Ở SÁU TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG Lê Hữu Phước* TÓM LƯỢC Kết quả đề tài đã thu thập được tổng cộng 288 dòng nấm từ 6 tỉnh An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng và Hậu G
Trang 1* Bộ môn Khoa học Cây Trồng, Khoa NN&TNTN, Email: lhphuoc@agu.edu.vn
THU THẬP, PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH BA LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp Ở SÁU
TỈNH ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
Lê Hữu Phước* TÓM LƯỢC
Kết quả đề tài đã thu thập được tổng cộng 288 dòng nấm từ 6 tỉnh An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Sóc Trăng và Hậu Giang trên các loài sâu bị nhiễm bệnh, bao gồm 3 loài nấm ký sinh
côn trùng Metarhizium anisopliae Sorok., Beauveria bassiana Vuill và Paecilomyces spp Bainier
Trong đó, quá trình phân lập, tách ròng và định danh (trong môi trường PDA) đã thu được 51 dòng Kết quả đánh giá độ hữu hiệu của các dòng nấm trên ấu trùng sâu ăn tạp tuổi 2 trong phòng thí nghiệm bằng cách nhỏ 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm (mật số 108 bào tử.ml-1) đã chọn ra 10 dòng nấm có hiệu quả nhất là M2-AG, M5-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2
-AG và P3-TG Môi trường SDAY3 là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của bào tử (bào tử.ml-1) nhất trong 4 loại môi trường lỏng (không chứa agar): CDA, CAM, SDAY1 và SDAY3
ABSTRACT
288 isolates of entomopathogenic fungi of Metarhizium anisopilae Sorok., Beauveria bassiana Vuill and Paecilomyces spp Bainier were collected from diseased insects in An Giang, Tien Giang, Can Tho, Vinh Long, Soc Trang and Hau Giang provinces Among them, isolation, purification and identification got 51 isolates in PDA medium
The evaluation results of the effectiveness on the Armyworm (Spodoptera litura) in the laboratory by coated dropping with 20µl (approximately 10 8 condia.ml -1 ) of the entomopathogenic fungi suspension on the second instars larve Armyworm showed that the most effectiveness of these isolates were M 2 -AG, M 5 -AG, M 1 -CT, M 3 -VL, M 1 -ST, B 2 -AG, B 2 -TG, B 1 –VL, P 2 -AG và P 3 -TG isolates SDAY 3 is the best medium for conidia growing (conidia.ml -1 ), compared with four liquid medium (containing no agar): CDA, CAM, SDAY 1 and SDAY 3
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau và là mối quan tâm
lo lắng hàng đầu của nông dân Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh mẽ cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Butt, T M và Copping, L., 2000) Ở trong nước, đã có một
số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật và Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và định danh một số dòng nấm
ở sáu tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, làm tiền đề cho việc nghiên cứu hiệu quả của 3 loài nấm này lên một số đối tượng gây hại quan trọng trên rau màu
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm và phân lập 3 loài nấm ký sinh côn trùng Beauveria bassiana (Bals.) Vuill, Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Paecilomyces spp ở 6 tỉnh An
Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang
- Thời gian thu mẫu: tháng 08 – 11/2008, có thể thu vào mọi thời điểm trong ngày nhưng tốt nhất
là vào buổi sáng sớm hay chiều mát vì lúc đó ẩm độ cao, sợi nấm mọc trương nước, khả năng sinh trưởng mạnh, thu thập về phân lập sẽ dễ hơn Lịch thu mẫu theo từng địa phương, nếu các lần đi thu
mẫu không đủ sâu bị nhiễm nấm thì có thể đi bổ sung vào những lần khác
4 mẫu/ruộng x 3 loại nấm x 4 xã x 6 tỉnh = 288 mẫu
