Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men LACTIC từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (ORYZA SATIVA)

Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men LACTIC từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (ORYZA SATIVA) Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lên men LACTIC từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (ORYZA SATIVA)

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện:

TP Hồ Chí Minh, 2020

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Hoài Hương

Sinh viên thực hiện:

TP Hồ Chí Minh, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Người thực hiện đề tài xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của nhóm thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Hoài Hương Các số liệu thu thập và phân tích trong đề tài là trung thực, nghiêm túc và không trùng lặp với bất kỳ đề tài nghiên cứu nào Những thông tin tham khảo đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Nếu có gì sai sót chúng tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tp HCM, Ngày 30 tháng 09 năm 2020

Sinh viên thực hiện

HỒ THỊ DƯỠNG

TRẦN QUANG

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập và hoàn thành tốt khóa học 2016 – 2020

Em xin cảm ơn thầy cô trong Viện Khoa học Ứng dụng đã tận tình chỉ dạy

và truyền đạt cho em những kiến thức quan trọng tạo nền tảng kiến thức vững chắc

để hoàn thành tốt Đồ án và sau này có thể ứng dụng vào công việc thực tiễn

Em xin cảm ơn thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Ứng dụng, Trường Đại học Công nghệ TP Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp cho em thực hiện và hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện để em hoàn thành tốt Đồ án tốt nghiệp này

Và em cũng gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng khóa đã tận tình hỗ trợ, giúp

đỡ, động viên khích lệ tinh thần, cùng trải qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp của mình

Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, gia đình đã luôn bên cạnh, cổ vũ động viên tinh thần, tạo mọi điều kiện để con có thể hoàn thành tốt

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH v

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Tình hình nghiên cứu 2

2.1 Ngoài nước 2

2.2 Trong nước 2

3 Mục tiêu nghiên cứu 2

4 Nội dung nghiên cứu 2

5 Phương pháp luận 3

6 Phương pháp xử lý số liệu 3

7 Kết quả đạt được 3

8 Kết cấu đồ án 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Các vi sinh vật và khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây trồng 5

1.1.1 Khả năng phân giải lân 5

1.1.2 Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA) 7

1.1.3 Khả năng tạo màng sinh học biofilm 8

1.2 Giới thiệu chung về nấm đạo ôn hại lúa 10

1.2.1 Triệu chứng bệnh trên lúa 10

1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn 11

1.2.3 Giới thiệu chung về Pyricularia oryzae 13

1.2.4 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Pyricularia oryzae 15

1.2.5 Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn trên lá lúa 18

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic nội sinh 21

1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic nội sinh 21

1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic nội sinh 25

1.3.3 Quá trình trao đổi chất 26

1.3.4 Khả năng sinh các hợp chất kháng khuẩn, kháng nấm 29

1.3.5 Ứng dụng của vi khuẩn lactic nội sinh 32

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Địa điểm nghiên cứu 35

2.2 Thời gian thực hiện 35

2.3 Vật liệu nghiên cứu 35

2.3.1 Vật liệu 35

2.3.2 Hóa chất sử dụng 35

2.3.3 Thiết bị 36

2.3.4 Dụng cụ 36

2.4 Phương pháp nghiên cứu 37

2.4.1 Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống trên bề mặt rễ lúa 38

2.4.2 Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các chủng phân lập 43

2.4.3 Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt tính kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập 47

2.4.4 Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo 49

2.4.5 Ứng dụng các chủng tuyển chọn xử lý hạt giống lúa 49

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52

3.1 Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống trên bề mặt rễ lúa 52

3.1.1 Phân lập chủng LAB nội sinh và sống trên bề mặt rễ lúa 52

3.1.2 Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 53

3.2 Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các chủng phân lập 59

3.2.1 Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng trưởng sinh khối 60

3.2.2 Khả năng tổng hợp sinh khối 61

3.2.3 Khảo sát khả năng phân giải lân 63

3.2.4 Khảo sát khả năng sinh IAA 65

3.2.5 Khả năng tạo màng biofilm 66

3.2.6 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 67

3.3 Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt tính kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập 69

3.3.1 Tái nhiễm theo quy tắc Koch 70

3.3.2 Định danh nấm chỉ thị bằng phương pháp giải trình tự vùng ITS 72

3.3.3 Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vitro 74

3.4 Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo 75

3.4.1 Khảo sát khả năng kháng nấm gây bệnh đạo ôn in vivo của 3 chủng RL1T, RL, L5 ở mật độ 10 8 , 10 7 , 10 6 (cfu/ml) sau 5 ngày 75

3.4.2 Định danh các chủng tuyển chọn 77

3.5 Ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic hỗ trợ tăng trưởng cây trồng 79

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 83

4.1 Kết luận 83

4.2 Kiến nghị 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 85

A PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM 1

B PHỤ LỤC PHƯƠNG PHÁP 6

C PHỤ LỤC HÌNH ẢNH 15

D PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ 28

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BCP: Bromocresol purple

DNA: Deoxyribonucleotide Acid

ĐBSCL: Đồng bằng sông Cửu Long

EFSA: Cơ quan Tiêu chuẩn Thực phẩm Châu Âu

EPSs: Extracellular Polymeric Substance

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations Fw: Forward primer (Mồi ngược)

GRAS: Generally Recognized As Safe

IAA: Indole Acetic Acid

IAM: Indole-3-acetamide

IPA: Indole-3-pyruvate

ITS: Internal transcribed spacer

LAB: Lactic acid bacteria

MRS: de Man, Rogosa and Sharpe

NA: Nutrient Agar

NB: Nutriend broth

NMSL: Nước muối sinh lý

NSAPs: Non – specific acid phosphatases

OD: optical density (Mật độ quang)

PGPR: vi khuẩn hỗ trợ tăng trưởng cây trồng

PHL: Post Harvest Losses

PSA: Potato Sucrose Agar

PSB: Potato Sucrose Broth

PSM: Phosphate Solubilizing Microorganisms

RNA: Ribonucleic Acid

Rv: Reverse primer (Mồi xuôi)

SHPT: Sinh học phân tử

TCA: Trichloroacetic acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại khoa học của nấm bệnh đạo ôn 12

Bảng 1.2 Độc tố của nấm đạo ôn 15

Bảng 1.3 Các loại thuốc hóa học trừ nấm bệnh đạo ôn 18

Bảng 1.4 Các giống lúa có khả năng kháng bệnh đạo ôn 20

Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động của các chủng vi khuẩn 21

Bảng 1.6 Phân loại vi khuẩn lên men lactic 23

Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc trên đĩa thạch và quan sát bằng kính hiển vi 54

Bảng 3.2 Hình thái tế bào của các chủng khảo sát 55

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng lên men các loại đường 60

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên % acid tổng số của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường MRS 61

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên mật độ các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường MRS (Log(cfu/ml)) 63

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên đường kính vòng hòa tan lân vô cơ khó tan (D – d) của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường Pikovskaya‟s 65

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên đường kính vòng IAA của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường Trypton water bổ sung cao nấm men 66

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng tạo màng biofilm của 4 chủng vi khuẩn phân lập đo ở OD550nm 67

