Hóa dược đại cương tài liệu giảng dạy

Trong cây, các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng hòa tan trong nước, trong dầu béo hoặc tinh dầu - Các hợp chất hòa tan trong nước dịch tế bào là các hydratcacbon có phân tử lượng thấp mono

hương 1 MỞ ẦU

1.1 KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LO I HỢP HẤT THIÊN NHIÊN

1.1.1 ỐI TƯỢNG VÀ LỊ H SỬ NGHIÊN ỨU

Hợp chất thiên nhiên là các sản phẩm hữu cơ của các quá trình trao đổi chất trong cơ thể sống

Ngành hóa học nghiên cứu tính chất và cấu trúc của các hợp chất thiên nhiên được gọi là hóa học các hợp chất thiên nhiên

Lịch sử các hợp chất thiên nhiên có từ xa xưa Ngành y học cổ truyền của nhiều nước đã biết nhiều đến độc tính và tác dụng chữa bệnh của của nhiều chất có nguồn gốc động thực vật Con người

đã phát triển chưng cất tinh dầu từ thế kỷ 16 Một số hợp chất cũng đã được phân lập rất sớm như campho được chiết từ thế kỷ 17

Cuối thế kỷ 19, các nhà hóa học đã nghiên cứu tính chất và cấu trúc của nhiều hợp chất thiên nhiên Một trong những công trình có giá trị là „‟qui tắc isopren‟‟ về cấu tạo của tecpenoit (Wallch, 1887)

Trong những năm của nửa đầu thế kỷ 20, các nhà hóa học đã xác định được nhiều hợp chất thiên

nhiên, như citral (Tiemann, Semmler, Verley, 1890-1897), linalol (Tiemann, Ruzicka, 1895-1919)…

Việc xác định các hợp chất thiên nhiên bằng các phương pháp hóa học là việc rất khó khăn và

phức tạp, có những trường hợp phải mất cả trăm năm Ví dụ morphin tinh khiết được phân lập từ cây

thuốc phiện từ năm 1805, nhưng đến năm 1923 các nhà hóa học mới đưa ra dự đoán về cấu trúc và mãi đến năm 1952 cấu trúc này mới được khẳng định bằng phương pháp tổng hợp Có nhiều hợp chất khác

được xác định cấu trúc cũng mất thời gian rất lâu như strychnin (1819-1954), quinin (1820- 1944) Từ

sau năm 1945, ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên phát triển mạnh mẽ nhờ sự hỗ trợ của các phương pháp vật lý hiện đại, đặc biệt là các phương pháp phân tích bằng quang phổ như: UV, IR, NMR, nhiễu xạ tia X

Ngày nay , song song với nghiên cứu hợp chất thiên nhiên, người ta cũng nghiên cứu cấu trúc của hợp chất cao phân tử, đặc biệt là các hợp chất cao phân tử trong cơ thể động thực vật sống trong đại dương để tìm kiếm các hợp chất có ích cho con người

1.1.2 PHÂN LO I Á HỢP HẤT THIÊN NHIÊN

Trong cơ thể động thực vật không chỉ có hợp chất hữu cơ mà còn có nhiều hợp chất vô cơ như muối khoáng Trong phần này chúng ta chỉ đề cập đến các hợp chất hữu cơ có trong động thực vật

Hợp chất hữu cơ thiên nhiên rất đa dạng và phong phú Tùy thuộc vào cách phân loại người ta chia các hợp chất thiên nhiên ra thành nhiều loại khác nhau

1.1.2.1 Dựa vào tính thiết yếu đối động thực vật:

người ta chia thành 2 nhóm

+ Chất trao đổi sơ cấp : Là những chất thiên nhiên cần thiết cho sự sống gồm cacbonhidrat,

protein, axit nucleic, các lipit và dẫn xuất của chúng Các hợp chất này được sản sinh từ các cơ thể sống, không phụ thuộc vào loài Quá trình trong đó các chất trao đổi sơ cấp được tạo thành được

gọi là quá trình trao đổi thứ cấp

+ Chất trao đổi thứ cấp: Là những hợp chất thiên nhiên không hẵn không cần thiết cho sự

sống của động thực vật Tuy nhiên khác với chất trao đổi sơ cấp, các chất trao đổi thứ cấp thường

phụ thuộc nhiều vào loài Các hợp chất thứ cấp bao gồm : tecpenoit, steroit, flavonoit,

ankaloit….Chúng là sản phẩm của quá trình trao đổi thứ cấp

Các chất trao đổi thứ cấp được nghiên cứu nhiều do tác dụng dược lý và các hoạt tính sinh học của chúng

Trong hợp chất thiên nhiên thường có các nhóm chức cơ bản:

1.1.2.2 Dựa vào bộ khung cacbon, các nhóm chức và theo tính phổ biến của hợp chất:

Các hợp chất thiên nhiên thường được phân loại thành:

+ Chất béo- lipit

+ Hidratcacbon- Gluxit ( monosacarit, oligosacarit, polisacarit)

+ Axit amin- Protit

+ Tecpenoit (monotecpen, ditecpen, tritecpen…)

1.2 PHƯƠNG PHÁP HIẾT XUẤT

Có nhiều phương pháp chiết xuất hợp chất thiên nhiên, tùy thuộc vào hợp chất cụ thể và từng loại nguyên liệu cụ thể mà người ta chọn phương pháp thích hợp Muốn vậy trước hết chúng ta phải biết những nguyên tác cơ bản trong chiết xuất hợp chất thiên nhiên

1.2.1.NGUYÊN LIỆU

Để nghiên cứu thành phần hóa học của cây nào đó trong điều kiện cho phép nên dùng nguyên liệu tươi Nguyên liệu thu hái xong nên ổn định bằng cách nhúng vào cồn hay nước đun sôi trong vài phút, sau đó để ráo nước hay làm khô tự nhiên trong không khí Hết sức tránh dùng nhiệt độ cao để làm khô nguyên liệu

Phải sơ bộ xử lý nguyên liệu ban đầu như: vứt bỏ nguyên liệu có sâu bệnh,

Phải xác định đúng tên khoa học của cây, vì nếu không xác định đúng tên của cây thì việc xác định không có ý nghĩa về khoa học Do đó thông thường khi thông báo khoa học phải ghi địa chỉ người xác định, cơ quan…để người đọc có thể liên hệ tham khảo khi cần thiết

1.2.2 TÍNH PHÂN Ự Á HỢP HẤT THIÊN NHIÊN

Trong cây, các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng hòa tan trong nước, trong dầu béo hoặc tinh dầu

- Các hợp chất hòa tan trong nước (dịch tế bào) là các hydratcacbon có phân tử lượng thấp (monosaccarit, một số oligosaccarit như pectin, gôm…); các glycozit, muối ankaloit của các axit hữu cơ; các aminoaxit, muối của aminoaxit; các hợp chất phenol hòa tan dưới dạng glycozit

- Các hợp chất tan trong dầu béo hoặc tinh dầu là các hidrocacbon, monotecpen, sesquitecpen, sterol, carotenoit…

Nói chung các chất tan trong nước là các chất phân cực còn các chất tan trong dầu béo và tinh dầu là các chất ít phân cực Tuy nhiên tính phân cực của chúng cũng khác nhau tùy thuộc vào khối lượng nguyên tử và nhóm chức có trong phân tử hợp chất

Thông thường các hợp chất có mạch cacbon dài kém phân cực, các hợp chất có nguyên tử H liên kết trực tiếp với nguyên tố âm điện như O, N, F, Cl…là những nhóm phân cực, càng nhiều nhóm phân cực trong phân tử thì tính phân cực càng lớn

1.2.3 DUNG MÔI

1.2.3 1 Tính phân cực của dung môi

Dung môi dùng cho chiết xuất rất đa dạng và thay đổi tùy theo tính chất của nguyên liệu Cơ

sở để lựa chọn dung môi để chiết là độ phân cực của các hợp chất chứa trong nguyên liệu và độ phân cực của dung môi

Người ta phân biệt các dung môi theo độ phân cực

+ Dung môi phân cực mạnh: nước, các ancol thấp (metanol, etanol….)

+ Các dung môi không phân cực: ete, êt-dầu hỏa, benzen, toluen hexan…

+ Các dung môi phân cực yếu hoặc vừa etyl axetat, cloroform, axeton,…

1.2.3.2 hất tan trong nước và dung môi phân cực

+ Các chất điện ly như muối vô cơ tan trong nước và dung môi phân cực

+ Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hóa, nhưng nếu chúng có những nhóm tạo được liên kết hydro với nước thì tan được trong nước Càng nhiều nhóm phân cực thì phân tử ấy càng dễ tan trong nước, nếu mạch cacbon càng dài thì độ hòa tan càng giảm

Thực nghiệm cho thấy : 1 nhóm phân cực trong phân tử có khả năng tạo thành liên kết hydro với nước thì làm cho phân tử chất đó tan được trong nước nếu phân tử của chất đó có mạch cacbon không quá 5 hoặc không quá 6 nếu hợp chất có mạch nhánh Nhưng nếu phân tử có nhiều nhóm phân cực (từ 2 trở lên) thì tỉ lệ này giảm xuống: một nhóm phân cực cho 3 hoặc 4 nguyên tử cacbon trong mạch thì phân tử ấy tan được trong nước

1.2.3.3 hất tan trong ete và các dung môi không phân cực

Các hợp chất hữu cơ không chứa nhóm phân cực được gọi là các chất không phân cực Nói chung các chất không phân cực đều tan trong ete và các dung môi không phân cực và ngược lại không tan trong nước và các dung môi phân cực khác

Các phân tử có một nhóm phân cực trong phân tử có thể tan được trong ete

Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước thì không tan trong ete

Nếu một chất vừa tan trong nước vừa tan trong ete thì chất đó phải là chất không ion hóa, có

số cacbon không quá 5, có một nhóm phân cực tạo liên kết hydro nhưng không phải là phân cực mạnh

