Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của một số cây thuốc ở an giang trong điều trị bệnh alzheimer

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã phát hiện ra nhiều cây thuốc và hợp chất có khả năng ức chế enzyme AChE nhằm định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng chúng trong ngành dược phẩm, nông ng

KẾT QUẢ NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ

CÂY THUỐC Ở AN GIANG TRONG

ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

ThS LÊ MINH TUẤN

Ts LÂM THỊ MỸ LINH

NĂM 2019

UBND TỈNH AN GIANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

-oOo -

BÁO CÁO KẾT QUẢ NHIỆM VỤ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE CỦA MỘT SỐ

CÂY THUỐC Ở AN GIANG TRONG

i

Nhiệm vụ nghiên cứu khoa học “Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase

của một số cây thuốc ở An Giang trong điều trị bệnh Alzheimer”, do tác giả Lê Minh

Tuấn, công tác tại Khoa Nông nghiệp & Tài nguyên thiên nhiên thực hiện Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo Trường Đại học An Giang thông qua ngày 07/03/2019

Thư ký

Phản biện 1 Phản biện 2

Chủ tịch hội đồng

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn đến:

Sở Khoa học Công nghệ tỉnh An Giang đã tạo điều kiện cho nhóm chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

Ban giám hiệu Trường Đại học An Giang, lãnh đạo Khoa NN&TNTN cùng lãnh đạo Khoa

Sư phạm đã tạo điều kiện về thời gian, cũng như các đồng nghiệp bộ môn Hóa và bộ môn KHCT đã hỗ trợ chúng tôi trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học

Phòng Quản trị - Thiết bị đã hỗ trợ, giúp đỡ chúng tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu này

Các đồng nghiệp trong Khu thí nghiệm đã hỗ trợ chúng tôi nhiệt tình và đầy trách nhiệm trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu này

Chủ nhiệm đề tài

Lê Minh Tuấn

iii

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NHÓM NGHIÊN CỨU

1 ThS Lê Minh Tuấn Phó trưởng bộ môn – Bm KHCT,

Khoa Nông nghiệp & TNTN Chủ nhiệm đề tài

2 Ts Lâm Thị Mỹ Linh Giảng viên – Bm Hóa,

Khoa Sư Phạm

Cán bộ phối hợp

chính

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm chúng tôi Các kết quả và số liệu có nguồn gốc rõ ràng Các kết luận mới về khoa học của đề tài này chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đây

An Giang, ngày 26 tháng 02 năm 2019

Người thực hiện

Lê Minh Tuấn

v

TÓM TẮT

Alzheimer là một căn bệnh khá phổ biến ở người cao tuổi, tỷ lệ người mắc bệnh đang tăng dần gây ảnh hưởng tiêu cực đến đời sống và sinh hoạt của nhiều người trên thế giới Thông tin do Tổ chức Alzheimer quốc tế (ADI) công bố trong báo cáo năm 2010 nhân ngày Alzheimer Thế giới (21/9) cho biết số người mắc bệnh Alzheimer sẽ tăng lên gấp đôi trong vòng 20 năm tới, khoảng 65 triệu người Phương pháp điều trị Alzheimer phổ biến nhất hiện nay là ức chế quá trình thủy phân acetylcholine trong các tế bào thần kinh thông qua ức chế enzyme AChE Vùng Bảy Nui, huyện Tinh Biên và Tri Tôn, tỉnh An Giang nổi tiếng với nguồn thảo dược phong phú, đa dạng, được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến trí nhớ, thần kinh, an thần và đau đầu Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có nghiên cứu nào mang tính quy mô

và hệ thống các cây thuốc Việt Nam nào có hoạt tính ức chế acetylcholinesterase Từ đó, yêu cầu cấp thiết được đặt ra là phải tìm kiếm các loại thuốc mới cũng như các hợp chất mới, đặc biệt là các hợp chất từ tự nhiên có khả năng ức chế enzyme AChE

Do đó, đề tài đã sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 dịch chiết methanol được điều chế từ 40 cây An Giang Sàng lọc các hoạt chất ức chế acetylcholinesterase của 40 chiết xuất metanol được điều chế từ 40 cây An Giang bằng cách sử dụng thuốc thử Ellman

Qua quá trình sàng lọc thử hoạt tính ức chế enzyme AChE, nhóm chúng tôi đã tìm ra nhiều mẫu cây thuốc có hoạt tính mạnh, điển hình là bốn mẫu cây thuốc có hoạt tính mạnh nhất, đó

là Hoàng đằng (F tinctoria; 2014; IC 50 = 0.36 µg/mL), Thổ hoàng liên (T foliolosum; 2038;

IC 50 = 1.90 µg/mL), Dâu tằm (M alba; 2025; IC 50 = 2.22 µg/mL) và Rau má (C asiatica; 2010; IC 50 = 4.48 µg/mL)

Kết quả nghiên cứu của đề tài đã phát hiện ra nhiều cây thuốc và hợp chất có khả năng ức chế enzyme AChE nhằm định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng chúng trong ngành dược phẩm, nông nghiệp và công nghiệp đặc biệt là các dược liệu trong lĩnh vực điều trị bệnh Alzheimer

Từ khóa: Alzheimer, enzyme acetylcholinesterase, Hoàng đằng, Thổ hoàng liên, Dâu

tằm, Rau má

vi

ABSTRACT

Alzheimer's is a fairly common disease in the elderly The increasing incidence of illness has

a negative impact on the lives and activities of many people around the world Information released by the International Alzheimer's Association (ADI) in its 2010 Alzheimer's World report (21/9) says that the number of people with Alzheimer's disease will double over the next 20 years, to 65 million people The most common Alzheimer's treatment nowadays is the inhibition of acetylcholine hydrolysis in nerve cells via AChE enzyme The Bay Nui region, Tinh Bien and Tri Ton district, An Giang province is famous for rich herbal resources, diversity, are used to treat diseases related to memory, neurological, sedative and headache However, to date, no research of any scale and any system of Vietnam medicinal plants have acetylcholinesterase inhibitors activity Since then, the urgent requirement is to look for new drugs as well as new compounds, especially natural compounds that can inhibit the enzyme AChE

Therefore, thesis was screened of acetylcholinesterase inhibitors activities of 40 methanol extracts which prepared from 40 An Giang plants Screening of acetylcholinesterase inhibitors activities of 40 methanols extracts which prepared from 40 An Giang plants by using Ellman reagent

Through screening of AChE enzyme inhibitory activity, many highly active plants were found, typically 4 medicinal plants with the strongest AChE enzyme inhibitory activity, there are F tinctoria – Hoang dang (2014; IC 50 = 0.36 µg / mL), T foliolosum – Tho hoang lien (2038;

IC 50 = 1.90 µg / mL), M alba – Dau tam (2025; IC 50 = 2.22 µg / mL) and C asiatica – Rau

ma (2010; IC 50 = 4.48 µg / mL)

The results of the study have discovered many medicinal plants and compounds that can inhibit enzyme AChE to guide the research and application of them in the pharmaceutical, agricultural and industrial sectors, especially medicinal herbs in the field of Alzheimer's treatment

Keywords: Alzheimer, enzyme acetylcholinesterase, Fibraurea tinctoria, Thalictrum

foliolosum, Morus alba, Centella asiatica

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iv

TÓM TẮT v

ABSTRACT vi

MỤC LỤC vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT x

DANH MỤC HÌNH xi

DANH MỤC BẢNG xiii

DANH MỤC SƠ ĐỒ xiv

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

1.3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.3.1 Nội dung nghiên cứu 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI 2

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học 2

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo 2

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội 3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH ALZHEIMER 4

2.1.1 Biểu hiện của bệnh Alzheimer 4

2.1.2 Các nguyên nhân dẫn đến bệnh Alzheimmer 4

2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME ACETYCHOLINESTERASE 5

2.2.1 Cấu tạo của enzyme acetylcholinesterase 5

2.2.2 Vai trò của acetylcholine 6

2.2.3 Vai trò của enzyme acetylcholinesterase 6

2.2.4 Các phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme AChE 6

2.2.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman 7

2.2.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B 8

viii

2.2.5 Một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme AChE từ tự nhiên 9

2.3 GIỚI THIỆU VỀ HỢP CHẤT ALKALOID, FLAVONOID, TERPENOID VÀ STEROID 14

2.3.1 Alkaloid 14

2.3.2 Flavonoid 15

2.3.3 Terpenoid 16

2.3.4 Steroid 17

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1 PHƯƠNG TIỆN 19

3.1.1 Hóa chất 19

3.1.2 Thiết bị 19

3.1.3 Dụng cụ 19

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.2.1 Xây dựng qui trình thử hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase bằng phương pháp trắc quan với chất đối kháng dương là galantamine và berberine 19

