Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bacillus sp ở bãi rác bình đức TP long xuyên t an giang đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường

Ở nước ta đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về xử lý rác thải như công nghệ xử lý rác - Seraphin thuộc Công ty cổ phần Công nghệ môi trường xanh, dây chuyền xử lý rác sinh hoạt - CDW

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

KHOA SƯ PHẠM

BỘ MÔN SINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

BACILLUS sp Ở BÃI RÁC BÌNH ĐỨC,

TP LONG XUYÊN, T AN GIANG

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: NGUYỄN THANH ĐÀO

NĂM 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

KHOA SƯ PHẠM

BỘ MÔN SINH

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN

BACILLUS sp Ở BÃI RÁC BÌNH ĐỨC,

TP LONG XUYÊN, T AN GIANG

NĂM 2011

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

I Rác thải 5

1 Phân loại 5

2 Thành phần 5

3 Hiện trạng xử lý chất thải rắn 5

II Vi khuẩn Bacillus sp 6

1 Phân loại 6

2 Đặc điểm chung của Bacillus sp 7

3 Ứng dụng enzyme của vi khuẩn Bacillus sp 7

4 Ứng dụng và tác hại của vi khuẩn Bacillus sp 8

III Enzyme vi sinh vật 10

1 Catalase 10

1.1 Giới thiệu về catalase 10

1.2 Ứng dụng enzyme catalase 10

2 Amylase 10

2.1 Giới thiệu về amylase 10

2.2 Ứng dụng enzyme amylase 11

3 Protease 11

3.1 Giới thiệu về protease 11

3.2 Ứng dụng enzyme protease 11

Chương 2 – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

A Vật liệu 14

I Thiết bị và dụng cụ 14

1 Thiết bị 14

2 Dụng cụ 14

II Hóa chất và môi trường 14

1 Hóa chất 14

1.1 Hóa chất kiểm tra khả năng sinh enzyme catalase 14

1.2 Hóa chất kiểm tra khả năng sinh enzyme amylase 14

1.3 Hóa chất kiểm tra khả năng sinh enzyme protease 14

1.4 Hóa chất nhuộm Gram 15

1.5 Hóa chất nhuộm tiên mao (thuốc nhuộm Nishizawa kangen) 15

1.6 Hóa chất nhuộm bào tử 16

2 Môi trường 16

2.1 Môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 16

2.2 Môi trường kiểm tra khả năng sinh enzyme protease 17

III Vật liệu thí nghiệm 17

B Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 17

I Địa điểm 17

II Thời gian 17

C Nội dung và phương pháp nghiên cứu 17

I Phân lập 17

1 Pha chế môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng 17

2 Thu mẫu 18

3 Xử lí mẫu 18

4 Phân lập và thuần khiết giống 18

5 Giữ giống 19

II Tuyển chọn giống Bacillus có khả năng tổng hợp enzyme tốt 19

Thu nhận chế phẩm enzyme thô từ phương pháp nuôi cấy chìm 19

1 Khả năng sinh enzyme catalase 19

1.1 Định tính 19

1.2 Định lượng 20

2 Khả năng sinh enzyme amylase 20

2.1 Định tính 20

2.2 Định lượng (theo phương pháp Wolhgemuth) 21

3 Khả năng sinh enzyme protease 21

3.1 Định tính 21

3.2 Định lượng (theo phương pháp Gross và Fuld) 22

III Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng tuyển chọn23 1 Đặc điểm hình thái 23

1.1 Quan sát đại thể 23

1.2 Quan sát vi thể 23

1.2.1 Hình dạng 23

1.2.2 Nhuộm Gram và đo kích thước vi khuẩn 24

1.2.3 Khả năng di động và nhuộm tiên mao 26

1.2.4 Nhuộm bào tử (theo phương pháp Schaffer và Fulton) 28

2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 28

2.1 Khả năng sống trong điều kiện hiếu khí, kị khí 28

2.2 Khả năng sử dụng một số nguồn carbon 29

IV Định danh vi khuẩn 29

1 Định danh vi khuẩn bằng Test Kit API 50CH 29

1.1 Nguyên tắc 29

1.2 Chuẩn bị 30

1.3 Tiến hành 30

1.4 Kết quả 30

2 Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gen 16S rRNA 32

2.1 Nguyên tắc 32

2.2 Tiến hành 33

2.3 Kết quả 33

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

I Phân lập 35

II Tuyển chọn giống Bacillus có khả năng tổng hợp enzyme tốt 37

1 Khả năng sinh enzyme catalase của 8 chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 và A5-2 38

1.1 Định tính 38

1.2 Định lượng 39

2 Khả năng sinh enzyme amylase của 8 chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 và A5-2 40

2.1 Định tính 40

2.2 Định lượng 41

3 Khả năng sinh enzyme protease của 8 chủng C1-1, C8, C6, A2-1, 2, A8-2, A6 và A5-2 42

3.1 Định tính 42

3.2 Định lượng 43

III Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng C1-1 và A5-2 45

1 Đặc điểm hình thái 45

1.1 Quan sát đại thể 45

1.2 Quan sát vi thể 45

1.2.1 Hình dạng 45

1.2.2 Nhuộm Gram và đo kích thước vi khuẩn 45

1.2.3 Khả năng di động và nhuộm tiên mao 46

1.2.4 Nhuộm bào tử 47

2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 47

2.1 Khả năng sống trong điều kiện hiếu khí, kị khí 47

2.2 Khả năng sử dụng một số nguồn carbon 48

III Định danh vi khuẩn 49

1 Định danh vi khuẩn bằng Test Kit API 50CH 49

2 Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gene 16S rRNA 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến:

Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Kế hoạch - Tài vụ trường Đại học An Giang đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện nghiên cứu khoa học này

Quý đồng nghiệp trong Bộ môn Sinh - Khoa Sư phạm, Phòng Thí nghiệm - Khoa Nông nghiệp và Tài nguyên Thiên nhiên đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực nghiệm

Chị Nguyễn Thị Lan Phương, Cán bộ phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc

tế người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn chỉnh đề cương chi tiết và đề tài nghiên cứu khoa học

Ths Nguyễn Hữu Thanh, Phó Bộ môn Công nghệ Sinh học - Khoa Nông nghiệp

và Tài nguyên Thiên nhiên không những có những đóng góp chân thành và hữu ích cho tôi hoàn thiện đề cương chi tiết mà còn chỉ dẫn tận tình và hỗ trợ kịp thời trong suốt quá trình tôi thực hiện nghiên cứu khoa học

Ths Nguyễn Văn Tâm (nguyên là Trưởng Bộ môn Sinh, nay nghỉ hưu) và Ths Nguyễn Bách Thắng (nguyên là Trưởng Phòng Thí nghiệm Bộ môn Sinh, nay là Phó trưởng phòng Hành chánh - Tổng hợp) đã định hướng và cùng tôi thực hiện nghiên cứu khoa học