1.2.4 Á PHƯƠNG PHÁP HIẾT XUẤT

Nói chung không thể có một phương pháp chung nào có thể áp dụng được cho tất cả nguyên liệu Trong phần này chỉ nêu những phương pháp chiết xuất nhằm nghiên cứu sơ bộ khi chưa biết

rõ thành phần hóa học của nguyên liệu

1.2.4.1 Phương pháp cổ điển: Dùng một dãy các dung môi từ không phân cực đến phân cực

mạnh để chiết phân doạn các chất ra khỏi nguyên liệu ví dụ dãy ete- dầu hỏa, ete, cloroform, cồn

và cuối cùng là nước

Cách chiết thông dụng nhất là chiết nóng liên tục trên máy soxhlet hoặc chiết hồi lưu Sau mỗi lần chiết với một loại dung môi, cần làm khô nguyên liệu rồi mới tiếp tục chiết với dung môi tiếp theo Mỗi phân đoạn chiết, thu hồi dung môi và tiến hành phân tích riêng

Dựa vào tính phân cực của dung môi và có thể dự đoán sự có mặt của các chất có mặt trong các dịch chiết

+ Trong phân đoạn ete, ete dầu hỏa sẽ có hidrocacbon béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monotecpen, các chất không phân cực như các chất béo caroten, các sterol, các chất màu thực vật, clorofyl

+ Trong dịch chiết cloroform có sesquitecpen, ditecpen, coumarin, quinon các aglycon do các glycozit thủy phân tạo ra, một số ankaloit bazo yếu

+ Trong dịch chiết cồn sẽ có mặt glycozit, ankaloit, flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin

+ Trong dịch nước sẽ có sẽ có các hợp chất phân cự như các glycozit, tanin, các đường, các hidratcacbon phân tử vừa như pectin, các protein thực vật, các muối vô cơ…

1.2.4.2 Khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong nguyên liệu, dung môi thích hợp nhất

là cồn (metanol hay etanol) 80% trong nước Cồn, đặc biệt là metanol được xem như dung môi vạn năng nó có thể hòa tan các chất không phân cực cũng như các chất phân cực khác

Dịch chiết khi bay hơi dung môi được cao toàn phần chứa hầu hết các hợp chất trong nguyên liệu

Sau đó cần tách phân đoạn các chất trong cao thì chuẩn bị một dãy các chất không tan trong nước có độ phân cực từ yếu đến mạnh như ví dụ dãy ete- dầu hỏa, ete, cloroform, etyl axetat, butanol

Hòa tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết, lần lượt chiết với các dung môi trên Dịch chiết mỗi phân đoạn sau khi thu hồi dung môi đem đi phân tích

1.2.4.3 ách chiết : có 2 cách chiết là chiết nóng và chiết ở nhiệt độ thường

+ Chiết ở nhiệt độ thường : có 2 cách là ngấm kiệt và ngấm phân đoạn Ngấm kiệt là phương pháp tốt hơn vì nó chiết được nhiều hợp chất hơn, ít tốn dung môi, nhất là khi áp dụng phương pháp ngấm kiệt ngược dòng

+ Chiết nóng: Nếu dung môi dễ bay hơi phải dùng phương pháp chiết liên tục ( trong soxhlet) hoặc chiết hồi lưu Nếu chiết hồi lưu thì ít nhất phải chiết 2 lần

1.2.4.4 ách thu hồi dung môi: bằng cách chưng cất, trong đó tốt nhất là dùng phương pháp chưng cất ở áp suất thấp

1.3 PHƯƠNG PHÁP TÁ H BIỆT Á HỢP HẤT THIÊN NHIÊN

Phương pháp tách biệt cơ bản nhất là các phương pháp sắc ký

1.3.1 Á PHƯƠNG PHÁP SẮ KÝ

1.3.1 1 Khái niệm về sắc ký

Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi hỗn hợp bằng

cách phân bố chúng ra 2 pha: một pha có bề mặt rộng gọi là pha cố định và một pha kia là một chất lỏng hay chất khí gọi là pha di động, di chuyển qua pha cố định

Phân loại: Chia thành 2 loại: là sắc ký lỏng và sắc ký khí

 Sắc ký lỏng : là sắc ký có pha động là chất lỏng

Trong sắc ký lỏng có các kỹ thuật:

+ Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy

+ Sắc ký lớp mỏng: pha tĩnh là lớp mỏng chất hấp phụ được trải bằng trên tấm thủy tinh hoặc kim loại

+ Sắc ký cột: Pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột Trong sắc ký cột tùy thuộc vào bản chất của chất rắn nhồi cột mà chia thành các loại:

-Cột cổ điển: cột đơn giản với chất hấp phụ là vô cơ hay hữu cơ

-Cột trao đổi ion: Cột là chất trao đổi ion âm hoặc dương

-Cột gel hay lọc gel: Pha tĩnh là một gel tổng hợp có lỗ xốp xác định để lọc các chất có kích thước khác nhau

+ Sắc ký lỏng cao áp: ( sắc ký lỏng hiệu năng cao)

 Sắc ký khí là sắc ký có pha động là các chất khí Dựa vào pha cố định người ta còn chia ra:

Trừ trường hợp nghiên cứu toàn diện về cây, thông thường người ta phải loại tạp trước khi và

cô đặc trước khi chấm Cách loại tạp thường dùng là tách bằng các dung môi khác nhau, bằng cách tủa, ly tâm, đông lạnh…

b) hấm mẫu thử: dùng ống mao quản có đường kính từ 0,5- 1mm Thông thường nồng độ

chất chấm từ 0,1-1%, lượng chất chấm từ 1-1000g tùy thuộc vào độ nhạy để phát hiện chúng Điều quan trọng trong kỹ thuật chấm vết là chấm vết càng nhỏ càng tốt và các vết trên cùng một lần sắc ký phải đồng đều nhau về kích thước và độ đậm đặc

c) Giấy: Nếu dùng sắc ký giấy để phát hiện chất thì có thể dùng loại giấy mỏng, nhưng nếu

dùng tách chất thì có thể dùng giấy dày Khi sử dụng cần triển khai đúng chiều của giấy Thông thường ở ngoài bó giấy có có mủi tên chỉ chiều triển khai giấy

d) Dung môi: Việc chọn dung môi thích hợp là yếu tố chính quyết định kết quả thí nghiệm

+ Cách chọn dung môi:

Thứ tự độ phân cực của dung môi ( theo E Berg, 1963)

Ete dầu hỏa < CCl4 < Xyclohexan< Cacbon disunfua < dietylete < benzen < các este < Cloroform < dicloetan < các ancol < nước < pyridin < các axit hữu cơ < các axit vô cơ và bazo

Cũng có thể dùng dung môi nguyên chất hoặc hỗn hợp dung môi với tỉ lệ thích hợp Để lựa chọn hệ dung môi ta có thể dùng chạy thử với chiều cao 10 cm là đủ

+ Các loại hệ dung môi

- Hệ dung môi có pha cố định là nước

- Hệ dung môi có pha cố định là dung môi hữu cơ phân cực ( ưa nước)

- Hệ dung môi có pha cố định là dung môi hữu cơ không phân cực kỵ nước

+ Triển khai ngang

+ Triển khai vòng

+ Triển khai nhiều lần và triển khai quá cở giấy

+ Sắc ký hai chiều

e) Phát hiện vết

+ Phương pháp hóa học: Dùng các chất hiện màu đặc trưng cho từng loại hợp chất Thuốc

thử được pha có nồng độ thích hợp cho tác dụng lên giấy Có 2 cách:

- Nhúng giấy: Áp dụng cho các sắc đồ nhỏ,và thuốc thử không hòa tan các vết

- Phun : Phương pháp này thường dụng hơn

+ Phương pháp vật lý:

Thường áp dụng với các hợp chất hấp thụ tia cực tím trong khoảng từ 240-260 nm hình thành các vết tối trên nền phát quang Trong một số trường hợp có thể phun lên giấy dung dịch Fluorescein (C20H18O2) với mục đích làm tăng độ phát quang của nền để nhìn vết rõ hơn

Một số chất có khả năng phát huỳnh quang khi chiếu tia cực tím ở bước sóng khoảng 360nm

B ác yếu tố ảnh hưởng đến giái trị R f

a) Trong sắc ký để biểu thị sự di chuyển của các chất người ta dùng khái niệm Rf

Giá trị Rf không phải là một hằng số đặc trưng cho sự di chuyển của một chất ở mọi điều kiện, do đó khi ghi giá trị Rf phải ghi đầy đủ những điều kiện thí nghiệm kèm theo (loại giấy, nống độ chất thử, lượng chấm, hệ dung môi, lượng dung môi, chiều triển khai, nhiệt độ tiến hành thí nghiệm)

b) Để làm tăng độ lặp lại trong sức ký giấy chúng ta phải lưu ý

+ Giữ nhiệt độ không đổi trong khoảng nhiệt độ cho phép  50C

+ Trộn đều dung môi và giử ở nhiệt độ thí nghiệm trong 1-2 ngày

+ Kiểm tra lại dung môi bằng cách chạy thử với chất chuẩn đối chiếu

+ Giấy đã chấm chất thử được đưa vào trước 24 giờ để tạo sự cân bằng giữa giấy và khí quyển trong bình

+ Đậy bình kín trong suốt quá trình triển khai

+ Đường di chuyển của dung môi phải từ 30-35 cm nếu triển khai xuôi và 25 cm cho triển khai ngược

+ Dùng một loại giấy, tiến hành trong cùng một điều kiện

Hiện tượng vết dị thường

a Vết lan rộng ( Không tập trung): Để khắc phục cần phải

- Chấm vết càng nhỏ, tròn

- Thuốc hiện màu không quá đặc, pha vừa đủ để hiện màu

- Chọn hệ dung môi thích hợp nhất là tốc độ chạy của hệ dung môi

Ngoài ra nếu hình dạng và kích thước lỗ xố của giấy không đề vết cũng lan rộng

b Vết có đuôi Vết có đuôi có thể do

+ Lượng chất chấm quá nhiều

+ Dung môi chảy quá nhanh

+ Sự biến dổi không thuận nghịch và thừ từ các thành phần trong chất tan trong quá trình di chuyển

+ Sự hấp phụ quá mạnh của bề mặt chất hấp phụ

c Hiện tượng hai đuôi

Hiện tượng này thường xãy ra đối với các chất màu của dịch chiết, do các chất màu này không có khả năng hấp phụ mạnh bằng các chất không có màu có mặt trong dịch chiết nên các chất không màu chiếm vị trí ngay ở giữa còn các chất màu di chuyển ra rìa khi chấm Vì vậy khi triển khai thì có hai đuôi do các vết trên và dưới chạy nhanh hơn ở 2 bên nên vế có 2 đuôi

d Ngoài ra còn có các hiện tượng: vết bè ra hai bên , lan rộng ra 2 bên, vết méo, vết

không di chuyển, mất vết hoặc một chất tạo nhiều vết

1.3.1.3 SẮ KÝ LỚP MỎNG (SKLM)

A Nguyên lý:

