Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn nitrate hóa từ nƣớc ao nuôi cá tra tại tỉnh an giang

Con số trên là một giá trị khổng lồ đối với các vùng nuôi tập trung, với lượng thải trên nếu không có giải pháp hạn chế sẽ là hiểm họa đối với môi trường nước vùng Đồng Bằng Sông Cửu Lon

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

Tên đề tài

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG

VI KHUẨN NITRATE HÓA TỪ NƯỚC AO NUÔI CÁ TRA TẠI TỈNH AN GIANG

Chủ nhiệm đề tài: Ths Trần Kim Hoàng

Cơ quan chủ trì: Đại Học An Giang

An Giang, tháng 12 năm 2012

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

từ 3 tháng tuổi trở lên Kết quả phân lập được 36 chủng vi khuẩn trong đó có 3 chủng vi khuẩn thuộc các giống Nitrobacter actobacillus acillus có khả năng chuyển hóa ammonium tốt Phân tích các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa và giải tr nh tự gen đ đ nh danh

được vi khuẩn là Bacillus subtilis ký hiệu chủng 2-25), Nitrobacter vulgaris (N1-1),

Lactobacillus acidophilus (N2-16) Các chủng vi khuẩn trên sau khi chọn lọc được sử

dụng làm tác nhân xử lý ammonium có trong nước thải ao nuôi cá tra Sau 5 ngày thí nghiệm hàm lượng NH4+

, NO2-, NO3- trong nước thải đều giảm đến giới hạn an toàn cho

cá và đạt giới hạn cho phép của Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước mặt bảo vệ đời sống thủy sinh và Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải sinh hoạt

Từ khoá: Vi khuẩn nitrat hoá ammonium, Bacillus subtilis, Nitrobacter vulgaris,

Lactobacillus acidophilus

MỤC LỤC

M Ắ i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iii

DANH SÁCH HÌNH iv

DANH SÁCH I Ắ v

CHƯƠNG 1 GIỚI HIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

1.3 Nội dung nghiên cứu 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO ÀI LIỆU 3

2.1 Ô nhiễm môi trường ao nuôi 3

2.2 Quá trình chuyển hóa Nitơ 4

2.2.1 Quá trình amon hóa 4

2.2.2 Quá trình nitrate hóa 4

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa 5

2.3 ình hình nghiên cứu vi khuẩn nitrate hóa trong và ngoài nước 6

2.3.1 rong nước 6

2.3.2 Ngoài nước 7

CHƯƠNG 3 Ậ LIỆU À PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 8

3.1 hời gian nghiên cứu, địa điểm thu và phân tích mẫu 8

3.2 ật liệu nghiên cứu 8

3.2.1 Dụng cụ 8

3.2.2 hiết bị 7

3.2.3 Môi trường nuôi cấy – xác định đặc tính sinh hóa 8

3.2.4 Hóa chất 9

3.3 Phương pháp nghiên cứu 9

3.3.1 Phương pháp điều tra thu thập số liệu 9

3.3.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu ở hiện trường (ao nuôi) 9

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 9

3.3.4 Định danh vi sinh vật 13

3.3.5 hử nghiệm khả năng khả năng chuyển hóa đạm của vi khuẩn tuyển chọn 14

3.4 Xử lý số liệu 15

CHƯƠNG 4 K QUẢ À HẢO LUẬN 16

4.1 Kết quả điều tra 16

4.1.1 hông tin về chủ hộ 16

4.1.2 Cơ cấu lao động 16

4.1.3 Kinh nghiệm nuôi thủy sản của nông hộ 16

4.1.4 Nguồn nước cho nuôi thủy sản 17

4.1.5 Kỹ thuật nuôi của nông hộ 18

4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm t nước và b n ao nuôi cá tra 22

4.2.1 Kết quả phân lập 22

4.2.2 Hình dạng tế bào và hoạt tính enzym 24

4.2.3 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn đư c chọn 27

4.3 hử nghiệm khả năng chuyển hóa đạm của các vi khuẩn đ tuyển chọn 28

4.3.1 hí nghiệm 1 28

4.3.2 hí nghiệm 2 32

CHƯƠNG 5 K LUẬN À Đ XUẤ 38

5.1 Kết luận 34

5.2 Đề xuất 38

ÀI LIỆU HAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 41

Phụ lục 1: Một số hình ảnh trong quá trình th c hiện 41

Phụ lục 2: Một số hóa chất, môi trường và phương pháp d ng trong nghiên cứu 45

Phụ lục 3: Kết quả thống kê 51

Phụ lục 4: hông tin về các dòng vi khuẩn đ phân lập 61

Phụ lục 5: Quy chuẩn về chất lư ng nước mặt bảo vệ đời sống thủy sinh (QC N 38 : 2011/BTNMT) 65 Phụ lục 6: Quy chuẩn về chất lư ng nước thải sinh hoạt (QC N 14 : 2008/BTNMT) 67

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: c c t u p n t c tr ng n c 14

Bảng 2: ng t n v c 16

Bảng 3: Nguồn n c c o nu t y sản 17

Bảng 4: ng t n v ao nu 18

Bảng 5: ức ăn và c ế đ c o ăn 19

Bảng 6: uản n c ao nu 20

Bảng 7: Bện c và p ơng p p đ u trị 21

Bảng 8: M t số óa c ất dùng để xử n c 22

Bảng 9: Kết quả p n ập 22

Bảng 10: c đ ể c c c ng v u n p n ập 24

Bảng 11: o t t n enzy và ả năng c uyển óa đ 25

Bảng 12: c đ ể s n , s n o c a c c c ng v u n 27

Bảng 13: Kết quả g ả tr n t gen 28

Bảng 14: Kết quả địn dan c c c ng v u n đ c tuyển c n 28

Bảng 15: ệu suất xử NH4+ t ng ệ 1 30

Bảng 16: ệu suất xử NO2- t ng ệ 1 31

Bảng 17: ệu suất xử NO3- t ng ệ 1 32

Bảng 18: ệu suất xử NH4+ c a t ng ệ 2 34

Bảng 19: ệu suất xử NO2- t ng ệ 2 35

Bảng 20: ệu suất xử NO3- t ng ệ 2 36

Bảng 20: K ả năng xử đ c a c c c ng v u n 36

DANH SÁCH HÌNH

n 1: Vòng tuần oàn N tơ trong t n n 6

Hình 2: S b ến đổ p trong t g an t ng ệ 29

Hình 3: S b ến đổ à ng N 4+ trong t g an t ng ệ 1 30

Hình 4: S b ến đổ à ng NO2- trong t g an t ng ệ 1 31

Hình 5: S b ến đổ à ng NO3- trong t g an t ng ệ 1 32

Hình 6: B ến đ ng p trong t g an t ng ệ 2 33

Hình 7: B ến đ ng N 4+ trong t g an t ng ệ 2 34

Hình 8: B ến đ ng NO2- trong t g an t ng ệ 2 35

Hình 9: B ến đ ng NO3- trong t g an t ng ệ 2 36

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Nghề nuôi cá Tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long đang phát triển mạnh cả về diện tích

lẫn mức độ thâm canh Theo quy hoạch phát triển đến năm 2020 sản lượng cá tra nuôi trồng tại Đồng Bằng Sông Cửu Long sẽ là 1.850.000 tấn thì lượng chất thải tương ứng

là 2.368.000 tấn chất hữu cơ trong đó có 93.240 tấn N; 19.536 tấn P và 651.200 tấn BOD5 Con số trên là một giá trị khổng lồ đối với các vùng nuôi tập trung, với lượng thải trên nếu không có giải pháp hạn chế sẽ là hiểm họa đối với môi trường nước vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long nói chung và đặc biệt nghiêm trọng đối với các vùng nuôi

cá tra (Dương Công Chinh và ctv, 2009)

