Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ứng dụng trong thức ăn thủy sản

TÓM LƢỢC Với mục đích tìm ra dòng vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất bacteriocin ứng dụng trong thức ăn thủy sản, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic sinh bacter

- Chủ nhiệm đề tài: Ths BẰNG HỒNG LAM

- Cơ quan chủ trì đề tài: TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THỰC HIỆN

Chủ nhiệm đề tài

Họ và tên: Bằng Hồng Lam (tham gia thực hiện Chương I, Chương II; Chương III và Chương IV)

Học vị: Thạc sĩ

Cán bộ tham gia nghiên cứu

- Họ và tên: Trịnh Hoài Vũ (tham gia thực hiện Chương II: Mục 2.2.1 và 2.2.2) Học vị: Thạc sĩ

- Họ và tên: Vương Bảo Ngọc (tham gia thực hiện Chương II: Mục 2.2.1 và 2.2.2) Học vị: Thạc sĩ

- Họ và tên: Trình Thị Thu Hồng (tham gia thực hiện Chương II: Mục 2.2.1 và 2.2.2)

Học vị: Trung cấp

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh An Giang và Ban Giám hiệu trường Đại học An Giang đã tạo điều kiện về kinh phí cho tôi thực hiện đề tài

Cảm ơn quý đồng nghiệp công tác tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trường Đại học An Giang đã tham gia thực hiện đề tài cùng tôi, nhiệt tình hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Cảm ơn quý Thầy Cô và bạn bè đã chia sẽ, trao đổi kinh nghiệm, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn với tấm lòng trân trọng nhất!

TÓM LƢỢC

Với mục đích tìm ra dòng vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất bacteriocin ứng dụng trong thức ăn thủy sản, đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ứng dụng trong thức ăn thủy sản” đã được thực hiện Kết quả thu được một trăm bảy mươi (170) dòng vi khuẩn lactic từ rau quả muối chua, các sản phẩm thịt và cá lên men và cơm mẻ thu được tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long Trong tổng số 170 dòng vi khuẩn lactic đã phân lập được kiểm tra sự tổng hợp bacteriocin thì chỉ có bốn mươi hai dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin ức chế sự tăng trưởng dòng vi khuẩn chỉ thị

Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 Kết quả định danh bằng kỹ thuật

PCR và giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA của mười dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao cho thấy có bốn dòng: DC12, RM18,

MC16 và CC1 là Lactobacillus plantarum; năm dòng: DC19, MA1, CC4, LX7

và CM13 là Pediococcus acidilactici; và một dòng: NC11 là Enterococcus faecium Dòng RM18 là dòng có khả năng sinh bacteriocin cao nhất trong 10

dòng đã được định danh và được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic phối trộn với thức ăn để đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn lactic đối với quá trình nuôi cá tra nghệ giống ở qui mô phòng thí nghiệm, kết quả thí nghiệm cho thấy chế phẩm vi khuẩn lactic rất có hiệu quả trong việc nâng cao khả năng tăng trưởng cũng như tỷ lệ sống của cá tra nghệ trong thí nghiệm Kết quả nghiên cứu của đề tài cho thấy chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic có khả sinh bacteriocin có thể ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản

Từ khóa: Vi khuẩn acid lactic, bacteriocin, Lactobacillus sakei subsp sakei JCM

1157, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Enterococcus faecium

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH BẢNG vii

DANH SÁCH HÌNH viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ix

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Một số thực phẩm lên men truyền thống 2

1.1.1 Rau (quả) muối chua 2

1.1.2 Mắm cá 2

1.1.3 Chượp cá 2

1.1.4 Lạp xưởng bò 3

1.1.5 Nem chua 3

1.1.6 Cơm mẻ 3

1.2 Vi khuẩn lactic 4

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic (LAB) 4

1.2.2 Các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic (LAB) 5

1.2.3 Phân bố của vi khuẩn lactic (LAB) 6

1.2.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic (LAB) 6

1.3 Sơ lược về vi khuẩn chỉ thị Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 7

1.4 Bacteriocin và tình hình nghiên cứu bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic trong và ngoài nước 8

1.4.1 Sơ lược về bacteriocin 8

1.4.2 Phân loại bacteriocin 9

1.4.3 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về bacteriocin được tạo ra bởi

vi khuẩn lactic 9

1.5 Định danh vi khuẩn lactic bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA 10

1.5.1 Sơ lược về kỹ thuật PCR 10

1.5.2 Sơ lược về kỹ thuật 16S ribosomal RNA (16S rRNA) 11

1.5.3 Các nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR và giải mã trình tự 16S rRNA để định danh vi khuẩn lactic 11

1.6 Sơ lược về cá tra nghệ 12

1.6.1 Phân loại cá tra nghệ 12

1.6.2 Phân bố 12

1.6.3 Đặc điểm 13

1.7 Chế phẩm sinh học (probiotics) 13

1.7.1 Tổng quan về probiotics 13

1.7.2 Tình hình sử dụng probiotics trong nuôi trồng thuỷ sản 14

1.7.3 Tình hình sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic trong nuôi trồng thủy sản 14

CHƯƠNG II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Thời gian và địa điểm 16

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ 16

2.1.3 Hóa chất và môi trường 16

2.1.4 Vật liệu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Thu mẫu 17

2.2.2 Thí nghiệm 1 Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc vi khuẩn lactic 18

2.2.3 Thí nghiệm 2 Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các dòng vi

khuẩn lactic đã phân lập 20

2.2.4 Thí nghiệm 3 Định danh mười dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 23

2.2.5 Thí nghiệm 4 Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic 23

2.2.6 Thí nghiệm 5 Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn lactic trong quá trình nuôi cá tra nghệ giống ở qui mô phòng thí nghiệm 25

2.3 Phân tích số liệu 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc vi khuẩn lactic 28

3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ rau quả muối chua; thịt, cá lên men và cơm mẻ 28 3.1.2 Định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được 29

3.2 Thí nghiệm 2: Kiểm tra khả năng sinh bacteriocin của các dòng vi khuẩn lactic (LAB) phân lập được 37

3.3 Thí nghiệm 3: Định danh mười dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin cao bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 41