Chiều dài di chuyển của chất thử Chiều dài di chuyển của dung môi

Rf =

Là phương pháp phân tích trong đó dung dịch chất phân tích di chuyển trên một lớp mỏng

chất hấp phụ mịn vô cơ hay hữu cơ theo một chiều nhất định Trong quá trình di chuyển, mỗi

chất chuyển dịch với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng và dừng lại ở những vị

trí khác nhau

B hất hấp phụ

Thường dùng là các oxit không tan, các oxit hidrat hóa và các muối

Lực hấp phụ của các chất hấp phụ theo trật tự tăng dần ( theo Strain) 1, Sacaroz

9, Axit silixic hoạt hóa

10, Nhôm oxit hoạt hóa

11, Than động vật hoạt hóa

Trong phân tích nguyên liệu, chất được dùng thông dụng nhất là silicagel

và oxit nhôm

Hoạt năng

Hoạt năng của chất hấp phụ phụ thuộc nhiều vào hàm lượng nước trong nó vì nước hấp phụ

sẽ chiếm vị trí hoạt động trên bề mặt làm giảm khả năng hấp phụ của chất hấp phụ, Vì vậy có thể

điều chỉnh khả năng hấp phụ bằng cách thêm nước Tuy nhiên trong thực tế khi triển khai thông

thường ta phải sấy khô để khả năng hấp phụ của chất hấp phụ tăng lên và sự hấp phụ ổn định

D hất hấp phụ thông dụng

a Silicagel: Dùng trong bản mỏng là loại bột mịn, vô định hình có đường kính cở hạt từ 10-

40 m, nếu dùng trong sắc ký cột thông thường thì đường kính cở hạt 63-200 m (63-200 mesh)

Về mặt hóa học silicagel vô định hình là loại có các nhóm siloxan O-Si-O và các nhóm

120 0C để loại nước, nhưng không sấy cao hơn 150oC vì khi đó các nhóm OH trong silicagel bị

mất nước và giảm khả năng hấp phụ và không hút nước

Ngoài ra để tăng thêm khả năng hấp phụ, tùy theo bản chất của chất cần tách người ta có thể

thêm axit hay bazo để sự hấp phụ có thể được tăng lên hay giảm xuống

b Alumina

Thành phần hóa học, chứa chủ yếu là -Al2O3

Nó có 3 loại: trung tính, baz và axit

 Alumin baz có chứa khoảng 0,1-0,5 % NaOH bám trên mặt alumin ở dạng natrialuminat,

có pH 10.Nó là chất trao đổi ion trong nước

 Alumin trung tính, có pH từ 6,5-7 Đây là loại dùng tốt cho sắc ký cột vì không gây phản ứng với chất thử

 Alumin axit được điều chế từ alumin với HCl loãng, pH  4, có tác dụng như chất trao đổi ion

Các chất thử có tính axit như các phenol, axit cacboxylic sẽ bị giữ lại trên alumin baz hơn loại trung tính và axit, ngược lại các chất có tính baz (amin, ankaloit ) sẽ bị giữ lại trên alumin axit hơn loại trung tính và baz

Khác với silicagel, các alumin nếu sấy trên 2000C sẽ hấp phụ lựa chọn đối với các chất phân cực và có thể làm tăng độ hấp phụ khi đun nóng đến dưới 7000

C và trên 7000C thì khả năng hấp phụ giảm

E Dung môi

a) Tốc độ di chuyển của chất phụ thuộc vào dung môi

Trật tự tăng dần lực phản hấp phụ dung môi như sau ( Theo Trappe)

Ete dầu hỏa < xyclohexan < CCl4 < tricloetylen < toluen < benzen

< metylclorua < clorofoc < ete etylic < etyl axetat < pyridin < axeton < n-propanol < etanol < metanol < nước

Trong thực tế người ta thường dùng hỗn hợp dung môi có độ phân cực với tỉ lệ phù hợp để tạo hệ các dung môi mới

b) Phương pháp chọn dung môi

Nguyên tắc chung: Nếu chất thử có ái lực yếu đối với chất hấp phụ thì chọn chất hấp phụ mạnh với hệ dung môi có lực phản hấp phụ yếu Ngược lại nếu chất thử ái lực mạnh với chất hấp phụ thì chọn chất hấp phụ yếu và chọn dung môi có lực phản hấp phụ mạnh

c) ấu tạo hóa học và ái lực hấp phụ

 Các hidrocacbon no hầu như không hấp phụ

 Sự có mặt của liên kết đôi tăng thêm lực hấp phụ, càng nhiều nối đôi, lực hấp phụ càng tăng

 Có thêm các nhóm chức càng làm tăng lực hấp phụ Bằng thực nghiệm, người ta thấy lực hấp phụ giảm dần theo dãy sau:

+ Đối với hidrocacbon thơm:

- COOH > -CO-NH2 > -OH > -NH-CONH2 > -NH2 > -OCO- CH3 > -CO-CH3 > - COCH3 > -N(CH3)3 > -NO2 > -OCH3 > -H > -Cl

+ Đối với hidrocacbon mạch thẳng :

- COOH > -OH > -NH2 > -COOR(ankyl) > -CH3

+ Các hợp chất cacbonyl hấp phụ yếu hơn hợp chất có OH và amin tương ứng

d) Kỹ thuật sắc ký

 Tráng kính, hoạt hóa kính : hoạt hóa ở 1100C – 1 giờ

 Bảo quản kính trong bình hút ẩm

Tùy theo tính chất của chất dùng làm cột mà sự tách có thể xãy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ (cột hấp phụ) ví dụ như silicagel, oxit nhôm hoặc cơ chế phân bố (cột phân bố) ví dụ như xenlulo

B Dụng cụ - hóa chất

a) ột

Kích thước cột và lượng chất hấp phụ: Thông thường lượng chất hấp phụ gấp 25- 50 lần lượng chất cần tách và độ cao của phần cột chất hấp phụ và của phần mẩu thử lớn hơn 8:1 Tuy nhiên với những chất khó tách thì cần cột to và lượng chất hấp phụ phải lớn hơn

Bảng 1.1: Một số thông số của kỹ thuật sắc ký cột

Mẫu sắc ký

(g)

Khối lượng chất hấp phụ (gam)

Đường kính cột

(mm)

Chiều cao cột (mm) 0,001

 ột hấp phụ : oxit nhôm, silicagel, poliamit, CaCO3, MgO, than hoạt

Một số hóa chất dùng cho sắc ký cột đã được tiêu chuẩn hóa

+ Oxit nhôm trung tính (Merck), cở hạt 0,063-0,200 mm (70- 230 mesh)

+ Oxit nhôm bazo, cở hạt 0,063-0,200 mm ( 70- 230 mesh)

 Hứng các phân đoạn vào dụng cụ hứng và thu hồi dung môi:

Thông thường các chất không phân cực ra trước sau đó mới đến các chất phân cực yếu và cuối cùng là các chất phân cực mạnh

Bảng 1.2 Thứ tự giải ly của các chất trong kỹ thuật sắc ký cột

Loại chất được giải ly ra khỏi cột Mức độ giải ly Thứ tự giải ly

Giải ly ra chậm (với dung môi phân cực)

từ dưới lên cho đến khi cột cao theo dự định

Tiếp đến cho dung môi vào cột một cách liên tục một thời gian để ổn định cột Từ lúc này trở đi không được để khô dung môi trong cột

Dung môi dùng để ổn định cột là dung môi đầu trong hệ các dung môi để tách chất trong cột

+ Vào cột bằng dung môi (Nhồi ướt): Cột được ổn định vào giá Lắc, trộn đều cột bằng dung môi thành một hỗn hợp dịch Rót vào cột cho chất hấp phụ lắng tự nhiên xuống đáy cột Khi dung môi chảy gần hết trong cột thì tiếp tục rót hỗn hợp dịch vào Chú ý là không được khô dung môi trong cột Tiếp tục cho dung môi hứng được rót vào cột cho chảy tiếp tục một thời gian (từ 5-10 giờ) để cho cột ổn định hoàn toàn

 ột phân bố: Cũng như sắc ký giấy, tách bằng cột phân bố là thực hiện sự tách giữa

2 pha là pha cố định và pha di động, do đó phải có giai đoạn xử lý pha cố định

Ví dụ tách glycozit bằng cột xenlulo với pha cố định là nước và pha di động là butanol, ta làm như sau: trộn bột xenlulo với nước, để yên 5-10 phút, sau đó lắc với dung dịch butanol bảo hòa trong nước thành một hỗn dịch rót vào cột Sau đó nhồi tương tự như nhồi ướt của cột hấp phụ

Ngược lại nếu tách caroten bằng hợp chất ít phân cực Đầu tiên bột xenlulo tẩm đều với dầu parafin tan trong ete dầu hỏa, để bốc hơi ete dầu Sau đó cho bột xenlulo vào cột bằng dung môi tương tự như trên

b ưa chất thử vào cột:

Yêu cầu là phải phân tán chất thử thành một lớp mỏng đồng đều trên một mặt phẳng Có nhiều cách đưa chất thử vào cột:

 Phương pháp dùng đĩa giấy:

Dùng giấy lọc cắt thành đĩa tròn có đường kính nhỏ hơn đường kính trong của cột khoảng 0,5 mm, dùng kim khâu đâm thành những lỗ thủng nhỏ cách đều nhau khoảng 1,5 mm

Cân chất thử hòa tan trong một lượng dung môi thích hợp Cho đĩa giấy thấm đều dung dịch thử, lấy ra cho bay hơi dung môi, tiếp tục tẩm dung dịch cho đến hết Nếu tiến hành cột lớn

 Phương pháp cho thẳng dung dịch thử lên cột:

Dùng lượng dung môi hòa tan mẫu càng ít càng tốt nhưng phải hòa tan hết, cột sau khi đã

ổn định cho dung môi chảy cho đến khi trên bề mặt chất hấp phụ vừa se khô thì đóng vòi lại Dùng ống hút cho dung dịch mẩu thử cho đều đặn trên mặt cột có thể dùng lớp cát dày 5-7mm lên mặt cột sau khi đã cho dung dịch mẫu thử vào