Tất cả các hệ thống dùng cho việc nuôi cá tra đều có khả năng gây ra ô nhiễm môi trường như: thức ăn cho vào cá không sử dụng hết thức ăn, xác chết của động thực vật trong ao nuôi…hậu quả là các chất hữu cơ tích tụ lại trong ao nuôi Những chất này tích

tụ lâu ngày, lắng đọng vào môi trường sinh ra các hợp chất như: NO3-, NO2-, H2S, NH3,

CH4,… (dù ở hàm lượng thấp) cũng gây ô nhiễm môi trường ao nuôi, ảnh hưởng đến sức khỏe và sự tăng trưởng của cá, đó cũng là nguyên nhân gây ra dịch bệnh cho cá Nuôi thủy sản thâm canh chứa đựng nhiều tiềm năng không ổn định và đầy rủi ro Trong khi nuôi cần phải bổ sung một lượng lớn thức ăn và năng lượng trên 1 đơn vị thể tích nước Việc nuôi thâm canh chính là việc điều chỉnh sản xuất từ một diện tích lớn sang diện tích khá nhỏ Thức ăn tự chế rất dễ gây ô nhiễm môi trường, do mau tan rã trong nước Mặt khác, do thức ăn dư thừa, cùng với các sản phẩm thừa khác như phân, nước tiểu, xác cá chết…tập trung lắng tụ nơi đáy ao Thức ăn công nghiệp có thành phần dinh dưỡng cao đặc biệt là giàu protein, phốt pho sẽ là nguồn tác động mạnh mẽ đến môi trường

Trong nước luôn tồn tại hệ vi sinh vật rất phong phú, trong đó có nhiều loài có ích:

Pseudomonas stutzeri, Nitrosomonas, Cellulomonas, Bacillus subtilis, Bacillus sphaericus, Nitrobacter,… có khả năng phân giải các chất NO3-, NO2-, NH3, H2S… Nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu sản xuất và ứng dụng thành công chế phẩm sinh

học xử lý môi trường nuôi từ 1, 2 hay nhiều chủng vi khuẩn thuộc các giống Bacillus,

Lactobacillus, Saccharomyces

Nhằm góp phần xây dựng nền thủy sản phát triển bền vững, hạn chế dịch bệnh của động vật nuôi thủy sản đồng thời bảo vệ môi trường nước, việc nghiên cứu, phân lập hệ vi sinh vật hữu ích, có khả năng phân giải các chất hữu cơ có ý nghĩa rất quan trọng Chính

vì lý do đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn nitrate hóa từ nước

ao nuôi cá tra tại tỉnh An Giang” được thực hiện

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrate nhằm ứng dụng trong xử lý môi trường nuôi thủy sản

1.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bùn và nước ao nuôi cá tra

Xác định hình thái và khả năng chuyển hóa đường, nitrate của các chủng vi khuẩn phân lập được

Tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitrate hữu hiệu

Bố trí thí nghiệm xử lý nước thải ao nuôi cá tra với tác nhân xử lý là các chủng vi khuẩn

đã tuyển chọn

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Ô nhiễm môi trường ao nuôi

Chất lượng nước trong ao nuôi cá tra rất thấp, nước có màu xanh đậm, độ keo trong nước tăng cao Theo Nguyễn Hữu Thọ và Đỗ Đoàn Hiệp (2004), sau một vụ nuôi có nhiều chất hữu cơ lắng đọng ở đáy ao Nguyên nhân là do trong quá trình nuôi, người nuôi cung cấp thức ăn và phân bón…Các chất hữu cơ không sử dụng hết sẽ lắng xuống đáy Chất hữu cơ tích lũy tạo điều kiện cho vi sinh vật đáy phát triển, làm nghèo oxy trong nước, sinh ra một số khí độc gây hại cho cá như: H2S, NH3-, NO2-, NO3-,…đặc biệt trong các lớp nước gần đáy ao hồ thường tích tụ nhiều H2S và cũng vì thế mà có nhiều vi khuẩn lưu huỳnh

Các mô hình nuôi cá tra hiện nay thả giống với mật độ rất dày đồng thời sử dụng lượng thức ăn rất lớn, chủ yếu là loại thức ăn viên và thức ăn tự chế biến và thức ăn tươi sống

tự chế của người dân Trong đó, thức ăn do người nuôi tự chế cần phải được quan tâm nhiều về chất lượng của hai loại thức ăn này rất thấp, dễ tan nên dễ gây ô nhiễm môi trường nước vì thành phần chủ yếu trong thức ăn này là cá tạp, bột cá, bột xương, cám, tấm, các phụ phẩm từ các nhà chế biến thủy sản hay từ các lò giết mổ gia súc để phối trộn Hai loại thức ăn này nếu sử dụng quá mức thì dẫn đến dư thừa, tan trong nước và tạo thành những vật chất lơ lửng, hoặc các chất hòa tan, sau đó chuyển hóa các phân tử carbon, nitơ ammoniac (N), và phosphorous (P) trong môi trường nước gây hại đến cá

nuôi (Chau Thi Đa và ctv, 2008)

Theo tính toán chỉ khoảng 20% lượng thức ăn khô được chuyển vào thành trọng lượng

cá còn lại là do dư thừa, bài tiết và đặc biệt được thải ra theo con đường tiêu hóa

Dưới tác động của nhiệt độ, hàm lượng oxy sẵn có trong ao, cùng với sự hiện diện các

vi khuẩn hiếu khí, yếm khí… Những chất dư thừa trên sẽ phân hủy, cường độ tăng dần

qua các tháng nuôi, bùn lắng có thể phát sinh từ nguồn này (Dương Công Chinh và ctv,

2009)

Chất hữu cơ trong thuỷ vực, trước hết là nguồn thức ăn cho thuỷ sinh vật, phần còn lại lắng đọng xuống nền đáy tạo thành chất bùn đáy thủy vực Khi lượng chất hữu cơ quá nhiều, quá trình phân hủy nhiều oxy hòa tan trong thủy vực gây nên hiện tượng nhiễm bẩn hay mất dinh dưỡng trong thủy vực (Lê Huy Bá, 2000)