Tôi luôn biết ơn vì những tấm chân tình và gửi lời cảm ơn chân thành đến những người thân yêu của tôi – gia đình và đồng nghiệp trong suốt thời gian qua Xin chúc sức khỏe tất cả quí vị

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Thanh Đào

TÓM TẮT

Rác thải ngày càng nhiều là hiểm họa đối với con người và gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng Vấn đề xử lý rác thải càng trở nên thiết thực và cấp bách Phân lập

vi khuẩn Bacillus sp từ bãi rác của thành phố Long Xuyên, chọn một số chủng Bacillus

có khả năng sinh tổng hợp cao một số enzyme catalase, amylase và protease, định danh

vi khuẩn Bacillus sp đến loài nhằm từng bước xây dựng bộ sưu tập một số chủng của chi Bacillus đã, đang và ngày càng trở thành vi sinh vật quan trọng hàng đầu về mặt ứng

dụng đặc biệt là ứng dụng trong xử lý rác thải, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Trong kết quả nghiên cứu, 8 chủng Bacillus được phân lập từ mẫu rác Khi khảo

sát đặc điểm khuẩn lạc của 8 chủng nhận thấy khuẩn lạc có dạng tròn đều, nhày, phẳng hoặc lồi, trắng sữa hoặc vàng nhạt, trơn hoặc khô, bóng hoặc không bóng Từ 8 chủng trên tiến hành khảo sát hoạt tính các enzyme ngoại bào như catalase, amylase và protease, kết quả đã chọn được 2 chủng ký hiệu là C1-1 và A5-2 có hoạt tính enzyme cao Kết quả khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa:

x C1-1 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đôi hoặc kết chuỗi ; Gram dương; kích thước: (0,7-0,8)µm x (2,0-2,1)µm ; có song chùm mao, di động chậm ; có nội bào

tử hình bầu dục, lệch tâm, không làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn hơn chiều dài

tế bào, kị khí tùy ý, sử dụng được 26 loại đường

x A5-2 hình que ngắn, thẳng, sống riêng lẻ, kết đôi hoặc kết chuỗi ; Gram dương; kích thước: (0,9-1,0)µm x (1,6-1,8)µm ; có chùm mao, di động nhanh hơn C1-1 ; có nội bào tử hình bầu dục, lệch tâm, không làm phình tế bào, chiều dài bào tử ngắn hơn chiều dài tế bào, kị khí tùy ý, sử dụng được 25 loại đường

Kết quả định danh:

x C1-1 là Bacillus subtilis strain PAN MC46

x A5-2 là Bacillus subtilis.

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Thành phần chất thải rắn sinh hoạt tại thành phố Long Xuyên 5

Bảng 2 Các giếng của API 50CH 30

Bảng 3 Quality control for Bacillus: Bacillus polymyxa (*) ATCC 43865 (with API 50 CHB/E Medium) 32

Bảng 4 Đặc điểm khuẩn lạc của 8 chủng vi khuẩn trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 37

Bảng 5 Hoạt độ catalase của 8 chủng vi khuẩn 39

Bảng 6 Hoạt độ amylase của 8 chủng vi khuẩn 42

Bảng 7 Hoạt độ protease của 8 chủng vi khuẩn 44

Bảng 8 Kích thước ngang lớn nhất của vết cấy đo theo không gian 2 chiều 46

Bảng 9 Khả năng phát triển của 2 chủng thông qua vết cấy trong thạch bán rắn 48

Bảng 10 Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng một số nguồn carbon của chủng C1-1 49 Bảng 11 Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng một số nguồn carbon của chủng A5-249 Bảng 12 Định danh vi khuẩn bằng Test Kit API 50CH 49

Bảng 13 Định danh vi khuẩn bằng giải trình tự gene 16S rRNA 50

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang

Biểu đồ 1 Hoạt độ catalase của các chủng vi khuẩn 40 Biểu đồ 2 Hoạt độ amylase của các chủng vi khuẩn 42 Biểu đồ 3 Hoạt độ protease của các chủng vi khuẩn 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Phân phối môi trường vào dụng cụ 17

Hình 2 Phương pháp cấy ria tế bào bằng que cấy vòng để tách khuẩn lạc đơn 18

Hình 3 Các dạng khuẩn lạc thường gặp 18

Hình 4 Các bước nhuộm Gram và ví dụ minh họa kết quả 24

Hình 5 Ví dụ minh họa kết quả nhuộm tế bào vi khuẩn và tiên mao 27

Hình 6 Các bước tiến hành nhuộm Lục Malachite và ví dụ minh họa kết quả 28

Hình 7 Phân lập Bacillus từ bãi rác thành phố Long Xuyên 35

Hình 8 Hình dạng khuẩn lạc của 8 chủng vi khuẩn sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn 35

Hình 9 Kiểm tra khả năng sinh catalase của 8 chủng vi khuẩn 38

Hình 10 Phản ứng màu catalase với KMnO4 của vi khuẩn 39

Hình 11 Kiểm tra khả năng sinh amylase của 8 chủng vi khuẩn 40

Hình 12 Khảo sát hoạt độ amylase của 8 chủng vi khuẩn 41

Hình 13 Trước khi kiểm tra khả năng sinh enzyme protease 42

Hình 14 Kiểm tra khả năng sinh protease của 8 chủng vi khuẩn sau 24 giờ và 48 giờ 43

Hình 15 Trước khi khảo sát hoạt độ protease 43

Hình 16 Khảo sát hoạt độ protease 44

Hình 17 Kết quả nhuộm Gram của chủng C1-1 và A5-2 45

Hình 18 Kích thước của chủng C1-1 45

Hình 19 Kích thước của chủng A5-2 46

Hình 20 Vết cấy của 2 chủng trong môi trường thạch bán rắn 46

Hình 21 Kết quả nhuộm tiên mao của chủng C1-1 và A5-2 47

Hình 22 Kết quả nhuộm bào tử của chủng C1-1 và A5-2 47

Hình 23 Bộ API 50CH sau khi nhỏ dịch nuôi cấy vi khuẩn 48 Hình 24 Khả năng sử dụng 1 số nguồn carbon của 2 chủng sau 24 giờ ủ ở 370C 48

MỞ ĐẦU

hoại đến cả môi trường sống… Tác nhân gây nguy hại môi trường của chất thải rắn là

rất lớn Vì vậy, vấn đề hiện nay là cần đưa ra những giải pháp quản lý và xử lý chất thải rắn hiệu quả, ứng dụng những tiến bộ khoa học trong và ngoài nước, góp phần giảm thiểu ảnh hưởng của chất thải rắn đến môi trường sống nói chung và môi trường không khí nói riêng, vì sức khỏe của con người và của cả xã hội