 Phương pháp trộn đều chất hấp phụ với mẫu chất thử

Trộn đều mẫu thử với chất hấp phụ và cho vào cột thành một lớp đều Nếu mẫu thử là cao đặc hoặc mềm thì có thể hòa tan một ít vào dung môi, trộn đều chất hấp phụ, sấy khô và tán thành bột

Trong 3 cách trên cho thẳng mẫu thử vào cột là nhanh hơn cả, nhưng cần chú ý một số điểm sau:

- Chất thử hòa tan hoàn toàn

- Cho dung dịch chất thử lên mặt cột đều (bằng cách ria đầu ống hút quanh thành cột, cách mặt cột khoảng 5 cm)

- Khi toàn bộ dung dịch thử ngấm hết vào cột mới cho dung dịch mới

- Cho dung môi nhẹ nhàng không làm xáo động mặt cột Nếu chất thử ngấm vào cột với các lớp dày đều nhau chứng tỏ kỹ thuật đảm bảo

c Rữa cột: có thể rữa cột trong các điều kiện sau:

Các yếu tố thay đổi được xây dựng bằng thực nghiệm như sau:

Bảng 1.3: Một số thông số của kỹ thuật sắc ký cột nhanh

Đường kính cột (mm) Thể tích dung môi

b1) Chọn dung môi: Dung môi dùng cho kỹ thuật sắc ký nhanh là nên chọn dung môi có

độ nhớt thấp như CHCl3, etyl axetat, ete dầu hỏa, metanol Dùng kính lớp mỏng Silicagel

40-60m tiến hành với các chất thử để tìm hệ dung môi thích hợp sao cho Rf trung bình là 0,35 (nếu hệ chất thử có 3 chất) Nếu các chất tách nhau khá xa thì điều chỉnh hệ dung môi sao cho có

Rf thấp nhất bằng 0,35

Nếu hỗn hợp nhiều thành phần thì căn cứ vào Rf của các thành phần này trên lớp mỏng để

sử dụng các hệ có độ phân cực tăng dần cho thích hợp

b2) Dựa vào R f và R f và lượng chất thử để chọn cột, thể tích dung môi và ấn định số phân đoạn tập hợp theo bảng trên

b3) Chuẩn bị cột: nhồi chất hấp phụ vào cột theo đúng yêu cầu:

Sau khi cố định cột, cho một ít bông đặt giữa đoạn nối giữa đáy cột và vòi hứng, cho một lớp cát sạch độ 4mm phủ tràn lên đáy cột Sau đó cho silicagel từng ít một vào cột, vừa cho vừa

gõ nhẹ vào thành cột chiều cao của cột silicagel là 15cm Mở vòi Bột silicagel vào xong, sau đó phủ lên một lớp cát độ 4mm, Tiếp đến rót dung môi vào đầy cột, lắp nút vào miệng cột, buộc dây

và bắt đầu mở vòi tăng áp suất từ từ Dung môi sẽ từ từ đi vào cột silicagel và đẩy không khí thoát ra ngoài theo vòi dưới cột Lưu ý là phải duy trì áp suất liên tục đến khi không khí thoát hết

ra ngoài Tiếp tục giử áp suất cho dung môi chảy hết đến khi chỉ còn cách mặt silicagel độ 3mm thì dừng lại, nhanh chóng tháo nút ra Dung môi hứng được dùng lại để rửa sau khi cho mẫu thử vào

b4) Vào dung dịch thử: Chủ yếu bằng phương pháp cho thẳng dung dịch thử vào cột Sau

khi cho mẫu thử vào cột xong cần phải điều chỉnh áp suất sao cho mỗi phút chảy được 5cm chiều cao của cột

c) Ưu điểm của kỹ thuật sắc ký nhanh

- Tiết kiệm chất hấp phụ và dung môi, thời gian nhanh hơn nhiều

- Nếu các chất có Rf từ 0,1-0,2 đều có thể tách được bằng phương pháp này, nếu chọn được hệ dung môi thích hợp

- Đơn giản, dễ áp dụng nhờ các thông số đã được xây dựng sẵn

1.3.1.5 Sắc ký khí ( xem tài liệu)

1.3.2 PHƯƠNG PHÁP HIẾT

1.3.2.1 hiết rắn – lỏng

 Chiết gián đoạn

 Chiết liên tục: dụng cụ soxhlet

Phenol là nhóm các hợp chất hữu cơ trong phân tử có nhóm OH liên kết trực tiếp với nhân thơm

Các hợp chất phenol nói chung dễ tan trong nước vì trong thiên nhiên chúng thường tồn tại

ở dạng glycozit

Trong hàng ngàn hợp chất phenol trong thiên nhiên đã biết rõ cấu tạo thì hợp chất flavonoit

là nhóm hợp chất quan trọng nhất Ngoài hợp chất phenol đơn chức một vòng, các phenylpropanoit và quinon cũng chiếm một tỉ lệ đáng kể

Về các poliphenol trong cây có lignin, melanin, tanin

Nhóm chức phenol còn tìm thấy trong một số protein thực vật trong ankaloit và tecpenoit Khi chiết xuất nguyên liệu, các phenol rất dễ bị phá hủy do tác dụng của enzim phenolaza vốn luôn có mặt trong cây Vì vậy sử dụng cồn nóng để chiết là cần thiết vì cồn hạn chế sự phân hủy phenol bởi các enzim

Để phát hiện phenol, người ta thường dùng dung dịch FeCl31% trong nước hoặc cồn Tùy thuộc vào bản chất của phenol mà có thể có từ màu lục, tím xanh hoặc màu đen

Nhiều hợp chất phenol có màu, có thể lợi dụng màu sắc của nó để theo dõi quá trình chiết xuất

2.1 PHENOL VÀ AXIT PHENOL

Các phenol và axit phenol thường được nghiên cứu chung vì chúng thường song song tồn tại với nhau ở trong cây

Một số phenol có trong cây là: hydroquinon (1,4-dihidroxibenzen), rezocxinol dihidroxibenzen), ocxinol (1,3-dihidroxi-5-metylbenzen), phlorogluxinol (1,3,5-trihidroxibenzen), catechol (1,2-dihidroxibenzen), pyrogalol (1,2,3-trihidroxibenzen),

(1,3-Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic,

axit protocatechic (axit 3,4-dihidroxibenzoic),

axit vanilic (axit 4-hidroxi-3-metoxi benzoic),

axit syringic (axit 4-hidroxi-2,3-dimetoxi benzoic),…

2.1.1 SỰ PHÂN BỐ

Các axit phenol tồn tại ở dạng kết hợp với lignin tạo thành este hoặc với các oza dưới dạng

glycozit Các axit phenol thường gặp là: axit p-hydroxibenzoic, axit pyrocatechic, axit vanilic,

axit syringic, các axit ít gặp là axit salixylic, axit o-protocatechic (axit 2,3-dihydroxibenzoic), Ngược với axit phenolic, các phenol tự do rất hiếm thấy trong cây Hydroquinon là chất thường gặp hơn cả, tiếp đến là catechol, ocxinol, phlorogluxinol, pyrogalol

2.1.2 PHÂN TÍCH PHENOL VÀ AXIT PHENOL

Việc tách phenol tốt nhất bằng SKLM Thông thường nguyên liệu tươi hoặc khô được nghiền nhỏ, thủy phân với kiềm hoặc axit trong cồn loãng 600

Thủy phân axit: dùng axit HCl 2M trong 30 phút, sau khi để nguội, lọc, chiết bằng ete Gạn lớp ete, rửa bằng nước vài lần, làm khan, bốc hơi đến khô Hòa cắn khô với metanol làm dung dịch chấm sắc ký

Nếu thủy phân bằng kiềm: NaOH 2M, thủy phân trong 4 giờ ở nhiệt độ thường Dịch thủy phân đem axit hóa rồi chiết bằng ete như trên

Chất hấp phụ là silicagel G với các hệ dung môi có độ phân cực trung bình Các hệ dung môi thường được dùng là :

A: Axit axetic : clorofoc (1 : 9) (Chất hấp phụ là silicagel G)

B: Etyl axetat: Benzen (9:11) ( Chất hấp phụ là silicagel G)

C: Benzen: metanol: axit axetic (45: 8: 6 (Chất hấp phụ xenlulo MN 300)

D: Axit axetic : nước ( 6 : 94) (Chất hấp phụ xenlulo MN 300)

Chất hiện màu : Vanilin + HCl

Kết quả phân tích được ghi ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Kết quả phân tích bằngsắc ký lớp mỏng ( SKLM) của một số phenol với 4 hệ dung

Đỏ Không màu Không màu Không màu Không màu

T.T Folin

Xanh Xanh Xanh sau khi hơ NH3Xanh sau khi hơ NH3

Xanh sau khi hơ NH3Xanh sau khi hơ NH3

276,282

282 275,280 276,283

279

295 269,273

272 260,295

265

271 260,290 235,305

294

291

288

293 Phân hủy Phân hủy

R= OH: axit cafeic R= OCH3: axit sinapic

2.2.2 PHÂN BỐ

Các axit hidroxixynamic tồn tại trong cây chủ yếu ở dạng este, dễ bị thủy phân bằng kiềm cho axit tự do

Axit cafeic thường tồn tại ở dạng este với axit quinic, gọi là axit clorogenic

2.2.3 HIẾT XUẤT VÀ PHÂN TÍ H

Axit hydroxixynamic thường được phân tích đồng thời với các phenol và các axit phenol sau khi thủy phân dịch chiết thực vật bằng kiềm và chiết láy phenol bằng ete hoặc etyl axetat Cắn sau khi bốc hơi, hòa tan trong metanol, chấm trên SKG hoặc SKLM xenlulozơ Hiện vết bằng soi UV hoặc UV + NH3

Dung môi: BAW: n-BuOH- HOAc - H2O (4: 1:5) lớp trên

BN: n-BuOH -NH4OH 2M (1: 1) lớp trên BEW: n-BuOH – EtOH- H2O (4: 1: 2,2)

Bảng 2.2 : Giá trị R f và màu sắc của một số axit hydroxyxinamic trên sắc ký giấy (SKG) với

62

82

37

- Xanh Xanh Xanh Vàng Tối

Màu hoa cà Xanh sáng Xanh sáng Xanh lục Vàng lục vàng

Khi oxi hóa với nitrobenzen, lignin cho ra 3 andehit phenolic tương ứng với ba axit phenol phổ biến trong cây là axit p-hydroxybenzoic, axit vanilic và axit syringic