- Cách lấy mẫu sâu nhiễm nấm: Dùng kẹp inox đặt các mẫu sâu nhiễm nấm ngoài tự nhiên (quan sát được bằng mắt thường) vào trong tuýp có sẵn bông gòn thấm ướt để tạo ẩm độ, ghi nhãn nơi thu thập
- Nhận biết mẫu sâu bị nhiễm nấm ngoài tự nhiên: Quan sát bằng mắt thường, nhận diện hình thái bên ngoài nấm trên cơ thể côn trùng:
+ Nấm Metarhizium anisopilae: có màu lục hoặc xanh lục (nên thường được gọi là nấm lục
cương) Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng ban đầu màu trắng sau chuyển sang màu xanh nhạt Trên bề mặt cơ thể côn trùng có một lớp phấn khá rõ màu xanh lục, các sợi nấm khá mịn
Trang 2+ Nấm Beauveria bassiana (nấm bạch cương): đặc điểm của loại nấm này là sợi nấm mọc xốp,
trông như những sợi nấm trắng, mịn mọc xốp, bao phủ bề mặt côn trùng
+ Nấm Paecilomyces spp (nấm tím): các sợi nấm mọc mịn bao phủ côn trùng, ban đầu có màu
tím rất nhạt sau đó sợi nấm chuyển sang màu tím
2.2 Phân lập, tách ròng, định danh và tồn trữ các mẫu nấm thu được trong môi trường PDA (Potato Destrose Agar)
- Phương pháp phân lập: Mẫu thu về được trữ trong đĩa petri có lót giấy thấm và bông gòn ẩm để tạo ẩm độ cho nấm phát triển, quan sát thấy tơ nấm xuất hiện tiến hành nuôi cấy nấm trong môi trường PDA Nuôi cấy theo phương pháp Slide culture để quan sát bào tử và cành bào đài Các bước phân lập:
• Chuẩn bị một mảnh môi trường Agar đặt trên đĩa petri, có diện tích 5 mm2, dầy 2 mm
• Đặt mảnh môi trường Agar trên lame, trong đĩa petri có để giấy thấm nước tạo ẩm độ
• Cấy một ít bào tử nấm vào mảnh Agar Sau đó dùng lame đậy lên trên
• Ủ đĩa Petri ở nhiệt độ 250C trong 3 – 5 ngày Sau đó chuyển mảnh Agar sang lame mới và đem quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang
Quan sát nhận diện, mô tả và chụp hình dạng bào tử, cành bào đài của các dòng nấm này
- Tiến hành định danh theo hệ thống phân loại của Barnett, H L and Barry, B Hunter (1998) sau khi đã có dạng bào tử và cành bào đài của các dòng nấm
Quan sát, ghi nhận một số đặc điểm sinh học trong quá trình phân lập để bước đầu ghi nhận những dòng nấm sinh trưởng mạnh, dễ nhân sinh khối như màu sắc, hình dạng, đặc điểm của bào tử, khuẩn lạc trên đĩa petri
2.3 Thử nghiệm hoạt lực sinh học của các mẫu nấm thu thập được trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm
Sử dụng các dòng nấm được phân lập và tách ròng từ các mẫu sâu bị ký sinh ngoài tự nhiên, cấy nguồn nấm sang môi trường PDA khoảng 7-10 ngày cho sợi nấm phát triển và sinh một lượng bào tử nhất định Sau đó tiến hành cạo nấm thu lấy bào tử, đếm mật số bào tử và pha loãng huyền phù bào tử đến mật số 108 bào tử.ml-1
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 52 nghiệm thức (51 dòng nấm và 1 đối chứng), 5 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 20 cá thể sâu đồng cở Nghiệm thức đối chứng sử dụng nước cất thanh trùng Mỗi cá thể sâu nuôi riêng trong các cốc nhỏ có nắp đậy để tránh bị lây nhiễm
Chủng vào mỗi cốc 20µl dung dịch huyền phù bào tử nấm và cho thức ăn nhân tạo vào, đậy cốc lại tránh lây nhiễm Ghi nhận số sâu chết sau 4, 6, 8, 10 ngày sau khi xử lý đối với cả 3 loại nấm
Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp Mỗi lần lấy chỉ tiêu đều đo nhiệt độ
và ẩm độ Tính độ hữu hiệu (%) bằng công thức Abbott (1925)
2.4 Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng lên sự hình thành và phát triển bào
tử của 3 loại nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp
trong môi trường lỏng