3.2.1.1 Thay đổi nồng độ chất nền acetylcholinesterase 19

3.2.1.2 Thay đổi nồng độ enzyme AchE 20

3.2.1.3 Khảo sát sự thay đổi hấp thu theo thời gian 20

3.2.1.4 Khảo sát nồng độ chất đối chứng dương galantamine 20

3.2.2 Thu thập các mẫu cây dược liệu Thực hiện ly trích mẫu cây khô bằng dung môi methanol để thu cao khô 21

3.2.2.1 Thu thập và định danh mẫu dược liệu 21

3.2.2.2 Ly trích mẫu dược liệu khô bằng dung môi methanol để thu được các mẫu cao thô 26

3.2.2.3 Xác định độ ẩm của nguyên liệu và hiệu suất ly trích của mẫu dược liệu 26

3.2.3 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme AChE của các mẫu dược liệu 27

3.2.3.1 Chuẩn bị hóa chất 27

3.2.3.2 Nguyên tắc phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme AChE 27

3.2.3.3 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế enzyme AchE 28

3.2.3.4 Xử lý kết quả 29

3.2.3.5 Nơi thực hiện thử nghiệm 29

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 XÂY DỰNG QUI TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME ACETYLCHOLINESTERASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG VỚI CHẤT ĐỐI KHÁNG DƯƠNG LÀ GALANTAMINE VÀ BERBERINE 30

ix

4.1.1 Thay đổi nồng độ chất nền acetylthiocholine 30

4.1.2 Thay đổi nồng độ enzyme AChE 30

4.1.3 Khảo sát sự thay đổi độ hấp thu theo thời gian 31

4.1.4 Kết quả và thảo luận 32

4.1.5 Khảo sát nồng độ chất đối kháng dương 33

4.2.THU THẬP CÁC MẪU CÂY DƯỢC LIỆU THỰC HIỆN LY TRÍCH MẪU CÂY KHÔ BẰNG DUNG MÔI METHANOL ĐỂ THU CAO KHÔ 34

4.2.1.Thu hái và định danh mẫu 34

4.2.2 Ly trích mẫu dược liệu khô bằng dung môi methanol để thu được các mẫu cao thô 35

4.2.3 Xác định độ ẩm của nguyên liệu và hiệu suất ly trích của mẫu dược liệu 37

4.2.3.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 37

4.2.3.2 Hiệu suất ly trích mẫu 39

4.3 SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME AChE CỦA CÁC MẪU DƯỢC LIỆU 42

4.3.1.Kết quả 42

4.3.2.Thảo luận 44

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

5.1 KẾT LUẬN 52

5.2 KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ CHƯƠNG 1 56

PHỤ CHƯƠNG 2 58

PHỤ CHƯƠNG 3 60

PHỤ CHƯƠNG 4 64

ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long

EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid

HR-ESI-MS : High resolution electro spray ionization mass spectroscopy

IC 50 : Nồng độ ức chế 50% enzyme (Inhibitory Concentration 50%)

M, MeOH : Methanol

MeOH-CLC : Cao chiết MeOH từ thân cây Chiêu liêu cườm

NMR : Nuclear magnetic resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

NP : Nomal phase (pha thường)

PBS : Phosphate buffered saline (đệm phosphate)

PTLC : Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế)

SEM : Standard error of the mean (sai số chuẩn của giá trị trung bình)

SSTT : Sa sút trí tuệ

TAU : Protein ổn định cấu trúc

TLC : Thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng)

Trolox : Acid 6-hydroxy - 2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic

UV : Ultraviolet (tử ngoại)

YHCT : Y học cổ truyền

xi

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Sự mất ổn định của protein TAU 4

Hình 2.2 Sự hình thành mảng β-Amyloid ở não người bệnh 5

Hình 2.3 Cấu trúc enzyme acetylcholinesterase 5

Hình 2.4 Cấu trúc của bộ ba xúc tác 6

Hình 2.5 Cấu trúc acetylcholine 6

Hình 2.6 Bản BTLC của dịch chiết loài Corydalis sp được hiện màu bằng thuốc thử Ellman 7 Hình 2.7 Muối Fast Blue B 8

Hình 2.8 Bản BTLC của các vết có lượng Physostigmin từ 10-5 đến 10-1 µg được hiện màu bằng thuốc thử muối Fast Blue B 8

Hình 2.9 Năm dược liệu có hoạt tính ức chế enzyme AChE mạnh 9

Hình 2.10 Hợp chất galagine phân lập từ lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) 10

Hình 2.11 Các hợp chất được phân lập từ cây Phi cầu (Sarcococca saligna) và cây Cà mà (Bucus papillosa) 11

Hình 2.12 Các hợp chất phân lập từ cây Thủy tiên (Narcissus poeticus) và cây Ngọc trâm (Eucharis grandiflora) 11

Hình 2.13 Các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Két (Beilschmiedia alloiophylla) 11

Hình 2.14 Các hợp chất phân lập từ một số loại dược liệu 12

Hình 2.15 Các hợp chất phân lập từ rễ cây Dướng (Broussonetia papyrifera) 12

Hình 2.16 Các hợp chất phân lập từ trái cây Bông lơn (Paulownia tomentosa) 13

Hình 2.17 Các hợp chất acid ursolic phân lập từ lá và thân cây Rau má (Centella asiatica) 13 Hình 2.18 Các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Lim xẹt (Peltophorum dasyrachis) 14

Hình 2.19 Một số hợp chất alkaloid 15

Hình 2.20 Một số hợp chất flavonoid 16

Hình 2.21 Một số các hợp chất triterpenoid 17

Hình 2.22 Một số các hợp chất steroid 18

Hình 4.1 Độ hấp thu của dung dịch theo sự thay đổi nồng độ của chất nền 30

Hình 4.2 Độ hấp thu của dung dịch theo sự thay đổi nồng độ của enzyme 31

Hình 4.3 Sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch theo thời gian 32

Hình 4.4 Phần trăm ức chế theo nồng độ chất đối kháng dương galantamine (a) và berberine (b) 33

Hình 4.5 Một số mẫu dược liệu đã phơi khô và xay nhỏ sau khi thu hái 35

xii

Hình 4.6 Hình ảnh các mẫu dược liệu trong suốt quá trình trích ly và cô quay 36

Hình 4.7 Cây Hoàng đằng 45

Hình 4.8 Cây Thổ hoàng liên 45

Hình 4.9 Cây Dâu tằm 46

Hình 4.10 Cây Rau má 46

Hình 4.11 Dây Thìa canh 47

Hình 4.12 Cây Lựu 47

Hình 4.13 Cây Ớt 48

Hình 4.14 Cây Trầu bà 48

Hình 4.15 Cây Dừa cạn 49

Hình 4.16 Cây Huỳnh bá 49

Hình 4.17 Cây Bí kì nam 50

Hình 4.18 Cây Húng chanh 50

Hình 4.19 Cây Trà xanh 51

xiii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Danh mục, tiêu chí lựa chọn của các cây thuốc nghiên cứu ở vùng Bảy Núi, AG 22

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ hấp thu của dung dịch theo sự thay đổi nồng độ của chất nền 30 Bảng 4.2 Kết quả khảo sát độ hấp thu của dung dịch theo sự thay đổi nồng độ của enzyme 31 Bảng 4.3 Kết quả khảo sát sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch theo thời gian 31

Bảng 4.4 Các thông số tối ưu của quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme AChE 33

Bảng 4.5 Kết quả khảo sát phần trăm ức chế theo nồng độ chất đối kháng dương 33

Bảng 4.6 Kết quả xác định độ ẩm của 40 mẫu dược liệu 37

Bảng 4.7. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi của 40 mẫu dược liệu 39

Bảng 4.8 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme AChE của galantamine và berberine 42

Bảng 4.9 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 mẫu cao methanol (2001-2040)42 Bảng 4.10 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme AChE của 4 mẫu cao có hoạt tính mạnh 43

xiv

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ điều chế các mẫu cao MeOH 26

Sơ đồ 3.2 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme AChE 28

1

CHƯƠNG 1

MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh Alzheimer là một dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất hiện nay Sa sút trí tuệ (dementia) là mất khả năng về trí lực và giao tiếp xã hội ở mức độ gây khó khăn cho cuộc sống hàng ngày

