Nghiên cứu ảnh hưởng các phương pháp cấy, nguồn mẫu, mật độ, dung dịch NANO (đồng, bạc), và môi trường hai lớp đến sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh loài hoa chuông

Nghiên cứu ảnh hưởng các phương pháp cấy, nguồn mẫu, mật độ, dung dịch NANO (đồng, bạc), và môi trường hai lớp đến sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh loài hoa chuông Nghiên cứu ảnh hưởng các phương pháp cấy, nguồn mẫu, mật độ, dung dịch NANO (đồng, bạc), và môi trường hai lớp đến sự tăng trưởng tạo cây hoàn chỉnh loài hoa chuông

TP Hồ Chí Minh, 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

VIỆN KHOA HỌC ỨNG DỤNG HUTECH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY, NGUỒN MẪU, MẬT ĐỘ, DUNG DỊCH NANO (ĐỒNG, BẠC), VÀ MÔI TRƯỜNG HAI LỚP ĐẾN SỰ TĂNG TRƯỞNG TẠO CÂY HOÀN CHỈNH LOÀI

HOA CHUÔNG (SINNINGIA SPECIOSA) IN VITRO

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiêp là công trình nghiên cứu

do chính em thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Trịnh Thị Lan Anh – giảng viên trường Đại học Công Nghệ TP Hồ Chí Minh Đề tài được thực hiện trên cở

sở nghiên cứu lý thuyết, tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật - Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trường Đại học Công Nghệ TP HCM Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong đồ án tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tất cả các nguồn thông tin trích dẫn trong luận án đã được liệt kê trong tài liệu tham khảo

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu phát hiện có bất kỳ gian lận nào em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

TP Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 09 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hồng Anh Sang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH ngành Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em được thực hiện

đồ án tốt nghiệp tại cơ sở

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Trịnh Thị Lan Anh đã luôn nhiệt tình quan tâm, hướng dẫn, chỉ bảo, định hướng và tạo mọi điều kiện cho em hoàn thành đồ án của mình Cô không chỉ giảng dạy kiến thức, mà còn truyền cảm hứng, động viên em cũng như khơi dậy đam mê được làm nghiên cứu khoa học Qua đó tạo động lực cho em theo đuổi đến cùng và không ngừng học hỏi, tìm hiểu thêm kiến thức mới Em thực sự biết ơn Cô đã giúp đỡ và luôn hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài để có được kết quả thành công như hôm nay Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công Nghệ TP HCM, Ban Lãnh đạo Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH ngành Công Nghệ Sinh Học, các phòng bạn cùng các thầy cô trong trường đã nhiệt tình hướng dẫn

và chỉ dạy em trong suốt quá trình học tập tại đây

Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến toàn thể ban lãnh đạo, tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, Trường Đại học Công nghệ

TP HCM, đặc biệt là thầy Nguyễn Phước Sinh đã giúp đỡ tận tình, tạo điều kiện

về thời gian cũng như hướng dẫn về các máy móc thiết bị giúp em thực hiện tốt

đồ án này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, chia sẻ những khó khăn, động viên để em hoàn thành tốt đồ án

Em xin chân thành cảm ơn!

Tp Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 09 năm 2020

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hồng Anh Sang

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC HÌNH ẢNH 8

DANH MỤC BẢNG 10

1 Đặt vấn đề 12

2 Mục tiêu nghiên cứu 13

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 13

4 Đối tượng nghiên cứu 14

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu 14

5.1 Ý nghĩa khoa học 14

5.2 Ý nghĩa thực tiễn 14

6 Phương pháp nghiên cứu 15

7 Kết quả đạt được 15

8 Kết cấu đề tài 16

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17

1.2 Giới thiệu chung về hoa chuông (Sinningia speciosa) 17

1.2.1 Nguồn gốc và phân loại 17

1.2.2 Phân loại 19

1.2.3 Đặc điểm sinh học của họ Gesneriaceae 19

1.2.4 Đăc điểm sinh học của loài Sinningia speciosa 20

1.2.5 Một số đặc điểm sinh học ở loài Sinningia speciosa 20

1.2.6 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa chuông 22

1.2.7 Những vấn đề thường gặp khi trồng hoa ở môi trường bên ngoài 23

1.3 Tình hình sản xuất, tiêu thụ hoa kiểng trên thế giới và ở Việt Nam 24

1.3.1 Trên thế giới 24

1.3.2 Ở Việt Nam 25

1.4 Các phương pháp nhân giống cây hoa chuông 26

1.4.1 Nhân giống hữu tính 26

1.4.2 Nhân giống vô tính 27

1.4.3 Áp dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào nhân giống cây hoa chuông 28

1.4.4 Một số thành tựu nghiên cứu về nhanh giống in vitro cây hoa chuông 28

1.5 Tổng quan về các nguồn mẫu nghiên cứu 32

1.5.1 Mô sẹo 32

1.5.2 Củ 33

1.6 Giới thiệu về các chất ứng dụng trong nghiên cứu 34

1.6.1 Alginate 34

1.6.2.Carboxymethyl cellulose 36

1.6.3 Nano đồng 37

1.6.4 Nano bạc 38

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 39

2.1 Vật liệu và phương pháp 39

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 39

2.1.2 Hóa chất sử dụng 39

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 39

2.2 Thiết bị và dụng cụ 39

2.2.1 Thiết bị 39

2.2.2 Dụng cụ 40

2.3 Điều kiện thí nghiệm 40

2.4 Phương pháp nghiên cứu 40

2.4.1 Pha môi trường nuôi cấy 40

2.4.2 Hấp khử trùng môi trường 41

2.4.3 Hấp khử trùng dụng cụ cấy 41

2.4.4 Các thao tác thực hiện trong phòng cấy 41

2.5 Nội dung nghiên cứu 42

2.6 Bố trí thí nghiệm 42

2.6.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 42

2.6.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 43

2.6.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 44

2.6.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây

hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 45

2.6.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 46

2.6.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự phát sinh hình thái cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 47

2.6.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nano đồng đến sự phát sinh cây con hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 48

2.6.8 Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của alginate trong môi trường 2 lớp đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 48

2.6.9 Thí nghiệm 9: Khảo sát ảnh hưởng của CMC trong môi trường 2 lớp đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 49

2.7 Chỉ tiêu theo dõi 51

2.8 Thống kê và xử lý số liệu 51

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 52

3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của mẫu cấy lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 57

3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 62

3.4 Thí nghiệm 4 Ảnh hưởng mật độ cấy đến khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 67

3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 72

3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 77

3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nồng độ nano đồng đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 84

3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro trên môi trường hai lớp 90

3.9 Thí nghiệm 9: Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 96

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102

4.1 Kết luận 102

4.2 Kiến nghị 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A/C : Auxin/Cytokinin AVG : Aminoethoxyvinlglycine

BA : 6-Benzyladenine BAP : 6-Benzylaminopurin DNA : Deoxyribonucleic Acid IAA : Indole-3-Acetic Acid IBA : Indole-3-Butyric Acid

MS : Môi trường MS (Murashige Và Skoog, 1962) NAA : 1-Naphthaleneacetic acid

SAS : Statistical Analysis System TP.HCM : Thành Phố Hồ Chí Minh STS : Silver Thiosuphate 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Bức họa đầu tiên về cây hoa chuông (Sinningia speciosa) 17

Hình 1.2 Sự đa dạng màu sắc của hoa chuông 18

Hình 1.3 .Cấu tạo phân tử alginate (Nguồn: Internet) 36

Hình 1.4 Carboxymethyl cellulose (Nguồn: Internet) 37

Hình 3.1 Ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 54

Hình 3.2 Ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 55

Hình 3.3 Ảnh hưởng của mẫu cấy lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 59

Hình 3.4 Ảnh hưởng của mẫu cấy lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 60

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 64

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 65

Hình 3.7.Ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 69

Hình 3.8.Ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 70

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 74

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 75

Hình 3.11.Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát hình thái của cây hoa chuông in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 79

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát hình thái của cây hoa chuông in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 80

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát hình thái của cây hoa chuông in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 81

Hình 3.14.Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát hình thái của cây hoa chuông in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 82 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ nano đồng lên quá trình tạo chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 86 Hình 3.16.Ảnh hưởng của nồng độ nano đông lên quá trình tạo chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 87 Hình 3.17.Ảnh hưởng của nồng độ nano đồng lên lá của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 88 Hình 3.18.Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông hoàn chỉnh trên môi trường hai lớp 92 Hình 3.19.Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông hoàn chỉnh trên môi trường hai lớp 93 Hình 3.20.Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông hoàn chỉnh trên môi trường hai lớp 94 Hình 3.21.Ảnh hưởng của nồng độ CMC lên quá trình tạo chồi và cây hoa chuông sau 8 tuần nuôi cấy 98 Hình 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ CMC lên quá trình tạo chồi và cây hoa chuông sau 8 tuần nuôi cấy 99 Hình 3.23.Ảnh hưởng của nồng độ CMC lên quá trình tạo chồi và cây hoa chuông sau 8 tuần nuôi cấy 100