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng phân lập 69

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae (%) 75

Bảng 3.11 Tỷ lệ nảy mầm và độ khỏe mầm của các nghiệm thức (P < 0.05, Duncan test) 82

Bảng 3.12 Chiều cao, cân nặng của thân và rễ cây non (P < 0.05, Duncan test) 83

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc Trp (Yunde Zhao, 2010) 8

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành màng sinh học (Jean – Christophe Piard và Romain Briandet, 2016) 9

Hình 1.3 Bệnh đạo ôn trên lá lúa 11

Hình 1.4 Bào tử nấm Pyricularia oryzae (http://plantmanagementnetwork.org/) 13

Hình 1.5 Sơ đồ cơ chế xâm nhiễm của nấm bệnh đạo ôn (Lê Hà, 2018) 14

Hình 1.6 Nấm đạo ôn 17

Hình 1.7 Con đường lên men Glucose 29

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 38

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập vi khuẩn bề mặt rễ lúa 39

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập vi khuẩn nội sinh 41

Hình 2.4 Sơ đồ khảo sát vi khuẩn lactic 43

Hình 2.5 Sơ đồ khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào 47

Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp 49

Hình 2.7 Sơ đồ ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic hỗ trợ tăng trưởng cây trồng 51 Hình 3.1 Chứng minh các chủng phân lập là vi khuẩn nội sinh Rễ lúa sau khi được khử trùng bề mặt, đặt vào môi trường NA, ủ 24 h nhiệt độ phòng (trái); nước rửa rễ lần cuối cấy ria trên môi trường NA ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng (phải) 53

Hình 3.2 Nhuộm bào tử của chủng Bacillus sp (trái) và Enterococcus sp RL1T (phải) 57

Hình 3.3 Thử nghiệm catalase các chủng vi khuẩn khảo sát RL1T, RL1V, RL2, RL và đối chứng dương (Bacillus sp.) 57

Hình 3.4 Thử nghiệm di động của các chủng vi khuẩn khảo sát RL1T, RL1V, RL2, RL (trái) và đối chứng dương Bacillus sp (phải) 58

Hình 3.5 Vi khuẩn lactic chuyển màu môi trường MRS có bổ sung chất chỉ thị 59

Hình 3.6 Canh trường nuôi cấy vi khuẩn đổi màu với thuốc thử so với đối chứng 59 Hình 3.7 Acid tổng (% acid lactic) của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường MRS không và có bổ sung NaCl 61

Hình 3.8 Log mật độ tế bào của các chủng phân lập nuôi cấy trong môi trường

MRS không và có bổ sung NaCl 63

Hình 3.9 Vòng hào quang Phosphate hòa tan của đối chứng (trái) và Enterococcus

sp RL (phải) 64

Hình 3.10 Đường kính vòng hòa tan của các chủng phân lập ở các nồng độ muối 65 Hình 3.11 Đường kính vòng IAA của các chủng phân lập 66 Hình 3.12 Khả năng tạo màng biofilm của 4 chủng vi khuẩn phân lập 67 Hình 3.13 Khả năng sinh enzyme caseinase của các chủng vi khuẩn lactic 69 Hình 3.14 Hình thái nấm chỉ thị (trái) dưới kính hiển vi và sau 9 ngày nuôi cấy nấm

chỉ thị trên môi trường PSA (phải) 71

Hình 3.15 Hình thái nấm chỉ thị dưới kính hiển vi (trái) và hình tái nhiễm nấm chỉ

thị trên lá lúa (phải) 72

Hình 3.16 Kết quả tái phân lập từ lá lúa đã được chích bào tử nấm chỉ thị, hình soi

vết bệnh dưới vật kính 4X (A), lấy ranh giới mô bệnh và mô khỏe tái phân lập trên môi trường WA (B), nấm bệnh được cấy chuyền từ môi trường WA sang PSA trong

5 ngày (C) 72

Hình 3.17 Kết quả tra cứu genbank NCBI 73 Hình 3.18 Khoảng cách di truyền từ chủng nấm chỉ thị (Rice blast fungus CM) đến

các chủng so sánh 74

Hình 3.19 Cây phát sinh loài cho thấy vị trí của nấm chỉ thị với các loài thuộc

Pyricularia oryzae xây dựng dựa trên trình tự ITS của các chủng Chủng Aspergillus flavus UPMZ02 là một chủng ngoài chi Pyricularia được sử dụng so

sánh Giá trị phần trăm Bootstrap (lặp lại 1000) được hiện tại lại vị trí nhánh phát sinh 74

Hình 3.20 Tỷ lệ ức chế nấm Pyricularia oryzae (%) ở các nồng độ muối 75 Hình 3.21 Ức chế nấm Pyricularia oryzae trên lá lúa ở mật độ tế bào vi khuẩn 106

cfu/ml sau 5 ngày 76

Hình 3.22 Cây phát sinh loài cho thấy vị trí của 2 chửng vi khuẩn RL và RL1T với

các loài thuộc chi Enterococcus, xây dựng dựa trên trình tự 16SrRNA của các

chủng Giá trị phần trăm Bootstrap (lặp lại 1000) được hiện tại lại vị trí nhánh phát

sinh 79

Hình 3.23 Khoảng cách di truyền các chủng RL1T và RL so với các chủng tham chiếu (MEGA X – so sánh cặp đôi) 80

Hình 3.24 Thân và rễ cây lúa sau 7 ngày trồng 81

Hình 3.25 Tỷ lệ nảy mầm và độ khỏe mầm của các nghiệm thức 81

Hình 3.26 Chiều cao, cân nặng của thân và rễ giữa các nghiệm thức 82

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Bệnh đạo ôn trên lúa do nấm Pyricularia grisea Sacc gây ra là một trong

những dịch bệnh có lịch sử lâu đời nhất với địa bàn phân bố rộng nhất và tác hại nghiêm trọng đối với tất cả các quốc gia trồng lúa trên thế giới [59] Tuy nhiên cho đến nay, bệnh đạo ôn vẫn là nỗi ám ảnh nặng nề nhất đối với người trồng lúa, tính kháng bệnh của giống liên tục bị phá vỡ do độc tính của nấm gây bệnh Do vậy, người trồng lúa chủ yếu sử dụng thuốc hóa học để đối phó với dịch hại này Với thực trạng trên cần có giải pháp cho cây lúa nói riêng hay cho sản xuất nông nghiệp hướng tới nền nông nghiệp an toàn Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn phổ biến là dùng thuốc hóa học Tuy nhiên, thuốc hóa học là tác nhân gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng sức khoẻ con người Do đó, việc hạn chế khả năng phát tán và

gây bệnh của nấm Pyricularia oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh

vật (VSV) như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, … nhằm đưa ra phương pháp tối ưu phòng trừ bệnh đạo ôn lúa bằng chế phẩm VSV là công việc cấp bách của các nhà khoa học