Sự thoái hóa mô não đang bình thường với nhiều nguyên nhân chưa được biết rõ, gây nên sự suy sụp dần dần trí nhớ và trí tuệ bệnh nhân Tỷ lệ mắc bệnh tăng theo độ tuổi cứ mỗi 5 năm sau tuổi 65, có nguy cơ nhiễm bệnh khoảng gấp đôi

Tổ chức Y tế Thế giới cho biết trong năm 2006 có 26,6 triệu người trên thế giới mắc bệnh Alzheimer, tỷ lệ này ước tính sẽ tăng lên 53 triệu người vào năm 2015 và 92 triệu người trong năm 2030 Một số phương pháp điều trị bệnh Alzheimer được quan tâm hiện nay đó là ức chế quá trình thủy phân acetycholine trong các tế bào thần kinh thông qua việc ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE).Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới có khả năng ức chế enzyme AChE từ tự nhiên là một vấn đề lớn, luôn được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới (Rouleau, Iorga & Guillou, 2011) Thông tin do Tổ chức Alzheimer quốc tế (ADI) công bố trong báo cáo năm 2010 nhân ngày Alzheimer Thế giới (21/9) cho biết số người mắc bệnh Alzheimer sẽ tăng lên gấp đôi trong vòng 20 năm tới, khoảng 65 triệu người; riêng ở Mỹ, hiện nay, cứ 8 người trong độ tuổi từ 65 trở lên thì có 1 người mắc bệnh Alzheimer, và gần một nửa số người từ 85 tuổi trở lên mắc căn bệnh này Dự tính, chi phí chữa trị Azheimer và các chứng bệnh mất trí nhớ khác trong năm 2010 sẽ lên tới 604 tỷ đôla

Mỹ, tương đương 1% tổng GDP toàn cầu Hiện các nước giàu chiếm 46% số trường hợp mắc bệnh Alzheimer và 89% chi phí chữa trị căn bệnh này trên thế giới Các tỷ lệ này ở các nước

có thu nhập trung bình lần lượt là 40% và 10%, còn ở các nước có thu nhập thấp lần lượt là 14% và 1% Những số liệu trên là hồi chuông cảnh báo bệnh Alzheimer sẽ trở thành cuộc khủng hoảng sức khỏe và xã hội nghiêm trọng nhất trong thế kỷ 21

Vai trò chính của Acetylcholinesterase (AChE) được tìm thấy trong màng tế bào hồng cầu, là điểm kết thúc của dây thần kinh thúc đẩy sự dẫn truyền tại những khớp thần kinh bởi sự thủy phân nhanh chóng của Acetylcholine (ACh) Nó chủ yếu được tìm thấy ở chức năng thần kinh

cơ (neuromuscular junction) và cholinergic synapses trong hệ thần kinh trung tâm, nơi nó là điểm cuối của dẫn truyền thần kinh AChE có tính xúc tác cao, mỗi mol AChE có thể thủy phân 25.000 phân tử ACh trong 1 giây AChE là 1 enzyme rất hoạt động, với sự luân chuyển khoảng 103 đến 104 s-1 Bằng cách ức chế enzyme AChE, quá trình thủy phân ACh cũng bị

ức chế, nhờ đó làm tăng nồng độ ACh ở synaptic của não người bệnh Alzheimer , cho phép tỉ

lệ lưu giữ cao hơn và quá trình lưu giữ ACh cao hơn ở thụ thể, cải thiện hiện trạng bệnh lý Trong cơ thể chúng ta luôn luôn diễn ra quá trình chuyển hóa từ acetylcholine dưới sự xúc tác của enzyme AChE tạo ra nhóm choline và nhóm acetate Tuy nhiên, trong não bộ chất acetylcholine đóng vai trò là chất dẫn truyền thần kinh, nếu chất này ở hàm lượng thấp sẽ gây

An Giang nói chung, vùng Bảy Núi nói riêng được thiên nhiên ưu đãi có vùng Bảy Núi với hệ thực vật và động vật khá phong phú, đa dạng chủng loài dược liệu với nhiều loại quý hiếm Bên cạnh việc khai thác, tỉnh An Giang đã có nhiều đề án, chương trình gắn với việc bảo tồn, sản xuất, phát triển cây dược liệu; vừa làm vị thuốc trong y học

Qua việc phân tích tài liệu tham khảo, nhận thấy rằng nhóm hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme AChE mạnh thuộc họ: flavonoid, alkaloid, terpenoid, polyphenol và glycoside coumarin Vì vậy, trong đề tài này sẽ tiến hành nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 loại cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang để làm cơ sở cho việc nghiên cứu phát triển thuốc trị bệnh Alzheimer

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:

Tìm ra 40 cây dược liệu có hoạt tính ức chế enzyme AChE mạnh, từ đó đưa ra khuyến cáo trong việc điều trị bệnh Alzheimer

1.3 NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:

1.3.1 Nội dung nghiên cứu:

- Xây dựng qui trình thử hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase bằng phương pháp đo quang với chất đối chứng dương là galantamine và berberine

- Thu thập các mẫu dược liệu tại vùng Bảy Núi - An Giang Ly trích mẫu cây khô bằng dung môi methanol để thu được cao khô

- Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme Acetylcholinesterase của các mẫu cao thô trên qui trình đã xây dựng

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 mẫu dược liệu

1.4 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian nghiên cứu: Đề tài thực hiện từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 01 năm 2019

- Địa điểm nghiên cứu: Thu hái mẫu được thực hiện tại vùng Bảy Núi – huyện Tịnh Biên và Tri Tôn – tỉnh An Giang Các thí nghiệm tối ưu qui trình thử hoạt tính và sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 mẫu dược liệu được thực hiện tại phòng thí nghiệm 315 và 418, Khu Thí nghiệm – Thực hành, Trường Đại học An Giang

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

1.5.1 Đóng góp về mặt khoa học

- Đã thu hái và định danh được 40 mẫu dược liệu tại vùng Bảy Núi – huyện Tịnh Biên và Tri Tôn – Tỉnh An Giang

- Trích ly 40 mẫu cao khô bằng dung môi methanol

- Tối ưu hóa quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme AChE với các điều kiện: pH của dung dịch là 8.0, nhiệt độ thực hiện là nhiệt độ phòng, nồng độ nền là 0.667 mM, nồng độ enzyme

là 0.01 U/mL và thời gian đo mẫu là 20 phút

- Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme AChE của 40 mẫu cao thô; trong đó tìm ra 13 mẫu dược liệu có hoạt tính ức chế enzye AChE mạnh

1.5.2 Đóng góp công tác đào tạo

Đề tài góp phần phục vụ công tác nghiên cứu khoa học và giảng dạy của giảng viên và sinh viên trường Đại học An Giang

3

1.5.3 Đóng góp phát triển kinh tế xã hội

Đề tài hướng đến việc sử dụng nguồn thực phẩm và dược liệu phong phú của địa phương trong việc chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh nói chung, cụ thể trong điều trị bệnh Alzheimer nói riêng

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH ALZHEIMER

Alzheimer là một căn bệnh phổ biến, thường gặp ở người cao tuổi, làm thoái hóa cả bộ não gây nên hiện tượng giảm trí nhớ ở người bệnh Ngoài ra, bệnh cũng gây ra tổn thương tế bào thần kinh ở vỏ não và những cấu trúc xung quanh làm sa sút trí nhớ, giảm phối hợp vận động, giảm cảm giác,… cuối cùng dẫn đến mất trí nhớ và chức năng tâm thần (Dan, Meira, Amiram, David & Hermona, 1999)

2.1.1 Biểu hiện của bệnh Alzheimer

- Mất trí nhớ hoàn toàn

- Mất tập trung tư tưởng

- Sụt cân không giải thích được

- Gặp khó khăn trong việc đi đứng

- Sự giảm estrogen sau mãn kinh, homocystcine, sự thiếu hụt vitamin nhóm B, trầm cảm,…

2.1.2 Các nguyên nhân dẫn đến bệnh Alzheimer

Những tiến bộ trong kĩ thuật hình ảnh cho thấy người bị bệnh Alzheimer có sự mất tế bào thần kinh và giảm thể tích những vùng não chi phối trí nhớ Đến nay, nguyên nhân gây ra bệnh vẫn chưa rõ ràng Các nhà khoa học đưa ra giả thuyết về nguyên nhân gây bệnh, đây là hai nguyên nhân được chấp nhận phổ biến hiện nay:

- Do một loại protein TAU – protein ổn định cấu trúc, có mặt trong não và hệ thần kinh trung ương của người Ở bệnh nhân Alzheimer, cấu trúc protein TAU bị mất ổn định tạo nên sự rối loạn các vi ống trong tế bào não (Hình 2.1) (Mudher & Lovestone, 2002)

Hình 2.1 Sự mất ổn định của protein TAU (Mudher & Lovestone, 2002)

- Sự xuất hiện của protein β-amyloid, chúng không hoà tan mà tích tụ thành những mảng keo

Sự tích tụ quá nhiều β-amyloid sẽ làm giảm chất trung gian dẫn truyền thần kinh

acetylcholine cần thiết cho trí nhớ và cũng ngăn chặn sự vận chuyển ion K+, Na+, Ca2+ qua màng tế bào (giúp cho quá trình truyền tín hiệu thần kinh) Bên cạnh đó, còn có sự tích tụ của một số protein khác như ERAB (endoplasmic reticulum associated binding protein), mảng

5

AMY (giống β-amyloid), Par-4 (prostate apotosis response – 4) (Hình 2.2) (Murphy & Harry,

2010)

Hình 2.2 Sự hình thành mảng β-Amyloid ở não người bệnh (Murphy & Harry, 2010)

Từ những giả thuyết đưa ra, các nhà khoa học chú ý đến sự giảm chất dẫn truyền thần kinh do

sự hình thành các mảng bám protein và lấy việc ngăn chặn sự hình thành cũng như tích tụ

β-amyloid làm cơ sở cho việc điều trị bệnh Alzheimer

2.2 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME ACETYCHOLINESTERASE

2.2.1 Cấu tạo của enzyme acetylcholinesterase

Phân tử enzyme acetylcholinesterase có dạng hình elip, hình thành từ khoảng 543 acid amin,

là một loại enzyme hoạt động cực kỳ hiệu quả do ở trung tâm phân tử enzyme có chứa bộ ba hoạt động xúc tác điển hình Serine – Histidine – Glutamine và trên bề mặt protein có trường tĩnh điện xung quanh (Hình 2.3) (Israel & Joel, 2008)

Hình 2.3 Cấu trúc enzyme acetylcholinesterase (Israel & Joel, 2008)

 Trung tâm hoạt động:

Trung tâm hoạt động của enzyme là một hốc sâu và hẹp, khoảng 20 Å, ăn sâu vào khoảng nửa enzyme và mở rộng gần phía nền, chứa bộ ba xúc tác Tâm hoạt tính của enzyme chứa một lượng nhỏ điện tích âm gần vùng xúc tác nhưng nhiều vòng thơm gần bộ ba xúc tác Serine – Histidine – Glutamine và trên thành hốc dẫn đến sự trượt xuống hốc của chất nền (Avigdor & cs., 1994)

Hình 2.4 Cấu trúc của bộ ba xúc tác (Avigdor & cs., 1994)

Trường tĩnh điện xung quanh bề mặt protein đóng vai trò quan trọng trong nhận biết và gắn kết phân tử chất nền dưới tác dụng của điện thế Coulomb Khi có sự va chạm giữa enzyme với chất nền mang điện, có thể xảy ra hai loại hiệu ứng sau:

- Sự phân bố điện tích của enzyme có thể ảnh hưởng đến tỉ lệ va chạm không cụ thể của chất nền với phần nào đó trên bề mặt enzyme

- Điều khiển chất nền đến vùng đặc biệt trên bề mặt enzyme, làm thay đổi xác suất của việc hình thành phức giữa enzyme với chất nền

2.2.2 Vai trò của acetylcholine

Trong cơ thể, acetylcholine được tổng hợp từ choline coenzyme A với sự xúc tác của choline – acetyl và lưu trữ trong các hệ thần kinh

Hình 2.5 Cấu trúc acetylcholine (Jacques & cs., 2006)

Acetylcholine là một chất trung gian dẫn truyền thần kinh trong quá trình giao tiếp giữa các tế bào não với nhau, hình thành những kí ức của con người

2.2.3 Vai trò của enzyme acetylcholinesterase

Enzyme acetylcholinesterase là enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine, tạo ra nhóm choline và nhóm acetate, thường được tìm thấy ở các khớp thần kinh hay các điểm nối thần kinh cơ trong hệ thần kinh Enzyme acetylcholinesterase là một loại enzyme có hoạt tính xúc tác cao, rất hoạt động với sự luân chuyển khoảng 103 - 104

s-1 (Dan, Meira, Amiram, David & Hermona, 1999)

Bằng cách ức chế enzyme acetylcholinesterase, quá trình thủy phân acetylcholine cũng giảm

và làm tăng khả năng lưu trữ acetylcholine ở các khớp thần kinh người bệnh Alzheimer làm cải thiện tình trạng của bệnh nhân

2.2.4 Các phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme AChE

Nghiên cứu sàng lọc là giai đoạn đầu của quá trình nghiên cứu phát triển thuốc mới Giai đoạn này thường tiến hành đánh giá hoạt tính của một lượng lớn các mẫu thử Vì vậy, những phương pháp được lựa chọn để sử dụng ở giai đoạn này phải là những phương pháp có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu, lượng mẫu cần ít, cho kết quả nhanh và chi phí thấp

Phương pháp thử in vitro đáp ứng được tất cả những yêu cầu đó Đối với nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE in vitro, có hai phương pháp thường được sử dụng là phương

pháp sử dụng thuốc thử Ellman và phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B (Hoàng Việt Dũng, 2014)

7

2.2.4.1 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman

Trong số những phương pháp được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế AChE

in vitro, phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman được xây dựng và ứng dụng sớm nhất

Hiện nay, phương pháp này vẫn được sử dụng khá phổ biến ở nhiều nghiên cứu cùng hướng; trong đó, phương pháp đo quang được sử dụng nhiều hơn phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học Phương pháp này sử dụng cơ chất là acetylthiocholine (ATCh) và thuốc thử là acid 5,5ꞌ-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB)

a/ Phương pháp đo quang

Phương pháp của Ellman dùng để xác định hoạt tính của enzyme AChE dựa vào đo quang được tác giả này mô tả lần đầu tiên vào năm 1961 Nguyên tắc của phương pháp: trong môi trường đệm pH = 8,0; enzyme AChE sẽ xúc tác quá trình thủy phân acetylthiocholine iodide (ATCI) tạo thành acetyl và thiocholine Thiocholine sinh ra sẽ phản ứng với acid 5,5ꞌ-dithiobis-2-nitrobenzoic (DTNB) để tạo ra sản phẩm màu vàng là axit 5-thio-2-nitrobenzoate có bước sóng hấp thu cực đại tại 412 nm

Sau đó, nhiều nghiên cứu sàng lọc về hoạt tính ức chế AChE in vitro khác tiếp tục được thực

hiện Tuy nhiên, so với phương pháp gốc được công bố bởi Ellman, phương pháp được triển khai trong các nghiên cứu sau đó đều có một số thay đổi về: nguồn gốc và hoạt độ của enzyme, loại đệm sử dụng, nồng độ dung dịch cơ chất và thuốc thử… cũng như tỷ lệ phối hợp của chúng vào hỗn hợp phản ứng

b/ Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học

Trên cơ sở phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học (BTLC) đã được phát triển Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, hỗn hợp gồm dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun lên bản mỏng, sau đó mới phun dung dịch enzyme Những chất gây ức chế AChE sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền vàng

Một trong những hạn chế của phương pháp BTLC là có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả, hiện tượng vết màu trắng xuất hiện trên bản mỏng không phải do tác dụng ức chế AChE Để khắc phục hạn chế này, bên cạnh bản mỏng thử phải tiến hành làm thí nghiệm với một bản mỏng khác (bản đối chiếu) Các bước tiến hành trên bản đối chiếu tương tự như trên bản thử chỉ khác ở giai đoạn phun thuốc thử hiện màu Đối với bản thử, hỗn hợp dung dịch thuốc thử DTNB và cơ chất ATCI được phun trước, sau đó mới phun dung dịch AChE Với bản đối chiếu, dung dịch thuốc thử DTNB được phun trước, sau đó hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất ATCI và dung dịch AChE được phun sau Cách bố trí thử nghiệm như trên nhằm đảm bảo những vết màu trắng xuất hiện trên cả hai bản là những vết cho phản ứng dương tính giả; còn những vết chỉ xuất hiện trên bản mẫu là có khả năng ức chế enzyme AChE Hình 2.6 dưới đây minh họa kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp BTLC hiện màu bằng thuốc thử Ellman

Hình 2.6 Bản BTLC của dịch chiết loài Corydalis sp được hiện màu bằng thuốc thử Ellman