Thực tế đã cho thấy nuôi cá theo hình thức thâm canh đã có tác động rất lớn đến môi trường do thức ăn dưa thừa, chất thải dạng phân và chất bài tiết bị tích góp lại trong nước và nền đáy Dưới hoạt động của vi sinh vật và các quá trình phân huỷ, chất thải chuyển thành Amoni, Nitrate, Photphat…các chất khoáng đã kích thích sự phát triển của tảo dẫn đến hiện tượng nở hoa trong ao Thêm vào đó các độc tố phát sinh từ quá trình phân huỷ chất thải trong khi nuôi và sự tàn lụi của tảo làm cho môi trường nuôi nhanh chóng bị suy thoái, các đối tượng nuôi dễ bị stress và chết do mắc bệnh, thiếu oxi hay tăng độc tính của các chất chuyển hoá Giải pháp cho vấn đề trên là biện pháp thay nước như vậy, chất dinh dưỡng, tảo cùng các chất ô nhiễm đã được cho ra khỏi ao và thay thế bởi nguồn nước có chất lượng tốt hơn có tác dụng cải tạo môi trường trong ao nuôi Với việc thải bỏ chất thải không được quản lý và kiểm soát trong điều kiện cơ sở

hạ tầng phát triển cấp thoát cho khu vực nuôi không được đảm bảo thì chất thải từ khu vực nuôi này sẽ theo nguồn nước cấp vào các khu nuôi khác Trên cơ sở đó để bảo vệ

môi trường, hạn chế tác động từ bên ngoài biện pháp duy nhất là chất thải từ các khu

nuôi thâm canh đều phải được xử lý (Dương Công Chinh và ctv, 2009)

Theo Arulampalam, P., F và ctv (1998) giải pháp hiệu quả và an toàn được lựa chọn

hiện nay là sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản để giảm ô nhiễm ao nuôi là một hướng đi có triển vọng và đáng được quan tâm nhất hiện nay Tuy nhiên,

trong nước luôn tồn tại hệ vi sinh vật có ích: Nitrosomonas, Pseudomonas, Bacillus… đặc biệt là Nitrosomonas có khả năng phân giải NH3 góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường nước ao

Vi sinh vật sống trong đất và trong nước tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ biến chúng thành CO2 và các hợp chất vô cơ khác dùng làm thức ăn cho cây trồng Các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ (N2) trong không khí thành hợp chất nitơ (NH3, NH4+) cung cấp cho cây cối Vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất khó tan chứa P, K, S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên

Sự phân hủy các chất hữu cơ diễn ra với tốc độ rất khác nhau Tùy thuộc vào thành phần của chúng và điều kiện của môi trường, sự phân hủy có thể diễn ra rất nhanh hay rất chậm Sự phân hủy vật chất hữu cơ xảy ra rất nhanh trong thủy vực ở những vùng gần

bề mặt nước, nhiệt độ nước mùa hè

Trong môi trường nước, các hợp chất hữu cơ chứa nitơ được chuyển hóa thành các hợp chất vô cơ hòa tan (NH

Amonia (NH3) là một chất độc với cá ngay cả ở hàm lượng thấp, NO2- cũng độc với cá

dù không độc như NH3 Nitrate (NO3-) không độc ở hàm lượng thấp, tuy nhiên độc ở hàm lượng cao và với thời gian tiếp xúc dài Do đó, nếu không có sự chuyển hóa các thành phần độc này thành khí nitơ khuyếch tán ra khỏi nước, môi trường nước sẽ không thích hợp cho cá sống Vì vậy khi nuôi cá chúng ta cần để ý để tạo ra một chu trình chuyển hóa nitơ trong ao nuôi để giúp cho cá phát triển bình thường (Carter, 1995)

2.2 Chu trình chuyển hóa Nitơ

2.2.1 Quá trình amon hóa

Quá trình amon hóa là quá trình phân huỷ và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa nitơ dưới tác dụng của các loài vi sinh vật thành NH

4

+

Các hợp chất hữu cơ có N vi sinh vật NH3 hoặc NH4+

2.2.2 Quá trình nitrat hóa

Quá trình chuyển hóa từ NH3 (NH4+) dưới tác dụng của các loài vi sinh vật thành

NO3- được gọi là quá trình nitrate hóa Quá trình này phụ thuộc vào pH của môi trường

và xảy ra chậm chạp, Trong điều kiện pH thấp, tuy không phải tất cả, quá trình nitrate trải qua hai giai đoạn: nitrite hóa và nitrate hóa

- Giai đoạn 1: oxi hóa NH3 thành nitrite (nitrite hóa)

NH4 + 3/2 O2 vi sinh vật NO2- + 2H+ + H2O +Q

Tham gia quá trình này có 4 giống chủ yếu: Nitrosomonas; Nitrosolobus;

Nitrocystis; Nitrosospira…Tất cả chúng đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa, chỉ

khác nhau về mặt hình thái học và cấu trúc tế bào

Các đại diện của giống Nitrosomonas không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé hình bầu dục Trên môi trường lỏng, Nitrosomonas trải qua một số pha, phát triển tùy thuộc

một số điều kiện Hai pha chủ yếu là pha di động- tế bào có 1 hay chùm tiên mao và pha tập đoàn khuẩn keo-các tế bào không di động

- Giai đoạn 2: oxi hóa nitrite thành nitrate (nitrate hóa)

NO2- + ½ O2 vi sinh vật NO3- + Q

Tham gia quá trình này gồm có 3 giống vi sinh vật: Nitrobacter; Nitrospira;

Nitrococcus Những vi sinh vật nitrit hoá đều là những sinh vật tự dưỡng hoá tổng

hợp, lấy năng lượng từ quá trình oxy hoá Chẳng hạn, Nitrosomonas khi chuyển hóa

amoniac thành NO2- sinh ra năng lượng 65 Cal/mol, còn Nitrobacter tạo ra năng lượng

17 Cal/mol Chúng sử dụng một phần năng lượng này để kiếm nguồn cacbon từ việc khử CO2 hay HCO3- Như vậy, khi thực hiện điều này để tự tăng trưởng, chúng đã sản sinh ra một lượng đáng kể nitrite hoặc nitrate cho môi trường

Nitrate (cũng như nitrite) dễ dàng lọc khỏi đất, đặc biệt trong đất chua Nếu không được thực vật đồng hoá, chúng có thể thoát ra khỏi hệ sinh thái này để đến hệ sinh thái khác qua sự chu chuyển của nước ngầm

Điều kiện chung cho vi khuẩn nitrate hóa là pH: 5,5 - 9, nhưng tốt nhất là 7,5, khi pH < 7 thì vi khuẩn phát triển chậm lại

Tế bào đặc trưng của Nitrobacter trong dịch nuôi thường có dạng hình que tròn,

hình hạt đậu, hoặc hình trứng, có thể di động hoặc không di động Khi điều kiện không

thuận lợi chúng có thể hình thành những tập đoàn khuẩn keo Chẳng hạn Nitrospina

gracilis là những trực khuẩn thẳng, mảnh dẻ, thỉnh thoảng có dạng hình cầu, không di

động, và có đặ trưng là hình thành những tập đoàn khuẩn keo, Nitrococcus mobilis có

dạng hình tròn, có tiên mao

Vi khuẩn nitrate hóa không sử dụng các chất hữu cơ và chuyển hóa một cách chặt chẽ đối với việc oxi hóa cơ chất NH3 và nitrite