Lignin của cây hạt kín và cây hạt trần có sự khác biệt Trong cây hạt kín có chứa lignin thuộc nhóm syringic nhưng trong cây hạt trần không có Ngược lai, axit phenol tự do trong thực vật hạt kín chỉ có axit p-hydroxybenzoic và axit vanilic mà không có mặt axit syringic, trong khi cây hạt trần có cả ba loại axit trên

Mối quan hệ giữa lignin và axit phenol tự do và sự khác biệt của chúng với nhau trong thực vật hạt trần và hạt kín có ý nghĩa trong việc phân tích, xác định về phương diện hóa thực vật

Để phân tích lignin, trước hết thủy phân trong axit HCl loãng, sau đó phân tích xác định các axit phenol từ dịch thủy phân

Một đơn vị cấu trúc của lignin

b Lignan

Lignan là các hợp chất phenol thiên nhiên có cấu trúc C6-C3 hoặc các dẫn xuất polime của chúng Hợp chất lignan đóng vai trò chủ yếu tạo nên lignin là coniferin, glycozit của coniferyl ancol

Những nhựa phenolic thiên nhiên rất gần với lignin, chúng là các dime của những đơn vị

C6-C3 liên kết ở vị trí  cuatr C3 Dưới đây là một số dạng phổ biến

- Dạng axit guaiaretic, dẫn xuất của

Về cấu trúc có thể có các loại khung isopren như suberosin (IV), colombianetin (V)

Về phân bố: Coumarin có trong nhiều họ thực vật: Leguminosen, Umbeliferae,

Ochidaceae, Rutaceae Chúng có mặt trong hầu hết các bộ phận của cây: rễ, lá, hoa, quả

ặc tính vật lý Coumarin là chất phát quang mạnh và rất nhạy với ánh sáng Người ta lợi

dụng tính chất này để tách các hợp chất coumarin

Về tác dụng dƣợc lý, coumarin và dicoumarin dùng làm thuốc chống đông máu Tính chất

này có liên quan đến nhóm OH ở vị trí C4 trong cấu trúc Tính chất chống đông máu biến mất hoặc giảm khi nhóm OH ở vị trí này bị biến mất hoặc bị thay thế bởi nhóm khác

Ngoài ra một số coumarin có tác dụng làm giản động mạch vành và mạch ngoại vi, có tác dụng chống co thắt Một số coumarin có tác dụng làm tăng cholesterol trong máu Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm và chống viêm

Do có mặt của nhóm lăcton, một số coumarin còn có nhóm OH phenol nên chúng tan được trong kiềm nóng Vì vậy có thể chiết chúng bằng kiềm loãng nóng , dịch kiềm đem axit hóa thu được kết tủa coumarin

Các glycozit của coumarin có thể được chiết bằng dung dịch metanol loãng hoặc etanol loãng (60-80%) Nguyên liệu được loại tạp chất béo bằng ete dầu hoả sau đó chiết bằng cồn Dịch chiết cồn sau khi đã lọai tạp có thể cho tinh thể coumarin khi làm bay hơi dung môi

Có thể loại tạp bằng dung dịch chì axetat Các glycozit coumarin có thể thủy phân bằng dung dịch axit hoặc bằng enzym Việc xác định phần đường có thể dùng sắc ký giấy

Để phân lập các coumarin có thể dùng sắc ký cột polyamit, silicagel hoặc sắc ký lớp mỏng

Có thể tinh chế coumarin bằng phương pháp thăng hoa (nhưng chỉ áp dụng với các coumarin bền với nhiệt độ)

Nhờ đặc tính phát quang mạnh của coumarin dưới đèn tử ngoại nên việc theo dõi, phát hiện chúng trong quá trình chiết xuất được dễ dàng

2.3.3 PHÂN TÍCH COMARIN

2.3.3.1 ịnh tính

Hầu hết có tính phát quang mạnh dưới đèn tử ngoại Các coumarin có Oxi ở vị trí số 7 có thể phát quang ở ánh sáng thường nhất là khi có axit sunfuric Các furocoumarin ( có cấu trúc kiểu (II) ) cho phát quang màu lục

Coumarin còn cho phản ứng màu với thuốc thử Emerson ( 0,5% Na2CO3, 0,9% aminoantipyrin, 5,4 % feroxianua trong nước)

4-Do có mặt nhóm lacton, coumarin tan được trong dung dịch kiềm và làm dung dịch có màu vàng, màu này biến mất khi thêm axit

Có thể kiểm tra thêm coumarin bằng phản ứng đặc trưng của vòng lacton Để xác định vòng furan trong furanocoumarin bằng phản ứng Erhlich (dung dịch 0,5% p-dimetylaminobenzandehit trong etanol, sau đó cho tác dụng với khí HCl) tạo màu vàng cam

2.3.3.2 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng

+ Sắc ký giấy:

Các hệ dung môi thường dùng là : Axit axetic: Nước (98:2)

Dimetyl focmamit : Etanol (4:6)

Phát hiện vết bằng đèn UV, bằng dd KI + I2 hoặc bằng các thuốc thử màu trên

+ Sắc ký lớp mỏng:

Chất hấp phụ thường được dùng là silicagel, các hệ dung môi thường được dùng là:

Ete dầu hỏa : etylaxetat (100: 3)

Toluen : etyl focmiat : axit focmic (5 : 4 :1)

CHCl3: CH3OH ( 9 : 1) CHCl3 : etyl axetat (1 :1) Hexan : etyl axetat (3:1) Benzen : axeton (9:1) Benzen : etyl axetat (9 : 1)

2.3.3.3 Phân tích quang phổ UV, IR, MS, NMR

Do có cấu trúc liên hợp nên phổ UV sử dụng khá hiệu quả,nhờ có các băng đặc trưng Các loại phổ IR, NMR cũng được sử dụng để xác định cấu trúc rất hiệu quả

2.4 QUINON

Quinon là những dixeton chưa no, khi khử chúng tạo thành poliphenol Các poliphenol này

dễ bị oxi hóa tạo lại quinon

Quinon là những hợp chất có màu , chúng góp phần tạo màu sắc của cây và động vật Nhiều hợp chất của quinon như vitamin K tham gia vào quá trình hô hấp, vào sự vận chuyển electron trong các tổ chức thực vật

Về mặt phân bố, chúng có rải rác ở thực vật đơn bào, ở nấm…, nhưng ít gặp trong cây một

O

O

CH2CH2CH2CH2COOHCH3O

Phần lớn các anthraquinon có nhóm OH ở C1 và C8 và tồn tại ở dạng glycozit Các glycozit này

dễ bị thủy phân trong quá trình chiết xuất

Công thức của một số anthraquinon

OO

R crisophanol R = CH 3

Đôi khi các glycozit là các chất khử, kết hợp với một oza hoặc hai quinon kết hợp với nhau qua nhóm xeton

OOHCH=CH-CH=CH-COOHHO

axit teleporic

OO

CH3

tashinon

2.4.2 HIẾT XUẤT

Do benzoquinon và naphtaquinon là những chất không phân cực nên rất dễ tan trong dầu béo

và các dung môi không phân cực (ete , benzen…) Một số benzoquinon không có OH ở C1 và naphtaquinon có thể cất kéo hơi nước Do đó benzoquinon và naphtaquinon có thể chiết bằng ete dầu hỏa hoặc benzen nóng Một số trường hợp chúng có thể kết tinh ngay trong bình khi bốc hơi dung môi

Các anthraquinon do có nhiều nhóm OH nên nói chung là những nhóm phân cực mạnh, chúng tan được trong nước nóng, trong cồn và các dung dịch kiềm và dung dịch cacbonat kiềm Các anthraquinon có thể chiết bằng cồn Dịch chiết cồn đem bốc hơi cồn và kết tinh lại trong hỗn hợp axeton-nước sẽ thu được glycozit anthranon toàn phần

Để thủy phân các glycozit có thể dùng axit axetic hoặc HCl 5% trong cồn ở 700C trong 1 giờ Các aglycon sau khi thủy phân được chiết bằng benzen Bốc hơi benzen và tinh chế lại thu được anthranon tinh khiết

Để tách hỗn hợp các quinon có thể bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là polyamit, silicagel, MgO hoặc canxi photphat

- Phản ứng Bortrager: Dùng để phát hiện anthraquinon và naphtaquinon

Trong ống nghiệm, cho vài mg chất thử được hòa tan trong 1 ml dung dịch 2-5% KOH Đun nóng 10 phút, để nguội Axit hóa dung dịch và chiết bằng benzen Tách lớp benzen qua ống nghiệm khác Cho vào ống chứa benzen 1 ml dung dịch KOH, lắc Nếu lớp benzen mất màu và lớp kiềm có màu đỏ là phản ứng dương tính

Nếu có dẫn xuất anthron thì lớp kiềm vẫn giữ màu vàng với huỳnh quang lục, nhưng sẽ chuyển sang màu đỏ nếu thêm vào đó 2 giọt dung dịch H2O2 3-6%

2.4.4 SẮ KÝ GIẤY VÀ SẮ KÝ BẢN MỎNG

Sắc ký giấy được sử dụng nhiều khi phân tích quinon Giấy được tẩm với dung dịch 5 dầu váelin trong ete-dầu hỏa Dùng hỗn hợp đimetylfocmamit-H2O (97:3) làm pha di động Các quinon cho vết phát quang màu lục hoặc tím dưới đèn tử ngoại

Đối với các hydroxiantraquinon dung hệ dung môi ete dầu hỏa bão hòa trong metanol 97%

Để hiện vết dùng dung dịch 0,5% mage axetat trong methanol và hơ nóng giấy 900

C trong 5 phút Các anthraquinon có OH ở meta cho màu da cam,, Nếu OH ở vị trí para cho màu mận chin và nếu

OH ở vị trí octo cho màu tím

Sắc ký lớp mỏng: chất hấp phụ thường dung là polyamit và silicagel Nếu dung silicagel tráng trên kính thì có thể dung các hệ dung môi sau:

-Benzoquinon: n-hexan – etylaxetat (17:3)

: benzene- axit axetic (9:1)

: clorofom-axit axtic (9:1)

-Naphtaquinon: Ete dầu hỏa-etyl axetat (7:3)

: benzene-ete dầu hỏa (7:3)

-Antraquinon: n-hexan – etylaxetat (85:15)

