấm nguồn Hình 24 Pha loãng huyền phù nấm, chuẩn

2 Khảo sát hiệu lực của các dòng nấm đã phân lập được đối với rầy nâu

trong điều kiện phòng thí nghiệm

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4 cho thấy, các dòng nấm đều tăng hiệu quả dần từ

4 ngày sau khi cấy (NSKC) đến 8 NSKC và 10 NSKC, đạt cao nhất ở 12 NSKC, khác

biệt có ý nghĩa thống kê với nghiệm thức đối chứng qua phép thử Duncan ở mức ý

nghĩa 5% Vào 4 NSKC, hầu hết các nghiệm thức đều đạt hiệu quả rất thấp, từ 8,4%

4 HiLĐa-CM 1 22,0 i-n 22,0 i-m 33,2 g-m 54,13 b-e 54,20 b-g

5 HiLĐa-CM 2 38,1 a-f 38,1 g-j 39,1 e-i 51,57 c-h 38,27 klm

13 HiVP- TS 2 23,5 i-n 23,5 b-e 40,4 d-h 51,50 c-h 59,93 abc

14 HiVP- TS 3 35,8 a-h 35,8 i-m 35,3 f-k 50,07 d-i 45,57 h-k

28 HiMP- CP 1 44,5 abc 44,5 a-d 49,7 b 52,27 c-g 56,50 a-f

29 HiMP- CP 2 28,9 f-j 28,9 b-e 46,3 b-e 48,90 e-j 57,60 a-e

38 HiCL- TT 1 37,7 a-g 37,7 cde 38,6 e-i 39,93 k-n 43,23 h-l

39 HiCL- TT 2 44,2 a-d 44,2 a 60,7 a 54,77 b-e 58,80 a-d

Trong cùng một cột, các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt ở mức ý

nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN

Các chữ ở chỉ số dưới được đặt tên viết tắt theo chữ cái đầu của xã – huyện thu thập mẫu

Số dòng nấm phân lập được trong cùng một xã thì được đánh số thứ tự khác nhau

Ký hiệu chữ theo sau số được lấy 3 chữ số trong kết quả ANOVA, nếu dài hơn 3 chữ số thì

lấy chữ đầu và chữ cuối

Kết quả thử hiệu lực diệt rầy nâu của các dòng nấm phân lập được ở Bảng 4

cho thấy rằng, những dòng nấm có hiệu lực sớm, mạnh và ổn định được chọn ra 05

dòng để thử nghiệm trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo là các dòng có số thứ tự 3,

Bảng 5 Danh sách năm dòng nấm có hiệu quả cao được chọn qua thí nghiệm trong phòng, được trữ mẫu để tiếp tục thí nghiệm sau

(giống lúa)

STT dòng nấm được mã hóa ở cùng xã

Ghi chú: Hi: Hirsutella citriformis

Các chữ ở chỉ số dưới được đặt tên viết tắt theo chữ cái đầu của xã – huyện thu thập mẫu

Số dòng nấm phân lập được trong cùng một xã có cùng ký hiệu thì được đánh số khác nhau

3 Khảo sát ảnh hưởng của năm môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty và sự hình thành bào tử

của 5 dòng nấm Hirsutella citriformis

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của năm môi trường dinh dưỡng MA, MYA, PDA, PDAY và YDA lên khả năng sinh trưởng của khuẩn ty của 5 dòng nấm