Đặc biệt ở các nước Đông Nam Á, lúa là cây lương thực đứng vị trí hàng đầu do có giá trị dinh dưỡng cao và nhiều công dụng khác, về giá trị kinh tế lúa gạo

là mặt hàng xuất khẩu của một số nước trong khu vực

Cây lúa đã và đang là cây trồng số một của nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam, là cây lương thực quan trọng nhất đối với vấn đề an ninh lương thực ở nước

ta

Diện tích trồng lúa của nước ta hiện nay hơn 3,123,9 nghìn ha (Tổng cục thống kê, 6/2019) nhưng nhìn chung năng suất và sản lượng lúa vẫn còn thấp Một trong những nguyên nhân chủ yếu làm cho năng suất và chất lượng lúa thấp là nấm bệnh

Từ thực tiễn cấp thiết trên đây sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập tuyển

chọn vi khuẩn lên men lactic từ rễ cây lúa hỗ trợ tăng trưởng cây trồng và

kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa (Oryza sativa)” nhằm góp phần vào xu

hướng phòng trừ bệnh đạo ôn lúa bằng chế phẩm VSV, tiến tới một nền nông

nghiệp sạch và bền vững hiện nay

Cây thực phẩm trong vụ xuân 2010, xác định sinh lý chủng nấm đạo ôn và nghiên cứu một số đặc tính của chúng

3 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn có khả năng đối kháng nấm

Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa và có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng

cây trồng

4 Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập, khảo sát các chủng vi khuẩn lactic nội sinh rễ lúa và sống trên

bề mặt rễ lúa

2 Khảo sát hoạt tính sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng của các chủng phân lập: Khả năng tăng sinh khối, khả năng sinh acid lactic, phân giải lân, sinh IAA, tạo màng sinh học biofilm, khả năng sinh enzyme protease, amylase, cellulase, chitinase

3 Xác định khả năng gây bệnh đạo ôn của nấm chỉ thị và sàng lọc hoạt tính

kháng nấm in vitro cùa các chủng phân lập

4 Tuyển chọn hoạt tính kháng nấm in vivo

5 Ứng dụng các chủng tuyển chọn xử lý hạt giống lúa

5 Phương pháp luận

Các hoạt tính sinh học như phân giải lân, sinh IAA, tạo biofilm, sinh enzyme, chịu mặn và ức chế các vi sinh vật gây hư hỏng hạt giống và ảnh hưởng đến sự phát triển của cây là những đặc tính quan trọng của một chế phẩm sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng, bảo quản hạt giống Những đặc tính này của vi khuẩn acid lactic

nội sinh, được sàng lọc tuyển chọn in vitro và kiểm tra hoạt tính kháng nấm in vivo khi cảm nhiễm với nấm Pyricularia oryzae

Xác định được tác nhân gây bệnh của nấm chỉ thị, khả năng đối kháng nấm với các chủng vi khuẩn lactic ở các nồng độ 0%, 1%, 2%, 3% NaCl qua thí nghiệm

đối kháng nấm in vitro

Xác định được khả năng đối kháng nấm trên lá lúa in vivo của chủng vi

khuẩn phân lập ở mật độ sinh khối 106, 107, 108 cfu/ml

Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn lactic ứng dụng vào nảy mầm hạt Định danh nấm chỉ thị là tác nhân gây bệnh đạo ôn trên cây lúa Định danh chủng RL1T và RL thuộc bộ sưu tập LAB

8 Kết cấu đồ án

Mở đầu

Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên quan đến tài liệu nghiên cứu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án

Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà

đề tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Các vi sinh vật và khả năng hỗ trợ tăng trưởng cây trồng

1.1.1 Khả năng phân giải lân

Phân lân hóa học là nguồn chủ yếu cung cấp lân cho đất nông nghiệp với ưu điểm là tiện lợi, dễ sử dụng, giá cả phải chăng Tuy nhiên, khoảng 75 – 90 % tổng

số lượng phân lân hóa học bón vào đất bị kết tủa thành dạng khó tan cây trồng không hấp thu được bởi các nguyên tố sắt, nhôm, magie hoặc các hợp chất calci có trong đất Sự tích lũy kết tủa này làm cho đất trở nên chai cứng, làm giảm độ phì nhiêu tự nhiên của đất Mặt khác, một phần lân từ phân hóa học có thể bị rửa trôi hoặc thấm xuống mực nước ngầm gây ô nhiễm môi trường nước [29]

Vi sinh vật (VSV) phân giải lân khó tan đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nông nghiệp VSV phân giải lân là các VSV

có khả năng chuyển hóa hợp chất phosphor khó tan thành dễ tiêu đối với cây trồng Hoạt tính phân giải lân được xác định định tính thông qua vòng phân giải lân trên môi trường nuôi cấy đặc chứa hợp chất phosphor khó tan hoặc định lượng thông qua lượng lân hòa tan được hình thành trong môi trường nuôi cấy lỏng Kết quả nghiên cứu xác định một số VSV có khả năng hòa tan nhiều hợp chất phosphor khó tan khác nhau, có tác dụng nâng cao hiệu quả sử dụng lân khoáng cho cây trồng Nhiều VSV phân giải lân có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, một số khác có khả năng đối kháng VSV gây bệnh vùng rễ cây trồng VSV phân giải lân có ảnh hưởng tốt hơn đến khả năng sử dụng dinh dưỡng nitơ, phosphor của cây trồng trong điều kiện hỗn hợp với VSV cố định nitơ Phân bón VSV phân giải lân đã được nghiên cứu sản xuất, ứng dụng tại một số cơ sở sản xuất và mang lại hiệu quả kinh tế được người sử dụng đánh giá cao [7]

Nhiều loại vi sinh vật gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn và tảo đã được ghi nhận

là thể hiện khả năng phân giải và khoáng hoá chẳng hạn: Pseudomonas spp., Agrobacterium spp., Bacillus circulans Các chủng thuộc các loài Azotobacter, Paenibacillus, Rhizobium, Serratia và nhiều chủng nấm cũng đã được ghi nhận

khả năng này như: Aspergillus, Paecilomyces, Penicillium, Rhizopus, Saccharomyces, Trichoderma [22]

1.1.1.1 Cơ chế quá trình hòa tan lân vô cơ

Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg… Trong thực tế, lân dạng H2PO4- là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất Phosphate calci dễ được huy động để làm thức ăn cho cây hơn là phosphate sắt, phosphate nhôm, các muối phosphate trong đất ít hòa tan Vì vậy, nồng độ lân hòa tan trong dung dịch đất thường rất ít Các dạng phosphate còn lại thường là những loại khó hòa tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan

Có nhiều lý thuyết về cơ chế hoà tan phosphate vô cơ Theo nhiều thí nghiệm cho thấy, cơ chế chính là quá trình tạo ra các hợp chất khoáng tan như acid hữu cơ, siderophores, protons, hydroxyl ions và CO2 Các acid hữu cơ được tạo ra ở chu chất bằng cách con đường oxi hoá trực tiếp, quá trình này làm pH giảm và dẫn đến quá trình acid hoá các tế bào vi sinh vật và môi trường xung quanh, chính vì vậy mà các ion P được giải phóng bằng việc thay thế H+ bằng Ca2+ Một cơ chế khác của việc tạo ra các acid hữu cơ chính là giải phóng H+ ra ngoài để hấp thu cation [22]