: benzene- axit axetic (10:2)

Hiện màu: Phun dung dịch KOH 10% trong methanol các vết màu vàng nguyên thủy của ảntaquinon sẽ chuyển thành màu đỏ, tím hoặc lục Cũng có thểhiện vết bằng cách hơ kính lên lọ ammoniac và soi phát quang ở UV

2.4.5 PHÂN TÍCH QUANG PHỔ

Chương 3 FLAVONOIT 3.1 I ƯƠNG

3.1.1 ỊNH NGHĨ : Flavonoit là những chất màu thực vật có cấu trúc cơ bản như sau:

O1 2

3 4 5

6

7

4' 5' 6' O

Tại các vòng có liên kết với hay một vài nhóm hydroxyl tự do hay đã thay thế một phần Vì vậy về bản chất chúng là những poliphenol có tính axit Các poliphenol có thể phản ứng với nhau qua các nhóm OH để tạo thành phân tử phức tạp hơn hoặc có thể liên kết với các hợp chất khác trong cây như các đường hoặc protein

6

7

8

2' 3' 4'

5' 6'

O

B

Thường gặp là

O1 2

3 4 6

7

5' 6'

O

O1 2

3 4 5

6 7

4'

5' 6'

O OH

3.1.2.2 Flavanon : khác flavon là không có liên kết đôi ở C2-C3

Chúng đều có OH ở vòng A hay vòng B Trong tự nhiên nó thường có mặt đồng thời với flavon tương ứng Các chất thường gặp là naringin, prunnin và hesperidin

O1 2

3 4 5

6

7

8

2' 3' 4'

5' 6'

O

O1 2

3 4 5

6 7 8

2' 3' 4'

5' 6'

7

5' 6'

O

O1 2

3 4 5

6 7

4' 5' 6'

O OH

3.1.2.3 Flavonol : khác với Flavonon là có nhóm OH ở C3

Nó là loại hợp chất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong cây hạt kín có chứa nhiều chất sau: kaempferol, quecxetin và mirixetin

O1 2

3 4 5

O

O1 2

3 4 5

6 7

4'

5' 6'

7

5' 6'

O

O1 2

3 4 5

6 7

4' 5' 6'

3.1.2.4 Dihydroflavonol : tương tự như flavonol nhưng không có nối đôi C2-C3

Chất phổ biến nhất là 7-hydroxidihydroflavonol

O1 2

3 4 5

O

O1 2

3 4 5

6 7 8

2' 3' 4'

5' 6'

Là loại flavonoit vòng mở, hai nhân thơm liên kết với nhau qua mạch ba cacbon α, β không

no Phổ biến nhất là butein



 2'

O



 2'

3' 4'

O

OH HO

OH

OH

Khung Chalcon Butein

3.1.2.6 Isoflavon:

là nhóm isoflavonoit phổ biến nhất có nhiều tác dụng chữa bệnh

Ví dụ daidzein có trong cát căn, hoặc fomonometin có trong cam thảo

O1 2

3 4 5

R1O

(khung isoflavon)

OR2

Ngoài ra còn có nhiều loại khác như auron, antoxyanidin, leucoantoxifanidin, rotenoit, neoflavonoit, biflavonoit

3.1.3 PHÂN BỐ

Nó là loại hợp chất phân bổ rộng nhất ở trong thiên nhiên ( lớn hơn 2000 chất) Nói chung nó không có mặt trong tảo và nấm còn các loại thực vật bậc cao đều có mặt flavonoit, và nó có mặt liên kết các bộ phận của cây : thân, lá, rể, gỗ… và khu trú ở thành tế bào Flavonoit tham gia vào

sự tạo thành màu sắc của cây (đặc biệt là hoa) đó là một trong những chức năng cơ bản của flavonoit đối với cây

3.1.4 V I TRÕ Ủ FL VONOIT TRONG ÂY

3.1.4.1 ác phản ứng sinh hóa:

- Các nhóm OH phenol của flavonit có vai trò trong sự hòa tan các chất và di chuyển dể dàng qua các màng sinh lý

- Một số flavonoit có tác dụng như là chất chống oxi hóat, bảo vệ axit ascorbic trong cây

- Một số có tác dụng ức chế các enjym và các chất độc của cây

3.1.4.2 Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng của cây :

Nhóm hydroxi có mặt trong cấu tạo của flavonoit đóng vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng của cây

Ví dụ trong cây ổi các flavonoit có các nhóm OH ở vị trí 4‟ làm tăng cường hoạt tính của enzim làm kích thích sinh trưởng, còn khi OH ở vị trí 3‟và 4‟ lại ức chế Flavonoit còn tham gia vào quá trình hô hấp quang hợp

3.1.4.3 Vai trò tạo màu sắc

Tạo ra sức hấp dẫn để dụ ong bướm đến thụ phấn góp phần cho cây tồn tại & phát triển Trong việc tạo màu các flanon, flavonol,chalcon cho màu vàng trong khi các autõyanin cho các màu hồng , đỏ, tím hoặc xanh thẩm

3.1.4.4 Vai trò bảo vệ cây:

Tạo vị đắng để động vật ăn cỏ không thích ăn cây

 Tác dụng estrogen: Một số flavonoit có tác dụng gây sẩy thai ở động vật

 Nhiều flavonoit có tác dụng chống dị ứng, chống co giật, giảm đau

3.2 HIẾT XUẤT

Độ hòa tan của các flavonoit tùy thuộc vào số nhiều axit có trong phân tử Do số nhóm và vị trí của các nhóm này rất khác nhau vì vậy không có phương pháp chung về chiết xuất Tuy nhiên

có thể nêu nguyên tắc chung như sau :

- Do flavonoit có hầu hết các bộ phận của cây (rễ, gổ, lá, hoa, quả, hạt, sáp), trường hợp chiết lớp sáp ở ngoài lá thì phải dùng ete… để rửa lấy sáp, các bộ phận khác nói chung sấy khô, tán bột

để chiết

- Nói chung các glycofit của flavonoit có độ phân cực mạnh hơn aglicon tương ứng Đối với aglicon mà có ít nhóm OH , chúng có độ phân cực yếu thì dùng các dung môi phân cực yếu như bonzen, cloroform, etyl axetat… để chiết

- Các flavonoit có nhiều nhóm OH như flavonol, các glycozit là những chất phân cực mạnh, nên có thể chiết chúng bằng cồn, nước hoặc là hỗn hợp của chúng

- Dung môi có thể áp dụng cho hầu hết flavonoit là cồn 80%, 60% (có thể là

C2H5OH,CH3OH 60%,80%)

- Chiết các glycozit : có thể dùng nước nóng

- Do có OH phenol nên có thể dùng dung dịch kiềm loãng

3.3 TÁCH RIÊNG – TINH HẾ

3.3.1.TÁ H SƠ BỘ : Nhằm mục đích loại tạp và tách phân đoạn đối với hỗn hợp các

flavonoit : có thể áp dụng các cách sau :

1 Có thể dung hỗn hợp các dung môi có độ phân cực khác nhau, không tan với nhau để phân đoạn :

Ví dụ : hỗn hợp aglycon và glycozit : CHCl3-H2O, H2O – etyl axetat , Butanol-ete dầu hỏa

2 Phương pháp cổ điển : Dùng Pb( CH3COO)2 để tủa flavonoit (phenol nói chung)

Hòa tan cao hỗn hợp vào cồn loãng,cho dung dịch chì axetat vào để tủa flavonoit Lọc lại cho tủa này tan trong cồn loãng khấy đều thành dung dịch đồng nhất Sau đó cho 1 trong các dung dịch sau đây : Na3PO4; Na2S để kết tủa chì (Dùng photphat hoặc sunfat tốt hơn sunfua vì các tủa này hấp phụ flavonoit ít hơn sunfua chì )

3 Dùng than hoạt tính cho vào dung dịch cao để hấp phụ flavonoit sau đó dùng dung môi rửa than để lấy lại flavonoit

Khi rửa dung môi từ không phân cực => phân cực ít => phân cực mạnh

Ví dụ : ete => methanol => nước nóng

4 Tách phân đoạn bằng các dung dịch có độ kiềm khác nhau

ví dụ : đầu tiên dùng dung môi hữu cơ CHCl3, etyl axetat; sau đó lần lượt chiết dung dịch trên với dung dịch natriborat Na3BO3, NaHCO3 và Na2CO3 10%

Axit hóa các dung dịch kiềm, flavonoit sẽ kết tủa, lọc thu kết tủa hoặc chiết lấy flavonoit bằng dung môi hữu cơ (CHCl3,etyl axetat )

3.3.3 TINH HẾ: phương pháp tốt nhất là lọc qua cột chất hấp thụ ( poliamit, silicagel, bột

xenlulo), hạn chế dùng than hoạt vì than hoạt hấp thụ rất mạnh flavonoit

Kết tinh flavonoit trong etanol , metanol hoặc cồn – axeton, cồn-etyt axetat

3.3.4 THỦY PHÂN GLY OZIT FL VONOIT Có thể dùng axit hay enzym

Đối với enzym thường dùng là -glycosidaza vì hầu hết cac glycozit flavonoit là -glycosit Cách thủy phân bằng axit: Có thể dùng các loại axit khác nhau (HCl, HCOOH,

CH3COOH…) với nồng độ thích hợp, thêm một ít cồn để hòa tan glycozit, đun sôi cách thủy từ vài phút đến 1 giờ hoặc có thể lâu hơn tùy theo từng loại hợp chất và điều kiện tiến hành phản ứng Để nguội Chiết dung dịch thu được bằng ete để láy phần aglycon Phần dịch nước chứa các đường, có thể phân tích hỗn hợp này bằng sắc ký giấy