Sử dụng 10 dòng nấm đã phân lập và thử độ hữu hiệu trên sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm Cấy nguồn nấm vào đĩa petri có chứa 10 ml môi trường cơ bản PDA đối với cả 3 loại nấm từ 10 đến 14 ngày cho nấm phát triển và sinh ra một số lượng bào tử nhất định Sau đó, cho 10ml nước cất vào mỗi đĩa rồi dùng lame cạo nhẹ vào mặt môi trường để thu lấy bào tử và đếm mật số bào tử ban đầu
Bố trí thí nghiệm theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương ứng với 4 loại môi trường CDA, CAM, SDAY1, SDAY3 và 5 lần lặp lại Mỗi đơn vị thí nghiệm tương ứng với 1 bình tam giác 400ml (chứa 100ml môi trường thử nghiệm) Ở mỗi bình tam giác, chủng 1ml huyền phù bào tử nấm có mật số 107 bào tử.ml-1 Các đơn vị thí nghiệm (bình chứa môi trường) được đặt trên máy lắc tốc độ 120 vòng.phút-1 ở nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm
3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Thu thập mẫu côn trùng bị nhiễm nấm
Qua quá trình đi thu thập các mẫu côn trùng bị nhiễm vi nấm ngoài tự nhiên trên đồng ruộng, chúng tôi nhận định rằng côn trùng bị nhiễm các loài nấm ký sinh khi chúng hiện diện với mật số cao
và ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật Hai trăm tám mươi tám dòng nấm Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp được thu thập từ những ruộng sản xuất rau của nông dân
hoặc vườn rau gia đình tại 6 tỉnh: An Giang, Cần Thơ, Sóc Trăng, Vĩnh Long, Hậu Giang và Tiền Giang (Bảng 1) Các dòng nấm chủ yếu thu thập trên các đối tượng như gây hại như: sâu ăn tạp
(Spodoptera litura), sâu ăn đọt (Crocidolomia binotalis), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua), rầy phấn trắng (Aleurodicus dispersus), sâu tơ (Plutella xylostella), sâu đục trái đậu nành (Etiella zinckenella), rầy mềm (Brevicoryne brassacicae) và bọ nhảy (Phyllotetra striolata)
Trang 3Bảng 1 Số mẫu sâu hại bị nhiễm nấm ký sinh thu thập được ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, tháng 8-9 năm 2008
Các dòng nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana dễ tìm, thường xuyên hiện diện với tỷ lệ trên sâu chết cao hơn so với các dòng nấm Paecilomyces spp Ngoài ra, nấm Paecilomyces
spp tồn tại ngoài tự nhiên đôi khi không có màu đặc trưng (tơ nấm màu tím) như giai đoạn đầu ký sinh trên sâu có màu trắng, sau đó chuyển dần sang hồng nhạt, giai đoạn sau nấm thoái hóa sẽ có màu nâu đen nhạt
3.2 Phân lập, định danh và tồn trữ
Các dòng nấm sau khi thu thập được ngoài được mang về phòng thí nghiệm để phân lập trong các đĩa petri với môi trường nấm chuẩn PDA
Kết quả phân lập được 51 dòng nấm, cụ thể như sau:
- Nấm Metarhizium anisopliae (20 dòng): 5 dòng tại An Giang (M1-AG, M2-AG, M3-AG, M4
-AG, M5-AG), 4 dòng tại Cần Thơ (M1-CT, M2-CT, M3-CT, M4-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (M1-VL,
M2-VL, M3-VL), 3 dòng tại Hậu Giang (M1-HG, M2-HG, M3-HG), 3 dòng tại Sóc Trăng (M1-ST, M2
-ST, M3-ST) và 2 dòng tại Tiền Giang (M1-TG, M2-TG)
- Nấm Beauveria bassiana (17 dòng): 4 dòng tại An Giang (B1-AG, B2-AG, B3-AG, B4-AG), 3 dòng tại Cần Thơ (B1-CT, B2-CT, B3-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (B1 –VL, B2-VL, B3-VL), 2 dòng tại Hậu Giang (B1-HG, B2-HG), 2 dòng tại Sóc Trăng (B1-ST, B2-ST) và 3 dòng tại Tiền Giang (B1-TG,
B2-TG, B3-TG)
- Nấm Paecilomyces spp (14 dòng): 3 dòng tại An Giang (P1-AG, P2-AG, P3-AG), 2 dòng tại Cần Thơ (P1-CT, P2-CT), 3 dòng tại Vĩnh Long (P1-VL, P2-VL, P3-VL), 2 dòng tại Hậu Giang (P1-HG,
P2-HG), 1 dòng tại Sóc Trăng (P1-ST) và 3 dòng tại Tiền Giang (P1-TG, P2-TG, P3-TG)
Khoảng 3-5 ngày đầu các sợi tơ nấm đều có màu trắng nhạt nên dễ nhầm lẫn 3 loại nấm này nếu