Ở nước ta đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về xử lý rác thải như công nghệ

xử lý rác - Seraphin thuộc Công ty cổ phần Công nghệ môi trường xanh, dây chuyền xử

lý rác sinh hoạt - CDW thuộc Công ty Trách nhiệm Hữu hạn Thủy Lực - Máy ứng dụng (Hà Nội), Công nghệ xử lý chất thải rắn bằng biện pháp yếm khí tùy nghi - A.B.T,…đều có sử dụng tổ hợp vi sinh vật có ích như vi sinh vật đẩy nhanh tốc độ phân hủy các chất hữu cơ và vi sinh vật khử mùi sinh ra trong quá trình vận chuyển và xử lý

rác Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sp ở bãi rác Bình Đức, thành phố

Long Xuyên, tỉnh An Giang” sẽ được nghiên cứu với bối cảnh địa phương còn nhiều

bất cập trong vấn đề xử lý rác thải

B Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

I Mục tiêu nghiên cứu

Định danh 2 chủng vi khuẩn Bacillus đến loài có hoạt tính enzyme mạnh

II Nội dung nghiên cứu

Đề tài được triển khai theo các nội dung sau:

- Phân lập vi khuẩn Bacillus sp

- Kiểm tra và chọn những chủng vi khuẩn Bacillus sp có khả năng sinh tổng hợp

catalase, amylase và protease cao

- Quan sát đại thể và vi thể Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của 2 chủng được tuyển chọn

- Định danh 2 chủng vi khuẩn Bacillus sp đến loài

C Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

I Đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus sp

II Phạm vi nghiên cứu

Thu mẫu ở bãi rác TP Long Xuyên đem về phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp

Tiến hành tuyển chọn 2 chủng có hoạt độ protease, amylase và catalase cao Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của 2 chủng được chọn Sau cùng định danh 2 chủng được chọn đến loài

D Cơ sở lý luận và phương pháp nghiên cứu

I Cơ sở lý thuyết được sử dụng

1 Tình hình xử lý rác thải

2 Giới thiệu vi khuẩn Bacillus sp

3 Khái quát về enzyme vi sinh vật

II Các phương pháp nghiên cứu đã được thực hiện

1 Phương pháp phân lập

2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

3 Phương pháp khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

4 Phương pháp định danh

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Rác thải

1 Phân loại

Rác thải được phân thành nhiều loại:

- Rác thực phẩm: bao gồm phần thừa thãi, không ăn được sinh ra trong khâu chuẩn

bị, dự trữ, nấu ăn…

- Rác bỏ đi: bao gồm các chất thải cháy và không cháy sinh ra từ các hộ gia đình,

công sở, hoạt động thương mại…

- Tro, xỉ: vật chất còn lại trong quá trình đốt than, củi, rơm rạ, lá…ở các gia đình,

nhà hàng, công sở, nhà máy, xí nghiệp…

- Chất thải xây dựng: rác từ các nhà đổ vỡ, hư hỏng gọi là rác đổ vỡ, còn rác từ các

công trình xây dựng, sửa chữa nhà cửa…là rác xây dựng

- Chất thải đặc biệt: liệt vào loại rác này có rác quét phố, rác từ các thùng rác công

cộng, xác động vật, vôi gạch đổ nát…

- Chất thải từ các nhà máy xử lý ô nhiễm: có rác từ hệ thống xử lý nước, nước

thải, nhà máy xử lý chất thải công nghiệp

- Chất thải nông nghiệp: vật chất loại bỏ từ các hoạt động nông nghiệp như gốc

rơm rạ, cây trồng, chăn nuôi…

- Chất thải nguy hiểm: chất thải hoá chất, sinh học, dễ cháy, dễ nổ hoặc mang tính

phóng xạ theo thời gian có ảnh hưởng đến đời sống con người, động thực vật

Trong nhiều trường hợp thống kê người ta phân chia thành 3 loại: chất thải rắn từ

sinh hoạt gia cư gọi là rác sinh hoạt, chất thải y tế và chất thải công nghiệp

2 Thành phần

Bảng 1 Thành phần chất thải rắn sinh hoạt tại thành phố Long Xuyên

STT Thành phần Tỷ lệ (%) Khối lượng (tấn/ngày)

(Nguồn: Báo cáo nghiên cứu khả thi ”Mở rộng bãi rác Bình Đức, TP Long Xuyên”)

3 Hiện trạng xử lý chất thải rắn

Chất thải rắn sinh hoạt của thành phố Long Xuyên sau khi thu gom được vận

chuyển đến bãi rác Bình Đức cách trung tâm thành phố Long Xuyên 9km về hướng Tây

Bắc của thành phố, cách quốc lộ 91 khoảng 700m, cách nhà dân chưa được 500m

Theo số liệu trong bảng 1 cho thấy khối lượng chất thải hữu cơ rất lớn (chiếm

khoảng 85%) chủ yếu có nguồn gốc từ thực vật và động vật Phần rác hữu cơ có thể

dùng làm nguyên liệu sản xuất phân compost, dùng bón cho nông nghiệp, lâm nghiệp với giá thành thấp vừa không gây tác động xấu đến môi trường, cánh đồng, vừa có thể cải tạo được một số vùng đất chết Tuy nhiên khả năng phân hủy chất hữu cơ trong bãi chôn lấp không hợp vệ sinh, chưa đúng cách, biện pháp xử lý duy nhất là đốt vào mùa khô và phun chế phẩm EM định kì nếu không xử lý phù hợp và kịp thời thì các loại chất thải này sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường sống của người dân tại khu vực gây nên

ô nhiễm nguồn nước, không khí, tạo điều kiện cho vi khuẩn và các loại bệnh tật phát triển như bệnh đau mắt, bệnh đường hô hấp, bệnh ngoài da, tiêu chảy, dịch tả, thương hàn…do chất thải rắn gây ra

Chính vì vậy việc lựa chọn công nghệ xử lý và quy hoạch bãi chôn lấp hợp lý có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với việc bảo vệ môi trường

Công nghệ xử lý chất thải rắn thường được phối hợp giữa chôn lấp và đốt hay sản xuất phân vi sinh Việc lựa chọn công nghệ phù hợp cần được xem xét trên cả hai phương diện kinh tế lẫn môi trường

Việc đề xuất một công nghệ thích hợp để xử lý các chất hữu cơ thành thức ăn hữu

cơ hoặc phân bón sinh học chất lượng cao, thay thế được phân bón hóa học, nâng cao năng suất cây trồng là một trong những vấn đề cần phải quan tâm và triển khai trong tương lai

Dựa vào đặc điểm bào tử, vi khuẩn Bacillus (Bac.) được chia 3 nhóm:

- Nhóm 1: bào tử không làm phình tế bào lên, màng bào tử mỏng, gồm các loài:

+ Hiếu khí không bắt buộc như Bac licheniformic, Bac cereus, Bac Anthracis

+ Hiếu khí bắt buộc như Bac lentus, Bac firmus, Bac megaterium, Bac

subtilis, Bac coagulans

- Nhóm 2: bào tử làm phình to tế bào lên, bào tử thường có hình ovan, màng bào

tử dầy, gồm các loài: Bac stearother mophilus, Bac coagulans, Bac laterosporus (bào

tử ở gần một đầu), Bac polymyxa, Bac macerans, Bac lavae, Bac popilliae, Bac

lentimorbus, Bac brevis, Bac pulvifaciens, Bac pantothenticus, Bac circulans, Bac alvei

- Nhóm 3: bào tử hình cầu làm phình to tế bào lên Không thủy phân casein và

tinh bột Gồm các loài: Bac sphaericus, Bac pasteurii

(Nguyễn Lân Dũng và ctv 1978)

Trong đất thường gặp các loài thuộc giống Bacillus như: Bac subtilis, Bac

mesentericus, Bac cereus, Bac simplex, Bac cereus var mycoides, Bac megatertum,

(N,X Êgôrôv 1976, người dịch: Nguyễn Lân Dũng 1983)

2 Đặc điểm chung của Bacillus sp

Bacillus sp là vi khuẩn hình que, chiều dài khác nhau, Gram dương, di động nhờ

chu mao, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc và có các đặc điểm sinh lí học khác

nhau, hầu hết chúng đều ưa ẩm, chịu nhiệt và một số chịu mặn như Bacillus subtilis

Các loài thuộc giống Bacillus đặc trưng cho các trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ

nguyên hình que khi mang bào tử, một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút Tùy thuộc từng loài vi sinh vật mà bào tử nằm ở chính giữa, nằm ở gần đầu hoặc ở đầu tế bào Chiều dài của bào tử không vượt quá chiều dài của tế bào

Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nẩy nở mà để chống chịu khi điều kiện bất lợi (nhiệt độ cao, khô hạn, phóng xạ,…) Đó là những tế bào ở trạng thái nghỉ mà trong chúng các quá trình sống bị ức chế rất mạnh Bào tử có màng gồm nhiều lớp, chứa ít nước tự do nên khi điều kiện bất lợi bào tử có thể tồn tại mặc dù các tế bào dinh dưỡng bị chết

Ở phần lớn vi khuẩn, trong tế bào chỉ có thể có một bào tử Khi bào tử được hình thành, thành tế bào và các phần còn lại của tế bào bị phân hủy, làm cho bào tử được rời

ra (N,X Êgôrôv 1976, người dịch: Nguyễn Lân Dũng 1983)

Khi điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ nẩy mầm, mỗi bào tử cho ra một tế bào dinh dưỡng Vì thế, khi xử lí mẫu rác ở nhiệt độ cao (thường là 800C/10- 30 phút), các tế bào sinh dưỡng bị phá hủy trong khi nhiều bào tử trong mẫu vẫn còn sống Cấy các mẫu đã qua xử lí nhiệt trên thạch và để ở điều kiện hiếu khí sẽ thu được các khuẩn lạc đa số

thuộc giống Bacillus sp (Nguyễn Đình Bảng và ctv 1992)

Các vi khuẩn thuộc giống Bacillus sp thường mọc tốt trên môi trường có nguồn

carbon duy nhất là đường, hữu cơ,…với nguồn hữu cơ duy nhất là amonium Tuy nhiên

có một số dạng cần vitamin để tăng trưởng Nhiều trực khuẩn thuộc loại này có khả năng sản xuất kháng sinh như: gramicidin, bacitracin, circulin, polymicin, tyrocidin Hầu hết việc tạo kháng sinh đều có liên quan đến quá trình bào tử hóa và kháng sinh được giải phóng ở giai đoạn tế bào bước vào pha tăng trưởng ổn định sau khi chuyển sang bào tử hóa (Nguyễn Lân Dũng và ctv 1978)

Bacillus được coi là vi sinh vật “vi đạm” Chúng có khả năng cố định nitrogen

phân tử, tiết ra protease phân giải protein, đồng thời amon hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitrogen Chúng còn sử dụng cellulose trong điều kiện hiếu khí hoặc khi sự xâm nhập của không khí bị hạn chế (N,X Êgôrôv 1976, người dịch: Nguyễn Lân Dũng 1983)

Bacillus có khả năng tổng hợp protease, amylase rất mạnh, có thể tổng hợp trên

2000 loại protein khác nhau chủ yếu là enzyme (Nguyễn Lân Dũng và ctv 1978), phát triển mạnh ở nhiệt độ 350C – 450C và pH thích hợp là 4,5 (Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Thị Thùy Dương 2003)

3 Ứng dụng enzyme của vi khuẩn Bacillus sp

Protease kiềm được sinh tổng hợp bởi Bacillus subtillis (hoạt động mạnh ở pH 7 –

11), có tên thương mại là enzyme tẩy rửa, ứng dụng trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa

Protease trung tính từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus được thương

mại hóa dạng bột, ứng dụng nhiều trong thuộc da, sản xuất bia, sản xuất protein đậm đặc

α – amylase chuẩn được thu nhận từ Bac subtilis, Bac amyloliquefaciens (hoạt

động mạnh ở 70 – 800C) α – amylase chịu nhiệt thu từ Bac licheniformic (hoạt động

mạnh ở 90 – 1050C) Amylase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, nhất là trong công nghiệp chế biến thực phẩm Hiện nay trên thế giới đang sản xuất và thương mại hóa nhiều chế phẩm enzyme amylase

Sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học BT được sản xuất từ Bac thurigensis Tính năng:

diệt được rất nhiều côn trùng Ưu điểm: không ảnh hưởng đến cây trồng, không làm thay đổi hệ sinh thái, không gây ô nhiễm môi trường, dễ phá hủy, không tạo ra dư lượng độc hại cho sản phẩm (Nguyễn Đức Lượng 2002)

Bacillus subtilis có khả năng điều tiết enzyme quan trọng, trong tế bào có trên

2000 loại protein khác nhau và chủ yếu là enzyme (Nguyễn Lân Dũng và ctv 1978)

Bacillus subtilis còn được đánh giá là một trong những vi khuẩn hàng đầu được sử dụng

để sản xuất các amino acid quan trọng bằng công nghệ sinh học như: lisin, valin, tyrozin, prolin,…