2.2.3 Quá trình phản nitrate hóa

Phản nitrate hóa là quá trình vi sinh vật thực hiện việc khử nitrate thành nitrogen phân tử, đồng thời oxi hóa các chất hữu cơ như đường, rượu, axit hữu cơ thành CO2 và

H2O với chất nhận điện tử cuối cùng là NO3- Năng lượng sinh ra khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong quá trình hoạt động sống của mình

Quá trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí lẫn kỵ khí, nhưng đặc biệt mạnh trong điều kiện kỵ khí

Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Phần lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kỵ khí tùy nghi gồm một số giống như:

Pseudomonas, Chúng sử dụng nitrat như nguồn oxy với sự có mặt của glucose và

photphat, có khả năng khác nhau trong sự khử nitrate theo 2 bước:

- Chuyển hóa nitrate thành nitrite

- Tạo ra nitơ oxít, đinitơ oxít, khí nitơ

Cơ chế: Dưới tác dụng của các loài vi sinh vật:

HNO3 +2H HNO2 +2H HNO +2H N2O +2H N2↑ + H2O

và tiếp theo bị khử trong quá trình phản nitrate trở thành nitơ phân tử Do quá trình phản nitrate đến nitơ phân tử chỉ xảy ra trong điều kiện kỵ khí hay kỵ khí một phần, nên quá trình này thường gặp trong đất yếm khí và trong đáy sâu của các hồ, các biển không

có oxy hoặc giàu các chất hữu cơ đang bị phân huỷ

Hình 1 : Vòng tuần hoàn Nitơ trong ao nuôi Nguồn: Robert M Durborow, 1997 2.3 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn chuyển hóa đạm trong và ngoài nước

2.3.1 Trong nước

Theo nghiên cứu của Phan Trường Khanh (2007), vi khuẩn Pseudomonas

stutzeri có khả năng phân giải ammonium trong nước ao tôm, chúng làm giảm hàm

lượng NH4+ từ 4,8 mg/l xuống còn 2,5 mg/l trong thời gian 5 ngày và làm giảm NO3- từ 4,185 mg/l còn 0,048 mg/l sau 5 ngày thí nghiệm

Trong nước ao nuôi cá tra, Pseudomonas stutzeri dòng D3b có khả năng làm

giảm hàm lượng NH4+ từ 3,06 mg/l xuống còn 0,11 mg/l trong thời gian 5 ngày (Trần Kim Hoàng, 2008)

Kết quả nghiên cứu của Phan Trường Khanh (2008) phân lập được 20 dòng vi

khuẩn Pseudomonas, tất cả các dòng vi khuẩn điều có khả năng khử được nitrate và

đạm amon trong mẫu nước ao nuôi tôm

Báo cáo của dự án Xử lý và tái chế nước và chất thải rắn từ ao nuôi cá vùng đồng bằng sông Cửu Long để cải thiện đời sống và giảm ô nhiễm nước đã phân lập được 15 dòng vi khuẩn khử đạm từ chất thải ao nuôi cá tra dọc theo sông Tiền và sông Hậu bằng môi trường SW-LB (môi trường nước biển nhân tạo Luria Britani) bổ sung với 10 mM NH4+ và NO3- 11 dòng được xác định là vi khuẩn Pseudomonas stutzeri

dựa trên mức độ tương đồng PCR-16S rRNA dùng các primers phổ biến và chuyên dụng Có 4 dòng là có hiệu quả trong việc làm giảm các mức N hòa tan (NH4+, NO2- và

NO3-) trong nước ao nuôi cá từ mức ban đầu là 10 mg/l xuống gần bằng 0 sau 4 ngày xử

lý

2.3.2 Ngoài nước

Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về xử lý môi trường và điều trị các bệnh do vi sinh vật gây ra cho động vật nuôi thủy sản bằng phương pháp sử dụng các vi sinh vật đối kháng ngày càng được quan tâm Nghiên cứu của Abraham (2001) về vai trò đối kháng của vi khuẩn đặc biệt là các vi khuẩn cùng tồn tại trong cùng một môi trường được xem như là những tác nhân điều khiển sinh học quan trọng thay thế cho các loại thuốc kháng sinh và hóa chất xử lý môi trường

Các probiotics thường được sử dụng trong NTTS thuộc các nhóm vi khuẩn sinh

acid lactic như (Lactobacillus, Carnobacterium ), Vibrio (Vibrio alginolyticus),

Bacillus và Pseudomonas (Singh, 2001)

Rao (2002) vi khuẩn kỵ khí có trong bùn đáy ao có khả năng khử nitrate thành

khí nitơ Có ít nhất 14 giống vi khuẩn có khả năng khử nitrate Trong đó, Pseudomonas,

Bacillus và Alkaligenes là những giống có số lượng nổi bật nhất Yêu cầu cần thiết của

các vi sinh vật xử lý chất hữu cơ là chúng phải có khả năng phân chia nhanh và hệ

enzym hiệu quả chẳng hạn giống Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,

Bacillus cereus, Bacillus coagulans), giống Phenibacillus (Phenibacillus polymyxa)

Tuy nhiên, những giống vi khuẩn này thường không hiện diện trong nước ở số lượng cần thiết, nơi cư trú của chúng là ở bùn đáy Khi bổ sung vào môi trường nước một số

lượng cần thiết các dòng Bacillus thì chúng sẽ cạnh tranh với hệ vi khuẩn vốn có trong

các chất thải hữu cơ như thức ăn thừa, xác bã của động vật nuôi thủy sản (Sharma, 1999)

Singh et al.,( 2001), Bacillus được trộn vào trong bùn, cát, thức ăn lắng dưới đáy

ao như là chất sinh học bổ sung Lactobacillus cũng được sử dụng cùng với Bacillus để

phân hủy cặn bã hữu cơ Hai chủng vi khuẩn này sản xuất 1 hệ enzym đa dạng, có khả năng phân hủy protein và tinh bột thành các phân tử nhỏ, và các phân tử nhỏ này được

sử dụng như là nguồn cung cấp năng lượng bởi các sinh vật khác

Việc loại bỏ một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ làm giảm độ đục của môi trường nước (Haung, 2003)

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian nghiên cứu, địa điểm thu và phân tích mẫu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2010 đến tháng 8/2011

- Địa điểm nghiên cứu

+ Địa điểm điều tra: Điều tra, thu thập số liệu các nông hộ nuôi cá tra tại hai nơi: huyện Châu Thành và xã Mỹ Hòa Hưng, Tp Long Xuyên

+ Địa điểm thu mẫu: huyện Châu Thành và xã Mỹ Hòa Hưng, Tp Long Xuyên Thu các ao nuôi cá tra từ 3 tháng tuổi trở lên

- Địa điểm phân tích và bố trí thử nghiệm: Phòng thí nghiệm khoa Nông nghiệp, trường Đại Học An Giang

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.3 Môi trường nuôi cấy – xác định đặc tính sinh hóa