không quan sát kỹ, tuy nhiên nấm Paecilomyces spp tương đối khó tìm hơn ngoài tự nhiên với màu sắc
đặc trưng Giai đoạn sau khi nấm tấn công vào cơ thể côn trùng, các sợi nấm nẩy chồi và bao phủ cơ
thể côn trùng thì các loại nấm có màu sắc, hình dáng đặc trưng Nấm Metarhizium anisopliae, mặt trên
đĩa xuất hiện các vòng màu xanh sậm, hơi đen (còn gọi là nấm xanh hay nấm lục cương), nấm
Beauveria bassiana mặt trên đĩa petri toàn thể có màu trắng (cả tơ nấm và bào tử nên còn được gọi là nấm trắng hay nấm bạch cương), còn nấm Paecilomyces spp các tơ nấm dần chuyển sang màu tím
than từ nhạt đến đậm (khoảng từ 5-7 ngày sau khi cấy, nên còn có tên là nấm tím) Nhiều loài côn trùng
chết có tơ nấm màu đen, nâu nhạt, thậm chí có màu vàng rơm đều là nấm Paecilomyces spp Sự đa
dạng về hình thái bên ngoài này cũng từng được Phạm Thị Thùy mô tả năm 2001 khi thu thập, phân lập
các dòng nấm Paecilomyces spp ngoài tự nhiên
Trang 4a b c
(a,b,c): Nấm Metarhizium anisopliae
(d,e): Nấm Beauveria bassiana
(f): Nấm Paecilomyces spp
Hình 1 Hình dạng, màu sắc tơ nấm điển hình của một số chủng nấm trong môi trường PDA vào 10 NSKC
3.3 Thí nghiệm hoạt lực các dòng nấm đối với sâu ăn tạp trong phòng thí nghiệm
Mười dòng nấm có hiệu quả cao trên sâu ăn tạp trong điều kiện phòng thí nghiệm là M2-AG, M5
-AG, M1-CT, M3-VL, M1-ST, B2-AG, B2-TG, B1 –VL, P2-AG và P3-TG Hiệu quả đối với sâu ăn tạp
vào thời điểm 10 ngày sau khi chủng nấm đối với nấm Metarhizium anisopliae từ 75,7% (M5-AG) đến 82,5 % (M1-CT), đối với nấm Beauveria bassiana từ 67,8% (B2-TG) đến 80,1% (B1-VL) và nấm
Paecilomyces spp từ 69,2% (P3-TG) - 69,5% (P2-AG)
3.4 Khảo sát ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng
Kết quả thí nghiệm cho thấy, tất cả 10 dòng nấm đều khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 1%
so với nghiệm thức đối chứng vào thời điểm 3 ngày sau khi lắc (NSKL) ở cả 4 môi trường lỏng, độ hữu hiệu tăng dần từ 3 NSKL đến 14 NSKL Tuy nhiên, độ hữu hiệu cao nhất trên sâu ăn tạp thể hiện ở môi trường SDAY3 Cụ thể, môi trường SDAY3 cho mật số bào tử (bào tử.ml-1) cao với nhiều dòng nấm nhất, được chọn để nhân sinh khối trong việc quy trình xuất chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh sau này
Về thời gian nhân sinh khối (thời gian lắc trong môi trường lỏng để nhân sinh khối nấm) cho kết
quả như sau: 9 NSKL là thời điểm tối ưu đối với nấm Metarhizium anisoplia Trong khi đó, 6 đến 9 NSKL, mật số bào tử được tạo ra cao nhất đối với nấm Beauveria bassiana và nấm Paecilomyces spp
đạt mật số bào tử cao nhất vào 6 NSKL
4 KẾT LUẬN
Kết quả đã thu thập tại 24 Phường/Xã thuộc 6 tỉnh: An Giang, Tiền Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long,
Sóc Trăng, Vĩnh Long và Hậu Giang (bao gồm 3 loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces spp.) được tổng cộng 288 dòng nấm Trong đó, đã phân lập và
định danh được 51 dòng nấm
Hiệu quả đối với sâu ăn tạp vào thời điểm 10 NSKC nấm đối với nấm Metarhizium anisopliae là
82,5 % (M1-CT), đối với nấm Beauveria bassiana là 80,1% (B1-VL) và nấm Paecilomyces spp là
69,5% (P2-AG)
Môi trường SDAY3 cho mật số bào tử cao nhất ở các NSKL, được chọn là môi trường nhân sinh khối chung
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Butt, T M and Copping, L 2000 “Fungal biological control agents”, Pesticide Outlook 11: 186-191
Barnett, H L and Barry B Hunter 1998 “Key for insects pathologens” Collection Of Insect Pathogens Insect Pathology Manual 2, Acadamic Press
Smith, D 2002 “Attachment of mycopathogens to cuticle”, The initial event of mycoses in arthropod hosts
p100