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Khảo sát ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 43 Bảng 2.2.Khảo sát ảnh hưởng của lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro 44 Bảng 2.3.Khảo sát ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 45 Bảng 2.4.Khảo sát ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 46 Bảng 2.5.Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 47 Bảng 2.6.Khảo sát ảnh hưởng của nano bạc đến sự phát sinh hình thái cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 47 Bảng 2.7.Khảo sát ảnh hưởng của nano đồng đến sự phát sinh cây con hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 48 Bảng 2.8.Khảo sát ảnh hưởng của alginate trong môi trường 2 lớp đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 49 Bảng 2.9.Khảo sát ảnh hưởng của alginate trong môi trường 2 lớp đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 50 Bảng 2.10.Các chỉ tiêu theo dõi về cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro 51 Bảng 3.1 Ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 53 Bảng 3.2.Ảnh hưởng của mẫu cấy lá đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 10 tuần nuôi cấy 58 Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 63 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây hoàn chỉnh của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 68 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 73

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ nano bạc đến khả năng phát hình thái của cây hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 78 Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ nano đồng đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro 85 Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro trên môi trường hai lớp 91 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến sự phát sinh chồi và cây hoa chuông (Sinningia speciosa) hoàn chỉnh in vitro sau 8 tuần nuôi cấy 97

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Phong trào trồng hoa ở Việt Nam trong những năm gần đây đã được chú ý

và phát triển, diện tích trồng hoa cũng vì thế mà tăng nhanh Với sự ưu đãi của thiên nhiên về điều kiện khí hậu và đất đai màu mỡ đã tạo điều kiện thích hợp cho việc trồng nhiều loại hoa như phong lan, địa lan, layer, hồng, đồng tiền, hoa chuông Gần 90% các loài hoa được trồng nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ ở trong nước, song song với thị trường trong nước, việc xuất khẩu hoa cũng đang tăng khá nhanh ở các thị trường khó tính như Châu Âu, Nhật Bản với một số loại hoa đặc thù của Việt Nam như hoa sen, hoa nhài

Ở Việt Nam, hoa chuông (Sinningia speciosa) thuộc họ tai voi (Gesneriaceae), bộ hoa môi (Lamiales), có nguồn gốc nhiệt đới (thuộc khu vực

rừng nhiệt đới của Brazil ở Nam Mỹ) là một trong những loại hoa mới được nhập nội với nhiều ưu điểm: màu sắc, hình dáng hoa đa dạng, hương thơm thanh dịu,

độ bền tự nhiên của hoa dài và được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như: trang trí trong nhà, ban công, công viên, công sở Do vậy, hoa Chuông đã nhanh chóng trở thành một trong những loài hoa nhập nội có giá trị, đáp ứng được xu hướng ưa thích các loài hoa mới lạ của người chơi hoa và sự quan tâm của người trồng hoa

Hoa Chuông được phát hiện từ rất sớm (1785) nhưng chỉ thực sự được nuôi trồng, nhân giống và lai tạo vào những năm 70 thế kỷ 18 Sau đó, hoa Chuông được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thể giới như Hà Lan, Pháp, Đức và được người châu Âu chọn tạo ra nhiều giống hoa mới ngày nay ( David, 2012) Tuy nhiên, nguồn cây giống đang được sử dụng tại Việt Nam chủ yếu là ở dạng hạt (nhập nội từ Trung Quốc), chất lượng cây giống không cao (cây bị phân ly, tỷ lệ mọc thấp) và không chủ động Vì vậy, diện tích trồng hoa Chuông còn rất ít, chủ yếu phục vụ cho công tác nghiên cứu ở các Trường Đại học, Viện nghiên cứu ở

Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh

Cây hoa Chuông trong tự nhiên có thể được nhân giống bằng hạt, đoạn thân, lá và củ Các phương pháp nhân giống truyền thống này thường cho hệ số

nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh tác lâu dài Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống và đảm bảo nguồn cung cấp cây giống có chất lượng cao cho người sản xuất Phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trở thành phương pháp nhân giống rất có hiệu quả với hệ số nhân giống cao, cây giống tạo ra hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về kiểu hình, ổn định về tính di truyền và có thể sản xuất được ở quy mô lớn

Trong những năm vừa qua, đã có nhiều công trình nghiên cứu nhân nhanh

in vitro cây hoa chuông: Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2004); Dương Tấn

Nhựt và cộng sự (2005); Eui và cộng sự (2012); Ioja-Boldura và Ciulca (2013);

Lã Thị Thu Hằng (2015)

Xuất phát từ những nhu cầu thực tế trên nên quyết định nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cấy, nguồn mẫu, mật độ, dung dịch nano (đồng, bạc, chitosan), và môi trường hai lớp đến sự tăng trưởng tạo cây

hoàn chỉnh loài hoa chuông (Sinningia speciosa) in vitro”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát sinh hình thái của cây hoa

Chuông (Sinningia speciosa) từ các bộ phận của cây (thân, củ, lá) với các hợp

chất điều hòa sinh trưởng với tỉ lệ auxin và cytokinin nhất định, ứng dụng công nghệ nano vào nuôi cấy cây hoa chuông, tìm ra nồng độ nano đồng, bạc thích hợp cho việc nuôi cấy Song song đó, nuôi cấy cây hoa chuong trong môi trường hai lớp để tìm ra các nồng độ CMC, và alginae thích hợp

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Đề tài này thực hiện những nhiệm vụ sau:

- Khảo sát ảnh hưởng nguồn mẫu của cây hoa chuông (Sinningia speciosa)

(thân, củ, mô sẹo) đến sự tạo chồi và cây hoàn chỉnh

- Khảo sát ảnh hưởng kích thước lá của cây hoa Chuông (Sinningia

speciosa) đến sự phát hình thái

- Khảo sát ảnh hưởng của mẫu cấy lá (Sinningia speciosa) (nguyên lá, phiến

lá, cuống lá) đến sự phát sinh hình thái của cây

- Khảo sát ảnh hưởng của mật độ mẫu cấy cây hoa Chuông (Sinningia

speciosa) đến sự tạo thành cây con hoàn chỉnh

- Khảo sát nồng độ nano bạc đến sự phát sinh hình thái cây hoa Chuông

4 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: thân, củ, lá in vitro của cây hoa Chuông (Sinningia

speciosa)

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài nghiên cứu

5.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung

thông tin về cây hoa chuông, kỹ thuật nhân giống in vitro tạo cây con hoa

Chuông hoàn chỉnh có năng suất cao, sạch bệnh, chất lượng tốt để áp dụng vào sản xuất có hiệu quả

Kết quả nghiên cứu làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo về chọn tạo giống và ứng dụng kỹ thuật di truyền đối với cây hoa Chuông

Là nguồn tài liệu tham khảo cho công tác giảng dạy, học tập và nghiên cứu khoa học, trong lĩnh vực công nghệ sinh học, công nghệ sản xuất giống và kỹ thuật trồng hoa chậu

giảm giá thành sản phẩm, góp phần ngăn chặn được dịch bệnh lây lan từ nước ngoài qua con đường cây giống

6 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu lý thuyết: thu thập thông tin, phân tích, tổng hợp, chọn lọc tài liệu là sách chuyên ngành, tạp chí chuyên ngành, các công trình nghiên cứu, các bài thi Eureka, các bài báo cáo của Viện, trường đại học, các nguồn internet tin cậy, các bài báo khoa học trong và ngoài nước…

Nghiên cứu thực nghiệm: tiến hành bố trí các thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường, điều kiện nuôi cấy, môi trường nuôi cấy,… Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên Các nghiệm thức được lặp lại 3 lần, ghi nhận kết quả trung bình Các số liệu sau khi thu nhập được sử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.4 và chương trình MicroSoft excel 2016 ®

7 Kết quả đạt được

- Xác định được sự ảnh hưởng kích thước lá đến khả năng phát sinh hình

thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được sự ảnh hưởng của mẫu cấy lá đến khả năng phát sinh hình

thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được sự ảnh hưởng của nguồn mẫu đến khả năng phát sinh hình

thái của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được sự ảnh hưởng mật độ cấy chồi đến khả năng phát sinh cây

hoàn chỉnh của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được nồng độ nano bạc ảnh hưởng đến sự hình thành chồi và cây

hoàn chỉnh của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được nồng độ nano đồng ảnh hưởng đến sự hình thành chồi và

cây hoàn chỉnh của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro

- Xác định được nồng độ CMC ảnh hưởng đến sự hình thành chồi và cây

hoàn chỉnh của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro trên môi trường hai lớp

- Xác định được nồng alginate ảnh hưởng đến sự hình thành chồi và cây

hoàn chỉnh của cây hoa Chuông (Sinningia speciosa) in vitro trên môi trường hai lớp

8 Kết cấu đề tài

Đề tài gồm 4 chương cụ thể như sau:

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và đề nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.2 Giới thiệu chung về hoa chuông (Sinningia speciosa)

1.2.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây hoa Chuông được phát hiện đầu tiên ở vùng rừng nhiệt đới Brazil vào năm 1785 Năm 1815, hoa Chuông được trồng ở Anh Năm 1817, người làm

vườn ở Anh tên là Conrad Loddiges đặt tên hoa Chuông là Gloxinia speciosa (G

Lodd.) (Hình 1.1), (G là viết tắt tên George Loddige) Người công bố thông tin

về cây hoa Chuông là con trai của George Loddige tên là Conrad Loddiges để vinh danh nhà thực vật học người Đức Benjamin Peter Gloxin (1765-1794) Năm