Môi trường Nutrient agar

Môi trường gelain – peptone

Xác định khả năng nitrite hóa bằng môi trường Vinogradxkii 1

Xác định khả năng nitrate hóa bằng môi trường Vinogradxkii 2

Xác định khả năng phản nitrate bằng môi trường Vinogradxkii 3

3.2.4 Hóa chất

Nhuộm Gram

Kiểm tra khả năng chuyển hóa đạm

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp điều tra thu thập số liệu

Điều tra dưới dạng lập phiếu câu hỏi và đến phỏng vấn lấy thông tin trực tiếp từ các nông hộ tại huyện Châu Thành và xã Mỹ Hòa Hưng, Tp Long Xuyên

Số phiếu điều tra: mỗi địa điểm 50 phiếu Tổng cộng 100 phiếu

Nội dung điều tra liên quan đến hoạt động nuôi trồng thủy sản của các hộ nuôi cá tra ao hầm:

+ Sơ lược thông tin nông hộ: trình độ, nghề nghiệp, số lao động chính, và tổng diện tích nuôi

+ Tình hình nuôi: điều kiện ao nuôi, kỹ thuật nuôi (cải tạo ao, thả giống, quản lý, chăm sóc, các loại thuốc phòng trị bệnh cá mà người dân đang sử dụng)

3.3.2 Phương pháp thu và bảo quản mẫu ở hiện trường (ao nuôi)

Thời gian thu mẫu: từ lúc 6 giờ đến 8 giờ Thu mẫu khi ao chưa sử dụng kháng

sinh và chế phẩm sinh học, hoặc sau 10 ngày đối với các ao có sử dụng thuốc hoặc chế phẩm sinh học

Số lượng mẫu thu: Mẫu được thu tại 10 ao, mỗi ao thu ba mẫu nước và bùn ở ba

vị trí khác nhau để đại diện cho toàn ao Vị trí thứ nhất là nơi nước vào, vị trí thứ hai là giữa ao và vị trí thứ ba là nơi nước thoát ra

Cách thu mẫu nước: Dùng xuồng bơi lại ba vị trí trên, ấn bình có nắp đậy xuống

dưới mặt nước từ 30-40 cm, mở nắp bình cho nước chảy vào từ từ, khi thấy không có bọt khí nổi lên là nước đã đầy bình, đậy nắp lại Sau khi thu đủ ba vị trí, trộn ba mẫu lại với nhau được một mẫu đại diện cho toàn ao

Cách thu mẫu bùn: Bơi xuồng lại ba vị trí trên, dùng dụng cụ thu mẫu bùn để

thu mẫu Tiến hành thu như mẫu nước

Mẫu nước và bùn được bảo quản ở 40C đến khi tiến hành nghiên cứu

3.3.3 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật

a Phương pháp phân lập

Pha loãng mẫu nước: 10-1

, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Cách pha loãng mẫu ra 10-1

ta dùng micropipet Gibson hút 1ml mẫu nước (trước khi hút ta lắc mẫu lên cho đều) cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,9 %, cách pha loãng mẫu ra 10-2

ta dùng

micropipet Gibson hút 1ml từ mẫu 10-1

cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh

lý 0,9 % và tương tự ta pha loãng ra 10-3

, 10-4, 10-5, 10-6 Mẫu bùn: 10 g bùn hòa vào 90 ml nước muối sinh lý 0,9 % cho vào bình tam giác 250 ml Sau đó ta bỏ lên máy lắc trong khoảng 15 - 20 phút Để lắng lại ta thu được dịch huyền phù của mẫu bùn

Pha loãng huyền phù của mẫu bùn:10-2

, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 Cách pha loãng mẫu ra 10-2

ta dùng micropipet Gibson hút 1ml huyền phù của mẫu bùn cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lý 0,9 %, cách pha loãng mẫu ra 10-3

ta dùng micropipet Gibson hút 1ml từ mẫu 10-2

cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh

lý 0,9 % và tương tự ta pha loãng ra 10-4

, 10-5, 10-6 Dùng micropipet Gibson hút 10 µl dung dịch pha loãng 10-5

, 10-6 nhỏ trực tiếp lên đĩa môi trường phân lập, dùng que thủy tinh vô trùng dàn đều giọt dung dịch trên toàn bộ môi trường, ủ 7 ngày, ở 280

C

Khi khuẩn lạc xuất hiện trên mặt môi trường, chọn những khuẩn lạc rời tiếp tục cấy chuyền trên môi trường phân lập đến khi khuẩn lạc rời (ròng) Nếu khuẩn lạc không xuất hiện thì ta tăng nồng độ lên 10-2

, 10-3, 10-4 cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện

Sau những lần cấy chuyền, chọn những khuẩn lạc rời, nằm trên đường cấy, quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng (đồng nhất về hình dạng và kích thước) thì tiến hành quan sát, đo kích thước khuẩn lạc; quan sát hình dạng, đo kích thước tế bào vi khuẩn

b Quan sát và đo kích thước khuẩn lạc

Quan sát khuẩn lạc (hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa khuẩn lạc) bằng mắt thường Với những khuẩn lạc nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát

Đo kích thước khuẩn lạc bằng thước milimet (mm)

c Nhuộm Gram vi khuẩn

Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:

Lấy 10l nước cất vô trùng nhỏ lên giữa lam kính

Dùng que cấy đã khử trùng lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng lên lam kính

Hơ nhanh mặt dưới của lam kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu

Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm Crystal violet lên kính, trải đều, để 1 phút

Rửa lại bằng nước cất, dùng giấy thấm chấm nhẹ cho bớt nước, để mẫu khô Nhỏ 1-2 giọt dung dịch Lugol, để yên 1 phút

Rửa lại bằng nước cất, dùng giấy thấm chấm nhẹ cho bớt nước

Rửa mẫu bằng cồn 70 % thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối lam kính đến khi mẫu không còn màu tím

Rửa lại bằng nước cất, dùng giấy thấm chấm nhẹ cho bớt nước, để khô vài giây Nhỏ 1-2 giọt thuốc nhuộm Fushin, trải đều, để yên 1 phút

Rửa lại bằng nước cất đến khi mất hết màu hồng của thuốc nhuộm Fushin, dùng giấy thấm chấm nhẹ cho khô nước Quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100X

d Xác định khả năng sinh ra enzyme catalase

Dùng kim cấy lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần (sinh khối khuẩn lạc thuần

có được từ sau những lần cấy chuyền) đặt lên phiến kính sạch Nhỏ một giọt H2O2 30 % lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính Nếu có sinh ra catalase thì có xuất hiện bọt khí, ngược lại thì không (Trần Linh Thước, 2005)

Khả năng sinh ra enzyme catalase của khuẩn lạc được quy định như sau:

Dấu (-): không sinh ra bọt khí, không có khả năng sinh ra enzyme catalase Dấu (+): sinh ra bọt khí ít, có khả năng sinh ra enzyme catalase nhưng rất yếu Dấu (+ +): sinh ra bọt khí nhiều, khả năng sinh ra enzyme catalase mạnh