A Phản ứng ức chế enzyme, vết trắng chỉ ra hoạt tính ức chế enzyme

B Phản ứng dương tính giả, vết trắng không phải vì ức chế enzyme

2.2.4.2 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B

So với phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman, số lượng nghiên cứu sử dụng phương pháp

này để sàng lọc hoạt tính ức chế AChE trên mô hình in vitro khá hạn chế Phương pháp này

sử dụng cơ chất là α-naphthyl acetate và thuốc thử là muối Fast Blue B (Naphthanil Diazo

Blue B)

Hình 2.7 Muối Fast Blue B

a/ Phương pháp đo quang

Thử nghiệm đo quang sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B được công bố lần đầu tiên bởi tác

giả Van Asperen K vào năm 1962 Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất α-naphthyl acetate

bị thủy phân bởi enzyme AChE giải phóng chất α-naphthol Chất này sau đó phản ứng với

thuốc thử muối Fast Blue B tạo thành sản phẩm màu diazo Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 600 nm

Tuy nhiên, sau đó, không có nhiều nghiên cứu sử dụng phương pháp này để nghiên cứu sàng

lọc tác dụng ức chế AChE trên mô hình in vitro và một trong số đó là nghiên cứu của tác giả

Di Giovanni S Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của tác giả này có một số thay đổi so với phương pháp của tác giả Van Asperen về: nguồn gốc và hoạt độ của enzyme, hóa chất để bất hoạt enzyme và nồng độ dung dịch cơ chất

b/ Phương pháp sắc ký lớp mỏng sinh học (BTLC)

Muối Fast Blue B cũng được sử dụng như một thuốc thử trong phương pháp BTLC để

nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức chế AChE in vitro và được phát triển bởi Marston năm

2002 Ở phương pháp này, sau khi bản mỏng được triển khai, dung dịch enzyme được

phun lên bản mỏng Sau đó, hỗn hợp gồm dung dịch cơ chất α-naphthyl acetate và dung

dịch thuốc thử muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng Những chất gây ức chế AChE

sẽ làm xuất hiện các vết màu trắng trên nền màu tím sẫm Hình 2.8 dưới đây minh họa kết quả nghiên cứu sử dụng phương pháp BTLC hiện màu bằng muối Fast Blue B

Hình 2.8 Bản BTLC của các vết có lượng Physostigmine từ 10-5 đến 10-1 µg được hiện

màu bằng thuốc thử muối Fast Blue B

Cũng giống phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử Ellman, phương pháp BTLC sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B cũng có thể gặp phải hiện tượng dương tính giả Để loại trừ các vết dương tính giả, một bản mỏng đối chiếu tương tự với bản mỏng thử được triển

9

khai Sau đó, các dung dịch α-naphthol và muối Fast Blue B được phun lên bản mỏng mà

không có dung dịch enzyme Nếu xuất hiện vết màu trắng thì vết đó là vết dương tính giả

Bên cạnh 2 phương pháp được trình bày ở trên, phương pháp điện di mao quản cũng

đã được sử dụng để nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế AChE trên mô hình in vitro trong

nghiên cứu của Tang Z M (2007) Tuy nhiên, mới chỉ có rất ít nghiên cứu sử dụng phương pháp này được công bố Lý do là bởi phương pháp này đòi hỏi phải có trang thiết bị phù hợp với thao tác thử nghiệm tương đối phức tạp Ngoài ra, hạn chế về số lượng mẫu thử được đánh giá ở mỗi lần thao tác máy cũng góp phần cản trở việc ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong nghiên cứu sàng lọc

2.2.5 Một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme AChE từ tự nhiên

Hiện nay có nhiều hợp chất được phân lập trong tự nhiên có khả năng ức chế enzyme AChE, những chất này chủ yếu thuộc họ alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, glycoside coumarine

và một số polyphenol khác

2.2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm alkaloid

Năm 2011, Đỗ Quyên và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu sàng lọc dược liệu có tác dụng ức chế enzyme acetylcholinesterase của 38 cây dược liệu ở Bắc Giang, Hưng Yên và Hà Nội Kết quả cho thấy rằng, 5 cây dược liệu (Bình vôi tán ngắn, củ Dòm, Cau, Náng và Trinh nữ hoàng cung) có hoạt tính ức chế enzyme AChE mạnh lớn hơn 70%, 5 cây dược liệu này đều

có thành phần hóa học chính là nhóm chất alkaloid (Đỗ Quyên & cs., 2011)

Hình 2.9 Năm dược liệu có hoạt tính ức chế enzyme AChE mạnh

(Đỗ Quyên & cs., 2011)

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm flavonoid

Năm 2012, Trịnh Thị Thanh Vân và các cộng sự đã phân lập được 6 hợp chất flavonollàizalpinine, macakurzin A, galangine, 8-prenylgalangine, macakurzin B, macakurzin

C và 1 hợp chất flavanone là glabranine từ lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) Kết quả thử

hoạt tính cho thấy cả 7 hợp chất đều có hoạt tính ức chế AChE, trong đó hợp chất galangine

có hoạt tính ức chế mạnh nhất với giá trị IC50 = 10 µM (Hình 1.10)

Hình 2.10 Hợp chất galagine phân lập từ lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) (Trịnh Thị

Thanh vân & cs., 2012)

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm chalcone

Theo Nguyễn Thị Cẩm Vi (2018) đã nghiên cứu trong 24 dẫn chất chalcone được khảo sát thì

có 4 chất có khả năng kháng AChE tốt nhất với IC50, gồm: D21 trimethoxyphenyl)-2-protein-1-one) là 114,8 µM; D20 (1-(thiophen-2-yl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-protein-1-one) là 137,36µM; D9 (1-(furan-2-yl)-3-(4-methoxyphenyl)-2-protein-1-one) là 173,7 µM; D5 (1-(pyridin-2-yl)-3-(3,4-dimethoxyphenyl)-2-protein-1-one)

(1-(thiophen-2-yl)-3-(3,4,5-là 179,3 µM

Kết quả nghiên cứu cho thấy, nhân thiophene làm tăng khả năng ức chế enzyme AChE so với nhân pyridine và furane Sự hiện diện của nhiều nhóm hoạt tính hơn so với các nhóm thể khác

Đồng thời, kết quả docking còn cho thấy, trong 3 nhóm dẫn chất chalcone trên thì các dẫn chất có nhóm thế -OCH3 ở nhân benzene có hoạt tính sinh học cao hơn hẳn các dẫn chất còn lại Sự có mặt của nhóm –OCH3 có thể hình thành liên kết hydro giữa –OCH3 với các acid amine vùng gắn kết đặc biệt là với Ser-200 của vùng xúc giác

2.2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm alkaloid

Năm 2011, tác giả Julien Rouleau và cộng sự đã phân lập từ cây Phi cầu (Sarcococca saligna)

và cây Cà mà (Bucus papillosa) được 4 hợp chất alkaloid (Hình 2.11) có khả năng ức chế

AChE như sau:

R Tên chất IC 50 (µM)

H Buxamine B 7,56

CH 3 N,N-Dimethyl buxapapine 7,28

11

Hình 2.11 Các hợp chất được phân lập từ cây Phi cầu (Sarcococca saligna) và cây Cà mà

(Bucus papillosa) (Rouleau, Iorga & Guillou, 2011)

Năm 2007, Pulok và các cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất là epinorgalantamine,

galantamine, sanguinine, 11-hydroxylgalantamine từ hai đối tượng nghiên cứu là cây Thủy

tiên (Narcissus poeticus) và cây Ngọc trâm (Eucharis grandiflora) Kết quả thử hoạt tính ức

chế AChE cho thấy cả 4 hợp chất đều ức chế rất mạnh enzyme với giá trị IC50 như sau:

Hình 2.12 Các hợp chất phân lập từ cây Thủy tiên (Narcissus poeticus) và cây Ngọc

trâm (Eucharis grandiflora) (Pulok, Venkatesan & Peter, 2007)

Năm 2012, M Abbas và các cộng sự đã phân lập được 4 hợp chất là asimilobine, boldine,

isoboldine, 2-hydroxyl-9-methoxyaporphine từ vỏ cây Két (Beilschmiedia alloiophyla) Kết

quả thử hoạt tính ức chế AChE cho thấy cả 4 hợp chất đều có hoạt tính ức chế mạnh với giá trị IC50 như sau:

R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 Tên chất IC 50 (µM)