4 Ứng dụng và tác hại của vi khuẩn Bacillus sp

Giống Bacillus phân bố rất rộng trong tự nhiên, nhất là trong đất, chúng tham gia

tích cực vào sự phân hủy vật chất hữu cơ nhờ vào khả năng sinh nhiều loại enzyme

ngoại bào Bacillus được tìm thấy gần 500 loài Do sự đa dạng sinh thái và loài nên các hoạt chất của chúng cũng rất phong phú Triển vọng ứng dụng Bacillus trong nhiều lĩnh

vực đời sống, đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản là rất to lớn Một số loài thuộc nhóm

vi khuẩn Bacillus như: B subtilis, B aterrimus B niger, B pumilis, B panis, B

vulgarus, B nigrificans, B natto, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B megaterium, B mesentericus… đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản với vai trò:

- Cải thiện sức khỏe: một số nghiên cứu trên các đối tượng nuôi thủy sản như luân

trùng, Artemia, nhuyễn thể, ấu trùng giáp xác, cá… cho thấy Bacillus đã trực tiếp cung

cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi đặc biệt là acid béo và vitamin ; vài loài vi khuẩn đã được nghiên cứu trên động vật hai mảnh vỏ cho thấy vi khuẩn còn góp phần hỗ trợ tiêu hóa do chúng sản sinh các enzyme như protease, lipase giúp cho quá trình tiêu hóa của vật chủ tốt hơn),

- Tăng cường các phản ứng miễn dịch: vi khuẩn có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Một nghiên cứu sử dụng vi khuẩn trộn vào thức ăn trên cá hồi

nước ngọt (Rainbow trout), kết quả làm tăng sự đề kháng với vi khuẩn gây bệnh Vibrio

thông qua làm tăng hoạt động thực bào của bạch cầu Một nghiên cứu khác của

Rengpipat et al., (2000) trên đối tượng tôm sú cũng cho rằng sử dụng Bacillus sp (S11) giúp vật nuôi ít nhiễm bệnh do vi khuẩn Bacillus đã tiết ra các chất làm tăng đáp ứng cả miễn dịch tế bào lẫn miễn dịch dịch thể Balcázar (2003) chứng minh Bacillus làm tăng

tỉ lệ sống và tăng trưởng của tôm thẻ do khống chế V harveyi và virus đốm trắng Một nghiên cứu khác của Hadi Zokaei et al., (2009) trộn B subtilis vào thức ăn tôm thẻ chân

trắng làm tôm tăng trưởng nhanh và tỉ lệ sống cao hơn so với đối chứng, mặt khác mật

độ B subtilis cũng tăng nhanh trong hệ tiêu hóa của tôm và mật độ Vibrio giảm

- Cải thiện môi trường: Bacillus tiết ra enzyme phân hủy các chất như

carbohydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Chúng cũng có khả năng

phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm Bacillus có tác dụng làm

giảm COD, H2S trong ao tôm làm tăng năng suất nuôi ; ứng dụng Bacillus trong trường

hợp này làm tăng quá trình phân hủy hữu cơ tránh đáy ao, làm giảm các chất dư thừa tích tụ đáy ao, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi đáy ao

- Ức chế tác nhân gây bệnh: hiện nay tác giả đã tổng kết có vài trăm dòng vi khuẩn

B subtilis có khả năng tiết ra hơn 20 chất kháng sinh với cấu trúc khác nhau Bao gồm:

subtilin, ericin, mersacidin, sublancin, subtilosin, surfactin, iturin, bacillibactin, bacillmycin, mycosubtilin, fengycin, plipastatin, corynebactin, bacilysin, difficidin, oxydifficicin, bacilysocin, rhizocticin, amicoumacin, mysobaccillin Khả năng sinh các enzyme phân hủy các hợp chất hữu cơ và kiểm soát sự phát triển quá mức của vi

sinh vật gây bệnh (Vibrio) giữ cho môi trường luôn ở trạng thái cân bằng là đặc tính nổi

trội của nhóm vi khuẩn này

(Nguồn: UV-Việt Nam)

Nhiều enzyme ngoại bào của Bacillus là enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn

có nhiều trong nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp thực phẩm như protease, amylase và CMC-ase (Ngô Tự Thành và cs 2007)

Amylase, hemicellulase, glucanase, xylanase, protease,…từ Bacillus subtilis thủy

phân phụ phẩm cá tra (Trần T Hồng Nghi và cs.)

Bacillus subtilis ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất enzyme, trong chế

biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc,… (Trần T Ánh Tuyết và cs.)

Vi khuẩn đối kháng Bacillus, Burkholderia và Pseudomonas được phân lập từ đất,

rễ cây, có khả năng kiểm soát hiệu quả đối với nấm Pythium, R solani và F

oxysporum… gây bệnh thối rễ, thối thân ở cây đậu tương, cây đỗ, rau diếp, cây trạng

nguyên, cây khoai tây

(Nguồn: Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme Viện Công nghệ Sinh học)

Hầu hết những loài Bacillus không độc hại đối với động vật, khả năng sản sinh kháng sinh và enzym Enzyme do vi khuẩn Bacillus tiết ra phân hủy rất có hiệu quả các chất như carbonhydrate, chất béo và đạm thành những đơn vị nhỏ hơn Giống Bacillus

có thể sinh trưởng tốt với nguồn carbon và nitơ thấp Giống Bacillus cũng có khả năng

phân hủy các chất hữu cơ tích lũy trong nền đáy ao nuôi tôm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khi bổ sung vi khuẩn này vào môi trường nuôi tôm sú thì tỉ lệ sống của tôm được cải thiện đáng kể và hệ miễn dịch tăng lên rõ rệt Ngoài ra, chúng còn hạn chế

vi khuẩn có hại trong đường ruột và trong môi trường giúp chuyển hoá hiệu quả thức ăn

và khống chế vi khuẩn gây bệnh (Nguồn: UV-Việt Nam)

Bên cạnh những ứng dụng đa lĩnh vực được nêu ở trên thì cũng có một ít loài

thuộc chi Bacillus gây nhiều tác hại Hai loài được xem là quan trọng về mặt y học là

Bacillus anthracis (gây ra anthrax) và Bacillus cereus (có thể gây ra một dạng bệnh từ

thực phẩm tương tự Staphylococcus) Hai loài nổi tiếng làm hỏng thức ăn là Bacillus

subtilis và Bacillus coagulans B subtilis là một sinh vật hiếu khí sống ký sinh có bào tử

có thể sống sót trong độ nóng cùng cực thường thấy khi nấu ăn Nó chính là tác nhân

làm cho bánh mì hư B coagulans có thể phát triển đến tận mức pH 4.2 và gây ra vị

chua nặng ở thức ăn đóng hộp bị ôi (bao gồm cả các thức ăn có tính acid mà bình

thường có thể khống chế sự phát triển của đa số vi khuẩn ở mức thấp nhất) Ấu trùng