Dấu (+ + +): sinh ra bọt khí rất nhiều, có khả năng sinh enzyme catalase rất mạnh

e Xác định khả năng sinh ra enzyme amylase

Cho vào mỗi ống nghiệm 1ml nước muối 0,1 %

Vi khuẩn sau khi được nhân sinh khối trong môi trường lỏng, đem ly tâm, chỉ lấy phần nước trong Lấy 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm có chứa 1ml nước muối 0,1 % và lắc đều

Sau đó cho vào tất cả các ống 1ml tinh bột 0,1 % lắc đều Đặt các ống trên trong nồi cách thuỷ ở 30 0C trong 30 phút Lấy các ống ra, nhỏ giọt iod 0,02 N vào mỗi ống

Nếu có hoạt tính amylase, làm mất màu dung dịch iod 0,02 N

Nếu không có hoạt tính amylase, không làm mất màu dung dịch iod

Khả năng sinh ra enzyme amylase của khuẩn lạc được ký hiệu như sau:

Dấu (-) là không có khả năng sinh ra enzyme amylase

Dấu (+) là có khả năng sinh ra enzyme amylase nhưng rất yếu

Dấu (+ +) là có khả năng sinh ra enzyme amylase mạnh

Dấu (+ + +) là có khả năng sinh ra enzyme amylase rất mạnh

f Xác định khả năng sinh ra enzyme protease

Cho vào ống nghiệm 9 ml môi trường lỏng gelatin – peptone

Vi khuẩn sau khi được nhân sinh khối trong môi trường lỏng, đem ly tâm, chỉ lấy phần nước trong Lấy 1ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm có chứa 9 ml môi trường gelain – peptone, lắc đều

Sau đó nuôi cấy ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lấy các ống nghiệm trên đưa vào môi trường lạnh ở 2 0C trong 30 phút Sau khi đưa vào môi trường lạnh ở 2 0C, đặt nghiêng các ống nghiệm và đọc kết quả :

Nếu có hoạt tính protease, môi trường gelatin – peptone bị hóa lỏng

Nếu không có hoạt tính protease, môi trường gelatin – peptone vẫn đông đặc Khả năng sinh ra enzyme protease của khuẩn lạc được ký hiệu như sau:

Dấu (-) là không có khả năng sinh ra enzyme protease

Dấu (+) là có khả năng sinh ra enzyme protease nhưng rất yếu

Dấu (+ +) là có khả năng sinh ra enzyme protease mạnh

Dấu (+ + +) là có khả năng sinh ra enzyme protease rất mạnh

g Xác định khả năng chuyển hóa amon

Khả năng nitrite hóa

Đây là quá trình chuyển từ NH4+

thành NO2- dưới tác dụng của vi sinh vật

10-4, 10-5 vào ống nghiệm có môi trường Đem nuôi ở nhiệt độ 28-30 oC trong 5-7 ngày

Quan sát vi khuẩn và kiểm tra kết quả

NO2- tác dụng với dung dịch Griess I và Griess II sẽ tạo thành hợp chất màu hồng hoặc đỏ theo phản ứng sau:

α Napthilamin Napthilamin azoic sunfoaxit

(Màu hồng)

Khả năng nitrate hóa

Đây là quá trình chuyển hóa NO2- thành NO3- dưới tác dụng của vi sinh vật

Kiểm tra kết quả

Cho một ít môi trường Vinogradxkii 2 đã nuôi cấy lên bản sứ Cho 1 giọt H2SO4đậm đặc và một giọt diphenylamin Nếu có màu xanh xuất hiện tức có NO3-

Cơ chế tác dụng như sau:

Diphenylamine + NO3- Sulfonylin diphenylamine

Lấy một ít dung dịch nuôi cấy vi khuẩn, cho vào bản sứ và cho dung dịch Griess

I, Griess II và Nếu có màu hồng đỏ xuất hiện, nghĩa là có phản nitrate hóa, sinh NO2

3.3.3 Thử nghiệm khả năng chuyển hóa đạm của vi khuẩn đã tuyển chọn

- Sử dụng các chủng vi khuẩn cho kết quả dương tính với dephenylamin (từ +++

trở lên) để bố trí thử nghiệm

- Thí nghiệm tiến hành trên mẫu nước ao cá tra

- Mẫu nước được xử lý bằng tia cực tím để loại bỏ vi khuẩn có trong nước

+ Đo chỉ số pH, hàm lượng N-NO2-, N-NO3-, NH3 Trong trường hợp hàm lượng

NH3 thấp, sử dụng NH4Cl để nâng hàm lượng này đạt đến khoảng 10 ppm

+ Các dòng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm được nhân giống cấp 2 trong bình chứa môi trường dinh dưỡng, đặt trên máy lắc sau khoảng 4 ngày, khi mật số vi khuẩn đạt khoảng 106

-107 tế bào/ml, sử dụng để bố trí thí nghiệm

- Thí nghiệm xác định khả năng khử đạm của vi khuẩn gồm 2 thí nghiệm

+ Thí nghiệm 1: được bố trí thành 4 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần)

bao gồm:

 1 nghiệm thức đối chứng (không bổ sung chủng vi khuẩn chuyển hóa nitrate)

 3 nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn

 Thể tích nước thải từ ao cá dùng để bố trí: 500ml

 Điều kiện thí nghiệm: Không sục khí trong thời gian thí nghiệm

 Thời gian bố trí thí nghiệm: 3 ngày, hoặc kết thúc khi hàm lượng N-NH3

 Các chỉ tiêu theo dõi:

ảng 1: Các ch tiêu phân tích môi trường nước

2 NH4+ mg/l Phương pháp Indophenol Blue so màu máy

[A]: Nồng độ trung bình của nghiệm thức đối chứng sau khi thí nghiệm kết thúc [B]: Nồng độ trung bình của nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn sau khi thí nghiệm kết thúc

+ Thí nghiệm 2:được bố trí thành 5 nghiệm thức (mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần) bao gồm:

 1 nghiệm thức đối chứng (không bổ sung chủng vi khuẩn chuyển hóa nitrate)

 3 nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn

 1 nghiệm thức có bổ sung dung dịch xử lý nước BKC

 Thể tích nước thải từ ao cá dùng để bố trí: 10ml

 Điều kiện thí nghiệm: Sục khí trong thời gian thí nghiệm

 Thời gian bố trí thí nghiệm: 5 ngày, hoặc kết thúc khi hàm lượng N-NH3

<1ppm ở bất kỳ nghiệm thức nào

 Thời điểm thu mẫu: cứ 24h thu mẫu nước xác định hàm lượng ammonium, nitrite, nitrate trong mẫu

 Các chỉ tiêu theo dõi: pH, NH4+, N-NO2-, N-NO3

- Tính hiệu suất xử lý N-NO2-, N-NO3-, NH3 sau khi thí nghiệm kết thúc

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả điều tra

4.1.1 Thông tin về chủ hộ

Kết quả khảo sát cho thấy độ tuổi trung bình của chủ hộ nuôi thủy sản là 47 tuổi, trình độ học vấn trung bình là 5,7/12, phần lớn chỉ học đến tiểu học, chỉ có 1 số ít học đến cấp 2 Việc nuôi thủy sản của những hộ này do người thân trong gia đình thực hiện hoặc có thể thuê người quản lý các trại nuôi và lao động nuôi thủy sản, đặc biệt là những hộ nuôi cá tra với quy mô lớn (từ 1 ha trở lên)