3.4 PHÂN TÍCH FLAVONOIT

3 4.1 PHÂN TÍ H ỊNH TÍNH

3 4.1 1 ác phản ứng màu flavonoit

a/ Amoniac ( NH3) : Khi có mặt của hơi NH3, nhiều flavonoit thay đổi màu, có thể quan sát

sự thay đổi màu bằng mắt thường hoặc dưới đèn tử ngoại

+ Cánh hoa màu trắng + hơi NH3 cho màu vàng là flavon hoặc flavonol

+ Cánh hoa màu vàng + NH3 cho màu vàng cam hoặc hồng là Chalcon, auron

+ Cánh hoa màu bất kỳ ( vàng , đỏ, tím…) +NH3 cho màu đỏ thẩm là autoxyanidin

b/ Phản ứng xianidin của Wilstater

 -Benzopyron trong đa số flavonoit có phản ứng với HCl +Mg bột

Trong 3 ống nghiệm, cho vào mỗi ống 1-2 ml dung dịch thuốc thử

- Màu đỏ ngay sau khi cho HCl là chalcon, auron

+ Ống 3: Thêm 0,5 ml HCl đặc đun cách thủy 5 phút, nếu có màu đỏ tím là leucoantoxyanidin

c/ Thuốc thử Fe l 3 trong cồn hoặc nước => cho màu của phenol và flavon

d/ Thuốc thử Sb l 5 1% trong tetraclorua cacbon => có tủa màu đỏ hoặc tím là của Chalcon,

màu vàng hay da cam => flavon ( phản ứng Marini – Bettolo )

e/ Thuốc thử axit boric trong anhydrit axetic

Các hợp chất 5- hydroxi flavonon cho màu cam hay đỏ

g/ H 2 SO 4

Hòa tan một ít cao của dịch chiết flavon vào axit sunfuric đặc, nếu cho màu: vàng tươi : flavon, flavonol

màu cam : flavonon

đỏ hoạc tím : chalcon, auron

h/ Kiềm : Dịch chiết flavonoit, nếu trong dung dịch kiềm Nếu có:

Màu vàng :flavon, flavonol, Màu cam, đỏ: flavon, isoflavonon

Màu tím : Chalcon Màu cà phê: flavonol Màu xanh: autoxyanin …

3 4.1.2 Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng

Nếu dùng hệ dung môi thích hợp ta có thể tách được các flavonoit khác nhau có Rf khác nhau

3.4.2 PHÂN TÍ H ẤU TRÖ BẮNG PHƯƠNG PHÁP QU NG PHỔ

Chương 4 TINH DẦU- HỢP HẤT L TON TE PENOIT 4.1 I ƯƠNG VỀ TINH DẦU

Tinh dầu (còn có tên khác là chất thơm, hương thơm, tinh du…) là hỗn hợp của nhiều chất bay hơi, có mùi đặc biệt có nguồn gốc chủ yếu từ thực vật thu được bằng cách chưng cất hoặc chiết bằng dung môi hữu cơ

Nó ít tan trong nước, dể tan trong ete, dầu béo, dể bay hơi,

Về phân bố: Cây chứa tinh dầu phân bổ khá rộng trong nhiều họ thực vật Trong cây, tinh dầu có thể khu trú tại lá, hoa, quả , rể, vỏ, thân gỗ… Thành phần tinh dầu của mỗi bộ phận của cây

có thể giống hoặc khác nhau ( ví dụ : thành phần tinh dầu hoa cam và vỏ cam rất khác nhau) Vì vậy thường để sử dụng người ta không khai thác tất cả các bộ phận của cây ma chỉ khai thác những

bộ phận nào có hàm lượng cao và phẩm chất tinh dầu tốt nhất

4.2 THÀNH PHẦN HÓ HỌ

Nó là hỗn hợp của nhiều hợp chất khác nhau: các hydrocacbon béo hoặc thơm, các dẫn xuất của chúng như ancol, andehit, xeton, este , ete… nhưng chung qui lại chúng có hai nhóm chính là tecpenoit và các dẫn xuất của phenol Nhóm tecpenoit chủ yếu là monotecpen, và sesquitecpen

OH

O

O

Hợp chất hai vòng

pinen thujon camphor

Sesquitecpen luôn có mặt cùng với monotecpen trong tinh dầu Sesquitepen trong tinh dầu do

có nhiệt độ sôi trên 200oC, do đó khi chưng cất thì chúng có hàm lượng không cao

Một số sesquitecpen có trong tinh dầu là :

Đặc điểm cấu tạo của tecpenoit

Người ta coi tecpenoit là sản phẩm của sự kết hợp các phân tử isopren với nhau Đó là „‟qui tắc isopren ‟‟ của tecpenoit

Cách xác định cấu trúc của tecpen Dựa vào các phản ứng đặc trưng và qui tắc isopren

Những phản ứng đặc trưng thường dùng :

+ Xác định liên kết đôi: phản ứng với dung dịch brom, cộng hydro ( Ni xúc tác)

+ Xác định H linh động: Tác dụng với CH3MgX hoặc với natri

+ Xác định nhóm -CHO: Dùng thuốc thử Fehling, Tollens hay axit fucsinsunfurơ

+ Xác định vị trí của liên kết đôi: Phản ứng ozon phân : Cho hỗn hợp các hợp chất chứa nhóm cacbonyl, phản ứng oxi hóa cắt mạch… phối hợp với ”quy tắc isopen” ta có thế xác định được cấu tạo của tecpen

Isoeugenol Mirislixin Anisandehit Vanilin

Ví dụ tinh dầu bạc hà có 50-70% mentol, ngoài ra có menton, limonene, -pinen, cadinen… Tinh dầu tiểu hồi có70-90% anetol, ngoài ra có các thành phần khác tương tự

4.3 HIẾT XUẤT

Tinh dầu khu trú trong nhiều bộ phân khác nhau của cây: lá, hoa , thân, vỏ thân, rễ, quả…Nguyên

liệu chiết tinh dầu có thể khô hoặc tươi, nhưng nếu có điều kiện thì dùng tươi tốt hơn vì thành phần

không bị hao hụt và phân hủy trong quá trình làm khô

Tùy thuộc vào các dạng tinh dầu có trong nguyên liệu trạng thái tự do, hay hết hợp glycozit

mà người ta dùng các phương pháp khác nhau để tách chúng

Nhìn chung các phương pháp được dùng để tách tinh dầu phải đạt yêu cầu cơ bản như sau :

- Giữ cho sản phẩm tinh dầu có mùi tự nhiên như nguyên liệu

- Qui trình kỹ thuật khai thác phù hợp, thuận tiện, nhanh chóng

- Phương pháp tách tinh dầu tương đối triệt để khai thác hết tinh dầu trong nguyên liệu mà có đầu tư ít tốn nhất

Trong thực tế người ta thường sử dụng các phương pháp sau:

4.3.1 PHƯƠNG PHÁP Ơ HỌ : ( thường là ép )

Phương pháp này thường dùng để tách tinh dầu nằm ở vỏ (quýt, cam, bưởi), khi tác dụng một lực lên các tế bào chứa tinh dầu vở, tinh dầu chảy ra Phương pháp này có ưu điểm nhanh, tinh dầu giữ được mùi tự nhiên Tuy nhiên phương pháp này không sử dụng được cho nhiều nguyên liệu chứa tinh dầu hoặc hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu thấp

4.3.2 PHƯƠNG PHÁP HƯNG ẤT :

Đây là thường dùng nhất vì thiết bị không phức tạp lắm mà có khả năng lấy kiệt được tinh dầu trong nguyên liệu và dựa vào nhiệt độ sôi các chất khác nhau có thể lấy được các phân đoạn với thành phần chủ yếu là một số chất nào đó Tuy nhiên có những nhược điểm là : Các tinh dầu có thành phần khó bay hơi, hay một số tinh dầu có thành phần không bền vững dễ thay đổi ở nhiệt độ cao thì không áp dụng được

4.3.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍ H LY (ngâm chiết)

Phương pháp này áp dụng cho các nguyên liệu tinh dầu mà thành phần hóa học của nó không bền dễ thay đổi thành phần và mùi vị ở nhiệt độ cao Ngoài ra các nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu quá ít cũng không dùng phương pháp chưng cất được mà phải dùng phương pháp trích ly

Phương pháp trích ly người ta thường dùng các dung môi hữu cơ dễ bay hơi như ete dầu hỏa, ete, ancol, axeton hoặc các dung môi khó bay hơi như mỡ động vật, vazơlin Gần đây người ta dùng CO2 lỏng để trích lý tinh dầu

4.3.4 PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

Đối với một số nguyên liệu, nhất là các loại hoa, có thể kéo dài thêm thời gian tạo hương sau khi hái rời khỏi cây, trước đây người ta dùng mở động vật để hấp thụ Nhưng phương pháp này mất nhiều thời gian, thao tác thủ công, không áp dụng ở qui mô công nghiệp được, giá thành đắt Hiện nay người ta dùng than hoạt tính làm chất hấp phụ, bằng cách cho luồng khí ẩm đi qua lớp hoa tươi, nhằm kéo dài thời gian sống của hoa Luồng khí ẩm khi đó cho qua lớp hoa tươi lôi cuốn theo chất thơm đi vào thiết bị hấp phụ Chất hấp phụ than hoạt sẽ giữ các chất thơm => sau

đó trích ly => thu tinh dầu

Lớp hoa sau khi hấp phụ, đen trích ly hoặc chưng cất để thu phần tinh dầu không bay hơi còn lại

4.3.5 PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN:

Phương pháp này dùng cho các loại tinh dầu ở dạng quả và các dạng mà tinh dầu không ở trạng thái tự do mà các dạng kết hợp khác (ở dạng glycozit là chủ yếu) Trước khi đưa sử dụng phương pháp tách tinh dầu thông thường, người ta phải dùng men, enzym xử lý sơ bộ trước để tạo tinh dầu ở dạng tự do

4.4 TÍNH HẤT Ủ TINH DẦU

4.4.1 TÍNH HẤT VẬT LÝ:

Ở nhiệt độ thường , tinh dầu chủ yếu ở thể lỏng, trừ một số trường hợp đặc biêt

Tinh dầu có tính dễ bay hơi, có thể cất kéo bằng hơi nước rất ít tan trong nước, tan trong cồn, các dung môi hữu cơ,các dầu mỡ

Tùy theo thành phần, tinh dầu tan trong cồn với nồng độ khác nhau, có thể tan một phần trong dung dịch kiềm (phenol), dung dịch NaHSO3 (andehyt)…

Tinh dầu không có màu hay có màu hơi vàng, có loại tinh dầu có màu xanh (tinh dầu dương

kỳ thảo) hay màu đỏ(tinh dầu thymus), màu nâu thẩm (tinh dầu quế)

Tình dầu có vị hơi cay và hắc

Tỷ trọng : nằm trong khoảng 0,850- 0,950 Một số nặng hơn nước (tinh dầu quế, đỉnh hương ) Tỉ trọng của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần của tinh dầu