1.1.1.2 Cơ chế khoáng hóa lân hữu cơ

Nguồn phosphor hữu cơ chính trong đất là các chất hữu cơ Hàm lượng phosphor hữu cơ trong đất có thể lên đến 30 – 50 % và dạng phổ biến nhất là

inositol phosphate (phytate) Các hợp chất phosphor hữu cơ khác có thể là:

Phosphomonoesters, phosphodiesters, phospholipids, nucleic acids và

phosphotriesters [22]

Khoáng hoá phosphor liên quan đến sự hoà tan phosphor hữu cơ và sự mất

đi của phần còn lại của phân tử Lý thuyết quan trọng và phổ biến nhất chính là “Lý thuyết loại bỏ” (sink theory), đề cập đến việc việc P liên tục mất đi sẽ dẫn đến việc hoà tan các hợp chất Ca – P, chính vì vậy mà hàm lượng P bị mất đi sẽ tương ứng với hàm lượng P có trong mật độ sinh khối của các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM) Quá trình sinh học

này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hoá Phosphor, nhiều nhóm enzyme tham gia vào quá trình này Nhóm đầu tiên là nhóm khử phosphor hoá liên kết của phosphor – ester hay phospho – anhydride của các hợp chất hữu cơ Chúng

là các acid phosphatases không đặc hiệu (NSAPs) và enzyme được nghiên cứu nhiều nhất từ các PSM là phosphomonoesterases (còn gọi là phosphatases) Các enzyme này có thể là acid hay alkaline phosphomonoesterases Một loại enzyme khác được tạo ra bởi PSM là phytase, enzyme này chịu trách nhiệm cho việc giải phóng phosphor từ hợp chất hữu cơ trong đất bằng cách giữ nó dưới dạng inositol phosphate (phytate) Sự phân giải phytate bởi phytase giúp giải phóng phosphor thành dạng thực vật có thể sử dụng [22]

1.1.2 Khả năng sinh Indole-3-acetic acid (IAA)

IAA (Indole-3-Acetic Acid) là chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhóm Auxin đầu tiên được xác định giữ vai trò trung tâm trong sự tăng trưởng ở thực vật IAA thường được dùng như một chất điều hòa quá trình sinh học, giúp kích thích kéo dài tế bào bằng cách thay đổi các điều kiện nhất định như tính thấm lọc, tăng tính thấm nước, giảm áp lực thành tế bào và tăng tổng hợp thành tế bào IAA còn ngăn chặn và trì hoãn hiện tượng sinh lý của lá, thúc đẩy sự ra hoa, tạo quả [9]

Auxin là những hợp chất có nhân Indol, được tổng hợp từ Tryptophan trong

mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non Sau đó, Auxin sẽ di chuyễn đến rễ và tích tụ trong rễ

Có nhiều loại Auxin khác nhau với cấu trúc hoá học khác nhau Loại Auxin quan trọng nhất là β-indol-acetic acid (IAA), ngoài ra một số Auxin khác cũng khá phổ biến là napthalen-acetic acid (NAA), phenyl-acetic acid (PAA)

Quá trình sinh tổng hợp Auxin là một quá trình phức tạp, có khả năng nhiều con đường cùng liên quan đến quá trình này IAA có thể được sinh tổng hợp từ Trp thông qua con đường Indole-3-pyruvate (IPA) Enzyme IPA decarboxylase xúc tác chuyển đổi IPA thành Indole-3-acetaldehyde, nghiên cứu được thực hiện trên Arabidopsis cho thấy enzyme chịu trách nhiệm chuyển hoá Trp thành IPA là TAA1

(Tryptophan Aminotransferase of Arabidopsis) và TAA1 mã hoá hiện diện ở trong thân và rễ, cho thấy cả thân và rễ của cây đều có khả năng sinh tổng hợp Auxin [80]

Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp IAA phụ thuộc Trp (Yunde Zhao, 2010)

1.1.3 Khả năng tạo màng sinh học biofilm

Màng sinh học (biofilm) được tạo nên bởi sự liên kết của các vi khuẩn với

bề mặt bám thông qua một ma trận kết nối được tạo nên từ các cơ chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substance - EPS) như protein, DNA hay polysaccharides [40] Đối với tế bào vi khuẩn, biofilm là nơi giúp các vi khuẩn chống chọi lại với tác động từ môi trường hay biến động môi trường như pH, sự thay đổi về oxy, chất dinh dưỡng, hoặc sự có mặt của kháng sinh

Các tế bào vi khuẩn sinh sống nếu không chịu một sự tác động di chuyển, quá trình sinh trưởng vẫn cứ tiếp tục, dần sẽ hình thành một kiểu khuẩn lạc trên bề mặt đó, đây là giai đoạn I của sự hình thành màng sinh học Ở giai đoạn II, vi khuẩn

sẽ bắt đầu thay đổi kiểu hình, khả năng sinh hóa mới để thuận lợi hơn trong việc tổng hợp nên cơ chất ngoại bào - Extracellular Polymeric Substance (EPS) Giai đoạn III của sự hình thành màng sinh học, các tế bào tách ra khỏi màng sinh học để tìm địa điểm khác, giai đoạn này gọi là giai đoạn phát tán Khả năng tạo màng sinh học như là một cách thức tồn tại, phát triển của vi sinh vật trong những điều kiện dinh dưỡng thấp của môi trường

Hình 1.2 Các giai đoạn hình thành màng sinh học (Jean – Christophe Piard và

Romain Briandet, 2016)

Các vi khuẩn có khả năng kích thích tăng trưởng cây trồng (PGPR) sẽ biểu hiện tốt hơn dưới dạng màng sinh học khi mà chúng làm tăng khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn khác, hấp thu chất dinh dưỡng nhanh hơn và phản ứng nhanh với những thay đổi trong môi trường Ảnh hưởng của màng sinh học khi liên kết với rễ cây đã được nghiên cứu cho thấy giúp cho sự phát triển của cây trồng, tăng sản lượng và chất lượng Sự hình thành màng sinh học ở rễ phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng và các chất từ cây trồng Mặc dù hàm lượng các chất hữu cơ từ rễ cây là không lớn, chỉ khoảng 0,4 % từ quang hợp nhưng lại mang lại sự ảnh hưởng rất lớn đến hệ vi sinh vật đất Bằng cách cung cấp các hợp chất hữu cơ như là một nguồn dinh dưỡng, rễ đóng vai trò trung tâm trong việc thu hút các vi khuẩn cộng sinh với

rễ cây [27]

Hầu hết các chủng vi khuẩn đều sử dụng quorum sensing như một hình thức giao tiếp giúp điều chỉnh, phối hợp và tương tác của vi khuẩn với thực vật Đây là một trong những yếu tố chính cho việc hình thành màng sinh học và hầu hết các PGPR đều sử dụng phương thức này [27]