1825, hoa Chuông được Conrad Loddiges đổi tên từ Gloxinia speciosa thành tên mới là (Sinningia speciosa)để đúng định danh thuộc loài S speciosa Năm 1877, hoa Chuông (Sinningia speciosa)được nhà thực vật học Hiern xác định có nhiều

màu sắc khác nhau, hoa có cấu trúc đối xứng (Hình 1.2) và tên khoa học về cây

hoa Chuông được dùng từ đó đến ngày nay là (Sinningia speciosa)(G Lodd.) Hiern Hầu hết các loài của Sinningia sống chủ yếu ở khu vực rừng nhiệt đới

Brazil ở Nam Mỹ Một số giống hoa Chuông hiện nay là kết quả của sự lai tạo từ

hai loài hoa của Brazil: (Sinningia speciosa)và Sinningia maxima do những

người làm vườn ở Scotland thực hiện vào thế kỷ XIX (Kessler,1999)

H nh 1.1 Bức họa đầu tiên về cây hoa chuông (Sinningia speciosa)

1.2 Sự đa dạng màu sắc của hoa chuông

Các giống hoa Chuông hoang dại đầu tiên được phát hiện ở Brazil có sự đa dạng về màu sắc, kích thước và hình dáng hoa Thông qua quá trình lai tạo và chọn lọc, các giống hoa Chuông trồng hiện nay có nhiều ưu điểm để phù hợp với thị hiếu của người chơi hoa Hiện nay hoa Chuông được trồng phổ biến ở các nước và khu vực như: Mỹ, Châu Âu, Trung Quốc, Nhật, Thái Lan, Bzail, Ấn Độ, Philippine… Ở điều kiện khí hậu lạnh hoa chuông được trồng như cây một năm, chúng sẽ ra hoa vào mùa hè và bắt đầu giai đoạn ngủ nghỉ vào mùa đông, ở vùng

có điều kiện khí hậu ấm hơn thì chúng có thể ra hoa quanh năm

Cây hoa chuông ((Sinningia speciosa) hay Gloxinia speciosa), là loài hoa

mới được nhập nội vào nước ta trong những năm gần đây Ở Việt Nam, hoa chuông còn có nhiều tên gọi khác: hoa tình yêu (valentine), hoa thánh, tử la lan,

tứ quý, mõm chó biển, đại nhâm đồng, hồng xiêm…

Bộ : Lamiales (Bộ Hoa môi)

Họ : Gesmeriaceae (Họ Tai voi)

Chi : Sinningia (Chi Hoa chuông)

Loài : Sinningia speciosa

1.2.3 Đặc điểm sinh học của họ Gesneriaceae

Họ Gesneriaceae là một họ lớn với khoảng 150 giống và 3200 loài Hầu hết

họ Gesneriaceae thường được phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới

Chúng thường được tìm thấy ở những nơi đất mùn, khe đá và rừng phủ mùn

Những cây thường gặp họ này là: Afican Violet, Florist Gloxinia (Sinningia

speciosa), Lipstick Plant (Aeschynanthus), Goldfish Plant (Nematanthus), Cape

Primrose (Streptocarpus), Flame Violet (Episcia) và Cupid’s Bower

(Achimenes), (Lã Thị Thu Hằng, 2015) Họ Gesneriaceae rất giống với họ

Scorphulariaceae, Bignoniaceae và cả Orobanchaceae

Gesneriaceae được phân biệt dựa vào một số đặc điểm:

- Họ Gesneriaceae: đính phôi trắc mô, không khí sinh

- Họ Orobanchaceae: đính phôi trắc mô, khí sinh rễ

- Họ Bignoniaceae: đính phôi trung trục, tâm bì với nhiều noãn, hột thường

có cánh và không có cán phôi cứng, to, hột ít khi có cánh và ít khi dẹp

Về hình thái học và sinh lý học thì họ này phân thành hai phân họ chính:

Cytrtandroideae và Gesnerioideae Cytrtandra là giống lớn nhất và phổ biến, có

khoảng 600 lời được phân bố ở Đông Nam Á, Malaysia, Indonesia, Philippine và các đảo của Thái Bình Dương như là Hawaii

Gesneriaceae được tách thành 3 nhóm dựa vào cách thân cây thay đổi thành

bộ phận dự trữ: căn hành, thân củ, rễ sợ (tất cả các cây thuộc họ Gesneriaceae

đều có rễ sợ)

Các nhà thực vật học có sự đóng góp to lớn trong việc phân loại họ

Gesneriaceae, đó là George Bentham, Robert Brown, Burtt, Clarke, Hilliard,

Joseph Dalton Hooker, William Jackson Hooker, Elmer Drew Merill, Harold Moore, Conrad Vernon Morton, Hern Nicholar, Laurence Skog, Wang, Anton Weber và Hans Wiehler Cho dến hiện tại nhiều nhà nghiên cứu vẫn đang tiếp tục thực hiện công việc này, do đó sự phân biệt đặc điểm chung của giống loài trong

họ này hay bị thay đổi

Một số nằm trong họ Gesneriaceae: Achimenes, Aeschynanthus, Alsibia,

Anodiscus, Besleria, Capamea, Chirita, Columnea, Episcia, Gasteranthus, Gesneria, Gloxinia, Koellikeria, Mitraria, Nematanthus, Pearcea, Saintpaulia, Seemamnnia, Siningia, Streptpcarpus,…

1.2.4 Đăc điểm sinh học của loài Sinningia speciosa

Sinningia là một giống thuộc họ Gesneriaceae Sinningia bao gồm khoảng

65 loài thân thảo có củ sống lưu niên, tất cả đều xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ

và đặc biệt là tập trung nhiều nhất ở Nam Brazil Những loài có thân củ lớn nằm

trong giống Sinnigia là S.leucotricha, S.iarae, S.lineata và S.macropoda,… Loài được biết đến nhiều nhất là Sinningia speciosa

Sinningia thường mọc trên những hòn đá cuội, vách đá và hầu hết được thụ

phấn nhờ chim ruồi hoặc ong Phần lớn các loài đều có lá mọc đối xứng và có nhiều lông tơ trên lá Hoa lớn, đơn hoặc lưỡng tính, màu sắc sặc sỡ và có hai cặp nhị so le với nhau trong đó có một nhị lép đính trên tràng hoa Các bao phấn dính nhau thành từng cặp (chỉ có nhị dính ) hoặc hợp sinh ở một số loài Cây có một nhụy hoa, vòi nhụy mảnh mai, núm nhụy chia thành 2 thùy Trái thường có vỏ chẻ ô hoặc phì quả Hạt nhiều và nhỏ, thường có nội nhũ (Trần Hoàng Ngọc Bích, 2004)

1.2.5 Một số đặc điểm sinh học ở loài Sinningia speciosa

Rễ: Rễ cây hoa Chuông thuộc loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều

ngang, ở tầng đất mặt từ 10 - 20 cm Kích thước các rễ trong bộ rễ chệnh lệch

nhau không nhiều, số rễ tương đối nhiều nên khả năng hút nước và dinh dưỡng của cây rất mạnh Rễ phát sinh từ mầm rễ của hạt, từ củ, thân, cuống lá và những

cơ quan sinh dưỡng tiếp xúc trực tiếp với đất Vì vậy, hoa Chuông rất thích hợp

trồng trên các loại giá thể tơi xốp, chủ động điều chỉnh thành phần dinh dưỡng

phù hợp để kích thích bộ rễ phát triển

Thân: Hoa Chuông thuộc loại cây thân thảo có nhiều đốt giòn dễ gãy Thân

dạngđứng hoặc bò Kích thước thân to hay nhỏ, cao hay thấp, cứng hay mềm tùy thuộc vào giống và thời vụ trồng Trên thân có các mắt ngủ tiềm sinh ở giữa cuống lá và thân Thân có khả năng tái sinh nên được sử dụng để nhân giống vô tính

Lá: Lá đơn mọc đối trên thân không có lá kèm Phiến lá mềm mỏng, có thể

to hay nhỏ hình thuôn hoặc oval, có màu sắc khác nhau (xanh đậm, xanh nhạt,

xanh phớt hồng ) tùy thuộc vào giống Cây có ít lá, mặt trên lá bao phủ một lớp lông tơ mượt như nhung, mặt dưới nhẵn, gân lá hình mạng, trung bình một chu

kỳ sinh truởng của cây có từ 5-18 lá trên thân chính Vì vậy, lá góp phần làm tăng giá trị thẩm mỹ của hoa và là cơ quan sinh dưỡng có thể sử dụng làm vật liệu để nhân giống vô tính