H H OCH 3 OH H CH 3 Asimilobine 8,7

OH OCH 3 OCH 3 OH H CH 3 Boldine 8,57

OH OCH 3 OH OCH 3 CH 3 H Isoboldine 9,40

Năm 2007, Pulok K Mukherjee và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về hoạt tính ức chế AChE cho thấy các hợp chất thuộc nhóm alkaloid là physostigmine, rivastigmine, assoanine được phân lập từ một số loại dược liệu có hoạt tính ức chế AChE mạnh, trong đó mạnh nhất

là physostigmine với giá trị IC50 = 6.10-4 µM (Hình 2.14)

Hình 2.14 Các hợp chất phân lập từ một số loại dược liệu (Pulok & cs., 2007)

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm flavonoid

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Hyung Won Ryu đã phân lập được 3 hợp chất flavonol là papyriflavonol A, broussoflavonol B, 8-(1,1-dimethylallyl)-5′-(3-methylbut-2-enyl)-3′,4′,5,7-

tetrahydroxylflavonol có hoạt tính ức chế enzyme AChE từ rễ cây Dướng (Broussonetia papyrifera) Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme AChE cho thấy hợp chất: 8-(1,1-

dimethylallyl)-5′-(3-methylbut-2-enyl)-3′,4′,5,7-tetrahydroxylflavonol và hợp chất papyriflavonol A có hoạt tính ức chế mạnh với giá trị IC50 tương ứng là 0.82 và 3.1 µM (Hình 2.15)

methylbut-2-enyl)-3′,4′,5,7-0,82

Hình 2.15 Các hợp chất phân lập từ rễ cây Dướng (Broussonetia papyrifera)

(Ryo & cs., 2012)

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của tác giả Jung Keun Cho và các cộng sự đã phân lập từ trái

cây Bông lơn (Paulownia tomentosa) được ba hợp chất dihydroflavonol và hai hợp chất

flavanone (Hình 2.16) có khả năng ức chế AChE như sau:

13

R 1 R 2 R 3 Tên chất IC 50 (µM)

OH OCH 3 H 4′-O-Methyldiplacone 31,9 OCH 3 OH H 3′-O- Methyldiplacone 48,5

 Một số hợp chất ức chế enzyme AChE thuộc nhóm terpenoid

Năm 2012, M N Nasir và các cộng sự đã phân lập từ lá và thân cây Rau má (Centella asiatica) 3 hợp chất terpenoid là acid madecassic, acid asiatic và acid ursolic Kết quả thử

hoạt tính ức chế AChE cho thấy hợp chất acid ursolic có hoạt tính mạnh nhất với giá trị

IC50 = 7.5 nM (Hình 2.17)

Hình 2.17 Hợp chất acid ursolic phân lập từ lá và thân cây Rau má (Centella asiatica)

(Nasir, Abdullah, Habsah, Ghani & Rammes, 2012)

Năm 2010, tác giả M Fujiwara, N Yagi và M Miyazawa đã phân lập từ vỏ cây Lim xẹt

(Peltophorum dasyrachis) được 8 hợp chất sesquiterpene (Hình 2.18) có khả năng ức chế

AChE như sau:

*Sự phân bố của lớp chất alkaloid trong thiên nhiên

Alkaloid thường được tìm thấy trong thực vật bậc cao, chủ yếu trong họ cỏ (như Bắp, Cỏ, Lúa), loa kèn (như Loa kèn), cà phê (như cây Cà phê), thuốc phiện (như cây Anh túc), cà (cây Thuốc lá), đậu (như cây Đậu Hà Lan),…Một số thực vật bậc thấp chứa một lượng đáng kể

alkaloid như thạch tùng (Lycopodium), mộc tặc (Equisetum) và một số loài nấm như

Claviceps (Nguyễn Diệu Liên Hoa & cs., 2015)

Hình 2.18 Các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Lim xẹt (Peltophorum dasyrachis)

(Fujiwara, Yagi & Miyazawa, 2010)

15

Trong quá trình sinh tổng hợp, alkaloid thường lưu trữ tại các mô khác với nơi nó được tạo ra,

ví dụ như nicotine được sinh tổng hợp từ rễ cây Thuốc lá nhưng được chuyển lên lá và tồn trữ tại đó Sự biến đổi cấu trúc hóa học cũng thường xảy ra ở nơi khác với nơi quá trình sinh tổng hợp xảy ra ban đầu, ví dụ như các tropan-alkaloid có hệ thống vòng cơ bản được tổng hợp ở

rễ cây Cà độc dược Datura và khi di chuyển lên lá, nhiều quá trình biến đổi xảy ra (Nguyễn

Diệu Liên Hoa & cs., 2015)

* Hoạt tính sinh học của alkaloid

Alkaloid có tác dụng dược lý phong phú như chống sốt r t (quinine), chống ung thư (homoharringtonine, taxol, vinblastine, vincristine), kháng acetyl choline (galantamine), giãn mạch (vincamine), chống loạn nhịp (quinidine), kích thích thần kinh trung ương (strychnine, caffeine), ức chế thần kinh trung ương (morphin, codeine), kích thích thần kinh giao cảm (ephedrine), liệt giao cảm (yohimbine), kích thích phó giao cảm (pilocarpine), liệt phó giao cảm (atropine), gây tê (cocaine), tác dụng hạ huyết áp (reserpine, serpentine), tác dụng diệt ký sinh trùng, diệt khuẩn (quinine, berberine, arecoline, emetine),… (Nguyễn Diệu Liên Hoa & cs., 2015)

Galantamine Berberine

Taxol

Hình 2.19 Một số hợp chất alkaloid 2.3.2 Flavonoid

* Khái niệm

Flavonoid là những hợp chất C15 được sắp xếp bởi hai nhân phenol gắn với nhau qua ột đơn

vị C3 Chúng là một lớp chất lớn nhất của các hợp chất phenolic thiên nhiên, tồn tại rất phổ biến trong thiên nhiên, dạng tự do và liên kết glycoside Trong hàng loạt các chất flavonoid thì các hợp chất chalcone anthocyanidine và auronone được biết là các chất màu ở trong cây (Trần Văn Sung & cs., 2011)

* Sự phân bố của lớp chất flavonoid trong thiên nhiên

Flavonoid là một trong những nhóm chất phân bố rộng nhất trong thiên nhiên, có mặt không những ở thực vật bậc cao mà còn ở một số thực vật bậc thấp và các loài tảo Có khoảng trên 11.000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và xác định cấu trúc Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: hoa, quả, lá, rễ, gỗ,…và khu trú ở thành tế bào Chúng tham gia tạo màu sắc cho cây, nhất là hoa Đó chính là một trong những chức năng sinh lý quan trọng của flavonoid đối với cây cỏ (Trần Văn Sung & cs., 2011)

Theo quá trình tiến hóa thực vật, bắt đầu xuất hiện lavonoid ở hai loài tảo vòng (Charrophyceae) Sự tiến hóa của flavonoid trong thực vật hạt kín (Angiospermae) dẫn đến sự hình thành các nhóm flavonoid mới như neoflavonoid, aurone và chromanocoumarane Các flavonoid tồn tại trong thiên nhiên với một số lượng lớn và ở nhiều họ thực vật khác nhau như Leguminosae (Đậu), Rutaceae (Cà phê), Moraceae (Dâu tằm), Ericaceae (Đỗ quyên) và Anacardiaceae (Đào lộn hột) Các isoflavonoid dựa trên khung cấu trúc 3-phenylchromane có nguồn gốc sinh học từ tiền chất flavanone, chúng xuất hiện không nhiều trong thế giới thực vật và hầu hết chỉ giới hạn trong phân họ Papillionoideae của họ Leguminosae (Đậu) (Trần Văn Sung & cs., 2011)

* Hoạt tính sinh học của flavonoid

Các flavonoid có phổ hoạt tính rất rộng và được sử dụng rộng rãi trong cuộc sống, nhất là trong dược phẩm và thực phẩm chức năng Một số hoạt tính chủ yếu của nhóm chất flavonoid là: hoạt tính chống oxy hóa (Các hợp chất licochalcone A và licochalcone B được phân lập từ cây Cam thảo (Glycyrrhiza uralensis F.) họ đậu (Fabaceae) có hoạt tính chống oxy hóa tương đương với vitamin E), hoạt tính kháng vi sinh vật (Hoạt chất baicalin được phân lập từ cây

Hoàng cầm (Scutelleria baicalensis G.) họ hoa môi (Lamiaceae) có tác dụng ức chế trực tiếp

virut HIV), hoạt tính ức chế enzyme, hoạt tính kháng viêm, hoạt tính oestrogen, hoạt tính

kháng khối u và gây độc tế bào (Từ lá cây Chổi xuể (Baeckea frutescens L.) họ sim