Trong số các chủng vi khuẩn được nghiên cứu về khả năng tạo màng sinh học, vi khuẩn sinh lactic được quan tâm vì chúng là nhóm vi khuẩn an toàn GRAS

và đã có nhiều nghiên cứu cho thấy tiềm năng của chúng trong phát triển cây trồng Màng sinh học của LAB được xem là có lợi và là một trong những yếu tố chính được xác định như là một rào cản để chúng chống lại sự phát triển của hư hỏng và mầm bệnh và đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu [40]; [57]

1.2 Giới thiệu chung về nấm đạo ôn hại lúa

1.2.1 Triệu chứng bệnh trên lúa

Bệnh đạo ôn (cháy lá) có thể phát sinh ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng của lúa và có thể gây hại ở cổ lá, lá, lóng thân, cổ bông, gié và hạt

Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu ở giai đoạn mạ - đẻ nhánh Lúc đầu vết bệnh chỉ nhỏ như đầu mũi kim, màu xám xanh giống như bị nước sôi, sau đó chuyển sang màu nâu, rồi lan rộng dần ra thành hình thoi, xung quanh màu nâu đậm, giữa màu xám trắng Nếu nặng, nhiều vết bệnh liên kết lại với nhau làm lá bị cháy khô, cây lúa bị lụi xuống, ruộng lúa sẽ bị thất thu nghiêm trọng

Trên cổ lá, thân và cổ bông: triệu chứng ban đầu cũng có màu xám xanh sau chuyển sang nâu, do nấm tấn công vào mạch dẫn gây cản trở việc vận chuyển các chất dinh dưỡng nuôi lá, thân và hạt làm cho lá, thân dễ gãy, hạt bị lép, lửng

Trên hạt: bệnh xảy ra vào giai đoạn trổ, vết bệnh trên hạt cũng có dạng mắt

én, viền nâu, tâm xám trắng Nếu bệnh tấn công sớm sẽ làm hạt bị lép, lửng Nếu

ẩm độ không khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc một lớp nấm mốc màu xám xanh, dễ bị gãy, làm ruộng lúa trở nên xơ xác Lúa sẽ bị cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh ở giai đoạn đẻ nhánh, nhất là khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh và bón phân không hợp lý [6]

Hình 1.3 Bệnh đạo ôn trên lá lúa

Ở Nhật Bản, từ năm 1953 – 1960, thất thu sản lượng lúa do bệnh cháy lá hằng năm trung bình là 2,98% Riêng trong năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24,8% trong tổng thiệt hại Đối với bệnh thối cổ gié, nếu vượt 10% gié bị nhiễm bệnh sẽ thất thu năng suất 6% và 5% hạt sẽ có phẩm chất kém Theo ước tính của FAO thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7% – 17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80%

Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Bảo vệ thực vật trên toàn quốc thiệt hại do nấm bệnh đạo ôn gây ra đối với cây lúa hàng năm mất khoảng 10% – 25% Ở các tỉnh phía Nam, diện tích nhiễm đạo ôn trên lá là 16773 hecta, trong đó diện tích nhiễm nặng là 10 hecta Bệnh đạo ôn hại cổ bông nhiễm 5847 hecta (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2014)

1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn

Tác nhân gây hại là nấm Pyricularia oryzae thuộc họ Moniliales, lớp nấm

Bất Toàn

Bảng1.1 Phân loại khoa học của nấm bệnh đạo ôn

Phân loại khoa học

là ký chủ chính, bệnh có thể lưu tồn trên các cây ký chủ phụ mọc quanh ruộng như các loài cỏ [4] Quan sát trên kính hiển vi cho thấy cành bào tử phân sinh hình trụ,

đa bào, đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc Bào tử có hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 ngăn ngang, bào

tử không màu như hình 1.4

Hình 1.4 Bào tử nấm Pyricularia oryzae

(nguồn: http://plantmanagementnetwork.org/)

1.2.3 Giới thiệu chung về Pyricularia oryzae

1.2.4.1 Đặc điểm chung

Bệnh đạo ôn do nấm Pyricularia oryzae gây ra, là một trong vài loại dịch

hại nguy hiểm đối với cây lúa ở Việt Nam và nhiều nước khác trong khu vực

Tác nhân gây hại là nấm Pyricularia oryzae Bào tử phân tán rất nhỏ, có hể

phát tán và bay cao đến 24 m, thậm chí đén 10 000 m để lây lan cho các ruộng lân cận trong khu vực Nấm phát triển tốt trong điều kiện mát từ 24 – 28oC, ẩm độ cao

>80%, biên độ giữa ngày và đêm cao sẽ dễ phát triển thành dịch Bào tử nảy mầm khi gặp lớp nước tự do trên lá hay không khí bão hòa nước, ở 24oC bào tử còn tiết

ra độc tố pyricularin gây độc cho cây (Ou, 1983)

Quan sát trên kính hiển vi cho thấy cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào, đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc Bào tử có hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 ngăn ngang, bào tử không màu

1.2.4.2 Đặc điểm hình thái

Giai đoạn vô tính: Pyricularia oryzae Cav et Bri (còn gọi là Pyricularia grisea) thuộc họ Moniliacea, bộ Miniliales – lớp nấm bất toàn

Giai đoạn hữu tính: Magnaportha grisea thuộc lớp nấm túi (thường không

có ngoài tự nhiên)

Hình 1.6 Nấm đạo ôn

Cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào không phân nhánh, đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc Bào tử phân sinh hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 vách ngăn ngang, bào tử không màu, kích thước trung bình của bào tử nấm 19 – 23 x 10 – 12 µm Nhìn chung, kích thước của bào tử nấm biến động tùy thuộc vào các isolates, điều kiện ngoại cảnh khác nhau cũng như trên các giống lúa khác nhau Bào tử của loại nấm rất nhỏ, có thể phát tán và bay cao 24 – 25 m, thậm chí có thể bay xa đến 10 000 m lây lan cho các ruộng lân cận trong khu vực

Nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp ở nhiệt độ 24 – 28oC và ẩm độ không khí

là 93% trở lên Phạm vi nhiệt độ nấm sinh sản bào tử là 10 – 30oC Ở 28oC cường

độ sinh bào tử nhanh và mạnh nhưng sức sinh sản giảm dần sau 9 ngày, trong khi đó

ở 16oC, 20oC và 24oC sự sinh sản tăng và kéo dài tới 15 ngày sau đó mới giảm xuống Điều kiện ánh sáng âm u có tác động thúc đẩy quá trình sinh sản bào tử của nấm Bào tử này nảy mầm tốt nhất ở nhiệt độ 24 – 28oC và có giọt nước Quá trình xâm nhập của nấm vào cây phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, ẩm độ không khí và ánh sáng Ở điều kiện bóng tối, nhiệt độ 24oC và ẩm độ bão hòa là thuận lợi nhất cho nấm xâm nhập vào cây Trong quá trình gây bệnh nấm tiết ra một số độc tố như

acid α – pycolinic (C6H5NO2) và pyricularin (C18H14N2O3) có tác dụng kìm hãm hô hấp và phân hủy các enzyme chứa kim loại của cây, kìm hãm sự sinh trưởng của cây lúa