4.1.2 Cơ cấu lao động

Số nhân khẩu trung bình/hộ là 5,2 người Về cơ cấu lao động của hộ, số lao động chính trung bình của hộ là 3,7 người Đối với những hộ nuôi thủy sản với quy mô lớn thường cần nhiều lao động để quản lý, chăm sóc và thu hoạch Do đó, nguồn lực nông

hộ thường không đủ và hộ thường thuê thêm lao động Có 72% nông hộ thuê thêm nguồn lao động từ địa phương hoặc từ các nơi khác Riêng đối với các hộ nuôi thủy sản

ở quy mô nhỏ thì không cần nhiều lao động (1-2 người) nên nguồn lao động của gia đình đủ đáp ứng trong quá trình nuôi, họ chỉ thuê thêm lao động khi thu hoạch

4.1.3 Kinh nghiệm nuôi thủy sản của nông hộ

ĐBSCL là vùng trồng lúa lâu đời nên hầu hết các nông dân đều có hơn 20 năm kinh nghiệm trồng lúa; trái lại nghề nuôi cá chỉ phát triển trong khoảng 10 năm trở lại đây nên người nuôi cá còn rất ít kinh nghiệm, kinh nghiệm trung bình là 9,4 năm

4.1.4 Nguồn nước nuôi thủy sản

Nguồn nước là yếu tố quan trọng trong nuôi thủy sản Tùy thuộc vào vị trí ao nuôi, cũng như chất lượng hệ thống thủy lợi trong vùng các hộ nuôi thủy sản sử dụng nguồn nước và chất lượng nước khác nhau Kết quả điều tra cho thấy, 100% hộ sử dụng nước kênh Về chất lượng nước nuôi thủy sản, ý kiến các nông cũng rất khác nhau: 51

%: tốt; 25% trung bình và 24 % xấu Nhưng tất cả chủ hộ đều cho rằng chất lượng nước

tương đối tốt vào mùa lũ do trong thời gian này lượng nước lớn đã cuốn trôi các loại

chất thải Chất thải từ ao cá là nguyên nhân chủ yếu gây ô nhiễm nước Vào mùa khô chất lượng nước kém thêm vào đó nước thải từ ruộng với nhiều hóa chất, thuốc trừ sâu làm ô nhiễm nguồn nước, gây ảnh hưởng không ít đến hoạt động nuôi trồng thủy sản

ảng 3: Nguồn nước nuôi thủy sản

03 Nơi chứa nước thải

- Sông hoặc kênh

- Ruộng lúa (Paddy)

- Ao lắng

68

24

8

- Nguồn nước sử dụng cho ao nuôi

Nguồn nước cấp được lấy trực tiếp từ kênh/sông, không xử lý hoặc xử lý bằng vôi trước khi cấp vào ao, nguồn nước này cung cấp vào ao nuôi bằng máy bơm hoặc bằng cống đặt ngầm

- Nguồn nước thải từ ao nuôi

Kênh rạch là nguồn cung cấp nước cho ao nuôi nhưng đồng thời cũng nơi tiếp nhận chất thải Kết quả điều tra cho thấy hầu hết các nông hộ đều không có hệ thống xử

lý nước thải từ ao; 68% nông hộ thải trực tiếp ra kênh rạch, 24% thải ra ruộng lúa, chỉ

có 8% nông hộ có ao lắng Kết quả điều tra hiện trạng hệ thống nuôi trồng thủy sản tỉnh

An giang của Trung tâm nghiên cứu và phát triển nông thôn trường Đại học An giang thì mô hình nuôi cá tra trong ao chỉ có 15,9% số hộ trong toàn tỉnh có xử lý nước thải trước khi thải ra môi trường bên ngoài

4.1.5 Kỹ thuật nuôi của nông hộ

ảng 4: Thông tin về ao nuôi

02 Sự giúp đỡ của các kỹ thuật viên (%) 60

- Tham gia tập huấn kỹ thuật

Trong quá trình nuôi, các nông hộ tích luỹ dần kinh nghiệm và tiếp thu kỹ thuật nuôi thông qua các phương tiện thông tin đại chúng (TV, báo, đài…), các lớp tập huấn (82% nông hộ); tiếp cận với các hội nông dân, cán bộ khuyến ngư - khuyến nông (60% nông hộ) nên đã tiếp cận được với những tiến bộ kỹ thuật, cập nhật thông tin mới và áp dụng vào sản xuất có hiệu quả Qua cuộc điều tra, người dân mong muốn các lớp tập huấn nên đi sâu vào thực tế sản xuất, truyền bá kinh nghiệm phù hợp với điều kiện sản xuất của địa phương

- Mật độ thả nuôi

Qua điều tra mật độ thả nuôi thủy sản của các hộ rất khác nhau tuỳ thuộc vào diện tích

và độ sâu của ao Mật độ cá thả nuôi dao động từ 12-60 con/m2 Kích thước cá thả nuôi khoảng 2,5 -3,5cm

Kết quả khảo sát cho thấy, mật độ thả nuôi của các hộ còn phụ thuộc vào nguồn vốn của gia đình Những hộ có nguồn vốn lớn thường thả nuôi với mật độ cao

- Nguồn giống trong nuôi thủy sản

Cá giống được mua chủ yếu từ các cơ sở sản xuất giống tư nhân ở An Giang và Đồng Tháp, hầu như không mua ở Trung tâm sản xuất giống do giá thành con giống cao hơn

so với các hộ sản xuất tư nhân Điều này cũng có ảnh hưởng đến người nuôi do con giống không đảm bảo chất lượng dẫn đến tỷ lệ hao hụt trong quá trình nuôi cao

Theo các nông dân việc chứa số lượng lớn con giống trong các thùng chứa khi vận chuyển đã làm xây xát cơ thể cá cùng với việc chuyển đổi môi trường sống đã tạo điều kiện cho các loài ký sinh trùng, vi sinh vật gây bệnh tấn công làm cơ thể cá suy yếu nhanh chóng Nên trong giai đoạn đầu vụ nuôi (thả cá giống) tỉ lệ hao hụt rất cao, có khi lên đến 50%

Khi chọn mua con giống, các hộ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và dùng phương pháp cảm quan để đánh giá như: kích cỡ con giống tương đối đồng đều, màu sắc tươi sáng, hoạt động bơi lội nhanh, không bị dị tật và hầm ương phải sạch (chiếm 90%) Chỉ có khoảng 10% số hộ là nhờ cán bộ kỹ thuật kiểm tra con giống trước khi mua Các hộ này chủ yếu là những hộ nuôi với quy mô lớn

- Thức ăn và chế độ cho ăn

Chi phí thức ăn chiếm tỷ lệ lớn nhất trong đầu tư nuôi các mô hình thủy sản Hiện nay người nuôi thủy sản trên địa bàn tỉnh sử dụng nhiều loại nguyên liệu để tự sản xuất thức

ăn, cách chế biến và phối hợp khẩu phần cũng khác nhau tùy theo mô hình, kinh nghiệm nuôi và nguồn vốn của hộ