3.3.1 Kết quả PCR 41

3.3.2 Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rRNA 41

3.4 Thí nghiệm 4: Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic 43

3.5 Thí nghiệm 5: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn lactic trong quá trình nuôi cá tra nghệ giống 44

3.5.1 Các yếu tố môi trường 44

3.5.2 Tăng trưởng khối lượng 49

3.5.3 Tỷ lệ sống 50

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

5.1 Kết luận 53

5.2 Đề nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 PHỤ LỤC A pc-1 PHỤ LỤC B pc-5

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1 Nguồn gốc của một số dòng vi khuẩn đã phân lập 28

Bảng 2 Đặc tính khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn đã phân lập 31

Bảng 3 Đặc điểm hình thái của một số dòng vi khuẩn đã phân lập 33

Bảng 4 Khả năng ức chế Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 của các dòng LAB có khả năng tạo bacteriocin bằng phương pháp khuếch giếng thạch 37

Bảng 5 Sự biến động của các yếu tố môi trường trong quá trình thí nghiệm 44

Bảng 6 Kết quả tăng trưởng về khối lượng của cá sau quá trình thí nghiệm 49

Bảng 7 Tỷ lệ sống của cá tra nghệ sau 60 ngày thí nghiệm 51

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1 a Dưa cải; b Dưa rau muống; c Măng chua; d Dưa củ sen 2

Hình 2 a Mắm cá; b Chượp cá; c Lạp xưởng bò; d Nem chua; e Cơm mẻ 3

Hình 3 Latobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 ở độ phóng đại 1000 lần 8

Hình 4 Sơ đồ phân lập vi khuẩn lactic từ các mẫu rau quả muối chua 18

Hình 5 Sơ đồ phân lập vi khuẩn lactic từ mẫu thịt, cá lên men và cơm mẻ 20

Hình 6 Sơ đồ khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các LAB đã phân lập bằng

phương pháp khuếch tán giếng thạch 21

Hình 7 Sơ đồ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic 24

Hình 8 Khuẩn lạc các vi khuẩn trên môi trường MRS đặc có 0,5% CaCO3 30

Hình 9 a Dòng MA1; b Dòng DC12 30

Hình 10 a Dòng DS2 có hình que dài; b Dòng LX6 có hình cầu 32

Hình 11 Kết quả kiểm tra khả năng di động của các dòng vi khuẩn phân lập 32

Hình 12 a Dòng RM18; b Dòng CC4 34

Hình 13 Kết quả thử nghiệm catalase của các dòng vi khuẩn phân lập: a Bacillus sp (đối chứng) catalase (+); b Dòng CM13 catalase (-) 34

Hình 14 Kết quả thử nghiệm oxidase của các dòng vi khuẩn phân lập: a Bacillus sp (đối chứng) oxidase (+); b Dòng LX7 oxidase (-) 35

Hình 15 a Dòng MC16; b Dòng NC1 35

Hình 16 Khả năng ức chế L sakei subsp sakei JCM 1157 của a Dòng RM18; b Dòng CC4; c Dòng NC11 39

Hình 17 Phổ điện di của sản phẩm PCR của 10 dòng vi khuẩn lactic 41

Hình 18 Chế phẩm vi khuẩn lactic 43

Hình 19 Biến thiên nhiệt độ của các nghiệm thức trong thí nghiệm 45

Hình 20 Biến thiên pH của các nghiệm thức trong thí nghiệm 46

Hình 21 Biến thiên Oxy hòa tan của các nghiệm thức trong thí nghiệm 47

Hình 22 Biến thiên NH4+/NH3 của các nghiệm thức trong thí nghiệm 47

Hình 23 Biến thiên hàm lượng NO2- trong thí nghiệm 48

Hình 24 Tỷ lệ sống của cá tra nghệ ở các nghiệm thức sau thí nghiệm 51

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATCC: American Type Culture Collection

bp: base pair

BLAST N: Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool

Catalase (+): Catalase dương tính

Catalase (-): Catalase âm tính

DWG: Date Weight Growth

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

Gram (+): Gram dương

Gram (-): Gram âm

JCM: Japanese culture of Microorganisms

kDa: kilo Dalton

LAB: Lactic acid bacteria

MRS: de Man, Rogosa and Sharpe

NCBI: National Center for Biotechnology Information

NBRC: National Institute of Technology and Evaluation (NITE) Biological Resource Center

Oxidase (+): Oxidase dương tính

Oxidase (-): Oxidase âm tính

PCR: Polymerase Chain Reaction

SR: Survival rate

TISTR: Thailand Institute of Scientific and Technological Research

TNHH: Trách nhiệm hữu hạn

LỜI MỞ ĐẦU

An Giang với thế mạnh là sản xuất thủy sản nên việc ứng dụng các chế phẩm sinh học nhằm nâng cao hiệu quả của quá trình trong nuôi trồng thủy sản là một việc làm cần thiết Chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic, một loài vi khuẩn có khả năng sinh bacteriocin, một loại kháng sinh tự nhiên có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gây hại mà không để lại tồn dư kháng sinh trong thịt

cá, nâng cao khả năng tiêu hóa và sức đề kháng cho cơ thể cá Chính vì vậy đề tài

“Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin ứng dụng trong thức ăn thủy sản” được thực hiện với mục tiêu và nội dung như sau:

Mục tiêu nghiên cứu

Tìm được dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao từ một số thực phẩm lên men truyền thống để sản xuất chế phẩm lactic phối trộn với thức

ăn phục vụ nuôi trồng thủy sản

Nội dung nghiên cứu

Phân lập các dòng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống (rau quả muối chua, sản phẩm lên men từ thịt, cá và cơm mẻ)

Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của những dòng vi khuẩn lactic phân lập được và định danh các dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic và đánh giá hiệu quả của chế phẩm trong quá trình nuôi cá tra nghệ giống ở qui mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG I LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Một số thực phẩm lên men truyền thống

1.1.1 Rau (quả) muối chua

Muối chua rau quả là quá trình lên men lactic mà nguyên liệu là rau quả, đường, muối và gia vị Vi khuẩn lactic phát triển trong điều kiện kỵ khí với nồng

độ muối là (1,2 – 2,5)% (đối với rau cải) Vi sinh vật này sẽ sử dụng và chuyển hóa một phần đường thành acid lactic Khi acid lactic đạt đến nồng độ (0,6 – 1,2)% sẽ kìm hãm sự hoạt động của các vi sinh vật gây thối rữa ở rau quả, do đó rau quả muối chua có thể giữ được vài tuần hoặc vài tháng [17]