(Myrtaceae) người ta đã phân lập được 2 flavanone có hoạt tính gây độc mạnh với tế bào ung thư bạch cầu L 1210 với giá trị IC50 là 0,25 μg/mL) (Trần Văn Sung & cs., 2011)

Licochalcone A Licochalcone B Baicalin

Hình 2.20 Một số hợp chất flavonoid 2.3.3 Terpenoid

* Khái niệm

Trong tự nhiên, lớp chất terpenoid là một trong những lớp chất trao đổi thứ cấp tồn tại phổ biến và có cấu trúc đa dạng nhất Phân tử của các terpenoid được cấu tạo từ các đơn vị chứa 5 nguyên tử carbon (isoprene); được phân loại theo số lượng nguên tử carbon trrong phân tử, bao gồm monoterpenoid (10 C), sesquiterpenoid (15 C), diterpenoid (20 C), triterpenoid (30 C) và carotenoid (40 C) (Trần Văn Sung & cs., 2011)

* Sự phân bố của lớp chất terpenoid trong thiên nhiên

Terpenoid được tìm thấy rộng rãi với số lượng lớn trong thực vật bậc cao, ở tất cả các bộ phận của cây như hoa, lá, hạt, rễ, gỗ và cũng xuất hiện ở rêu, tảo, địa y, địa tiễn Một số có nguồn gốc từ động vật (đặc biệt là côn trùng) và vi khuẩn (Nguyễn Diệu Liên Hoa & cs., 2015) Mono- và sesquiterpenoid là thành phần chính của tinh dầu, là những chất dễ ba hơi và có mùi (thường là mùi thơm), tìm thấy trong nhựa cây (sap) và mô thực vật, thường dễ bị lôi cuốn theo hơi nước Tuy nhiên, các mono- và sesquiterpenoid tồn tại ở dạng glycoside hay ester với acid béo thì không bị lôi cuốn theo hơi nước (Nguyễn Diệu Liên Hoa & cs., 2015)

* Hoạt tính sinh học của terpenoid

Với cấu trúc đa dạng, phong phú và được phân bố rộng rãi trong động vật và thực vật, terpenoid đặc biệt là các triterpenoid ngày càng được quan tâm nghiên cứu cả về cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học Các hợp chất triterpenoid có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm,

chống ung thư (Hợp chất acid ursolic được phân lập từ các loài Prunella vulgaris, Psychotria serpens, Hypris capitata thể hiện độc tính đối với các tế bào ung thư phổi dòng A-549, tế bào

bạch cầu lympho P-388 và L-1210); kìm hãm sự phát triển khối u (Acid betulonic và các dẫn xuất của nó lần đầu tiên được M Sholichin và cộng sự phân lập từ vỏ cây Betula mandshurica cho thấy có hoạt tính kháng khuẩn, kháng khối u và sốt rét khá hiệu quả); chống oxy hóa, kháng virus (Hợp chất saponine được tách từ hạt đậu nành có khả năng ức chế được sự nhân bản của các tế bào MT-4 của virus HIV-1); trừ sâu; trị các chứng bệnh về đường hô hấp, bệnh gan, bệnh thấp khớp, ho, nấm; hạn chế sinh tổng hợp cholesterol, đặc biệt là khả năng chống lại sự phát triển của virus HIV (Trần Văn Sung & cs., 2011)

Acid ursolic Acid betulonic

Hình 2.21 Một số hợp chất triterpenoid 2.3.4 Steroid (Trần Văn Sung & cs., 2011)

* Khái niệm

Steroid là các trietrpenoid biến đổi, chứa hệ bốn vòng như trong triterpenoid lanosterol nhưng không có ba nhóm methyl gồm hai nhóm ở C-4 và một nhóm ở C-14

Các steroid trong tự nhiên:

 Sterol: cholesterol, ergosterol, sitosterol,…

 Acid mật: acid cholic, acid cholanic,…

 Hormon của tuyến thượng thận

 Hormon sinh dục

 Glycoside tim

 Saponin

 Steroid akaloid,…

* Sự phân bố của lớp chất steroid trong thiên nhiên:

Steroid là một nhóm hợp chất thiên nhiên quan trọng, phân bố rộng rãi trong động vật và thực

vật, cũng được tìm thấy trong vi sinh vật

* Hoạt tính sinh học của steroid

Nhiều steroid tự nhiên và một lượng lớn steroid tổng hợp và bán tổng hợp có hoạt tính sinh học hữu ích nên được sử dụng nhiều trong y học Trong y học hiện đại, các thuốc kháng sinh

và các thuốc steroid là những loại thuốc thiết yếu nhất để điều trị và phòng ngữa nhiều bệnh hiểm nghèo Hiện nay, hàng trăm loại thuốc steroid đang được dùng để điều trị hàng trăm loại bệnh tật khác nhau; do đó, các chất steroid còn được gọi là chìa khóa của cuộc sống

Cholesterol β-Sitosterol

Hình 2.22 Một số hợp chất steroid

19

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN

3.1.1 Hóa chất

- Methanol

- Galantamine (Sigma, Switzerland, code 1953044, ≥ 94%)

- Berberine (Sigma – Aldrich, Germany, code 2517832, ≥ 99%)

- Enzyme AChE (Sigma, USA, code 9000811, 200 – 1000 U/mg protein)

- Acetylthiocholine (Fluka, Switzerland, code 1866155, ≥ 99%)

- Acid 5, 5ꞌ-dithiobis(2-nitrobenzoic) (Aldrich, Germany, code 69783, 99%)

- Phosphate buffered saline, PBS

- Dimethyl sunfoxide (Trung Quốc)

- NaH2PO4.2H2O(Trung Quốc)

- Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc)

- NaHCO3 (Trung Quốc)

3.1.2 Thiết bị

- Bồn điều nhiệt, bếp đun

- Bộ trích Soxhlet

- Cân kỹ thuật, cân phân tích

- Hệ thống đun hoàn lưu, cô quay áp suất kém

- Tủ sấy, máy sấy

- Máy quang phổ (SHIMADZU UV-1800)

3.1.3 Dụng cụ

- Becher 1000 mL, 500 mL

- Bình cầu 2000 mL, 1000 mL

- Erlen 1000 mL, 500 mL

- Các dụng cụ thông thường khác như đũa thủy tinh, ống vi quản, hủ bi, lọ đựng mẫu

cao thô, giấy lọc, băng keo, bông gòn, găng tay, nia,…

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Xây dựng qui trình thử hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase bằng phương pháp đo quang với chất đối kháng dương là galantamine và berberine

Quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme AChE được tham khảo quy trình của tác giả Ellman và cộng sự được tối ưu hóa các điều kiện như nồng độ chất nền, nồng độ enzyme và thời gian đo mẫu cho phù hợp với phòng thí nghiệm (George L Ellman & cs., 1961)

3.2.1.1 Thay đổi nồng độ chất nền acetylthiocholine

Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ chất nền từ 0.0557 – 2.00 mM trong khi cố định nồng

độ enzyme và thuốc thử

 Dung dịch thuốc thử acid 5,5ʹ-dithio-bis(2-nitrobenzoic): nồng độ 5mM

 Dung dịch đệm phosphate: nồng độ 0.1 M; pH = 8.0

 Dung dịch enzyme acetylcholinesterase: nồng độ 0.0179 U/mL

 Dung dịch chất nền acetylthiocholine: thay đổi từ 0.0557 – 2.00 mM

 Dung dịch NaHCO3: nồng độ 15 mM

 Nhiệt độ thí nghiệm: nhiệt độ phòng

Dung dịch mẫu thật được thực hiện 3 lần giống hệt nhau; dung dịch mẫu trắng được làm 1 lần

để trừ nền

Sau khi đo độ hấp thu bằng máy trắc quang, vẽ đồ thị, từ đó suy ra tại một nồng độ chất nền

sẽ thu được giá trị độ hấp thu cực đại

3.2.1.2 Thay đổi nồng độ enzyme AChE

Enzyme là một phần quan trọng trong toàn bộ quá trình thực nghiệm, dùng nhiều sẽ gây lãng phí nhưng nếu dùng không đủ thì không đạt được sự hấp thu cực đại

Tương tự như phần khảo sát thay đổi nồng độ chất nền

Sau khi thực hiện bước 3.2.1.1: chúng tôi sẽ cố định được nồng độ chất nền mà tại đó thu được độ hấp thu cực đại

Chúng tôi tiến hành cố định nồng độ thuốc thử và chất nền, thay đổi nồng độ enzyme