1.2.4 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Pyricularia oryzae

Bào tử nấm nảy mầm khi gặp lớp nước tự do trên lá hay không khí bão hòa nước, ở 24oC bào tử cần 6 giờ, vượt quá 28oC bào tử phát triển kém Bào tử xâm nhập vào tế bào lá bằng cách mọc thành đĩa áp, chọc thủng vách tế bào lá lúa Ngoài

ra, bào tử còn tiết ra độc tố pyricularin gây độc cho cây Trên bề mặt vết bệnh, bào

tử được tạo ra ở ẩm độ không khí từ 93% trở lên Ẩm độ càng cao tốc độ sinh trưởng càng nhanh Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nảy mầm được và sau 24 giờ có khả năng sinh sản

Hình 1.5 Sơ đồ cơ chế xâm nhiễm của nấm bệnh đạo ôn (Nguồn: Lê Hà, 2018)

1.2.3.1 Độc tố của nấm

Theo kết quả nhóm giải mã gen nấm gây bệnh đạo ôn do Ralph Dean thuộc

Đại học Bắc Carolina (Mỹ) đứng đầu xác định Pyricularia oryzae có hơn 11000 gen

và tiết ra gần 800 protein để xâm nhập và lây nhiễm sang lúa Nấm sử dụng một loại thụ thể mới để phân biệt lúa với các thực vật khác Những thụ thể này nằm trên bào

tử của nấm Trên bề mặt lá, bào tử nảy mầm xâm nhiễm trực tiếp qua lớp cutin và biểu bì qua sự tạo trực tiếp đĩa bám và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm có thể xâm nhiễm trực tiếp qua khí khổng Vòi xâm nhiễm phát triển từ đĩa bám sau khi xâm nhập vào tế bào sẽ tạo thành một túi và từ đó khuẩn ty lan vào các tế bào cây được trình bày ở hình 1.5 Trong cây bệnh hay trong môi trường nuôi cấy, người ta trích được hai loại độc tố: α – picolinic axit (C6H5NO2) và một chất khác được gọi tên là piricularin (C18H14N2O3) Nếu trực tiếp bôi piricularin lên một vết thương cơ học trên lá lúa, sẽ tạo một đốm cháy giống như vết bệnh cháy lá Piricularin còn làm cây bệnh và tập trung coumarin làm cây lúa không phát triển Piricularin bị chlorogenic axit và ferulic axit làm mất độc tính Ngoài ra, nấm còn tạo ra hai loại độc tố khác là pyriculol và tenuazonic axit [6]

Bảng 1.2 Độc tố của nấm đạo ôn

α – picolinic axit hoặc

và ức chế ở nồng độ cao

lúa, gây vàng lá thối rễ

Tenuazonic axit Là chất gây độc thực vật

1.2.3.2 Điều kiện phát sinh và phát triển của nấm bệnh

Sự phát sinh và phát triển của bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại cảnh và mức độ nhiễm bệnh của giống Ảnh hưởng của thời tiết, khí hậu: Bệnh này thường phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu mát mẻ, ẩm độ cao, mưa nhỏ kéo dài, đêm sương mù nhiều Đặc biệt trong vụ lúa Đông Xuân tại vùng ĐBSCL vào tháng giêng – tháng hai dương lịch, bệnh này sẽ gây hại trên diện rộng trùng vào lúc lúa đứng cái đến trổ Các vùng thường xuyên bị bệnh cháy lá hằng năm như Tiền Giang, An Giang, Đồng Tháp và Sóc Trăng Tuy nhiên, điều kiện khô hạn làm cây lúa thiếu nước, quá trình trao đổi chất kém, khả năng hấp thu dinh dưỡng yếu, cây lúa không chống chọi được bệnh Ở những vùng cao nguyên, điều kiện khô hạn thiếu nước kết hợp với đêm sương mù nhiều, biên độ nhiệt lớn sẽ làm cho bệnh này càng dễ phát sinh mạnh Ảnh hưởng của đất: những ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước, những vùng đất kém màu mỡ, đất nhẹ, giữ nước kém và những ruộng lúa có lớp đất sét nông rất phù hợp cho bệnh đạo ôn phát triển và gây hại Ảnh hưởng của phân bón: Ba loại phân N – P – K đều có ảnh hưởng rất lớn đến việc phát sinh bệnh nếu bón không cân đối Thông thường, bón dư thừa phân đạm sẽ làm tăng bệnh, dư phân lân không thấy rõ ảnh hưởng lên bệnh Tuy nhiên, nếu bón thêm phân lân trên vùng đất phèn sẽ hạn chế bệnh cháy lá rất rõ ràng Phân Kali có ảnh hưởng rất phức tạp trên sự phát triển của bệnh cháy lá; bón dư thừa đạm

và Kali đều làm tăng bệnh; bón đạm vừa phải kết hợp đủ lượng Kali thì sẽ giảm bệnh rất rõ Do đó, trong giai đoạn sau trổ nếu ruộng bị nhiễm bệnh cháy lá hoặc thối cổ bông thì không được bón thêm phân bón lá có Nitrat Kali Mật độ gieo sạ cũng có liên quan đến khả năng phát triển của bệnh cháy lá Gieo sạ càng dày, tán lá

lúa càng nhiều, khả năng che khuất càng lớn, ẩm độ dưới tán lá càng cao, điều kiện khí hậu càng thuận lợi cho nấm cháy lá phát triển Ảnh hưởng của giống lúa: ngoài các yếu tố nêu trên thì đặc tính của giống cũng có ảnh hưởng tới mức độ phát triển của bệnh Những giống nhiễm bệnh nặng (giống mẫn cảm) sẽ tạo điều kiện cho bệnh gây hại và lây lan trên diện rộng (Hà Huy Niên, 2007)

1.2.5 Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn trên lá lúa

1.2.5.1 Sử dụng thuốc hóa học

Hiện nay, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn vì cho hiệu quả nhanh, dễ sử dụng, khi phát hiện ổ bệnh trên đồng ruộng cần tiến hành phun thuốc trừ sớm và nhanh Những diện tích bị nhiễm bệnh

có 10% số lá bị bệnh, tiến hành phun thuốc phòng trừ bằng một trong số các loại thuốc đặc hiệu Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng, không hợp lý, sử dụng lâu dài

sẽ gây ảnh hưởng xấu tới môi trường, tăng khả năng hình thành tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt thiên địch, phá vỡ cân bằng sinh thái, gây nhiều dịch hại mới Một số loại thuốc hóa học phồng trừ bệnh đạo ôn được trình bày ở bảng 1.3

Bảng1.3 Các loại thuốc hóa học trừ nấm bệnh đạo ôn

Fuji – one Isoprothiolane Nội hấp, ức chế hình thành phosphatidylcholine

thành phần quan trọng của tế bào nấm

Như cơ chế của Triclazole và Hexaconazole kìm hãm quá trình khử metyl của sterol, kìm hãm sinh tổng hợp ergosterol ở màng tế bào làm ngừng sự phát triểm của sợi nấm

1.2.5.2 Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM (Integrated Pest Management)

Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM (Integrated Pest Management) được xem là biện pháp chính trong kiểm soát dịch hại Chọn giống tốt, kháng bệnh khử lẫn tạp hạt cỏ trước khi gieo Dùng biện pháp sạ hàng, bón phân cân đối N – P –