Paenibacillus gây ra các chứng bệnh của ong mật ở ong mật

III Enzyme vi sinh vật

Trong tế bào vi sinh vật rất giàu các hệ enzyme để thực hiện các phản ứng hóa sinh phức tạp Có một số hệ enzyme tiết vào môi trường xung quanh để phân hủy các cơ chất thành các chất có cấu tạo phân tử thấp mà vi sinh vật có thể đồng hóa được Đó là những enzyme ngoại bào như: protease, amylase, cellulase, pectinase,… Những enzyme ngoại bào đầu tiên được hình thành trong tế bào khi môi trường có những cơ chất cảm ứng rồi tiết dần vào môi trường Vi sinh vật tạo thành những enzyme này chủ yếu ở thời

kì phát triển, khi các tế bào còn non (Lương Đức Phẩm và Hồ Sưởng 1978)

1 Catalase

1.1 Giới thiệu về catalase

Catalase là enzyme được tìm thấy trong đa số vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý (vi khuẩn kỵ khí bắt buộc không sử dụng oxy trong quá trình hô hấp, nó cũng không có catalase)

Một số vi khuẩn có khả năng khử nguyên tử oxy thành H2O2, đây là chất độc đối với vi khuẩn Tuy nhiên một số vi khuẩn có khả năng kháng lại chất độc này bằng cách tạo ra một loại enzyme là catalase, biến đổi H2O2 thành 2 hợp chất O2 và H2O

1.2 Ứng dụng enzyme catalase

Ngoài khả năng xúc tác phản ứng đặc hiệu phân hủy H2O2, catalase còn có thể phân hủy formaldehyde, formic acid và alcohol - những chất độc hại đối với môi trường (Trần Đình Toại và Trần Thị Hồng 2007)

Can thiệp vào tiến trình oxy hóa ở mô và thúc đẩy quá trình tạo mô hạt trong tiến trình lành sẹo của vết thương

2 Amylase

2.1 Giới thiệu về amylase

Amylase là enzyme xúc tác thủy phân tinh bột và các poliose như dextrin, glicogen… Các enzyme chủ yếu trong nhóm này là: α – amylase, β – amylase, Glucoamylase

α – amylase hầu như không tác dụng lên tinh bột nguyên thể mà tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa Quá trình thủy phân xảy ra qua nhiều giai đoạn Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân, tạo thành một lượng dextrin, độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh, sang giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin vừa được tạo thành bị thủy phân, tiếp tục tạo ra các dextrin phân tử thấp hơn là maltose, isomaltose và glucose.Tuy nhiên thông thường, trong một thời gian ngắn (30 – 60 phút), α – amylase chỉ thủy phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp là chủ yếu và một ít đường maltose

α – amylase tương đối bền với các tác dụng nhiệt do sự có mặt của calci trong phân tử enzyme, calci giữ vai trò ổn định trong cấu trúc bậc ba của phân tử enzyme

α – amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu, α – amylase của vi khuẩn hoạt động mạnh ở pH 5,9 – 6,1 Nếu pH < 3, đa số amylase bị vô hoạt hoàn toàn Các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis…có khả năng

tổng hợp α – amylase có ý nghĩa trong công nghiệp (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv 1998)

2.2 Ứng dụng enzyme amylase

Xử lí phế phẩm chứa nhiều tinh bột từ các cơ sở sản xuất, từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp, … giúp chuyển hóa nhanh các chất hữu cơ, tạo ra phân bón hữu cơ thay cho phân bón hóa học, giảm ô nhiễm môi trường

Amylase phối hợp với protease, tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc, giúp tăng hiệu suất hấp thụ thức ăn, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc, gia cầm

Ngoài ra, amylase còn dùng trong sản xuất siro có hàm lượng fructose cao và những sản phẩm có vị ngọt cao, sản xuất cồn từ tinh bột, sản xuất bia, sản xuất bánh mì, sản xuất nước tương và nước chấm ; ứng dụng trong công nghiệp dệt,…

3 Protease

3.1 Giới thiệu về protease

Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân

tử protein và các cơ chất tương tự Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển amine

So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết, hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng phân tử đồng nhất Do đó, protease vi sinh vật có tính đặc hiệu rộng rãi, cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng

3.2 Ứng dụng enzyme protease

Protease từ vi sinh vật được sử dụng trong xử lí chất thải hữu cơ, giúp cải thiện

trình trạng ô nhiễm môi trường Bacillus subtilis có vai trò to lớn trong thủy phân

protein nhờ khả năng sinh tổng hợp protease mạnh

Trong nuôi trồng thủy sản, protease vi sinh vật được dùng để phân hủy các chất hữu cơ lắng đọng do thức ăn của vật nuôi tích tụ, giúp cải thiện chất lượng nước của ao nuôi thủy sản, tăng hàm lượng oxy hòa tan trong nước

Trong chế biến thủy sản, protease vi sinh vật được dùng trong việc xử lí nước thải, rác thải hữu cơ từ các nhà máy chế biến thủy sản, giúp bảo vệ nguồn nước sinh hoạt, bảo vệ môi trường sinh thái

Trong sản xuất nước mắm, nếu thực hiện theo phương pháp lên men cổ truyền thì thời gian sản xuất kéo dài 9 tháng đến 1 năm, hiệu quả kinh tế không cao Nên hiện nay người ta nghiên cứu và sử dụng enzyme thực vật, vi sinh vật vào sản xuất nước mắm nhằm rút ngắn thời gian sản xuất, tăng hương vị sản phẩm

Protease có ý nghĩa lớn trong sản xuất chất tẩy rửa, tổng hợp aspartam, sản xuất insulin cho người từ insulin heo, sản xuất keo động vật, mỹ phẩm, dược phẩm,…

Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng

độ ổn định của bia và rút ngắn thời gian lọc, thủy phân nhanh protein trong hạt ngũ cốc, giúp xử lý bia tốt hơn

Protease được dùng trong kỹ nghệ sản xuất thịt thường là protease thực vật (papain, bromelin, fixin…) và enzyme vi sinh vật Các chế phẩm thường dùng là papain hay papain lẫn với protease vi sinh vật

Trong công nghiệp sữa, protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Renin là enzyme có giá tri đặc biệt, cho phép tạo các sản phẩm

có chất lượng cao nhất Còn các protease vi sinh vật thì ngoài khả năng làm đông tụ sữa còn có khả năng thủy phân sâu sắc casein, gây ảnh hưởng xấu đến mùi vị của phomat

Vì vậy người ta thường dùng các chủng vi sinh vật cho phép thu protease có tính chất tương tự renin hoặc chỉ thay thế một phần renin (25 – 50%) bằng protease vi sinh vật Trong công nghiệp da, protease được sử dụng với mục đích tách lông trên da, làm mềm da nhờ sự thủy phân một phần protein của da, chủ yếu là một số liên kết của colagen (Nguyễn Trọng Cẩn và ctv 1998)