 Dung dịch thuốc thử acid 5,5ʹ-dithio-bis(2-nitrobenzoic): nồng độ 5mM

 Nhiệt độ thí nghiệm: nhiệt độ phòng

Dung dịch mẫu thật được thực hiện 3 lần giống hệt nhau; dung dịch mẫu trắng được làm 1 lần

để trừ nền

Sau khi đo độ hấp thu bằng máy trắc quang, vẽ đồ thị, từ đó suy ra tại một nồng độ enzyme sẽ thu được giá trị độ hấp thu cực đại

3.2.1.3 Khảo sát sự thay đổi độ hấp thu theo thời gian

Yếu tố thời gian cũng cần được quan tâm trong qui trình thử hoạt tính, vì vậy trong thực

nghiệm chúng tôi khảo sát sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch trong thời gian 60 phút

Sau khi đã cố định được nồng độ chất nền và enzyme ở bước 3.2.1.1 và bước 3.2.1.2, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch này trong khoảng thời gian 60 phút

 Dung dịch thuốc thử acid 5,5ʹ-dithio-bis(2-nitrobenzoic): nồng độ 5mM

 Dung dịch đệm phosphate: nồng độ 0.1 M; pH = 8.0

 Dung dịch enzyme acetylcholinesterase: đã cố định được ở bước 3.2.1.2

 Dung dịch chất nền acetylthiocholine: đã cố định được ở bước 3.2.1.1

 Dung dịch NaHCO3: nồng độ 15 mM

 Nhiệt độ thí nghiệm: nhiệt độ phòng

Sau khi đo độ hấp thu bằng máy trắc quang, vẽ đồ thị, từ đó suy ra tại một điểm thời gian sẽ thu được giá trị độ hấp thu cực đại

3.2.1.4 Khảo sát nồng độ chất đối kháng dương galantamine và berberine

Chất đối kháng dương galantamine và berberine: là chất đã được dùng trong thực tế để điều trị bệnh Alzheimer

 Dung dịch enzyme acetylcholinesterase: đã cố định được ở bước 3.2.1.2

 Dung dịch chất nền acetylthiocholine: đã cố định được ở bước 3.2.1.1

 Dung dịch NaHCO3: nồng độ 15 mM

 Dung dịch galantamine: thay đổi nồng độ từ 1.0 – 3.0 µM; dung dịch berberine: thay đổi nồng độ từ 0.1 – 1.0 µM

 Nhiệt độ thí nghiệm: nhiệt độ phòng

Tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch, vẽ đồ thị Từ đồ thị, ta thu được đường thẳng với hàm

số như sau: y = ax + b, từ đó ta tìm được giá trị IC50

3.2.2 Thu thập các mẫu cây dược liệu Thực hiện ly trích mẫu cây khô bằng dung môi methanol để thu cao khô

3.2.2.1 Thu thập và định danh mẫu dược liệu

- 40 mẫu nguyên liệu được thu hái tại vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên và huyện Tri Tôn, tỉnh

An Giang theo các tiêu chí: kinh nghiệm dân gian, tài liệu tham khảo và lựa chọn ngẫu nhiên

- Các mẫu dược liệu được định danh bởi TS Lương Minh Châu – Viện lúa ĐBSCL

- Các mẫu nguyên liệu khô hiện được lưu giữ trong quyển lưu tiêu bản thực vật, ký hiệu được đánh số từ 2001 đến 2040 (Bảng 3.1), đặt tại Phòng thí nghiệm 315, Khu Thí Nghiệm, Trường Đại học An Giang

21

Bảng 3.1 Danh mục, tiêu chí lựa chọn của các cây thuốc nghiên cứu ở vùng Bảy Núi, AG

(Đỗ Huy Bích & cs., 2004; Đỗ Tất Lợi, 2005; Võ Văn Chi, 2003)

Ký

Bộ phận

sử dụng

Tên thông thường

c

2001 Aloe vera (L.)

Burm F

Lô hội (Asphodelaceae)

Toàn thân

Nha đam

Kháng virút và giúp tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể, tiêu sưng, giải dị ứng và làm lành vết thương, mau lên da non

c

2002 Artemisia

vulgaris L

Cúc (Asteraceae)

Toàn thân

Ngải cứu

Băng huyết, đau bụng kinh, đau dạ dày, đau khớp, bổ máu

2005 sinensis O.Ktze Camellia (Theaceae) Chè Lá Trà xanh

Giảm nguy cơ tiến triển bệnh tim mạch và một số bệnh ung thư

b

2006 Capsicum ssp (Solanaceae) Cà Toàn

thân

Ớt rừng

Khoan trung, tán hàn, kiện tỳ, tiêu thực, chỉ thống (giảm đau), kháng nham (chữa ung thư )

c

2007 Catharanthus roseus (L.) (Apocynaceae) Trúc đào Toàn

cây

Dừa cạn

Chống u bướu, trị bạch huyết, hạ huyết

độ di căn của các khối

u ác tính

c

22

2009 Celtis timorenis

Span

Cơm nguội (Celtidaceae) Toàn thân Cơm

nguội

Có tính sát trùng, giải độc, được sử dụng để chữa các bệnh như viêm nhiễm ngoài da, chàm

c

2010 Centella asiatica

(L.) Urban

Hoa tán (Apiaceae) thân Toàn Rau má

Tăng trí nhớ, thị lực,

hạ sốt; điều trị các chứng phù, viêm thanh quãn, tĩnh mạch, phế quản, trĩ, lợi tiểu

b

2011 Citrus

grandis L

Cam (Rutaceae) Vỏ bưởi Vỏ

Chữa ăn uống không tiêu, đau bụng, có tác dụng trừ phong, hóa đờm, tiêu báng tích

c

chelidonii L.f

Màn màn (Cleomaceae) Toàn thân Mần ri

Chữa trị bệnh đau nhức đầu, giải độc, chữa nấc cụt, người hay bị chóng mặt, da xanh, mệt mỏi, ngoài

ra trị rắn cắn rất hiệu quả

Kháng viêm, viêm gan, sốt r t, thuốc bổ, bệnh lỵ, tiêu chảy, thanh nhiệt, sát trùng

b

2015 Gentiana lutea

L

Long đởm (Gentianaceae) Toàn thân Long đởm

Chống lại sốt, bệnh gút, bệnh lo sợ, sốt rét và ký sinh trùng trong ruột

c

sylvestre R Br

Lõa ti (Gymnema) Toàn thân Thìa canh

Trị phong thấp tê bại, viêm mạch máu, rắn độc cắn, trĩ và các vết thương do dao, đạn; còn dùng diệt chấy rận

Tiêu viêm, lợi tiểu, tiêu sưng, lọc máu, trừ nhiệt, giải khát, trừ đờm

c

Toàn thân

lo t, táo bón, căng thẳng, sỏi mật, béo phì, ung thư

Lợi tiểu, tiêu viêm, kháng sinh, sát trùng, viêm gan, bong gân, thấp khớp

Trị nhiễm khuẩn sau sinh, viêm hạch bạch huyết, viêm tử cung, viêm tuyến sữa, bế kinh, khí hư, thấp khớp, nhức xương

c

2021 Lantana camara

L

Cỏ roi ngựa (Verbenaceae) Toàn thân Trâm ổi

Có tính sát trùng, cầm máu nên dùng lá cây bông ổi giã nát đắp lên vết thương, vết loét, thậm chí chỗ bị rắn cắn

c

2022 Leea rubra

Blunne

Gối hạc (Leeaceae) Toàn thân Gối hạc

Chữa sưng tấy, đơn bắp chuối hay phong thấp sưng đầu gối và chữa đau bụng

c

2023 Lindera myrrha

Merr

Long não (Lauraceae) Toàn thân Ô dước

Trị các khớp tay, chân đau nhức, tay chân tê, trúng phong miệng méo, mắt lệch, họng nhiều đờm

c

2024 Mentha crispa

L

Hoa môi (Lamiaceae) Toàn thân Húng lủi

Tốt cho tiêu hóa, ngừa ung thư, làm đẹp da, chữa trị vết cắn côn trùng, giúp hơi thở thơm mát

b

2025 Morus alba L Dâu tằm

(Moraceae) Thân

Dâu tằm

Lợi tiểu, huyết áp cao,

ho, viêm gan, nhức mỏi

b

2026 Nauclea

Officinalis (Pit.)

Cà phê (Rubiaceae) Toàn thân Huỳnh bá

Có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu sưng, giảm đau, dùng trị viêm amydal cấp

b