Nếu tỷ lệ các hidrocacbon tecpenoit cao thì tỷ trọng thấp (<0.9) Nếu tỷ trọng cao hơn 0,9 thì thường chứa nhiều hợp chất chứa oxi ( este, ancol, andehit, xeton) Nếu tỉ trọng lớn hơn 1 thường chứa nhiều thành phần chứa nhân thơm (eugenol, andehit xinamic…)

Nó thường có năng suất quay cực : có thể quay phải (+) như tinh dầu long não hay trái quay trái (-) như tinh dầu bạc hà

Chỉ số khúc xạ 1,450-1,560: chỉ số khúc xạ của tinh dầu phụ thuộc vào thành phần hóa học của tinh dầu Nếu tinh dầu có chứa nhiều nhân thơm hoặc vòng có nhiều nhóm chứa oxi thì tỷ trọng và chỉ số khúc xạ đều cao

Điểm sôi : tinh dầu có đặc điểm sôi cao 150-180oC nếu thành phần là các tecpen 250-280o

C nếu là sesquitecpen; và trên 300 oC nếu thành phần là là politecpen Một số tinh dầu có thể phát quang dưới đèn tử ngoại ( eugenol, andehyt ximamic)

O

+ O3

Nhiều thành phần có nhóm chức khác nhau (ancol, andehit, phenol…) các nhóm này giúp cho việc kiểm nghiệm, chiết xuất tinh dầu

4.5 PHÂN TÍ H TINH DẦU

Hỗn hợp tinh dầu với cacbon disunfua với lượng bằng nhau, nếu đục là tinh dầu có lẫn nước

4.5.2 PHẢN ỨNG MÀU

- Phát hiện ancol trong tinh dầu: Cho 1 giọt tinh dầu, 0,3ml CS2, 100mg KOH đã nghiền nhỏ Lắc trong 5 phút Nếu có xuất hiện màu vàng hay tủa vàng là có ancol Nếu không có phản ứng, thêm 1-2 giọt amoni molipdat 1%, sau đó axit hóa từ từ bằng axit sunfuric, làm lạnh hỗn hợp

và thêm 3-4 giọt CHCl3 Lắc mạnh hỗn hợp và giữ yên, nếu lớp CHCl3 có màu tím là phản ứng dương tính

- Phát hiện andhit – xeton : Hòa tan 1 giọt tinh dầu vào 2-3 giọt etanol tuyệt đối + 1 giọt

thuốc thử 2,4-dinitro phenyl hydrazin ( hòa nóng 5 gam 2,4-dinitro phenyl hydrazin trong 60ml axit photphoric 85% được pha bằng 39,5 ml etanol)

Nếu có kết tủa đỏ là có nhóm cacbonyl thơm

Nếu có màu vàng cam là có nối đôi ở vị trí α,β,

Nếu có màu vàng là có cacbonyl bảo hòa Thêm 1 giọt KOH 2N trong etanol màu sẽ chuyển sang màu đỏ thẩm, màu mận chín hoặc màu xanh

Ngoài ra có thể phát hiện andehyt bằng thuốc thử Schiff (axit fucsinsunfuro), Tollens

-Phát hiện phenol : dùng FeCl3

- Phát hiện hợp chất chƣa bảo hòa: cộng Br2/CCl4, nếu có hợp chất không bão hòa thì màu của brom biến mất sau 1 phút

Các phenol và một số hợp chất thơm có nhóm metylen cũng có phản ứng dương tính Để phân biệt nên làm thêm phản ứng Baeyer:

Hai giọt tinh dầu hòa trong 1-2 ml axeton Cho từng giọt dung dịch KMnO4 1% Lắc Nếu

có tủa màu café do KMnO4 bị khử chứng tỏ có hydrocacbon chưa no và các chất khử khác như andehyt Các hợp chất hydrocacbon thơm và một số phenol còn cho phản ứng với hỗn hợp H2SO4-focmandehyt Dẫn xuất benzene cho màu màu hồng hoặc vàng cam ngay sau khi cho thuốc thử, còn dẫn xuất phaphtalen cho màu lục hoặc ve

Ngoài ra có thể dùng sắc ký bản mỏng, sắc ký giấy để nhận biết các chất trong tinh dầu

4.6 TÁ H Á THÀNH PHẦN TRONG TINH DẦU

- Đối với chất rắn ở nhiệt độ thường: để lạnh, lọc ly tâm (mentol của bạc hà)

- Tách axit tự do ra khỏi tinh dầu: nếu không có phenol hay nhóm cacbonyl thì lắc với kiềm loãng, rửa tinh dầu bằng nước, làm khô bằng Na2SO4

- Phương pháp tách cổ điển là chưng cất phân đoạn ở áp suất thường hay thấp

Với dụng cụ có nhiều đĩa, các chất có nhiệt độ sôi thấp ra trước, sau đó monotecpen chứa oxy tiếp đến là hợp chất thơm và cuối cùng là sesquitecpen Phần còn lại trong bình là các sản phẩm polime, đitecpen và hợp chất azulen

Nếu tinh dầu thu được bằng cách chiết với dung môi hoặc ép thì trong cặn có chứa sáp

- Sắc ký cột: có thể dùng cột silicagel để tách các các hidrocacbon ra khỏi hợp chất có chứa oxi, rữa bằng ete dầu hỏa, sau đó dùng etyl axetat để tách hợp chất có oxi ra khỏi cột

Để tách từng chất trong phần có chứa oxi, có thể dùng cột oxit nhôm trung tính, rửa cột bằng các dung môi phân cực tăng dần lần lượt vớ n-pentan; pentan-benzen (9:1); benzene; benzene-ete (9:1); ete; ete-clorofom (9:1); clorofom; và clorofom-etanol (9:1);

Các phân đọan thu được có thể tiếp tục tách hoặc tinh chế bằng sắc ký

4.7 HỢP HẤT LACTON TECPENOIT

- Các hợp chất lacton của tecpenoit có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học và nông nghiệp Đặc điểm là sesquitecpen lacton, chúng có tác dụng được tế bào, kháng ung thư, kháng vi trùng, diệt côn trùng, diệt nấm mốc…

- Đa số các lacton tecpenoit đều có vị đắng , một số chất có mùi vị khó chịu làm cho động vật

ăn cỏ và sâu bọ không thích Đặc tính đó có thể là một trong các chức năng của lacton là bảo vệ thực vật

Vòng laton không no trong cấu trúc có quan hệ đến vị đắng và các tác dụng độc và kháng trùng Các liên kết không no trong vòng lacton dễ dàng tác dụng với nhóm OH, SH, NH2 của các axit amin và protein trong vi khuẩn, biến thành chất độc và làm rối loạn các quá trình sống của vi khuẩn

- Theo Kupchan, tác dụng kháng ung thư của các hợp chất tecpenoit đều liên quan đến sự liên hợp của nối đôi với nhóm C=O của vòng lacton

9 10

11 12 13 14

1 2 3

4 5

6 7 8

9 10

9 10

11 12 13

Đặc biệt artemisinin (VII) là một loại sesquitecpen lacton có mặt trong cây thanh cao hoa

vàng (Artemisia annua L ) mọc ở nhiều nơi ở miền Bắc Việt Nam và nhiều nước trên thế giới có

tác dụng chống vi trùng sốt rét

O O-O

O H

O

H H

6 7 8 9 10

11 12

và etanol ở nguội, nhưng tan nhiều khi nóng

Có thể chiết sesquitepen lacton theo các cách sau đây sau :

a hiết bằng H l 3

Bột nguyên liệu có thể loại chất béo bằng ete dầu, sau đó chiết CHCl3 từ 6-12 giờ Cất thu hồi CHCl3 Cắn hòa tan vào C2H5OH nóng Sau đó cho thêm 1 lượng tương đương Pb(CH3COO)2

5% và vài giọt HCl ( để dung dịch có môi trường axit yếu)

Để yên 1 ngày, lọc bỏ kết tủa Thu hồi cồn (còn lại nước), chiết nước này bằng CHCl3 Lấy lớp CHCl3 , rửa bằng nước, làm khan dịch CHCl3 bằng Na2SO4 Cất thu hồi dung môi thu được cắn sesquitecpen Tinh chế bằng sắc ký cột oxit nhôm

b hiết cồn (metanol hoặc etanol)

Bột nguyên liệu được chiết bằng cồn nóng Thu hồi cồn còn lại ¼ thể tích Thêm lượng tương đương nước Dùng ete dầu để chiết loại chất béo Sau đó chiết sesquitecpen lacton bằng CHCl3 Dịch chiết CHCl3 rữa nhiều lần bằng nước, làm khan bằng Na2SO4 Thu hồi CHCl3 Tinh chế như trên thu được sản phẩm

c hiết bằng cồn - nước

Chiết nguyên liệu bằng cồn ( ngâm kiệt ) Bã còn lại cho vào nước đun sôi 1-2 giờ Dịch chiết cồn thu hồi cồn Cắn còn lại hòa vào dịch chiết nước

Dịch nước được chiết bằng CHCl3 hoặc butanol, thu hồi dung môi thu được cắn Đun cặn này với benzen, lọc nóng, sau đó để lạnh, sesquitecpen sẽ kết tủa Lọc lấy tủa Tinh chế bằng cột oxit nhôm

d hiết bằng dung dịch kiềm nóng

Vòng lăcton trong môi trường kiềm đun nóng sẽ mở ra tạo thành muối tan được trong nước Dung dịch này nếu trong dung dịch axit sẽ đóng vòng trở lại và và kết tủa trong nước

- Các hợp chất có vòng lacton α,β không no cho phản ứng với các thuốc thử:

+ Legan (natri nitroprusinat = natri nitroxianua): màu hồng

+ Baljet (axit picric): Màu vàng da cam

+ Kedde ( axit 3,5-dinitrobenzoic trong metanol): màu hồng

- Các hợp chất lacton không no (α,β và β,) đều khử dung dịch Tollen, trong đó các hợp chất lacton β, cho phản ứng mạnh hơn do đó có thể khử dung dịch AgNO3 trong môi trường trung tính Người ta có thể dùng phản ứng với thuốc thử Tollen để phân biệt lacton no và không no

- Ngoài ra sesquitecpen lacton cho phản ứng dương tính với thuốc thử Libermann Burchat (1

ml anhidrit axetic + 1mlCHCl3 + 1 giọt H2SO4)dung dịch SbCl3, Vanilin photphoric