Luận văn đánh giá khả năng tái sinh in vitro của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qua agrobacterium tumefaciens

luận văn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-


   -

NGUYỄN VĂN CỬU

ðÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA CÁC GIỐNG LÚA INDICA VÀ BIẾN NẠP GEN cryIAc VÀO LÚA THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số : 60.62.05

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ðỖ NĂNG VỊNH

HÀ NỘI - 2010

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả

Nguyễn Văn Cửu

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin g ửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới GS TS đỗ Năng Vịnh, Giám ựốc Phòng Thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp ựã tận tình chỉ dẫn và trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình

quá trình h ọc tập và công tác tại Viện Di truyền Nông nghiệp

Tôi xin bày t ỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong Bộ môn Di truyền giống ựã

chân thành c ảm ơn Ban Lãnh ựạo Viện đào tạo sau ựại học, Trường đại học

Nông nghi ệp Hà Nội ựã tạo ựiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành c ảm ơn cán bộ, ựồng nghiệp trong Phòng Thắ nghiệm

ựộng viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thắ

giúp ựỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống Sự tin

Tác giả

Nguyễn Văn Cửu

2.1 Cơ sở khoa học của xây dựng, ñánh giá khả năng tái sinh 4 2.1.1 Cơ sở khoa học của xây dựng và ñánh giá khả năng tái sinh 4 2.1.2 Cơ sở di truyền của công nghệ sinh học bảo vệ thực vật 4 2.1.3 Một số hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen 5

2.1.4 Những thay ñổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro 6 2.2 Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 8

2.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 8 2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 9 2.2.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA 10

2.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium

2.2.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật 12

2.2.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn

2.4 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 20

2.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 20

2.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể ñộc 23

2.6 Tình hình nuôi cấy mô lúa và chuyển gen vào lúa thông qua

3.2.2 Phương pháp ñánh giá khả năng tái sinh in vitro 39

3.2.3 Biến nạp gen cry1Ac thông qua vi khuẩn Agrobacterium

3.2.4 Phương pháp thu thập và phân tắch số liệu thống kê thu ựược 42

4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các phytohocmon (2,4D, BAP,

NAA) ựến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của

4.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp 2,4D và hỗn hợp axắt amin ựến

khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của giống lúa IR64 46 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp (BAP và NAA) ựến khả năng

tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64 49 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của ựiều kiện nuôi cấy ựến khả năng tạo

mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR 64 51 4.2 đánh giá khả năng tạo mô sẹo phôi hóa và tái sinh cây hoàn

chỉnh của các giống lúa indica trên môi trường và ựiều kiện tối

4.4 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen (mang gen cry1Ac) thông qua

4.5 Xác ựịnh sự tồn tại của gen chuyển trong hệ gen lúa sử dụng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ

RB- Right Border Biên bên phải

PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp

T-DNA (Transfer DNA) ðoạn DNA chuyển

Ti-plasmid (Tumor inducing

Vir (Virulence Region) Vùng gây ñộc

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các gen chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 18

2.3 Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica 28 3.1 Danh sách và kí hiệu giống lúa sử dụng trong nghiên cứu 33 3.2 Thông tin liên quan ñến hệ thống biến nạp 34 3.3 Bảng tổng hợp các môi trường sử dụng trong ñánh giá khả năng

3.4 Thành phần môi trường sử dụng trong chuyển gen lúa 38 3.5 Bố trí thí nghiệm ñánh giá khả năng tái sinh in vitro 39 3.6 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu 44 4.1 Ảnh hưởng của tổ hợp 2,4 D và hỗn hợp axit amin ñến khả năng

4.2 Ảnh hưởng của tổ hợp (BAP và NAA) ñến khả năng tái sinh cây

hoàn chỉnh thông qua mô sẹo của giống lúa IR64 49

43 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy ñến khả năng tạo mô sẹo và

tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR 64 51 4.4 Khả năng tạo mô sẹo phôi hóa của các giống lúa 53 4.5 Khả năng tái sinh cây của các giống lúa 54 4.8 Kết quả biến nạp gen thế hệ T0 giống IR64 59 4.9 Một số ñặc ñiểm nông sinh học cây lúa chuyển gen và cây ñối