1.1.3 Chượp cá

Qui trình sản xuất nước mắm gồm nhiều công đoạn: muối cá, ủ cá (chượp cá), luân chuyển nước mắm, Để trở thành nước mắm cá phải trải qua nhiều giai đoạn thủy phân protein cá nhờ vào hệ enzym có sẵn trong thịt cá và ruột cá

cũng như hệ vi sinh vật có trên da cá, trong các mô và nội tạng cá thực hiện quá trình lên men [19]

1.1.4 Lạp xưởng bò

Đây là món lạp xưởng của người Chăm, còn gọi là “Tung lò mò” Tung lò

mò được làm từ thịt và mỡ bò theo tỷ lệ hai thịt một mỡ tùy theo ý thích Gia vị ướp vào gồm có ngũ vị hương, muối đường, tiêu và đặc biệt có một loại không phải gia vị nhưng lại không thể thiếu là cơm nguội Đây là nét độc đáo trong cách chế biến lạp xưởng bò của người Chăm Cơm nguội trộn cùng hỗn hợp thịt sau khi dồn vào ruột bò đã làm sạch đem phơi nắng sẽ lên men và cho vị chua đặc trưng của Tung lò mò [79]

1.1.5 Nem chua

Nem chua là sản phẩm truyền thống và có nhiều làng nghề sản xuất trên cả nước, tùy theo vùng miền mà có đặc trưng khác nhau Nem chua là sản phẩm lên men từ thịt tươi, bản chất của quá trình lên men là sự chuyển hóa đường thành

acid lactic nhờ vào vi khuẩn lactic như: Lactobacillus, Pediococcus, Micrococcus, Streptococcus,… [11]

1.2 Vi khuẩn lactic

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic (LAB)

Vi khuẩn lactic có tên gọi đầy đủ là vi khuẩn acid lactic (Lactic acid bacteria – LAB) đóng vai trò quan trọng trong một số thực phẩm lên men LAB

là vi khuẩn Gram (+), oxidase (-), catalase (-), hình cầu hoặc hình que, không hình thành bào tử Chúng tạo ra acid lactic như là sản phẩm chính của quá trình lên men carbohydrate (glucose và lactose) Một số giống quan trọng như:

Bifidobacterium và Carnobacterium [74] Vi khuẩn lactic thường có dạng hình

cầu (hoặc hình ovan) và hình que Đường kính của các dạng cầu lactic từ (0,5 – 1,5)µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau Kích thước tế bào trực khuẩn lactic từ (1 – 8)µm, trực khuẩn đứng riêng lẽ hoặc kết thành chuỗi [9]

Một đặc tính quan trọng dùng để phân biệt các giống LAB là dựa vào phương thức lên men glucose dưới những điều kiện chuẩn như không giới hạn nồng độ glucose và các yếu tố tăng trưởng (các amino acid, các vitamin, nucleic acid,…) nhưng giới hạn oxy Dưới những điều kiện này, vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm là: vi khuẩn lactic đồng hình và vi khuẩn lactic dị hình [53]

- Vi khuẩn lactic đồng hình: Là những vi khuẩn khi lên men trong các nguyên liệu có chứa đường tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid lactic Các chủng

tham gia trong kiểu lên men này chủ yếu là hai giống: Lactobacillus và Streptococcus

+ Giống Lactobacillus (trực khuẩn) với một số loài điển hình như:

nóng)

C

+ Giống Streptococcus với một số loài điển hình như:

C

▪ Streptococcus cremoris, lên men sữa, nhiệt độ thích hợp cho sự phát

C [9]

- Vi khuẩn lactic dị hình: Là những vi khuẩn khi lên men trong các nguyên liệu có chứa đường nhưng chỉ tạo ra acid lactic với một lượng ít, còn lại là các sản phẩm khác như ethanol, acid acetic, acid propionic,…Cũng giống như vi

khuẩn lactic đồng hình, hai giống (Lactobacillus và Streptococcus) cũng được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong lên men với một số loài điển hình như: Lactobacillus brevis, Lactobacillus pasteurianus, Streptococcus falcalis, Streptococcus cumoris [10]

1.2.2 Các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic (LAB)

Cũng như tất cả các sinh vật khác, sự sinh trưởng và phát triển của LAB phụ thuộc vào nhiều yếu tố như:

C [9]

- pH : Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men của LAB , phạm vi pH tối ưu nằm giữa 5,5 – 6,0 [4] Các trực khuẩn lactic ưa nhiệt phát triển tốt ở pH là 6,5 [8]

- Oxy: LAB là vi sinh vật kỵ khí nhưng có thể có thể chịu đựng được khi môi trường chứa oxy Những vi khuẩn không có hệ enzyme catalase mà tăng trưởng trong điều kiện yếm khí thì có thể kết luận chúng là LAB chỉ ngoại trừ giống Bifidobacterium [74]

- Dinh dưỡng: Tất cả LAB phụ thuộc vào nguồn carbohydrate như là nguồn cung cấp năng lượng, chúng là vi sinh vật lên men bắt buộc LAB có nhu cầu dinh dưỡng rất cao Khả năng tổng hợp các amino acid và vitamin bị giới hạn, không có loài nào thuộc LAB có thể sinh trưởng trong môi trường muối khoáng thuần khiết mà không có glucose và muối amonium Các vitamin thiết yếu cho sự sinh trưởng của LAB là : riboflavin, thiamine, folic acid, biotin,… [4]

1.2.3 Phân bố của vi khuẩn lactic (LAB)

Trong tự nhiên thường gặp LAB trong đất, trong không khí, trong nước, nhưng chủ yếu ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm lên men (dưa chua, rau cải muối chua, yaourt,…) [9]

Thông thường LAB sống ở môi trường giàu dinh dưỡng trong một số thực phẩm khác nhau (sữa, thịt, thức uống,…) Tuy nhiên, vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở miệng, ruột, và âm đạo của động vật hữu nhũ [53]

1.2.4 Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic (LAB)

- Trong công nghệ thực phẩm:

+ Trong sản xuất thực phẩm: Trong sản xuất rau cải muối chua: LAB làm tăng quá trình chuyển hóa các hợp chất trong nguyên liệu thành các hợp chất mong muốn (L - lactic acid hoặc các amino acid), tích lũy những hợp chất ngon

và làm giảm những hợp chất không mong muốn [59] Trong sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa (sữa chua, phomat, bơ,…) LAB biến đổi đường lactose trong sữa thành acid lactic và một số sản phẩm phụ nâng cao phẩm chất sản phẩm [9]