Hoa: Hoa hình chuông, cánh mướt như nhung và viền cánh hoa có gợn

sóng Hoa khoe sắc, mọc ra từ nách lá, đơn lẻ hoặc thành chùm nhiều bông và có thời gian nở hoa dài Màu sắc hoa rất đa dạng, hầu như có tất cả các màu trong tự

nhiên (trắng, tím, đỏ hồng, ) Một bông có thể có một màu hoặc nhiều màu pha

trộn Hoa có hai dạng là hoa đơn và hoa kép, hoa kép có nhiều vòng cánh, các

cánh xếp xen kẽ nhau Đường kính bông hoa tùy thuộc vào giống và thời vụ

trồng, trung bình khoảng 3-7 cm Hoa có hai dạng chính là hoa lưỡng tính và hoa

đơn tính, đôi khi xuất hiện cả những hoa vô tính Cấu tạo hoa gồm các bộ phận: đài hoa, cánh hoa, nhị hoa và noãn Có hai cặp nhị so le với nhau, trong đó có một nhị lép đính trên tràng hoa, các bao phấn dính nhau thành từng cặp, có một nhụy hoa, vòi nhụy mảnh mai, núm nhụy chia thành hai thùy Ngoài ra, còn có thêm túi mật thu hút côn trùng (ong, kiến) và động vật nhỏ (chim, ruồi, dơi) làm tăng khả năng thụ phấn của hoa nhờ côn trùng và gió Vì vậy, hoa Chuông có thể đáp ứng được sự đa dạng về thị hiếu, sở thích của người chơi hoa Ngoài ra, cấu tạo hoa rất phù hợp để lại tạo, chọn lọc ra nhiều giống mới có màu sắc và kiểu

dáng hoa khác nhau

Quả và hạt: Quả có dạng quả nang (khi chín sẽ nứt ra theo 3 đường nứt

dọc để giải phóng các hạt), hạt nhiều và nhỏ (12.000 hạt/g), có nội nhũ Như vậy,

cây hoa Chuông vừa có khả năng nhân giống vô tính và nhân giống hữu tính Tuy nhiên, nhân giống bằng phương pháp hữu tính thường khó (khả năng thụ phấn thụ tinh thấp ở những vùng sinh thái có nhiệt độ, ẩm độ… không phù hợp),

tỷ lệ cây mọc thường biến động, cây có thời gian sinh trưởng rất dài 5 - 6 tháng, cây thường bị phân ly với tỷ lệ cao Nhân giống vô tính được sử dụng phổ biến ở các giống hoa Chuông hiện nay

Sinh sản: Vô hạn (cây có củ, các chồi mới mọc nên từ củ, khi cây kết thúc

một chu kỳ sinh trưởng)

Giai đoạn ngủ nghỉ: Bắt buộc, khi lá rụng hết Đặc điểm sinh trưởng này

của cây giúp cho người trồng hoa có thể tiếp tục sử dụng củ để làm giống cho vụ sau khi cây kết thúc chu kỳ sinh trưởng Các chồi mới mọc lên từ củ sẽ sinh trưởng phát triển tốt cho năng suất và chất lượng hoa cao nếu được chăm sóc

đúng quy trình kỹ thuật

1.2.6 Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa chuông

Nhiệt độ: Hoa Chuông có nguồn gốc nhiệt đới nên đa số các giống hoa

Chuông được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp dao động

từ 18 - 24 0 C Trong giai đoạn ra hoa, nhiệt độ 16 - 18 0 C sẽ kéo dài thời gian ra

hoa Nhiệt độ nhỏ hơn 10 0 C cây ngừng sinh trưởng, gây tổn thương đến lá và hoa, khi nhiệt độ lớn hơn 27 0 C cây sinh trưởng nhanh Yêu cầu điều kiện nhiệt

độ này, vụ Đông Xuân ở tỉnh Thừa Thiên Huế có thể đáp ứng để cây hoa Chuông

sinh trưởng phát triển tốt, cho năng suất và chất lượng hoa cao

Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và sự

nở hoa của cây hoa chuông Hoa Chuông ưa ánh sáng tán xạ Ánh sáng trực tiếp

sẽ làm cháy lá, trong thời kỳ ngủ nghỉ cây không cần ánh sáng Quang kỳ thích hợp nhất để hoa Chuông phát triển là khoảng 12 - 16 giờ chiếu sáng/ngày Cường

độ ánh sáng thấp (270 lux) được chấp nhận với nhiệt độ mát 18 0 C, mức ánh sáng

từ 0,5 - 1,1 Klux hoặc cao hơn được khuyến cáo để cây phát triển số lượng nụ và hoa tốt hơn Vì vậy, trong sản xuất chúng ta có thể điều chỉnh thời gian và cường

độ chiếu sáng cho cây hoa Chuông bằng cách dùng lưới đen che nắng, thắp đèn

để điều chỉnh sinh truởng phát triển của cây, nhằm đạt hiệu quả kinh tế cao nhất

Đất: Hoa Chuông là cây trồng cạn, bộ rễ ăn nông Vì vậy, yêu cầu đất trồng

phải cao ráo, thoát nước tốt, tơi xốp và nhiều mùn, thích hợp với đất có pH từ 5,8

- 7.5

Ẩm độ và nước tưới: Hoa Chuông là cây trồng cạn nên không chịu được

úng Tuy nhiên, do cây có sinh khối lớn, bộ lá to nên cần nhiều nước, chịu hạn

kém Cây hoa Chuông sinh trưởng, phát triển thuận lợi nhất trong điều kiện ẩm

độ đất từ 65 - 80%, độ ẩm không khí từ 60 - 75% Trong thời kỳ nở hoa nếu độ

ẩm quá cao gây thối hoa và sâu bệnh phát triển mạnh làm giảm chất lượng hoa và

độ bền của hoa Cây bị úng trong giai đoạn ra hoa thì các núm hoa bị rụng và có thể gây chết Khi cây ở giai đoạn ngủ nghỉ, giảm lượng nước tưới cho cây Bảo quản củ trong giai đoạn ngủ nghỉ ở điều kiện mát mẻ nhưng phải khô ráo Khi trồng nên sử dụng chậu thoáng và thoát nước tốt Tưới nước mỗi ngày phụ thuộc vào cường độ ánh sáng và nhiệt độ Nên tưới nước vào lúc sáng sớm, tưới nước

xung quanh gốc cây, không tưới quá đẫm vì cây dễ bị thối và nhiễm bệnh Thiếu

nước cây sinh trưởng kém, rút ngắn chu kỳ sinh trưởng

1.2.7 Những vấn đề thường gặp khi trồng hoa ở môi trường bên ngoài

Cây ra hoa có thể ít nhất 2 tháng nhưng sau đó cây khô hạn ở bất cứ nơi nào, đây là lúc cây cần thời gian nghỉ ngơi sau khi ra hoa Lúc cây bắt đầu giai đoạn nghỉ thì giảm bớt lượng nước tưới, đặt cây nơi thoáng mát và khô ráo Sau thời gian nghỉ (6-12 tuần) thì củ nên được trồng trong chậu sạch, tưới nước trở lại, đặt nơi ấm áp có ánh nắng tán xạ và một thời gian sau cây sẽ lại phát triển, sẵn sang cho hoa tiếp Hầu như phần phức tạp nhất là phần chăm sóc cây hoa Chuông trong khoảng thời gian nghỉ

Những bông hoa bị rụng, yếu la do độ ẩm và cường độ ánh sáng trong nhà thấp hơn môi trường bên ngoài Cắt bỏ những bông hoa bị héo để kích thích những nụ hoa phát triển tốt hơn, cắt bỏ những cuống hoa đã hư và để cây nghỉ ngơi cho lần ra hoa tiếp theo Khi những bông hoa sắp héo thì ngững bón phân và giảm tưới nước, khi lá cây héo thí ngừng tới nước hoàn toàn, lá sẽ bị xoăn và rụng Khi cây bắt đầu tàn nên cắt bỏ những lá khô, để thân củ khô và trồng lại

sau gian đoạn ngủ nghỉ của cây Để giừ hoa tồn tại lâu có thể làm ẩm gián tiếp bằng máy làm ẩm không khí nhưng chú ý không phun sương trên lá

Những bệnh thường gặp như thối rữa củ, virus, giun tròn, rệp cây, nhện, sâu đục lá, bọ trĩ, thối rữa do thời tiết quá lạnh và ẩm ướt Khi mép lá bị cuộn lên trên cho biết không khí đang khô hay lá bị cháy xén, khô héo là do mặt trời chiếu trực tiếp lên cây, lá bị đốm là do tưới phun sương thẳng lên lá Hoa Chuông có củ nên khi trồng chú ý không chon cũ quá sâu sẽ làm cây thối rữa

1.3 T nh h nh sản xuất, tiêu thụ hoa kiểng trên thế giới và ở Việt Nam

1.3.1 Trên thế giới

Ngày nay, sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển một cách mạnh mẽ và trở thành một ngành thương mại với giá trị sản lượng cao Sản xuất hoa mang lại chuỗi giá trị rất lớn cho nền kinh tế của các nước trồng hoa cây cảnh, ước tính số lượng hoa kiểng được tiêu thụ mỗi năm trên thế giới có giá trị khoảng 100 tỷ

USD, mức tăng bình quân là 10% (Barbara et al., 2014) Giá trị nhập khẩu của

hoa kiểng ngày càng tăng và các nước thu nhập nhiều như là Đức, Anh, Pháp, Mỹ,…

Theo Sudhagar và Phil năm 2013, trên thế giới có hơn 145 quốc gia tham gia vào việc trồng hoa và diện tích các loại cây hoa đang gia tăng đều đặn Năm