K, không bón thừa phân đạm, nên bón phân đạm theo nhu cầu cây lúa Sau mùa thu hoạch, cày vùi rơm rạ để trả lại nguồn hữu cơ cho đất đồng thời diệt được mầm bệnh, hạn chế đốt rơm vì biện pháp này chỉ trả lại một số chất khoáng có trong tro, đất dần dần kém màu mỡ, mau suy kiệt Vệ sinh đồng ruộng bằng cách thu gom, tiêu diệt lúa rày, cỏ dại mọc ven bờ là nơi lưu tồn và lây lan mầm bệnh sau này Giữ mực nước đầy đủ thường xuyên trên mặt ruộng tùy theo nhu cầu nước theo từng giai đoạn của cây lúa, tránh để ruộng khô nước khi bệnh 13 cháy lá xảy ra Cần thăm đồng thường xuyên, phát hiện kịp thời khi bệnh mới xuất hiện (Nguyễn Văn Đĩnh, 2004)

1.2.5.3 Sử dụng giống kháng bệnh

Nhờ ứng dụng các phương pháp sinh học hiện đại, các nhà nghiên cứu đã cho ra đời nhiều giống lúa có năng suất cao và mang các gen kháng bệnh đạo ôn đem lại lợi nhuận cao được nhiều nhà nông ưa chuộng Với ưu điểm vượt trội so với các giải pháp phòng trừ bệnh đạo ôn khác thì có thể nói đây là một bước ngoặc lớn chấm dứt nỗi ám ảnh về bệnh đạo ôn

Bảng1.4 Các giống lúa có khả năng kháng bệnh đạo ôn

BC15

Thuộc bản quyền của Công ty cổ phần tập đoàn ThaiBinh Seed

Phương pháp lai Backcross

Kim cương 111

Công ty cổ phần Giống cây trồng Trung ương (Vinaseed)

Thừa hưởng gen di truyền của dòng bố

R 03 – 1

MTL547

Bộ môn Tài nguyên Cây trồng – Viện Nghiên cứu phát triển ĐBSCL

Lai tổ hợp hai giống lúa MTL156 và Khaohom

1.2.5.4 Ứng dụng công nghệ sinh học

Việc áp dụng các thành tựu về công nghệ sinh học trong nông nghiệp ngày càng phổ biến Đặc biệt trong sản xuất lúa gạo càng quan trọng hơn, để đáp ứng nhu cầu an ninh lương thực trong nước và đẩy mạnh xuất khẩu gạo ra thị trường thế giới với các tiêu chí an toàn sinh học, không ảnh hưởng môi trường, hệ sinh thái hơn hết

là sức khỏe con người góp phần nâng cao chất lượng sản phẩm lúa gạo ngày càng được các nhà khoa học chú trọng Các chế phẩm sinh học hỗ trợ tăng trưởng cây trồng, phòng trừ sâu bệnh trên lúa đã và đang được nhiều nhóm nghiên cứu, trung tâm và viện liên quan cho ra mắt trên thị trường Các sản phẩm đó ngày càng chứng

tỏ ưu điểm vượt trội so các sản phẩm khác như an toàn sinh học cao, không tác động xấu tới môi trường và hệ sinh thái, tránh xảy ra hiện tượng kháng thuốc đối với các đối tượng gây bệnh Đặc biệt đối với đối tượng bệnh đạo ôn do nấm

Pyricularia oryzae gây ra trên cây lúa đã mở đường cho xu hướng sản xuất lúa gạo

an toàn, chất lượng cao, không dư lượng thuốc bảo vệ thực vật ngày một khả quan, khiến cho nỗi ám ảnh triền miên của nông dân được tháo gỡ

Bảng 1.5 Cơ chế hoạt động của các chủng vi khuẩn

chitinase

Nấm men

Kunyosying, D., anun, C and Cheewangkoon, R, 2018

To-Sự xâm nhập của nấm men ức chế bào tử nấm bệnh nảy mầm Dịch chiết của cỏ hôi

Kích kháng nhờ các hợp chất polyphenol

Streptomyces spp Nguyễn Thị Phong Lan

và cộng sự, 2015 Đối kháng trực tiếp

Trichoderma asperellum,

Bacillus subtilis Ibrahim Hashim, 2019

Các hợp chất kháng nấm nguồn gốc từ

Trichoderma asperellum, Bacillus subtilis

1.3 Tổng quan về vi khuẩn lactic nội sinh

1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic nội sinh

Vi sinh vật nội sinh là VSV sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng

rễ, thân, lá, quả của thực vật Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ, thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại

vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân,

lá, hoa [81]; thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ [36]

Cây thường xuyên tham gia vào tương tác với một loạt các vi khuẩn Vùng

rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng đọng các chất hữu cơ, và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh

dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra (El – Shatnawi và cộng sự, 2001)

Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học (Ryan và cộng sự, 2007)

Vi khuẩn nội sinh không gây hại cho cây chủ cũng như cấu trúc bên ngoài của thực vật, được phân lập từ hoa, trái, cây, lá, thân, rễ và hạt giống loài thực vật khác nhau (Ahmad và cộng sự, 2006), hầu hết chúng đều có khả năng cố định đạm

như: Azospirillum, Gluconacetobacter diazotrophicus, Herbaspirillum, Klebsiella, Azoarcus, Enterobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Azotobacter (Phạm Thị

Khánh Vân và cộng sự) Chúng thường có khả năng tổng hợp kích thích tố Auxin [18], giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường [51], tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh [25], hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng [3]

Vi khuẩn sinh acid lactic nội sinh là nhóm vi khuẩn gram dương, không sinh bào tử, có dạng cầu hoặc que nhiệt độ phát triển trong khoảng 10 – 45 °C, tối

ưu ở 30 – 40 °C, có tỉ lệ GC trong bộ gene thấp [48]

Nhìn chung, có thể dễ dàng nhận thấy khả năng sinh acid lactic từ carbohydrate là khả năng chung của những vi khuẩn gram dương và không có ý nghĩa trong việc phát sinh loài Về mặt phân loại, vi khuẩn sinh acid lactic được phân bố trong các dòng sau: Họ Bacillaceae, họ Sporolactobacillaceae, họ Bifidobacteriaceae và các Lactobacillales khác mà từ xưa vẫn được xem là vi khuẩn lactic [33]

Hệ thống ngày nay phân loại thành 6 họ có tỉ lệ G – C trong bộ gene thấp và gram dương

Bảng 1.6 Phân loại vi khuẩn lên men lactic

Aerococcaceae: Abiotrophia,

Aerococcus, Dolosicoccus,

Giovanna E Felis và cộng sự, 2016

Đây là nhóm vi khuẩn

có catalase âm tính, kị

Nhóm vi khuẩn có catalase âm tính, dạng cầu hoặc que, có khả năng di động, có thể phát triển ở điều kiện

Các chủng có thử nghiệm catalase âm tính, hình cầu, không sinh bào tử, kị khí, kị khí tùy nghi hoặc hiếu

khí

Lactobacillaceae:

Lactobacillus và Pediococcus

Giovanna E Felis và cộng sự, 2016

Là nhóm các vi khuẩn thuộc nhóm an toàn GRAS không sinh bào

tử, hình que hay cầu khuẩn, không có khả năng di động, có khả năng chịu oxi, có khả năng sinh acid Leuconostocaceae: Giovanna E Felis và Không sinh bào tử, kị

CO2 từ glucose, trừ chi

Fructobacillus tạo acid

acetic thay vì ethanol Streptococcaceae:

Lactococcus, Lactovum và

Streptococcus

Giovanna E Felis và cộng sự, 2016

Không sinh bào tử, kị khí tùy nghi, có dạng hình chuỗi hoặc cặp

Trong đó, hai họ Lactobacillaceae và Streptococcaceae là hai dòng vi khuẩn đóng vai trò quan trọng vì chúng chứa nhiều loài vi khuẩn lactic phổ biến [33]

Nhiều vi sinh vật đã được xác định như các chất kiểm soát sinh học (BCAs)

an toàn và hiệu quả đối với các phytopathogens vi khuẩn và nấm BCA hoạt động thông qua nhiều cơ chế (Compant và cộng sự, 2005) Có ba cơ chế đã biết mà LAB hoạt động như một tác nhân kiểm soát sinh học; thông qua việc sản xuất hoạt chất kháng khuẩn (Kao và Frazer, 1966; Tramer, năm 1966; Trias và cộng sự, 2008), các loại oxy phản ứng (Trias và cộng sự, 2008) và vi khuẩn; bằng cách loại trừ mầm bệnh bằng cách khu trú trước các mô thực vật dễ bị nhiễm bệnh (Visser và Holzapfel, 1992; Rosello và cộng sự, 2013), và bằng cách thay đổi phản ứng miễn dịch của thực vật (Konappa và cộng sự, 2016)

Ngoài đối kháng trực tiếp với phytopathogens, phương pháp điều trị LAB

có thể thay đổi phản ứng của thực vật đối với mầm bệnh, do đó cải thiện khả năng miễn dịch bẩm sinh của chúng Hiệu ứng như vậy được gọi là kháng thuốc toàn thân (SAR) [37] Những thay đổi gợi ý về hình thái của cà chua được xử lý bằng các

chủng Lactobacillus khác nhau là bằng chứng về phản ứng SAR, dẫn đến khả năng

kháng lại nấm bệnh Ủng hộ lý thuyết này, hạt cà chua được xử lý bằng

Lactobacillus paracasei được phân lập từ thân rễ cà chua đã tạo ra cây con có khả

năng chống nhiễm khuẩn Ralstonia solanacearum cao hơn do sự biểu hiện khác biệt

của các chất chuyển hóa liên quan đến phòng vệ ở cây con được xử lý (Konappa và cộng sự, 2016)

1.3.2 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic nội sinh

Theo Saeed A Hayek và Salam A Ibrahim, vi khuẩn lactic là những vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng cao Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau [67]

Nhu cầu dinh dưỡng carbon: Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được nhiều loại carbohydrate từ các monosaccharide (glucose, fructose) và các disaccharide (saccharose, lactose, maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin) Chúng

sử dụng nguồn carbon này để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm

cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, lactic, pyruvic, fumaric, acetic, …

Nhu cầu dinh dưỡng nito: Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về nguồn nito khác nhau Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nito Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nito có sẵn trong môi trường Các nguồn nito vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone, …

Nhu cầu về vitamin: Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin

Nhu cầu các chất hữu cơ khác: Ngoài các acid amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các base nito hay các acid hữu cơ Một số acid hữu cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của

vi khuẩn lactic như acid citric, acid oleic Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrate, dẫn xuất của acid oleic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic

Nhu cầu các muối vô cơ khác: Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, phosphor, lưu huỳnh, magie, mangan Đặc biệt là magie và mangan, vì nó tham gia và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme, giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào

Nhu cầu dinh dưỡng oxy: Vi khuẩn lactic có khả năng sống được trong môi trường có oxy hay không có oxy Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với trong điều kiện kị khí

1.3.3 Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua việc lên men lactic

Một tính năng cần thiết của LAB trong quá trình trao đổi chất là khả năng lên men carbohydrate, các ATP tạo ra được sử dụng cho các mục đích tổng hợp sinh học khác và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là acid lactic (từ 50% carbon của đường) LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose, mannose, galactose, fructose …), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose (arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan Chúng chỉ sử dụng được các loại đường ở dạng đồng phân D Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo ra cũng khác nhau

Dựa vào khả năng lên men lactic từ glucose, người ta chia vi khuẩn lactic làm hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình

- Lên men lactic đồng hình:

Lên men đồng hình là quá trình lên men trong đó có các sản phẩm acid lactic tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ acid acetic, acetol, di-acetiyl Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6  2CH3CHOHCOOH + 21,8.104J Con đường Glycolysis hay con đường EMB (Embden-Meyerhof-Parnas

pathway) được sử dụng bởi hầu hết các LAB (ngoại trừ Leuconostocs, nhóm III

Lactobacilli, Oenococci và Weissellas) tạo ra fructose-1,6-diphosphate (FDP) và

nhờ FDP aldolase để tiếp tục chuyển thành dihydroxyacetonephosphate (DHAP) và glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) đối với những chất có mức phosphoryl hóa ở 2

vị trí, sau đó tạo thành pyruvate Trong điều kiện có nhiều đường và hạn chế oxy, pyruvate bị khử thành acid lactic bởi lactate dehydrogenase (nLDH) và NAD+, do

đó NADH đã được oxy hóa trước đó, khi thế oxy hóa khử được cân bằng, sản phẩm cuối cùng được tạo ra chủ yếu là acid lactic và quá trình này được gọi là lên men lactic đồng hình

- Lên men lactic dị hình

Một số con đường lên men khác như: con đường pentose phosphate, con đường pentose phosphoketolase pathway, con đường hexose monophosphate, con đường 6-phosphogluconate Đặc điểm của con đường này là sự khử hydro ngay từ bước đầu tạo 6-phosphogluconate Theo sau đó là sự tách carbon tạo pentose-5-phosphate và tiếp tục chuyển hóa thành glyceraldehyde-3-phosphate (GAP) và acetyl phosphate GAP được tạo thành tương tự như trong con đường glycolysis và kết quả là tạo ra acid lactic Trong điều kiện không có mặt của các chất nhận điện

tử, acetyl phosphate sẽ bị khử tạo thành ethanol thông qua CoA và acetaldehyde Khi quá trình này ngoài sản phẩm acid lactic còn tạo ra một lượng đáng kể các sản phẩm phụ như CO2, ethanol, acid acetic, acid succinic… thì nó được gọi là lên men lactic dị hình Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +

CO2

Trong đó, acid lactic chiếm khoảng 40%, acid succinic khoảng 20%, rượu etylic và acid acetic 10% các loại khí 20%… đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích lũy một lượng ít acid foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên men lactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình Theo quan điểm tiến hóa sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lactic đồng hình là hướng tiến hóa độc lập của lên men dị hình