+ Trong bảo quản thực phẩm: Một số loài LAB sản xuất kháng sinh sinh học được gọi chung là bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của những

mầm bệnh như Listeria, Clotridium, Staphylococcus, Bacillus spp và Enterococcus spp làm tăng thời gian sử dụng của sản phẩm [34]

- Trong y học: Probiotics là tên gọi chung của các chế phẩm sinh học có chứa chủng vi khuẩn có lợi mà phổ biến là LAB giúp cải thiện cân bằng vi khuẩn trong đường ruột [67]

- Trong nông nghiệp:

+ Trong trồng trọt: LAB cũng có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo vệ mùa màng: sử dụng sản phẩm gọi là Silage Silage về bản chất là sự phối hợp của những thực vật (cỏ, bắp, cỏ linh lăng) với vi khuẩn lactic ngăn chặn sự hình thành nốt rễ ở cây trồng bởi những vi sinh vật không mong muốn [50]

+ Trong chăn nuôi: Phương pháp ủ chua thức ăn gia súc được sử dụng để

dự trữ thức ăn đồng thời nâng cao tỷ lệ tiêu hoá thức ăn cho gia súc nhờ hệ vi sinh vật trong sản phẩm mà chủ yếu là LAB [1]

+ Trong nuôi trồng thủy sản:

▪ Một số sản phẩm probiotics có chứa một số chủng LAB như; Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus,… khi được bổ sung vào thức ăn có tác dụng làm

tăng tỷ lệ sống sót và tăng trưởng của cá [44]

▪ Các dòng vi khuẩn lactic mà đặc biệt là các loài thuộc giống Lactobacillus có khả năng ức chế được nhiều vi khuẩn gây bệnh mà trong đó có Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus, Listeria monogenes, [39]

▪ Các loài vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus được phân lập từ dạ dày –

ruột của một số loài cá nước ngọt có khả năng ức chế mạnh một số loài vi khuẩn

gây bệnh phổ biến ở cá nước ngọt như: A hydrophila, E tarda 524362, Yersinia ruckerii và Staphylococcus aureus 169E [29]

1.3 Sơ lƣợc về vi khuẩn chỉ thị Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157

Latobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 có chiều dài 653 nucleotide và

được phân loại như sau:

Hình 3 Latobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 ở độ phóng đại 1000 lần

Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 đã được nhiều nhà khoa học sử

dụng như dòng chỉ thị cho khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn lactic:

- Khi nghiên cứu về khả năng sinh bacteriocin của dòng Lactobacillus

bệnh khác đã được sử dụng làm dòng chỉ thị cho khả năng sinh bacteriocin của vi khuẩn acid lactic Sb2 được phân lập từ đường ruột cá [52]

1.4 Bacteriocin và tình hình nghiên cứu bacteriocin được sinh tổng hợp bởi

vi khuẩn lactic trong và ngoài nước

1.4.1 Sơ lược về bacteriocin

Bacteriocin có bản chất là peptide kháng khuẩn sinh ra bởi vi khuẩn để chống lại vi khuẩn khác, có khả năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ chủng loại gần với vi khuẩn sinh ra bacteriocin đó [30]

Bacteriocin có thể được sinh ra bởi khuẩn Gram (-) và vi khuẩn Gram (+) Tuy nhiên bacteriocin của vi khuẩn Gram (+) khác với bacteriocin của vi khuẩn

Gram (-) ở hai phương thức cơ bản: Thứ nhất, các bacteriocin do vi khuẩn Gram

(+) sản xuất ra không gây chết các tế bào sản xuất ra nó và các tế bào lân cận như

ở vi khuẩn Gram (-); Thứ hai, vi khuẩn Gram (+) tạo ra sự điều hòa bacteriocin

đặc biệt trong khi các bacteriocin của vi khuẩn Gram (-) chỉ nhờ vào mạng lưới điều hòa của ký chủ [57]

Bacteriocin được tạo ra từ vi khuẩn acid lactic đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học bởi chúng hoạt động chỉ cần một lượng nhỏ và không gây độc Có nhiều loại bacteriocin được tạo ra bởi vi khuẩn acid lactic và cũng có nhiều cách phân loại bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn này

1.4.2 Phân loại bacteriocin

Bacteriocin của LAB được chia thành 3 nhóm:

Nhóm I: Lantibiotic (các bacteriocin chứa lanthionine): là các peptide có khối lượng phân tử nhỏ hơn 5kDa có chứa nhóm lanthionine và/hoặc methyllanthionine trong chuỗi polypeptide (chứa 19-38 amino acid) Một số bacteriocin thuộc nhóm lantibiotic như nisin, epidermin, cytolycin,

Nhóm II: Nonlantibiotic: khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa, là các peptide chịu nhiệt Các bacteriocin nhóm (II) có thể được chia thành các nhóm phụ: + (IIA) Các bacteriocin giống pediocin: pediocin PA-1, sakacin P,

+ (IIB) Hai peptide bacteriocin: plantaricin S, lactacin F

+ (IIC) Các bacteriocin phụ thuộc thứ cấp: lactococcin A, divergicin A, + (IID) Các bacteriocin nhóm (II) không thuộc các nhóm phụ khác

Nhóm III: Nonlantibiotic: khối lượng phân tử lớn hơn 30kDa, không bền nhiệt: enterolysin A, lactococcin 972,… [30]

1.4.3 Những nghiên cứu trong và ngoài nước về bacteriocin được tạo

ra bởi vi khuẩn lactic

+ Lactobacillus plantarum L24 đã được nghiên cứu khả sinh tổng hợp

bacteriocin, kết quả cho thấy vi khuẩn này vừa có khả năng sinh acid lactic vừa

có khả năng sinh một loại bacteriocin thuộc nhóm II có trọng lượng phân tử 30)kDa [15]

(10-+ Một số đặc tính của bacteriocin được sản xuất bởi vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cho thấy L acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella và một số vi khuẩn lactic khác [6]

+ Nghiên cứu thu nhận bacteriocin bằng phương pháp lên men tế bào

Lactococcus lactic cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn và ứng dụng trong

bảo quản thịt tươi sơ chế tối thiểu cho thấy lượng bacteriocin thu được tương đối cao [16]