2013 có khoảng 305.105 ha diện tích sản xuất hoa ở các nước trên thế giới, trong

đó tổng diện tích ở châu Âu là 44.444 ha, Bắc Mỹ 22.388 ha, Châu Á và Thái Bình Dương 215.386 ha, Trung Đông và Châu Phi 2.282 ha, Trung Phi và Nam Phi 17.605 ha Ấn Độ có diện tích lớn nhất với 88.600 ha, theo sau là Trung Quốc với 59.527 ha, Indonesia: 34.000 ha, Nhật Bản 21.218 ha, Hoa Kỳ 16.400

ha, Brazil 10.285 ha, Đài Loan 9.661 ha, Hà Lan 8.017 ha, Ý 7.654 ha, Vương quốc Anh 6.804 ha, Đức 6.621 ha và Colombia 4.757 ha Hoa trồng trong nhà kính trên thế giới là 46.008 ha

Theo Barbara và cộng sự (2014), giá trị xuất khẩu hoa trên thế giới tăng trung bình hàng năm 9% trong giai đoạn 2001 đến 2012 từ 7,1 tỷ đô la Mỹ năm

2001 lên 17,8 tỷ đô la Mỹ năm 2012 Trong đó hoa cắt cành tăng từ 47 % năm

2001 lên 49 % năm 2012 về tổng giá trị xuất khẩu hoa trên thế giới

Sản xuất hoa thế giới tiếp tục phát triển mạnh mẽ ở các nước châu Á, châu Phi, châu Mỹ Hướng sản xuất hoa trên thế giới là tăng năng suất và chất lượng, giảm chi phí lao động, giảm giá thành sản phẩm Mục tiêu sản xuất hoa hướng tới là giống chất lượng cao và giá thành thấp Châu Âu và Bắc Mỹ là thị trường tiêu thụ hoa lớn nhất thế giới

Hoa Chuông được phát hiện ở Brazil từ rất sớm (năm 1785) và hiện nay được trồng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như: Anh, Đức, Hà Lan, Thái Lan, Trung Quốc Tuy nhiên, những thông tín thông kê cụ thể về diện tích trồng

và tình hình tiêu thụ cây hoa Chuông ở các nước trồng hoa chưa được công bố riêng Vì vậy, diện tích trồng và tình hình tiêu thụ cây hoa Chuông nói riêng cũng nằm trong xu thế phát triển chung của các loại hoa ở các nước trồng hoa lớn

1.3.2 Ở Việt Nam

Việt Nam có diện tích đất tự nhiên là 33 triệu ha nhưng diện tích trồng hoa chỉ chiếm 0,06% diện tích đất tự nhiên và tập trung một số vùng trồng hoa truyền thống như: Ngọc Hà, Quảng An, Tây Tựu (Hà Nội), Đằng Hải, Đằng Lâm (Hải Phòng), Hoành Bồ, Hạ Long (Quảng Ninh), Triệu Sơn (Thanh hoá), Gò Vấp, Hóc Môn (TP Hồ Chí Minh), Đà lạt, Đức Trọng (Lâm Đồng), Sapa (Lào Cai) tổng diện lích trồng khoảng trên 13.000 ha (lê huy hàm, 2011)

Kỹ thuật sản xuất hoa ở Việt Nam, chủ yếu dựa vào kinh nghiệm: trồng tự nhiên ngoài đồng ruộng (phụ thuộc vào điều kiện thời tiết), sử dụng kỹ thuật nhân giống truyền thống (cây giống được tạo ra từ hạt, củ, cành giâm, ), Vì vây, các sản phẩm hoa làm ra có năng suất, chất lượng không cao, do nguồn cây giống dễ bị thoái hoa, sâu bệnh nhiều, đặc biệt là bệnh virut có khả năng lan truyền và phát triển, Ở một số vùng trồng hoa lớn, sản xuất hoa áp dụng kỹ thuật thâm canh cao (trồng hoa trong điều kiện nhà lưới và sử dụng nguồn giống

có chất lượng cao - cây giống cây mô, ) đã được triển khai nhưng còn ở quy mô nhỏ Tuy nhiên, đây là phương pháp mà các nước trồng hoa tiên tiến đã ứng dụng

từ lâu và mang lại hiệu quả rất cao

Hiện một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản và các nước Tây

Âu có nhu cầu nhập khẩu hoa với số lượng lớn Với 35 – 40% tổng diện tích trồng hoa hồng, 25 – 30% trồng hoa cúc thì Việt Nam đang có cơ cấu hoa phù

hợp với thị hiếu nhập khẩu của các nước này Tuy nhiên, đây là những thị trường khó tính, đòi hỏi hoa phải có hình thức đẹp, chất lượng cao, cạnh tranh về giá Điển hình như Nhật Bản có nhu cầu nhập khẩu hoa tươi rất lớn, mỗi năm khoảng

46 triệu USD nhưng kim ngạch xuất khẩu hoa tươi của Việt Nam sang Nhật Bản chỉ đạt 6,2 USD/năm, chiếm 1,4% thị phần Bộ thương mai dư báo, nếu thâm nhập tốt, xuất khẩu hoa tươi của Việt Nam sang Nhật trong thời gian tới sẽ có thể tăng tới hơn 8 triệu USD/năm, đặc biệt là hoa phong lan và các loại ghép cành Các loại hoa được trồng ở Việt Nam rất đa dạng như hoa lan, ly, đồng tiền, hồng, cẩm chướng, Tuy nhiên, cây hoa Chuông chưa được trồng phổ biến do các giống hoa Chuông mới được nhập vào nước ta, nguồn cung cấp giống bị động nên diện tích trồng còn rất ít, chủ yếu phục vụ công tác nghiên cứu và tập trung ở Hà Nội, Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh, Ở khu vực miền Trung, cây hoa Chuông chưa được tiến hành trồng thử nghiệm để mở rộng diện tích

Để phát triển sản suất hoa nói chung và hoa Chuông nói riêng cần chú trọng công tác nhập nội, chọn tạo và nhân nhanh các giống hoa chất lượng cao, thích nghi với nhiều vùng sinh thái, Đồng thời tăng cường tiếp nhận, chuyển giao các công nghệ, tiến bộ kỹ thuật trong nhân giống, trồng, chăm sóc, thu hoạch và phân phối hoa để tăng hiệu quả, giá trị sản phẩm Trong đó, vấn đề giống, kỹ thuật canh tác là yếu tố quan trọng cần được quan tâm, đầu tư thích đáng

1.4 Các phương pháp nhân giống cây hoa chuông

Trong tự nhiên cây hoa Chuông được nhân giống bằng 2 phương pháp: nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính Ở mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm nhất định

1.4.1 Nhân giống hữu tính

Nhân giống hữu tính là hình thức dùng hạt để làm giống, cây con được hình thành từ hạt Đây là phương pháp nhân giống cây đơn giản, dễ làm, ít tốn kém và không cần nhiều trang thiết bị Hạt giống được hình thành do kết quả thụ tinh giữa giao tử đực (hạt phấn) với giao tử cái (noãn) Từ hạt sẽ hình thành một cây mới mang đặc tính của cả cây bố và cây mẹ (trong trường hợp thụ phấn chéo) hoặc nghiêng hẳn về cây bố hoặc cây mẹ (trong trường hợp vô phối) Cây con mọc lên từ hạt, thường tạo thành cây giống khỏe, có khả năng sinh trưởng phát

triển tốt, khả năng chống chịu cao (sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh), năng suất cao

Tuy nhiên, phương pháp nhân giống hữu tính cũng nhược điểm là hạt giống tạo ra có bản chất lai, có ưu thể lai, cây có tính dị hợp, cây thường bị phân ly với

tỷ lệ cao, tỷ lệ cây mọc thường biến động, cây có thời gian sinh trưởng rất dài 5 -

6 tháng… Mặt khác, phương pháp nhân giống bằng hạt thường gặp nhiều khó khăn: khả năng thụ phấn thụ tinh thấp ở những vùng sinh thái có nhiệt độ, ẩm độ… không phù hợp Do đó, chất lượng hoa không cao, giá trị thương phẩm thấp Nên phương pháp nhân giống này ít được sử dụng trong sản suất

Gill và cộng sự (1994) chỉ ra rằng, đối với cây hoa Chuông việc nhân giống bằng hạt thường khó, có tỷ lệ thành công thường biến động và giá thành cao Kessler (1999) khẳng định, cây hoa Chuông có thể nhân giống từ hạt Hạt giống cây hoa Chuông rất nhỏ (12.000 hạt/g) Do đó, hạt giống nên được trộn với cát và gieo trên giá thể trồng, chú ý không phủ hạt giống Tưới nước thường xuyên và luôn giữ nhiệt độ đất khoảng 20 - 24°C Để quá trình nảy mầm tốt thì cường độ ánh sáng nên nhỏ hơn 2.150 lux Hạt hoa Chuông thường nảy mầm sau gieo 2 - 3 tuần

1.4.2 Nhân giống vô tính

Cây hoa Chuông cũng có thể được nhân giống từ các cơ quan, bộ phận sinh dưỡng của cây như thân, lá, củ, là hình thức nhân giống vô tính phổ biến ở nhiều loại cây trồng Quá trình nhân giống vô tính có thể diễn ra trong tự nhiên

và nhân tạo Phương pháp nhân giống vô tính có nhiều ưu điểm:

- Giữ được những đặc tính di truyền của cây mẹ

- Cây giống sau trồng sớm ra hoa

- Thời gian nhân giống nhanh

- Các đột biến có lợi khó bị mất đi do không phải trải qua quá trình phân

bào giảm nhiễm

Bên cạnh những ưu điểm nổi bật, phương pháp nhân giống này vẫn còn bộc

lộ một số nhược điểm sau:

- Cây mẹ truyền bệnh virus sang cho cây con

- Cây giống nhanh bị thoái hóa (sinh trưởng phát triển không đều, giảm giá

trị thương phẩm)

- Hệ số nhân thấp, cần số lượng lớn cây bố mẹ, tốn thời gian, phụ thược vào

điều kiện thời tiết và cây giống dễ bị thoái hóa qua quá trình canh tác lâu dài

Để phát huy những ưu điểm và hạn chế nhược điểm của phương pháp nhân

giống vô tính truyền thống, công nghệ nhân giống in vitro cần được ứng dụng, để

tạo ra cây giống đồng nhất về kiểu hình, ổn định về di truyền, sạch bệnh đáp ứng nhu cầu sản xuất Đây là kỹ thuật nhân giống đã được ứng dụng rộng rãi ở

các nước có ngành sản xuất hoa tiên tiến Kỹ thuật nhân giống in vitro luôn được

hoàn thiện để đưa vào ứng dụng trong thực tiễn sản xuất

1.4.3 Áp dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro vào nhân giống cây hoa chuông

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống, thường được sử dụng cho

việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bằng việc sử dụng các bộ phận khác nhau của cây với kích thước nhỏ

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là quá trình điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật một cách có định hướng, dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật

1.4.4 Một số thành tựu nghiên cứu về nhanh giống in vitro cây hoa chuông

Scaramuzzi và cộng sự (1999) đã thành công trong việc nhân giống cây hoa

Chuông (Sinningia speciosa) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ phiến lá và chồi

Với môi trường nuôi cấy MS có bổ sung IAA và kinetin tỷ lệ mẫu sống là 80%

và đạt 25 - 30 chồi/mẫu cấy Với môi trường nuôi cấy MS có bổ sung IAA và BA

tỷ lệ mẫu sống là 80% và đạt 40 - 50 chồi/mẫu cấy

Naz và cộng sự (2001) đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa Chuông từ lá và sử dụng môi trường MS có bổ sung auxin và cytokinin với các nồng độ khác nhau Quá trình tạo chồi sử dụng môi trường MS có bổ sung 3mg BAP/l Quá trình tạo rễ sử dụng các chồi có chiều cao 2 - 2,5 cm và nuôi trong môi trường MS có bổ sung NAA và IBA trong thời gian 4 - 5 tuần và đưa

ra trồng trong vườn ươm trên giá thể đất cát trong thời gian 20 ngày

Fráguas và cộng sự (2003) đã nghiên cứu tìm kiếm nguồn dinh dưỡng thay thế cho NH4NO3 để bổ sung nguồn N vào môi trường nuôi cấy cây hoa Chuông

in vitro (Gloxinia speciosa Lodd.) Tác giả đã thay NH 4NO3 bằng cách sử dụng đạm urê Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, urê không thay thế NH 4 NO 3 trong môi

trường nuôi cấy cây hoa Chuông in vitro

Jie (2004) đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa Chuông

từ lá dùng môi trường MS có bổ sung 1 mg BA /l và 0,2 mg NAA/l để tạo callus

Để tạo cây tác giả đã dùng môi trường MS có bổ sung 3 mg BA/l và 0,2 mg NAA/l và quá trình tạo rễ sử dụng môi trường 1/2 MS có bổ sung 0,2 mg NAA/l Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2004sử dụng HgCl 2 0,1% để khử trùng mẫu cây hoa Chuông trong thời gian 10 phút cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ mẫu sạch đạt 55% Môi trường tối ưu cho hệ số nhân: MS + 0,5 mg BA/l + 0,2 mg α- NAA/l, hệ số nhân đạt 6,02 chồi sau 6 tuần nuôi cấy Môi trường MS có lượng khoáng đa lượng giảm đi một nửa cho khả năng tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất Sau

3 tuần nuôi cấy 100% cây có rễ đầy đủ, cây sinh trưởng mạnh Giá thể tốt nhất để trồng cây con tách từ lá giâm là giá thể trấu hun Ra cây vào vụ hè, cây sinh trưởng, phát triển tốt, chiều cao cây cấy mô sau trồng 2 tháng có thể đạt 7,07 cm

Ở giai đoạn trồng cây thương phẩm, sử dụng giá thể đất + trấu hun + EM Bokashi 5 (tỷ lệ 4:8:1) và phun NPK (21:21:21) Cây sinh trưởng phát triển tốt, năng suất, chất lượng hoa tốt

Lê Hữu Cần và Nguyễn Thị Hồng Minh (2005) nghiên cứu ứng dụng công

nghệ in vitro trong nhân nhanh cây hoa Chuông màu đỏ cánh đơn ở Thanh Hóa

Kết quả nghiên cứu cho thấy: sử dụng HgCl 2 0,1% trong 15 phút hoặc Ca(OCl) 2 15% trong 10 phút cho kết qủa khử trùng tốt nhất, tỷ lệ mẫu sống đạt 58% Môi trường nhân nhanh chồi tối ưu là MS bổ sung 0,7 mg Ki/l Môi trường thích hợp

để ra rễ là MS bổ sung 1 g than hoạt tính/l Giá thể thích hợp cho cây ở vườn ươm là trấu hun Cây ra vườn sản xuất sau trồng 60 ngày xuất hiện nụ và 90 ngày thì nở hoa

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005) nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây hoa Chuông bằng phương pháp nuôi cấy đốt thân và xử lý ra rễ ex vitro Kết quả

nghiên cứu chỉ ra rằng, đốt thân thứ 2 tính từ ngọn của cây hoa Chuông cho sự tái

sinh chồi nhiều nhất trên môi trường MS có bổ sung 1 mg BA/l Các chồi in vitro

có thể xử lý bằng 1000 mg IBA /l hoặc 2000 mg α-NAA /l đều cho tỷ lệ ra rễ 100% sau 2 - 4 tuần ươm

Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2005) đã thực hiện đề tài nghiên cứu cơ sở “ thiết kế hệ thống nuôi cấy bằng màng nylon dạng ống trong sự tái sinh chồi ở

mảnh cấy lá của Sinningia spp” [86] Cùng thời gian này, đề tài về “Công nghệ tiên tiến trong vi nhân giống một số cây quan trọng” trong đó Sinningia sp là một

trong những đối tượng được nghiên cứu

Lia và cộng sự (2009) đã nghiên cứu sự nhân nhanh trong ống nghiệm và

thuần hóa cây hoa Chuông Sinningia hybrida Nhóm tác giả đã sử dụng lá non có

kích thước trung bình làm vật liệu nuôi cấy, mẫu lá non đưa vào nuôi cấy được khử trùng bằng Domestos 10% trong thời gian 30 phút, sau đó được rửa bằng nước cất 5 lần Mẫu sau khi khử trùng được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung 0,5mg NAA/l, 2 mg BAP/l, sucrose 30g/l, agar 4 g/l, pH 5,8 để nhân nhanh Cây hoa Chuông nuôi cấy mô tiếp tục được chuyển sang môi trường tạo rễ MS

bổ sung 2 mg NAA/l Cây giống hoa Chuông in vitro được đưa ra vườn ươm sử

dụng giá thể bao gồm đá trân châu và than bùn với tỷ lệ 1:1, chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày với nhiệt độ 22 - 25 o C, độ ẩm 90% trong thời gian 2 tuần sau đó cây được đưa ra trồng, trong thời gian từ khi cây trong ống nghiệm đến khi cây trưởng thành (khoảng 6 tháng) với tỷ lệ cây sống đạt tỷ lệ 80%

Xu và cộng sự (2009) đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cấy mô cây hoa Chuông từ lá theo hai cách Cách thức nhất là tạo callus và chồi sau đó tạo rễ cho cây bằng môi trường MS có bổ sung 2 mg BA/l và 0,2 mg NAA/l Kết quả tỷ

lệ tái sinh chồi đạt 99,0% Cách thứ hai là tạo callus và rễ sau đó tạo chồi bằng môi trường MS có bổ sung 1 - 5 mg NAA/l Hiệu quả của phương pháp này với

tỷ lệ tái sinh chồi đạt 90,4%

Chae và cộng sự (2012) đã nghiên cứu ảnh hưởng Ethylene đến sự phát triển chồi của cây hoa chuông Nhóm tác giả đã sử dụng môi trường có bổ sung 2

mg BAP/l và 0,1 mg NAA/l và có bổ sung với nồng độ khác nhau của cobancloxít (CoCl 2 ), aminoethoxyvinylglycine (AVG), và bạc thiosulphate (STS) Sự bổ sung của AVG, CoCl 2 , và STS cải thiện đáng kể hệ số tái sinh chồi

Sự tăng trưởng chồi cao nhất khi sử dụng STS với hàm lượng 5 mg/l và AVG, CoCl 2 với nồng độ 1 mg/l