Qua điều tra có 3 dạng thức ăn được người nuôi sử dụng: thức ăn công nghiệp (27%) , thức ăn tự chế (58%), và hỗn hợp thức ăn công nghiệp và thức ăn tự chế (15%)

ảng 5: Thức ăn và chế độ cho ăn

01 Loại thức ăn (%)

03 Loại chất dinh dưỡng bổ sung (%)

còn sử dụng thêm bột cá và bột đậu nành, để tăng thêm hàm lượng đạm Hàm lượng đạm ở các loại thức ăn trên luôn ở mức 220

N - 320N Ngoài ra các hộ nuôi thường trộn thêm các vitamin, men vi sinh, 1 số khoáng chất vào thức ăn nhằm tăng thêm sức đề kháng của cá

Thời gian cho cá ăn trong ngày từ 9 giờ sáng đến 7 giờ tối Kết quả điều tra cho thấy số lần cho cá ăn trong ngày cũng khác nhau, 12% nông hộ cho cá ăn 1 lần/ngày, 78% nông

hộ cho cá ăn 2 lần/ngày, 10% nông hộ cho cá ăn 3 lần/ngày

- Quản lý nước ao nuôi

Lượng nước trong mỗi lần thay (thể tích ao) 1/3

04 Kiểm tra chất lượng nước

05 Hút bùn

Trong quá trình nuôi, hơn 95% hộ nuôi thường xuyên thay nước ( khoảng 1/3 thể tích

ao ) và có khoảng 50% hộ vét bùn đáy ao trong khi nuôi để loại bỏ thức ăn dư thừa lắng đọng dưới đáy ao, vào mùa khô thường hút bùn nhiều hơn mùa mưa, giai đoạn cá đạt

trọng lượng 500g/con đến thời điểm xuất cá nông hộ cho hút bùn và thay nước thường hơn lúc đầu vụ; cụ thể: hút bùn: 15 ngày/ lần, thay nước hầu như mỗi ngày, lượng nước thay khoảng 30% lượng nước trong ao/ mỗi ngày

- Phòng, trị bệnh thủy sản

Trong quá trình nuôi thủy sản, có không ít trở ngại liên quan đến các yếu tố thời tiết, khí hậu, môi trường, chất lượng con giống gây hao hụt trong quá trình nuôi Một trong những hạn chế ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả kinh tế của mô hình nuôi, đó là dịch bệnh Kết khảo sát cho thấy, bệnh thủy sản trên địa bàn tỉnh xuất hiện quanh năm, nhưng nhiều nhất vào mùa nước đổ (khoảng từ tháng 6 đến tháng 10) và trong giai đoạn chuyển mùa từ tháng 12 đến tháng 2 năm sau, khi có gió bấc, thời tiết trở lạnh Bệnh thường gặp nhất trên cá tra là gan thận có mủ, nhiễm ký sinh trùng, đốm trắng, cá có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, cá chết và nổi trên mặt nước; đối với cá lóc là nhiễm ký sinh trùng, nấm thủy mi, phù đầu, xuất huyết,

03 Hiệu quả điều trị

Đa số người dân đều thường xuyên trộn men tiêu hóa, vitamin C vào thức ăn cho thủy sản

để phòng bệnh Khi cá bệnh nông dân thường đến các đại lý thuốc thủy sản, liên hệ với kỹ thuật viên của công ty thuốc thủy sản để được hướng dẫn và mua thuốc điều trị Họ thường sử dụng các loại kháng sinh: Amoxycilline, Cotrim, Penicilline, Kanamycine, Oxamet…trộn vào thức ăn hoặc rãi trong nước Ngoài ra một số hộ nuôi sử dụng các

loại hóa chất xử lý nước như Vikong, BKC, Bioca, Yulai, Aquapure, Prawbac và 1 số loại khác

ảng 9: Kết quả phân lập:

STT Chủng vi

khuẩn

Màu sắc khuẩn lạc Đặc điểm khuẩn lạc

Đường kính khuẩn lạc (mm)

1 N1-1 Trắng, Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

3 N3-3 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,1

6 B1-6 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,2

7 B1-7 Trắng sữa Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

8 B2-8 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,6

9 B2-9 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

10 B2-10 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

11 B3-11 Vàng nhạt Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

13 N1-13 Vàng nhạt Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

14 N2-14 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

15 N1-15 Hồng nhạt Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 1

17 N2-17 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,6

18 N2-18 Hồng nhạt Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

19 N2-19 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

20 N2-20 Trắng sữa Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,6

22 N1-22 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,5

23 N1-23 Vàng nhạt Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

26 B1-26 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

27 B2-27 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,6

28 B1-28 Trắng sữa Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,2

30 B2-30 Trắng Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

32 N2-32 Trắng sữa Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,4

33 N2-33 Vàng tươi Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 1,5

34 N1-34 Vàng tươi Nổi, nhô cao, rìa trơn láng 0,3

4.2.2 Hình dạng tế bào và hoạt tính enzym

Các chủng vi khuẩn được phân lập có dạng hình cầu, hình que ngắn Đa số chủng là vi khuẩn Gram dương và có khả năng chuyển động

ảng 10: Đặc điểm các chủng vi khuẩn phân lập

nitrate hóa

phản nitriate

4.2.3 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn đƣ c chọn

Các khuẩn lạc đặc trưng của các chủng N1-1, N2-16, B2-25 được phân lập thuần, giữ giống, kiểm tra đặc tính sinh hóa Kết quả như sau

ảng 12: Kết quả kiểm tra đạc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn

Căn cứ vào khoá phân loại của Bergeys trên cơ sở các đặc điểm hình thái,

sinh lý và sinh hóa, 03 chủng trên được xác định thuộc chi Nitrobacter (chủng N1-1),

Lactobacillus (chủng N2-16) và Bacillus (B2-25)

Để phân loại đến loài, 3 chủng vi khuẩn này được giải trình tự gen 16s rARN và được so sánh với các loài có quan hệ họ hàng gần trên ngân hàng dữ liệu gen BLAST Kết quả như sau:

ảng 13: Kết quả giải trình t gen 16s rARN

N2-16 1450 Lactobacillus acidophilus 99,8

Kết hợp dữ liệu thu được từ các bảng 9, 10, 11, 12 và 13, chúng tôi xác

định tên loài của 3 chủng vi khuẩn được tuyển chọn

ảng 14: Tên các chủng vi khuẩn đƣ c tuyển chọn

Nghiệm thức 1: Đối chứng (DC): không bổ sung chủng vi khuẩn

Nghiệm thức 2 (BN): Bacillus subtilis + Nitrobacter vulgaris

Nghiệm thức 3 (LN): Lactobacillus acidophilus + Nitrobacter vulgaris

Nghiệm thức 4 (BL): Bacillus subtilis + Lactobacillus acidophilus

Thể tích nước ao cá tra: 500ml

Thể tích vi khuẩn bổ sung: 1ml

Mật độ vi khuẩn: 106

CFU/ml Điều kiện thí nghiệm: không cung cấp Oxy (sục khí) trong quá trình thí nghiệm