+ Enterococcus faecium BFE 900 phân lập từ ô liu đen đã sản xuất

Enterocin 900, có khả năng kháng lại Lactobacillus sake, Clostridium butyricum, Enterococci và Listeria spp bao gồm Listeria monocytogenes [41]

+ Lactobacillus plantarum BFE 905 phân lập từ xà lách ăn liền có khả

năng sinh tổng hợp bacteriocin plantaricin D kháng lại hoạt động của

Lactobacillus sake và Listeria monocytogenes [40]

+ Hai bacteriocin (ST28MS và ST26MS) được sinh ra bởi Lactobacillus plantarum được phân lập từ mật đường Kết quả là hai bacteriocin này có khả năng ức chế một số loài vi khuẩn như: Lactobacillus casei, Lactobacillus sakei, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli và Acinetobacter baumanii [69]

+ Bacteriocin được tạo ra từ các dòng vi khuẩn Lactobacillus fermentum

và Lactobacillus acidophilus được phân lập từ yogurt, phân gà, có khả năng ức chế sự phát triển của dòng vi khuẩn Escherichia coli kháng lại kháng sinh

cephalosporin [73]

+ Pediococcus acidilactici KKU 170 phân lập từ các thực phẩm lên men

truyền thống của Thái Lan có khả năng sinh bacteriocin ức chế mạnh sự sinh

trưởng nhiều loài vi khuẩn gram dương, bao gồm Listeria sp [75]

1.5 Định danh vi khuẩn lactic bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S ribosomal RNA

1.5.1 Sơ lƣợc về kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường

dư thừa dNTPs và các cặp mồi đặc hiệu

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:

- Biến tính (denaturation): phân tử DNA được biến tính ở (94 – 95)0C trong

30 giây – 1 phút

- Lai (anealation): Cặp mồi chuyên biệt bắt cặp với mạch khuôn ở (50 –

- Tổng hợp hay kéo dài (elongation): DNA polymerase hoạt động tổng hợp

Các đoạn DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi

[3]

1.5.2 Sơ lƣợc về kỹ thuật 16S ribosomal RNA (16S rRNA)

16S rRNA là bộ phận cấu thành bán đơn vị 30S của ribosome ở prokaryote Đoạn gen 16S rRNA gồm khoảng 1542 nucleotide

Đoạn gen 16S rRNA được sử dụng cho nghiên cứu về nguồn gốc phát sinh loài bởi vì nó có tính bảo toàn cao giữa các loài khác nhau của vi khuẩn và archaea Việc phân tích trình tự của đoạn gen 16S rRNA được thực hiện bằng việc giải trình tự đoạn gen này mà dùng một số cặp mồi được gọi là “Universal primers” để thực hiện phản ứng PCR Mục tiêu của các primer này là những vùng bảo toàn trong đoạn gen 16S rRNA và khuếch đại chúng thành nhiều phần khác nhau Cuối cùng những phần được khuếch đại này có thể được nối với nhau để

có toàn bộ trình tự amino acid của đoạn gen 16S rRNA [77]

1.5.3 Các nghiên cứu dùng kỹ thuật PCR và giải mã trình tự 16S rRNA để định danh vi khuẩn lactic

Kỹ thuật PCR và phân tích trình tự 16S rRNA để định danh các loài vi khuẩn đã được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng thành công:

- Một số loài của Lactococcus và Leuconostoc đã được định danh bằng kỹ

thuật PCR để khuếch đại vùng 16S rRNA và đánh dấu DNA chuyên biệt [61]

- Kỹ thuật PCR đã được sử dụng để định danh các vi khuẩn lactic chiếm ưu thế phân lập từ những sản phẩm rau quả lên men truyền thống ở phía đông

Himalayas cho thấy các vi khuẩn được định danh là Lactobacillus brevis,

Lactobacillus plantarum, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici và Leuconostoc fallax [49]

- Ba loài vi khuẩn lactic chịu nhiệt Lactobacillus reuteri AC5,

KUB-AC16 và KUB-AC20 phân lập từ hệ tiêu hóa gà có khả năng tổng hợp hoạt chất giống với bacteriocin kháng được vi khuẩn gây bệnh đã kháng lại kháng sinh là

Escherichia coli và Salmonella sp bằng kỹ thuật 16S rRNA [72]

- Kỹ thuật 16S rRNA để định danh hai loài vi khuẩn lactic chịu nhiệt

Pediococcus acidilactici JAK-CS7-1và JAK-M1-3 có khả năng sản xuất hoạt

chất kháng khuẩn có phổ ức chế rộng vi khuẩn gây bệnh gram âm và gram dương phân lập từ phân ủ ở Thái Lan [56]

Các vi khuẩn lactic được phân lập từ lạp xưởng lên men truyền thống ở Thái đã được định danh bằng phương pháp giải và so sánh trình tự gen 16S

rRNA Kết quả Weissella cibaria/kimchii, W confusa, Pediococcus pentosaceus,

P acidilactici, Lactobacillus fermentum, L brevis, L farciminis, L plantarum và

L sakei đã được định danh [42]

1.6 Sơ lƣợc về cá tra nghệ

1.6.1 Phân loại

Cá tra nghệ có hệ thống phân loại như sau:

Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Siluriformes Họ: Pangasiidae

Giống: Pangasius Loài: Pangasius kunyit [54]

1.6.2 Phân bố

Ở Việt Nam, cá tra nghệ được tìm thấy chủ yếu ở môi trường nước lợ trong các cửa sông như là cửa sông Ba Lai (Ba Tri), cửa sông Đại (Bình Đại), cửa sông Tranh Đề và cửa sông Định An, sông Tiền… và cá cũng được tìm thấy ở môi trường nước ngọt (ở Châu Đốc và Vàm Nao) [62]

1.6.3 Đặc điểm

- Đặc điểm hình thái: cá tra nghệ có 2 gai lưng, 30 vây đến 33 vây hậu môn, đầu rộng và hơi tròn, mõm dài (40- 53,4)% chiều cao thân, chiều cao đầu (48- 54,7)% chiều cao đầu, đầu rộng (70,7– 76,6)% chiều cao thân, chiều rộng cột sống khoảng 9,25 lần đến 11,2 lần chiều rộng của nó [78]

- Đặc điểm dinh dưỡng: Cá tra nghệ ăn tạp, thức ăn chủ yếu là côn trùng, giun, cây ngập nước, hạt Cá con và cá sắp trưởng thành kiếm mồi ở các bãi ngập chủ yếu ăn thức ăn thực vật [32]