Jiliang và cộng sự (2012) nghiên cứu nhân giống cây hoa Chuông từ nụ hoa

có đường kính khoảng 7 cm và lá non được cắt ra Mẫu được khử trùng bằng HgCl 2 ở nồng độ 0,1% trong thời gian 8 phút và sau đó rửa ba lần bằng nước cất

vô trùng Tiếp theo, chẻ nụ thành bốn phân đoạn theo chiều dọc và cắt các lá non thành các mảnh khoảng 5 cm 2 Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả chỉ ra rằng, khả năng tái sinh chồi của cây hoa Chuông chịu ảnh hưởng bởi ánh sáng, kích thước của nụ hoa và chất điều hòa sinh trưởng gibberellin acide (GA3) và cytokinin (BA) Trong môi trường MS cơ bản có chứa 1 mg GA 3 /l và 0,5 mg BA/l đã mang lại 93,4% khả năng tạo chồi của mẫu từ nụ và 86,7% từ lá non Eui và cộng sự (2012) đã thực hiện nghiên cứu về việc sử dụng bạc nitrate

và xử lý putresxin nhằm cải thiện sự phát sinh cơ quan chồi ở Gloxinia Nhóm

tác giả sử dụng mô lá cây hoa Chuông để nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung BAP và NAA Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng với môi trường MS có bổ sung 2 mg BAP/l và 0,1 mg NAA/l cho kết quả cao nhất về tỷ lệ tạo chồi/mẫu cấy (12,3 ± 0,8) và chiều cao chồi là (1,2 ± 0,1 cm) sau 6 tuần theo dõi Khi bổ sung bạc nitrat là 7 mg/l đã làm tăng hệ số nhân chồi và sự phát triển của chồi lần lượt là (23,9 ± 1,6) và (1,7 ± 0,2 cm) sau 6 tuần theo dõi Tương tự, khi bổ sung putresxin với nồng độ 50 mg/l đã làm tăng số chồi (19,2 ± 1,6) và chiều cao chồi

là (1,7 ± 0,2 cm) Sau khi chuyển sang môi trường tạo rễ, cây nuôi cấy mô được đưa ra vườn ươm với tỷ lệ sống đạt 90%

Ioja-Boldura và Ciulca (2013) nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh cây hoa chuông Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, sự phối hợp 4 mg BA/l và 0,1 mg NAA/l là hiệu quả nhất cho sự hình thành chồi/mẫu cấy

Sharma (2013) đã nghiên cứu nâng cao khả năng tạo chồi của cây hoa Chuông từ lá Mẫu lá được khử trùng bề mặt bằng dung dịch HgCl2 0,1% và Bavistin 2% Môi trường nuôi cấy tạo chồi là môi trường MS bổ sung 2 mg BAP/l và 0,5 mg NAA/l trong thời gian 2 tuần số lượng trung bình chồi là 7,3 chồi/mẫu cấy Chồi sau đó được nuôi cấy trong môi trường tạo rễ MS có bổ sung

NAA và IBA Cây hoa Chuông in vitro được chuyển ra vườn ươm trên giá thể

gồm đất sạch và cát với tỷ lệ 1:1

Nhận xét: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cây mô tế bào thực vật để nhân giống vô

tính in vitro cây hoa chuông, đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều

nhà khoa học trên thế giới và trong nước Vì vậy, từ những kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học và thực tiễn giúp nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi

cấy mô tế bào thực vật để nhân giống nhanh in vitro cây hoa Chuông cũng như

khảo sát các ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật, và các dung dịch nano đồng, nano bạc, nano chitosan đến sự tăng trưởng của cây hoa Chuông

trong nuôi cấy in vitro

1.5 Tổng quan về các nguồn mẫu nghiên cứu

1.5.1 Mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào nhu mô phát triển vô tổ chức, hiện diện trong các giai đoạn hóa lignin khác nhau của thực vật, thường do các tế bào vùng tượng tầng (vùng phân simh) như tượng tầng liber mộc, tượng tầng vỏ ở gốc của đoạn cắt tạo thành Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Những mô của thực vật có thể dùng nuôi cấy tạo mô sẹo là: tượng tầng liber mộc, tượng tầng vỏ, phôi nhũ,

tế bào diệp lục, lá trụ bì rễ, tử diệp… Cây tái sinh từ mô sẹo có thể tái sinh cho cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy

Mô sẹo thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là trong sự tạo rễ Do đó, cây non hay những mảnh thân non của cây trưởng thành dễ tạo mô sẹo Ngược lại, những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo Sự tạo mô sẹo ở thực vật xảy ra khi môi trường nuôi cấy được

bổ sung một lượng auxin (2,4 D) thích hợp

Nồng độ và loại kích thích tố sử dụng trong môi trường nuôi cấy là những yếu tố có ảnh hưởng đến sự hình thành và phát triển mô sẹo Thường mô sọe được hình thành trên môi trường giàu auxin, có thể dùng auxin riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau hoặc có thể kết hợp với cytokinin tùy từng laoị cây

Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của các hormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo Vì vậy nguồn mẫu cấy, việc lấy mẫu cấy, cách đặt mẫu cấy trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phát sinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy Với một số cây thì vấn đề này không quan trọng nhưng cũng có một số cây chịu ảnh hưởng rất lớn Màu sắc của mô sẹo không giống nhau trên các môi trường nuôi cấy khác nhau hay trên các bộ phận khác nhau và chúng thường có màu vàng, trắng, nâu, hay trắng xanh…

1.5.2 Củ

Chỉ có những loài có khả năng tạo củ mới tạo củ được và có rất nhiều yếu

tố ảnh hưởng đến qúa trình tạo củ Ngoài các yếu tố môi trường thì kiểu gen, tuổi sinh lý và tình trạng của cây cũng gây ra sự khác biệt đáng kể (Stephen, 1999)

b) Độ ẩm

Đối với thực vật, nước rất cần cho quá trình hình thành củ Ở điều kiện nước bị hạn chế thì tượng tầng hoạt động kém, khả năng phân chia giảm Khi thiếu nước, quá trình quang hợp của thực vật bị ức chế dẫn đến việc cản trở tổng hợp và tích lũy các chất đồng hóa, hạn chế sự phình to củ Tuy nhiên, chất dự trữ trong củ (chủ yếu là carbonhydrate) bị thủy phân nhanh, thu hút các vi sinh vật tấn công gây hại củ

Yếu tố Hormone

Sự hình thành củ được điều chỉnh bằng sự cân bằng hormone trong cơ thể Vai trò của các phytohormone lên quá trình này như sau:

- Auxin kích thích sự hình thành rễ Chúng được sản sinh ở chồi ngọn và lá non, vận chuyển hướng gốc và kích thích sự hình thành rễ do nó kích thích phân chia tượng tầng, giúp sự phân hóa mô dẫn ức chế sự hình thành

Nguồn sucrose

Vì nuôi cấy in vitro, thức vật không có khả năng tự dưỡng do chức năng

của lục lạp bị khiếm khuyết Vì vậy cần bổ sung nguồn C bên ngoài để đáp ứng nhu cầu phát triển của tế bào

Sucrose được sử dụng nhiều nhát trong juôi cấy mô, vì nói được sử dụng nhanh hơn và tập trung ở rễ nhiều hơn, cho nên môi trường có chứa sucrose thích hợp sẽ giúp tạo củ tốt hơn

1.6 Giới thiệu về các chất ứng dụng trong nghiên cứu

1.6.1 Alginate

Là một loại polymer sinh học biển phong phú nhất thế giới và là một loại polymer sinh học nhiều thứ 2 thế giới sau cellulose, là một chất hữu cơ có trong tảo nâu, có trọng lượng phân tử từ 32.000 – 200.000, do D-Mannuroic acid và L- Guluronic acid liên kết với nhau bởi liên kết glucozit Nó tồn tại dưới dạng sợi, hạt hay bột màu trắng, dễ vàng nâu, được dùng làm chất tạo đông, chất ổn định, chất tạo gel, chất nhũ hóa,…

Alginate giúp phục hồi ẩm độ đất, giữ phân bón dư thừa và cung cấp dinh dưỡng trở lại dễ dàng, giúp cho cây tạo hormone tăng trưởng, cải thiện miễn dịch, tạo ra tế bào mới và khỏe mạnh (Cao Thị Lan Như, 2008)

Đỗ Ngọc Thanh Mai và cộng sự (2015) đã nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ

phôi vô tính hình thành từ nuôi cấy chóp rễ in vitro cây tỏi ta (Allium sativum L.)