Protease được dùng để điều chế dịch đạm thủy phân, làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm, sản xuất một số thức ăn kiêng và điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất kháng sinh, vaccine,…

CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP

1.3 Hóa chất kiểm tra khả năng sinh enzyme protease

Định lượng

Dung dịch casein 0,1%: có thể chuẩn bị theo 2 cách:

- Cách 1: cân 0,1g casein hòa tan trong 100ml dung dịch carbonade natri đun ấm cho đến khi hòa tan

- Cách 2: cân 0,1g casein, trộn lẫn với 5ml dung dịch NaOH 0,1N, 25ml nước cất

và đun cách thủy cho đến khi hòa tan hoàn toàn Làm lạnh, dùng dung dịch HCl 0,1N để điều chỉnh pH đến 8 Thêm nước cất vào đến 100ml

Dung dịch acid acetic 1%: 1ml acid acetic đặc hòa với 49ml nước cất và 50ml

1.4 Hóa chất nhuộm Gram

Dung dịch tím kết tinh (crystal violet)

Cồn 950, ống nghiệm nước cất vô trùng, dầu soi kính

(Lê Duy Linh và ctv 2001)

1.5 Hóa chất nhuộm tiên mao (thuốc nhuộm Nishizawa kangen)

Hòa AgNO3 vào nước cất, lấy ra 10ml cho vào 1 cốc thủy tinh có dung tích 100ml Thêm từng giọt NH3 và lắc đều, lúc đầu thấy vẫn đục khi thấy trong thì thôi ngay (khoảng 5-6 giọt) Đổ dung dịch này vào phần còn lại trong lọ (90ml) của dung dịch B lắc đều Lọc qua giấy lọc Dung dịch A và B phải đựng trong chai có màu, A sau khi pha xong chỉ giữ được 6 giờ

Ống nghiệm nước cất vô trùng

Ống nghiệm đựng 1ml nước muối sinh lý vô trùng

Cốc thủy tinh 250ml chứa nước tiêu bản

Dầu soi kính (Lê Duy Linh và ctv 2001)

1.6 Hóa chất nhuộm bào tử

2.2 Môi trường kiểm tra khả năng sinh enzyme protease

III Vật liệu thí nghiệm

Giống vi khuẩn Bacillus được phân lập từ bãi rác Bình Đức - Thành phố Long

Xuyên - Tỉnh An Giang

B Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

I Địa điểm: Phòng thí nghiệm - Bộ môn Sinh - Trường Đại học An Giang

Phòng thí nghiệm - Khoa Nông nghiệp - Trường Đại học An Giang

II Thời gian: từ tháng 03 năm 2010 đến tháng 9 năm 2011

C Nội dung và phương pháp nghiên cứu

I Phân lập

1 Pha chế môi trường thạch đĩa và thạch nghiêng

Cân, đong chính xác từng thành phần môi trường

Hòa tan các chất vào nước, đun và khuấy cho tan

Làm trong môi trường, kiểm tra thể tích và pH

Rót môi trường vào dụng cụ (ống nghiệm: ¼ ống, bình tam giác: ½ bình) Làm nút bông, bao giấy họa báo

Khử trùng ở nồi hấp áp lực hơi nước (0,8 – 1,0 atm/15 phút)

Chế môi trường thạch đĩa Ống thạch đặt nghiêng

Hình 1 Phân phối môi trường vào dụng cụ

(Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng 2006)

2 Thu mẫu

Chọn 2 mẫu rác có thời gian phân hủy là 30 ngày, độ sâu 20cm và 30cm, màu nâu

đen, mùi nhẹ Mỗi độ sâu, lấy 3 mẫu rác từ 3 vị trí khác nhau, cho vào túi nylon

3 Xử lí mẫu

Trộn đều các mẫu rác có độ sâu và vị trí khác nhau Cân 10g mẫu, cho vào bình tam giác 250ml, tiếp tục cho vào bình này 90ml nước cất Lắc 150 vòng/phút trong 20 phút, để mẫu lắng

4 Phân lập và thuần khiết giống

Rút 50ml hỗn hợp nước từ mẫu rác đã đồng nhất, cho vào bình tam giác 100ml, đặt vào bể điều nhiệt ở 900C trong 30 phút nhằm tiêu diệt các vi sinh vật không chịu được nhiệt độ cao

Cấy dịch huyền phù của mẫu rác này lên môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn bằng que trang, ủ từ 1 – 2 ngày, sau đó chọn các khuẩn lạc rời có kích thước lớn và có các đặc điểm khác nhau về màu sắc, dạng bìa, độ nổi,… cấy lên môi trường dinh dưỡng tối thiểu rắn bằng que cấy vòng và tiếp tục cấy đến khi mẫu thuần Cuối cùng, cấy truyền vào ống thạch nghiêng và trữ ở tủ lạnh

Hình 2 Phương pháp cấy ria tế bào bằng que cấy vòng để tách khuẩn lạc đơn

(Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng 2006)

Hình 3 Các dạng khuẩn lạc thường gặp

(Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng 2006)

5 Giữ giống

Tùy theo đặc điểm của giống, thời gian sử dụng và điều kiện thực tế có thể lựa

chọn các cách giữ giống sau:

- Cấy truyền định kỳ trên môi trường thạch nghiêng mới (tháng/lần) và giữ vi khuẩn ở nhiệt độ 4-50C trong tủ lạnh hoặc phòng lạnh

- Trộn vi khuẩn với glycerol vô trùng với tỉ lệ 1 : 20 và giữ ở nhiệt độ 3-50C

II Tuyển chọn giống Bacillus có khả năng tổng hợp enzyme tốt

∗ Thu nhận chế phẩm enzyme thô từ phương pháp nuôi cấy chìm

Đặt các bình tam giác lên máy lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ

Sau 2 ngày, ly tâm 4 000 vòng/phút trong 10 phút để thu enzyme thô (phần dịch trong) Enzyme có thể sử dụng ngay hoặc được bảo quản trong tủ mát (tốt nhất là 40C)

1 Khả năng sinh enzyme catalase

1.1 Định tính

Nguyên tắc

Catalase có trong tế bào của hầu hết các vi khuẩn hiếu khí Catalase xúc tác cho

phản ứng phân giải H2O2 thành nước và oxy phân tử Nếu có catalase sẽ sinh bọt khí khi cho khuẩn lạc vi khuẩn vào giọt H2O2

Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

(Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng 2001)

1ml dung dịch KMnO4 0,1N tương ứng với 1,7mg H2O2

Hoạt độ catalase (C) được tính bằng mg H2O2 bị phân giải

C = (A - B) x 1,7

A - số ml dung dịch KMnO4 đã dùng để chuẩn độ mẫu kiểm tra

B - số ml dung dịch KMnO4 đã dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm

(Nguyễn Lân Dũng và cs 1978)

2 Khả năng sinh enzyme amylase

2.1 Định tính

Nguyên tắc

Amylase phân giải tinh bột và làm mất màu dung dịch iodine Kiểm tra sự có mặt

của enzyme amylase bằng cách cho một lượng tinh bột nhất định sẽ làm mất màu dung dịch iodine

Tiến hành

Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 1ml dung dịch NaCl 0,1% trong mỗi ống Số

ống nghiệm tương ứng với số dòng vi khuẩn khảo sát và 1 ống đối chứng

Lấy 1ml enzyme thô cho vào 1 ống nghiệm đã chuẩn bị, lắc đều Ống đối chứng thì cho 1ml nước cất

Cho vào mỗi ống nghiệm trên 1ml dung dịch hồ tinh bột 0,1%, lắc đều

Đặt các ống nghiệm trên vào tủ ủ 300C trong 30 phút

Lấy các ống nghiệm ra và tiến hành nhỏ từng giọt iodine 0,01N vào ống chứa mẫu trắng (ống đối chứng) trước cho đến khi dung dịch giữ được màu tím đậm và bền trong

1 phút Sau đó cho lượng iodine như trên vào tất cả các ống nghiệm còn lại, lắc đều Kết quả

Phản ứng (+): làm mất màu dung dịch iodine 0,01N

Phản ứng (-): không làm mất màu dung dịch iodine 0,01N

2.2 Định lượng (theo phương pháp Wolhgemuth)

Nguyên tắc

Xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột xác định

dựa theo phản ứng màu với iodine

Đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi có ion

Cl- có thể phân giải 1mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với dung dịch iodine

Hoạt độ của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1ml dịch môi trường hoặc 1ml dịch chiết enzyme

Cho vào mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ ở 300C trong 30 phút rồi làm lạnh

Cho vào mỗi ống nghiệm 1 giọt dung dịch iodine 0,02N

Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không tạo màu với iodine

Tính kết quả

Gọi n: ống nghiệm có độ pha loãng lớn nhất mà không tạo màu với iodine

Ta có 2n: độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống nghiệm thứ n

2: số ml tinh bột trong mỗi ống nghiệm

Vậy đơn vị hoạt tính của 1ml dung dịch enzyme là: 2n × 2

Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa 9ml môi trường gelatin - peptone vô trùng

Lấy 1ml enzyme cho vào các ống nghiệm đã chuẩn bị, lắc đều

Tiến hành nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ và 370C trong 48 giờ

Lấy các ống nghiệm trên đưa vào môi trường lạnh ở 20C trong 30 phút Làm lạnh

Kết quả

Phản ứng (+): môi trường geletin – peptone sẽ hóa lỏng

Phản ứng (-): môi trường gelatin – peptone vẫn đông đặc

3.2 Định lượng (theo phương pháp Gross và Fuld)

Nguyên tắc

Casein hòa tan trong môi trường kiềm yếu và bị kết tủa khi thêm dung dịch acid acetic trong etanol Trong điều kiện này, sản phẩm thủy phân của casein không bị kết tủa Phương pháp Gross và Fuld dựa trên cơ sở xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết

để phân giải 2mg casein đến mức không bị kết tủa bởi acid acetic trong điều kiện thí nghiệm

Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme của 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1mg casein ở 380C trong 30 phút

Lấy 1ml dung dịch của ống thứ 12 bỏ đi

Đặt tất cả các ống nghiệm vào tủ ấm trong 10-15 phút để dung dịch enzyme đạt đến 380C

Thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch casein (đã đạt đến 380C), lắc đều, giữ ở 380C trong 30 phút

Làm lạnh ngay trong nước đá để ngừng phản ứng

Cho cẩn thận theo vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic

Các ống casein chưa bị phân giải hết, xuất hiện vòng kết tủa trắng ở mặt tiếp xúc Tính kết quả

Ví dụ sau khi cho dung dịch acid acetic vào các ống nghiệm quan sát thấy từ ống thứ nhất đến ống thứ 7 hoàn toàn không có kết tủa, bắt đầu xuất hiện kết tủa ở ống thứ

8 Điều đó cho phép kết luận lượng enzyme trong ống thứ 7 là lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2mg casein Ở ống thứ 7 dung dịch enzyme bị pha loãng

64 lần, tương ứng với 0,0156ml dung dịch ban đầu Như vậy, 1ml dung dịch nghiên cứu ban đầu có hoạt độ là 128 đơn vị (2 : 0,0156ml)

Từ số liệu này có thể tính được số đơn vị có trong 1g chế phẩm Ví dụ : 1g chế phẩm hòa tan trong 100ml, 1ml có 128 đơn vị, như vậy 1g chế phẩm có 12 800 đơn vị

Ghi chú

Nếu sau khi cho acid acetic vào, ở tất cả các ống đều kết tủa, có nghĩa là dung dịch enzyme hoạt động yếu, cần chuẩn bị dung dịch ban đầu có nồng độ enzyme cao hơn Ngược lại, nếu ở tất cả các ống đều không có kết tủa, cần pha loãng dung dịch enzyme ban đầu trước khi cho vào các ống nghiệm

Phương pháp này không thật chính xác nhưng khá đơn giản, vì vậy được sử dụng rộng rãi khi nghiên cứu hoạt động của các chế phẩm

Vi khuẩn sẽ có hình dạng đặc trưng trong vòng 24 giờ nuôi cấy Sau thời gian này

vi khuẩn có thể bị thay đổi hình dạng do nhiều nguyên nhân

Chuẩn bị vi khuẩn

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường dinh dưỡng tối thiểu lỏng

Nuôi ở 370C Quan sát hình dạng tế bào vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy dưới kính hiển vi thông qua tiêu bản nhuộm đơn

Tiến hành làm tiêu bản nhuộm đơn

Bước 1: Trải trùng (làm vết bôi)

Lấy 1 giọt nước cất vô trùng, cạ nhẹ đường cấy hoặc khuẩn lạc, hòa đều vào giọt nước và trải mỏng trên mặt phiến kính Để khô

Bước 2: Cố định mẫu

Hơ nhẹ phía dưới phiến kính qua ngọn lửa đèn 3 đến 4 lần, hoặc nhỏ vài giọt cồn ngay vết trải và đốt Rửa nước

Bước 3: Nhuộm màu

Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn (xanh metylene 0,1%) lên vết trải trong 1-2 phút Rửa nước Làm khô Quan sát với vật kính dầu (x100)

Kết quả: vi khuẩn sẽ bắt màu thuốc nhuộm khi quan sát dưới kính hiển vi, nhờ

vậy xác định được vi khuẩn có dạng hình cầu, hình que, hình phẩy,