- Đặc điểm sinh trưởng: Cá tra nghệ sống trong tự nhiên có thể sống trên 20 năm, đã gặp cỡ cá trong tự nhiên 18kg hoặc có cá dài tới 1,8m Trong ao nuôi cá

bố mẹ cho đẻ đạt tới 25kg ở cá 10 tuổi Nuôi trong ao, một năm cá đạt (1,6 – 2)kg/con và sau khoảng 2 năm đến 3 năm nuôi, trong điều kiện bình thường, cá

có thể đạt trọng lượng (2,5 – 3,5)kg/con [21]

1.7 Chế phẩm sinh học (probiotics)

1.7.1 Tổng quan về probiotics

“Probiotics” là những vi sinh vật sống mà khi được tiêu thụ với lượng thích

hợp sẽ mang lại những tác động có ích cho vật chủ [45] Định nghĩa “probiotics”

đối với nuôi trồng thủy sản bao gồm cả việc bổ sung vi khuẩn sống vào ao nuôi, những vi khuẩn có lợi này sẽ cải thiện thành phần vi sinh vật của nước và nền đáy nhằm cải thiện chất lượng nước Probiotics được giả định là gia tăng cường sức khỏe của vật nuôi bằng việc loại trừ các mầm bệnh hoặc hạn chế tối đa tác

hại trực tiếp của mầm bệnh Vi khuẩn probiotics có thể bám vào bề mặt bên

ngoài của vật chủ hay đi vào trong ruột, trực tiếp từ nước, qua thức ăn hay qua những hạt có thể tiêu hóa được [28]

Probiotics bao gồm những vi sinh vật hữu ích và trong thủy sản hầu hết

những sinh vật này là vi khuẩn acid lactic (L plantarum, L acidophillus, L casei, L rhamnosus, L bulgaricus, Carnobacterium…), giống Vibrio sp (Vibrio alginolyticus), giống Bacillus (B subtilis, B licheniformis, B megaterium, B polymyxa,…), Actinomycetes, Nitrobacteria, Pseudomonas… [37]

1.7.2 Tình hình sử dụng probiotics trong nuôi trồng thuỷ sản

Việc sử dụng probiotics như thức ăn bổ sung cho vật nuôi được bắt đầu từ

1970 Chúng được trộn vào thức ăn để làm tăng sự tăng trưởng và sức khỏe vật nuôi bởi chúng giúp vật nuôi tăng khả năng kháng bệnh tật [68]

Việc nuôi tôm trên thế giới bị giảm bởi bệnh trên tôm do vi khuẩn Vibrio,

trong khi việc khi việc sử dụng kháng sinh để trị không hiệu quả ngược lại còn có thể làm cho vi khuẩn kháng thuốc, hơn nữa còn khả năng gây hại đến con người nếu sử dụng quá liều lượng Chính vì vậy mà probiotics được sử dụng như là một giải pháp để giải quyết vấn đề, nghiên cứu cho thấy rằng ở những ao nuôi tôm có

Lactobacillus fructivorans AS17B đã được phân lập từ ruột cá tằm (Sparus aurata) và bổ sung chúng trong suốt thời gian nuôi cá tằm với việc sử dụng Brachinons plicatilis, Arternia salina và thức ăn khô như là vectơ mang vi khuẩn

này Kết quả cho thấy có sự giảm đáng kể tỷ lệ chết của cá so với nghiệm thức

không có bổ sung Lactobacillus fructivorans AS17B [63]

Vi khuẩn acid lactic được phân lập từ ruột cá được sử dụng như một chế

phẩm sinh học có tác dụng kháng lại vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá rô phi nước ngọt (Oreochromis mossambicus) và khi thêm vào thức ăn

của cá có tác dụng gia tăng tốc độ tăng trưởng và trọng lượng vật nuôi [65]

Probiotics chứa Micrococcus luteus có tác dụng thúc đẩy khả năng tăng trưởng và sức khỏe của cá rô phi (Oreochromis niloticus) ở sông Nile [36]

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật làm chế phẩm sinh học trong nuôi tôm cao

sản, một trong những loại vi sinh vật được sử dụng là Lactobacillus Chế phẩm

này có tác dụng tăng tính ngon miệng, giúp tiêu hoá các chất dinh dưỡng có trong thức ăn, tăng cường sức đề kháng, phòng ngừa các bệnh đường ruột như nhiễm

E.coli, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại, nâng cao năng suất nuôi tôm

[22]

CHƯƠNG II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Thời gian và địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12/2010

đến tháng 12/2011 tại Trường Đại học An Giang

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ

- Cân điện tử, nồi khử trùng, bộ micropipet, tủ cấy, tủ ủ, kính hiển vi, máy li tâm, tủ sấy, tủ lạnh, máy PCR, máy điện di, máy đọc gel Bio-Rad, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu, máy chụp ảnh,…

- Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, chai lọ thủy tinh, ống đong, que cấy, que chà, đèn cồn, tuýp PCR, bể 500 lít, nhiệt kế, thau, vợt, thước,

2.1.3 Hóa chất và môi trường

a Hóa chất: Nhuộm Gram, nhuộm bào tử, thử catalase, thử oxidase, ly trích

DNA và thực hiện phản ứng PCR, test môi trường nước (Sera): pH, DO,

b Môi trường (thành phần môi trường xem phần phụ chương)

- Môi trường dùng để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lactic: MRS lỏng,

- Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157 nhận từ trường Đại học

Kasetsart Thái Lan được sử dụng làm dòng chỉ thị

- Cá tra nghệ 30 ngày tuổi với khối lượng khoảng 0,95 ± 0,1 g/con (Bộ môn Thủy sản- Đại học An Giang)

CFU/g

- Thức ăn công nghiệp T503S (Công ty TNHH Uni- Presedent Việt Nam)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu mẫu

a Phương pháp thu mẫu đối với rau quả muối chua

- Mẫu dưa cải được thu sau khi lên men 4 ngày đến 5 ngày từ An Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ, Đồng Tháp và Kiên Giang Thu 9 mẫu với thể tích là 250ml/mẫu

- Mẫu dưa rau muống, măng chua và dưa củ sen được tiến hành lên men 4 ngày đến 5 ngày ở 3 địa điểm phường Mỹ Xuyên, phường Mỹ Phước và phường Đông Xuyên thuộc tỉnh An Giang Mỗi loại nguyên liệu được tiến hành lên men