Trong nghiên cứu này đã cho thấy ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến

sự nảy mầm của hạt nhân tạo cây tỏi Kết quả thu được cho thấy nồng độ sodium alginate khác nhau ảnh hưởng đến chất lượng cũng như khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo Hạt nhân tạo được bọc với 2% sodium alginate không định hình được rõ ràng, dễ biến dạng và khó bọc phôi Trong khi đó, nghiệm thức sử dụng 3% sodium alginate để tạo vỏ hạt cho hạt có hình dạng đẹp, ổn định Các kết quả gần đây cũng cho thấy nồng độ sodium alginate cao hơn sẽ làm cho hạt cứng hơn, từ đó ảnh hưởng đến sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt (Redenbaugh et al., 1986) Ngược lại, khi sodium alginate được sử dụng ở nồng độ thấp dẫn tới vỏ hạt dễ bị biến dạng, khó thao tác trong việc tạo hạt Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả

về tỉ lệ nảy mầm của hạt cho thấy nồng độ 3% sodium alginate cho tỉ lệ nảy mầm

là cao nhất (60%) Sodium alginate đã được sử dụng rộng rãi để sản xuất hạt nhân tạo của các loài cây khác nhau, kết quả cũng cho thấy nồng độ sodium alginate 3% thích hợp cho cả quá trình tạo hạt cũng như sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt (Ara et al., 2000; Rai et al., 2009; Redenbaugh et al., 1987)

Lê Thị Thúy và cộng sự (2019) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ

sodium alginate, nồng độ môi trường và sucrose lên lưu trữ chồi in vitro của 2

giống lan dendrobium bằng kỹ thuật hạt nhân tạo Trong nghiên cứu này, sử dụng

kỹ thuật hạt nhân tạo để bảo quản chồi in vitro của 2 giống lan hoàng thảo

Dendrobium polyanthum Wall Ex Lindl và Dendrobium lituiflorum Lindl là 2

loại lan rừng quý hiếm, cho hoa bền và đẹp Để tạo hạt nhân tạo, chồi của 2 giống lan được bọc trong dung dịch sodium alginate nhờ quá trình trao đổi ion giữa sodium alginate và CaCl2 Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ sodium alginate 40 g/l bổ sung môi trường ½ MS và không bổ sung đường sucrose là

thích hợp cho việc bảo quản chồi của giống lan Dendrobium lituiflorum Lindl

với tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 76,67% sau 42 ngày bảo quản Trong khi đó, nồng độ sodium alginate 50 g/l bổ sung ¼ MS và không bổ

sung đường sucrose thích hợp cho việc bảo quản chồi Dendrobium polyanthum

Wall Ex Lindl với tỷ lệ chồi sống và không nảy mầm bật ra khỏi hạt là 80% sau

56 ngày bảo quản Chồi của 2 giống lan trên sau thời gian bảo quản được cấy sang môi trường tái sinh cho thấy các chồi đều phát triển bình thường, tỷ lệ chồi tái sinh là 100% sau 28 ngày theo dõi

H nh 1.3 .Cấu tạo phân tử alginate (Nguồn: Internet)

1.6.2.Carboxymethyl cellulose

Carboxymethyl cellulose (CMC) lần đầu tiên được sản xuất vào năm 1918

Kể từ khi được giới thiệu thương mại tại Hoa Kì bởi Hercules Incorporated vào năm 1946, Carboxymethyl cellulose được sử dụng ngày càng rộng rãi bởi những chức năng quan trọng của nó như: chất làm đặc, ổn định nhũ tương, chất kết dính,…

CMC là chữ viết tắt của carboxymethyl cellulose Đây là một dẫn xuất cenlulose với các nhóm carboxymethyl (– CH 2 – COOH) liên kết với một số nhóm hydroxyl của các glucopyranose monomer tạo nên khung sườn cellulose,

nó thường được sử dụng dưới dạng muối natri carboxymethyl cellulose CMC là chế phẩm ở dạng bột trắng, hơi vàng, hầu như không mùi, hạt hút ẩm, CMC có khả năng tạo đông thành khối vững chắc với độ ẩm rất cao khoảng 98 % Nồng

độ tối thiểu để CMC tạo thành dạng keo là 0,2 % CMC tinh khiết còn được sử dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm,… (Đào Hồng Thắm, 2012)

Hiện tại trong lĩnh vực công nghệ sinh học chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của CMC đến khả năng tăng trưởng của thực vật trong nuôi cấy mô Ngô Thị Minh Phương và cộng sự (2019) đã nghiên cứu nghiên cứu tạo màng pectin - carboxymethyl cellulose cố định tinh dầu sả

Nguyễn Cao Hiền, Nguyễn Văn phúc, Tán Văn Hậu (2018) đã nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng copolymer ghép carboxymethyl cellulose - polyacrylonitrile từ cây lục bình

H 1.4 Carboxymethyl cellulose (Nguồn: Internet)

1.6.3 Nano đồng

Hiện nay, các hạt nano đồng đã có nhiều ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệo và công nghệ cao Trong lĩnh vực nông nghiệp, nhiều khảo nghiệm đã được thực hiện trong những năm gần đây để khẳng định vai trò quan trọng của nano đồng trong nông nghiệp mà cụ thể đó chính là khả năng diệt nấm khuẩn gây bệnh hại cho cây trồng

Đồng được sử dụng là chất kháng khuẩn trong nhiều thập kỷ nay, nó thể hiện đặc tính kháng khuẩn mạnh mẽ và có thể tiêu diệt tới 99,9% vi khuẩn Cơ quan bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) đã chấp nhận việc sử dụng đồng là chất kháng khuẩn liên quan tới một số loại bệnh nhiễm khuẩn chết người Hạt nano đồng được biết đến có hoạt tính kháng khuẩn trong dải rộng chống lại nhiều dòng

vi khuẩn gram âm và gram dương Các hạt oxid đồng hoạt đọng như chất kháng

khuẩn tiền năng chống lại các vi sinh vật truyền bệnh như E.Coli, Bacillus

subtilis, Vibria cholera, Pseudomonas aeruginosa, Syphillis typhus và Staphylococcus aureus,…

Chế phẩm nano đồng ứng dụng trong nông nghiệp: nano đồng được sử dụng như một loại thuốc đặc trị nấm bệnh gây hại cây trồng và thay thế cho các nhóm thuốc bảo vệ thực vật hoá học Nano đồng được sản xuất theo công nghệ nano tiên tiến, thuờng ở nồng độ 100-300 ppm, kích thước hạt 6–10 nm (Dương Thị Ánh Tuyết, 2011)

Theo nghiên cứu thực nghiệm, nano đồng ở kích thước hạt 3 – 10 nm có

tính kháng nấm chống lại các nấm gây bệnh trên cây trồng như nấm Fusarium

oxysporum (nấm gây bệnh vàng lá thối rễ, lở cổ rễ, bệnh héo vàng, héo rũ, bệnh

xì gôm chảy nhựa mủ thân gốc…); nấm Alternaria alternate (bệnh đốm lá, đốm vòng); nấm Curvularia lunata và Phoma

1.6.4 Nano bạc

Các hạt nano bạc có kích thước dao động từ 1 – 100 nm được xem như các

hạt nano hay là các túi nano (Rafsanjani et al., 2012.) Nhờ kích thước cực kỳ

nhỏ này, các hạt nano có diện tích bề mặt lớn làm tăng khả năng tiếp xúc với không gian bên ngoài Do đó, sự bám dính lên bề mặt tế bào gia tăng dẫn đến hiệu quả tác động cao (Shah và Belozerov, 2008)

Trên lĩnh vực nông nghiệp ở Việt Nam, hiện nay thị trường trong nước xuất hiện nhiều chế phẩm dung dịch nano bạc sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản phòng bệnh cho tôm cá hoặc trồng trọt phòng ngừa sâu bệnh Dương Tấn Nhựt

và công sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nano bạc lên sự tăng trưởng của

cây Cúc, Dâu tây, Đồng tiền trong nuôi cấy in vitro trong nghiên cứu này, nano

bạc được bổ sung từ 0 – 20 ml/l nhằm khảo sát ảnh hưởng của nano bạ lên sự

sinh trưởng của cây Cúc (Chrysanthemum sp.), Dâu tây (Fragaria spp.) và Đồng tiền (Gerberajamesonii) Kết quả cho thấy nano bạc trong môi trường nuôi cấy ở

nồng độ 10 ml/l là sinh trưởng tốt nhất cho Cúc và Dâu tây, trong khi ở Đồng tiền thì chỉ có 5ml/l Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ nano bạc thì sẽ gây ức chế và làm giảm sự tăng trưởng của các cây trong nghiên cứu

Có thể thấy rằng công nghệ nano đã được nghiên cứu và đi vào ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực kinh tế, xã hội và đời sống với rất nhiều ưu điểm và lợi ích Tuy nhiên, nuôi cấy mô tế bào thực vật lại chưa được quan tâm nghiên cứu, ứng dụng kết hợp với công nghệ này

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu và phương pháp

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu về các bộ phận của cây hoa chuông (Sinningia speciosa)

Nghiên cứu về nồng độ nano bạc và đồng

Nghiên cứu về các chất CMC và aliginate

2.1.2 Hóa chất sử dụng

- Nồng độ nano bạc là 500 ppm, được mua tại trung tâm Công nghệ Sinh Học BIO SUN Địa chỉ: 68 Nguyễn Huệ, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP HCM SĐT: (028) 2243.0122 Kích thước hạt nano từ 25 – 30 nm, nồng độ 0,5%

- Nồng độ nano đồng là 30.000 ppm, được mua tại trung tâm Công nghệ Sinh Học BIO SUN Địa chỉ: 68 Nguyễn Huệ, Phường Bến Nghé, Quận 1, TP HCM SĐT: (028).2243.0122 Kích thước hạt nano từ 6 – 10 nm, nồng độ 3%

- Agar, SA, CMC, alginate, than hoạt tính được mua tại Công Ty Cổ Phần Xuất Nhập Khẩu Hóa Chất Toàn Thắng Địa Chỉ: 656/30/4 Quang Trung, Phường 11, Quận Gò Vấp, TP HCM SĐT: 028.3895.1478 cùng một số hóa chất khác do Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật cung cấp

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS cơ bản (Murashige và Skoog, 1962) và một số chất được bổ sung gồm:

- Chất điều hòa sinh trưởng thực vật : BAP, NAA

- Nguồn carbon: đường sucrose