3 mẫu ứng với một địa điểm Thu tổng cộng 27 mẫu với thể tích là 250ml/mẫu Thu tất cả là 36 mẫu rau quả muối chua

b Phương pháp thu mẫu đối với các sản phẩm từ thị, cá lên men và cơm mẻ

- Mẫu mắm cá được thu sau khi ủ 3 tháng đến 4 tháng ở An Giang và Kiên Giang Thu 5 mẫu với trọng lượng là 250g/mẫu

- Mẫu chượp cá được thu sau khi ủ 3 ngày đến 5 ngày ở An Giang và Kiên Giang Thu 5 mẫu với trọng lượng là 250g/mẫu

- Mẫu lạp xưởng bò được thu sau 3 ngày phơi nắng ở xã Phú Hiệp, huyện Phú Tân, tỉnh An Giang Thu 5 mẫu với trọng lượng là 250g/mẫu

- Mẫu nem chua được thu sau khi gói 3 ngày ở các cơ sở nem Giáo Thơ, Út Thẳng, Giáo Quì, Cô Hoàn và Tư Kiên thuộc huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Thu 5 mẫu với trọng lượng là 250g/mẫu

- Mẫu cơm mẻ được thu ở Long Xuyên, Thoại Sơn và Kiên Giang Thu 9 mẫu với trọng lượng là 250g/mẫu

Thu tất cả là 29 mẫu thịt, cá lên men và cơm mẻ

2.2.2 Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc thuộc vi khuẩn lactic

muối chua, các sản phẩm lên men từ thịt và cá và cơm mẻ Định danh sơ bộ để xác định các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc nhóm vi khuẩn lactic (LAB)

 Dòng LAB thuần

- Hút 0,1ml mẫu đã pha loãng ở độ pha loãng 10-5 cho vào đĩa petri chứa

MRS đặc bằng phương pháp cấy ria cho đến khi chỉ còn một loại khuẩn lạc duy nhất trên đĩa (khuẩn lạc rời, có kích thước, màu sắc giống nhau), ta được các dòng vi khuẩn thuần

- Các dòng vi khuẩn thuần được kiểm tra một số đặc tính hình thái - sinh hóa để nhận diện vi khuẩn lactic: hình dạng, khả năng di động, trạng thái nhuộm gram, nhuộm bào tử, thử catalase, oxidase để khẳng định sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc vi khuẩn lactic

- Cấy trữ các dòng vi khuẩn thuần được xác định là LAB vào ống nghiệm thạch nghiêng có chứa môi trường MRS đặc, khi vi khuẩn đã phát triển đem trữ ở

 Đối với mẫu sản phẩm thịt, cá lên men và cơm mẻ

* Sơ đồ thí nghiệm:

Mẫu sản phẩm thịt, cá lên men và cơm mẻ

 Nghiền mịn

 Cân 5g cho vào bình tam giác chứa chứa 45ml môi trường MRS lỏng



 Pha loãng mẫu; hút 0,1ml mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri chứa môi trường





Chọn khuẩn lạc làm tan CaCO3, cấy truyền ra môi trường MRS đặc để tách ròng



 Kiểm tra hình thái - sinh hóa để định danh sơ bộ vi khuẩn lactic

 Dòng LAB thuần

pha loãng, phân lập và định danh sơ bộ để nhận diện vi khuẩn tương tự như các bước thực hiện đối với mẫu nước rau quả muối chua để được các dòng LAB thuần

- Cấy trữ các dòng thuần được xác định là LAB vào ống nghiệm thạch

C

để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo [60]

2.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các dòng

vi khuẩn lactic đã phân lập

a Mục đích: Tìm ra dòng có khả năng sinh bacteriocin ức chế dòng vi

khuẩn chỉ thị từ các dòng LAB phân lập được

b Cách thực hiện:

* Phương pháp: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch (Well diffusion agar) với dòng chỉ thị Lactobacillus sakei subsp sakei JCM 1157

Dòng vi khuẩn thuần

* Sơ đồ thí nghiệm:

Các dòng LAB đã phân lập

 Nuôi kỵ khí trong môi trường MRS

MRS đặc, để ráo

 Tạo giếng có đường kính 5mm



 Kiểm tra và đo đường kính vòng vô khuẩn

xung quanh giếng (nếu có)

Hình 6 Sơ đồ khảo sát khả năng sinh bacteriocin của các dòng LAB đã phân

lập bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Bơm 50µl bacteriocin thô/giếng

* Thực hiện thí nghiệm:

Khả năng sinh bacteriocin của các dòng LAB đã phân lập được kiểm tra thông qua sự ức chế sinh trưởng do bacteriocin thô mà các dòng LAB này sinh ra

lên dòng chỉ thị L sakei subsp sakei JCM 1157 Để tiến hành kiểm tra, phương

pháp khuếch tán giếng thạch được sử dụng và tiến hành qua 2 bước: chuẩn bị bacteriocin thô và tiến hành phương pháp khuếch tán giếng thạch

- Quy trình chuẩn bị bacteriocin thô của các dòng LAB đã phân lập được

tiến hành như sau: Các dòng LAB phân lập, mỗi dòng được nuôi ở điều kiện kỵ khí trong 3 ống nghiệm (mỗi ống nghiệm được xem như 1 lần lặp lại) có chứa

để lấy phần dịch trong Điều chỉnh pH của dịch trong về pH= 6,0 bằng NaOH

- Phương pháp khuếch tán giếng thạch được tiến hành như sau:

+ Dòng chỉ thị L sakei subsp sakei JCM 1157 được kỵ khí nuôi trong môi

C trong 48 giờ, tiến hành đếm mật số vi khuẩn trong

tb/ml Sau đó hút 50µl dịch nuôi này cho vào môi trường MRS đặc, trải mẫu, để ráo

+ Lấy đĩa petri có chứa dòng vi khuẩn chỉ thị tiến hành đục lỗ thạch có đường kính 5mm (mỗi đĩa petri đục 4 lỗ: 3 lỗ cho bacteriocin thô vào và 1 lỗ đối chứng cho nước cất vô trùng vào)

+ Dùng micropipet hút 50μl bacteriocin thô của các dòng LAB chịu nhiệt

đã chuẩn bị bơm vào mỗi lỗ thạch

2.2.4 Thí nghiệm 3: Định danh mười dòng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự đoạn gen 16S rRNA

a Mục đích: Định danh đến loài 10 dòng LAB có khả năng tổng hợp

bacteriocin cao từ các dòng LAB phân lập được

b Cách thực hiện:

* Kỹ thuật PCR:

- Ly trích DNA: Dùng bộ kit GenElute™ Bacterial Genom DNA Kit và Lysozyme

- Thực hiện phản ứng PCR: Dùng bộ kit JumpStart™ Taq ReadyMix™,

27F primer có trình tự AGAGTTTGATCCTGGCTCAG và 1522R primer có trình tự AAGGAGGTGATCCAGCCGCA

- Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR: Các sản phẩm sau khi được

khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên agarose gel 2% để kiểm tra sản phẩm PCR

- Chụp hình gel điện di chứa sản phẩm phản ứng PCR: Sản phẩm phản ứng

PCR sau khi chạy điện di được chụp hình bằng máy Gel Logic 212 để phát hiện các băng được khuếch đại trên gel

* Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA: Mười dòng vi khuẩn lactic sinh

bacteriocin cao có trình tự DNA được khuếch đại trên gel được đem giải mã trình

tự gen của chúng (việc giải trình tự được thực hiện tại công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa)

2.2.5 Thí nghiệm 4: Sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic

dòng LAB sinh bacteriocin cao nhất

* Sơ đồ thí nghiệm:

Môi trường MRS lỏng (500ml)

 Hấp thanh trùng

  Cấy chủng



 Thu sinh khối (giống cấp 1)

 Cấy chủng (5% giống cấp 1) 

kiện kỵ khí ở nhiệt độ 370C trong 72 giờ, thu sinh khối (sinh khối này được xem

là giống cấp 1)

+ Môi trường rỉ đường cũng được hấp thanh trùng và để nguội, cấy 5%

sinh khối này được sấy 40°C trong 12 giờ, sau đó được phối trộn với chất độn

khuẩn của chế phẩm lactic được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc), chế

C [20]

2.2.6 Thí nghiệm 5: Đánh giá hiệu quả của chế phẩm vi khuẩn lactic trong quá trình nuôi cá tra nghệ giống ở qui mô phòng thí nghiệm

a Mục đích: Tìm được mật số chế phẩm vi khuẩn lactic thích hợp nhất phối

trộn với thức ăn của quá trình nuôi cá tra nghệ giống ở qui mô phòng thí nghiệm

b Bố trí thí nghiệm

Cá tra nghệ sử dụng trong thí nghiệm là cá 30 ngày tuổi với khối lượng khoảng 0,95 ± 0,1g/con (Bộ môn Thủy sản- Đại học An Giang) Cá được bố trí trong 15 bể composit 500 lít và có sục khí với mật độ thả 30 con/bể với thời gian nuôi là 60 ngày

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức và 3 lần lập lại:

- Nghiệm thức 1 (A): Thức ăn được phối trộn với chế phẩm vi khuẩn lactic

c Kỹ thuật phối trộn chế phẩm vi khuẩn lactic với thức ăn

Cân lượng chế phẩm vi khuẩn lactic (tùy theo lượng thức ăn) cần phối trộn với thức ăn và hòa tan trong dung dịch gelatin 1%, sau đó phun vào thức ăn và trộn đều, để cho thức ăn khô tự nhiên trước khi cho ăn

d Chăm sóc và quản lý

- Nguồn thức ăn sử dụng là T503S (thức ăn cá tra, cá basa) của Công ty

TNHH Uni-President Việt Nam, cho ăn 2 lần/ngày vào lúc 7 giờ và 17 giờ Khẩu phần ăn là 10% trọng lượng cá

- Định kỳ thay nước cho các nghiệm thức 3 ngày/lần, mỗi lần thay 1/3 thể tích nước trong bể bằng cách xi- phông đáy bể

e Thu thập số liệu

* Các chỉ tiêu môi trường nước

- Nhiệt độ: Sử dụng nhiệt kế đo hàng ngày vào buổi sáng lúc (6-7) giờ và chiều (14-15) giờ

- pH: đo bằng test pH của Sera, cách 3 ngày đo 1 lần vào lúc chiều (14-15) giờ

- Hàm lượng oxy hòa tan (DO): đo bằng test DO của Sera, cách 3 ngày đo 1 lần vào lúc chiều (14-15) giờ

ngày đo 1 lần vào lúc chiều (14-15) giờ

vào lúc chiều (14-15) giờ

* Theo dõi tăng trưởng về khối lượng của cá

Định kỳ 30 ngày lấy mẫu một lần để xác định tốc độ tăng trưởng về khối lượng của cá Mỗi lần kiểm tra bắt ngẫu nhiên 10 con/bể, trước khi kiểm tra tốc

độ tăng trưởng ngưng cho cá ăn 1 buổi

- Khối lượng cá được xác định bằng cách cân từng cá thể bằng cân điện tử 2

số lẻ

- Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối của cá (DWG: g/ngày)

t: Thời gian thí nghiệm (60 ngày)

* Xác định tỷ lệ sống

Tỷ lệ sống của cá sẽ được xác định sau khi kết thúc thời gian thí nghiệm bằng cách đếm số cá còn lại ở mỗi nghiệm thức so với tổng số cá thả ban đầu theo công thức:

2.3 Phân tích số liệu: Số liệu của các thí nghiệm được xử lý và phân tích bằng

chương trình Microsoft Excel 2003 và phần mềm Statgraphics Centurion 15.2.11.0

Số cá thu hoạch

SR (%) = x 100

Số cá thả

CHƯƠNG IIIKẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thí nghiệm 1: Phân lập và định danh sơ bộ các dòng vi khuẩn phân lập được thuộc vi khuẩn lactic

3.1.1 Phân lập vi khuẩn từ rau quả muối chua; thịt, cá lên men và cơm

mẻ

Một trăm bảy mươi (170) dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường MRS từ 36 mẫu rau quả muối chua; 20 mẫu sản phẩm lên men từ thịt, cá và 9 mẫu cơm mẻ thu tại các quận huyện và thành phố thuộc 5 tỉnh khu vực Đồng bằng sông Cửu Long Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập được thể hiện ở (Bảng 1 và Bảng 1 PL- phần phụ lục B)

Bảng 1 Nguồn gốc của một số dòng vi khuẩn đã phân lập

Stt Tên dòng Mẫu Nguồn gốc mẫu

Ghi chú: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập còn lại được liệt kê trong Bảng

1 PL- phần phụ lục B