DANH MỤC HÌNH

2.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật 12

3.1 Cấu trúc vector pCAMBIA 1300enh 35Smang gen cryIAc 35 4.1 Một số hình ảnh về tạo mô sẹo và tái sinh cây IR64 55 4.2 Một số hình ảnh tái sinh cây in vitro của một số giống lúa 56 4.3 Một số hình ảnh liên quan biến nạp gen cryIAc vào giống lúa IR64 58 4.4 Khẳng ñịnh các dòng lúa mang các gen chuyển thế hệ T0 bằng kỹ

thuật PCR sử dụng mồi ñặc hiệu khuếch ñại ñoạn gen cryIAc tạo

1 MỞ ðẦU

1.1 ðặt vấn ñề

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực quan

trọng nhất trên thế giới với hơn 3 tỷ người sử dụng hàng ngày Cây lúa ñược trồng chủ yếu ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới của các châu lục Trong ñó, khoảng 90 % diện tích lúa trồng trên thế giới thuộc về châu Á Khoảng 80 %

sản lượng lúa thế giới là của các giống indica Ở Việt Nam, lúa là cây lương

thực quan trọng nhất, chiếm hơn 60 % tổng sản lượng lương thực và ñược gieo trồng 3,96 triệu hecta - là cây có diện tích lớn nhất ở Việt Nam Do ñó, nghiên cứu về cây lúa ñã và ñang ñược quan tâm sâu sắc của nhiều nhà nghiên cứu

ðể ñảm bảo an ninh lương thực trong ñiều kiện dân số thế giới tăng nhanh hiện nay, cần khẩn cấp gia tăng sản lượng lúa gạo Trong ñiều kiện diện tích ñất, nguồn nước sử dụng cho nông nghiệp bị giảm ñi nhanh và yêu cầu giảm thiểu sử dụng hoá chất nông nghiệp, việc chọn tạo các giống lúa có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng kháng với sâu, bệnh, các tác nhân vô sinh ñang ñòi hỏi cấp thiết

Phương pháp chọn tạo giống truyền thống ñã thu ñược nhiều giống có năng suất cao, sử dụng trong cuộc cách mạng xanh Tuy nhiên, ñể tạo ra các giống mới bằng các phương pháp truyền thống thường mất 3- 4 năm Do ñó,

ñể tạo ra các giống lúa mới mang tính trạng mong muốn trong thời gian ngắn hơn, các phương pháp truyền thống cần kết hợp với những kết quả thu ñược

do phương pháp Công nghệ sinh học tạo ra

Việc tạo ra các giống cây trồng biến ñổi di truyền có khả năng kháng sâu, bệnh và côn trùng nhờ kỹ thuật chuyển gen thực vật ñang ñược quan tâm nghiên cứu và ứng dụng vào thực tiễn nhằm nâng cao năng suất và tính chống

chịu của cây trồng ựể ựem lại lợi ắch tối ựa cho nền nông nghiệp

Biến nạp gen là một trong các chiến lược quan trọng ựược sử dụng ựể ựưa gen phân lập từ cơ thể nào ựó vào cây trồng trong cùng hoặc khác loài, tạo ra những cây biến ựổi gen có tắnh trạng mong muốn Có 2 phương pháp chuyển gen ựang ựược áp dụng phổ biến hiện nay là dùng súng bắn gen và sử

dụng vi khuẩn Agrobacterium Tuy nhiên, chuyển gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium phổ biến hơn vì giá thành rẻ, thao tác ựơn giản, hiệu quả cao

Hiệu quả biến nạp gen lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố: phương pháp biến nạp, giống, mô sử dụng ựể biến nạp, thành phần môi trường nuôi cấy, chất ựiều hòa sinh trưởng, và ựiều kiện tái sinh cây (Ge và cs., 2006) Nhiều

nghiên cứu ựã chỉ ra ở các giống lúa indica hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây in vitro thấp hơn ở các giống japonica và phụ thuộc ựáng kể vào từng

giống (Amin và cs., 2004; Khanna H K và cs.,1999) Do ựó, ựể tăng hiệu

quả tạo mô sẹo và tái sinh cây cần thiết tối ưu hóa môi trường nuôi cấy cho các giống

Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu lương thực chủ lực trên thế giới để duy trì ưu thế cạnh tranh và tăng cường sản lượng, năm 2006, Chắnh phủ Việt Nam ựã phê duyệt chương trình trọng ựiểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn ựến năm 2020 Tầm nhìn ựến 2020, diện tắch trồng trọt các giống cây trồng mới tạo ra bằng các kỹ thuật của công nghệ sinh học chiếm trên 70 % Trong

ựó, diện tắch trồng trọt các giống cây trồng biến ựổi gen chiếm 30- 50 % (Website http: //.www bonongnghiepvaphattriennongthon )

Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu ựề tài: Ộđánh giá khả năng tái sinh in vitro

của các giống lúa indica và biến nạp gen cryIAc vào lúa thông qua Agrobacterium tumefaciensỢ

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Ớ Chọn ựược môi trường thắch hợp và tối ưu các ựiều kiện nuôi cấy ựể tạo mô sẹo và tái sinh cây giống lúa IR64

Ớ đánh giá ựược khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các giống lúa

indica trên môi trường và ựiều kiện nuôi cấy ựã tối ưu cho giống lúa IR64

Ớ Bước ựầu nghiên cứu tạo cây lúa indica biến nạp mang gen cryIAc kháng sâu thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

1.3 Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các phytohocmon (2,4-D, BAP, NAA) ựến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64

 Nghiên cứu ảnh hưởng của ựiều kiện nuôi cấy (nhiệt ựộ, ánh sáng,Ầ) ựến khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của giống lúa IR64

 đánh giá khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây hoàn chỉnh của các

giống lúa indica trên môi trường và ựiều kiện ựã tối ưu cho giống lúa IR64

 Nghiên cứu tạo cây lúa chuyển gen (mang gen cryIAc) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

 Xác ựịnh sự hợp nhất của gen chuyển trong hệ gen lúa sử dụng kỹ thuật PCR

1.4 địa ựiểm nghiên cứu

Phòng Thắ nghiệm trọng ựiểm Công nghệ tế bào thực vật Ờ Viện Di

truyền Nông nghiệp

Thời gian nghiên cứu: 15 / 06 / 2009 ựến 15 / 08 / 2010

1.5 Ý nghĩa khoa học

đề tài xây dựng nền tảng nuôi cấy tái sinh in vitro phục vụ cho chiến

lược chuyển gen vào các giống lúa indica thông qua mô sẹo Bước ựầu nghiên

cứu tạo cây lúa chuyển gen kháng sâu, từng bước chọn tạo ra giống lúa mới

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học của xây dựng, ựánh giá khả năng tái sinh

2.1.1 Cơ sở khoa học của xây dựng và ựánh giá khả năng tái sinh

Việc xây dựng và ựánh giá khả năng tái sinh của cây trồng có thể thực

hiện ựược nhờ vào tắnh toàn năng của tế bào thực vật

Tắnh toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của các tế bào ựã ựược biệt hóa (trừ một số loại tế bào ựã biệt hóa sâu như ống mạch, mao dẫnẦ) có khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và trong ựiều kiện phù hợp có thể phát triển phôi dẫn ựến việc hình thành cây hoàn chỉnh mới

Trong một cơ thể thực vật bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong ựó có nhiều loại tế bào khác nhau thực hiện các chức năng khác nhau Các mô có cấu trúc chuyên môn nhất ựịnh là nhờ sự phân hóa Phân hóa

tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hóa, ựảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Trong ựiều kiện thắch hợp, các tế bào phân hóa có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và lại phân chia mạnh mẽ Quá trình này gọi là quá trình phản phân hóa

đánh giá khả năng tái sinh của các giống cây trồng có thể ựược tiến

hành dựa trên việc xây dựng một hệ thống tái sinh in vitro có hiệu quả tái sinh

cao từ một giống ựiển hình

2.1.2 Cơ sở di truyền của công nghệ sinh học bảo vệ thực vật

Cơ sở di truyền của công nghệ sinh học bảo vệ thực vật là dựa trên lý

thuyết gen ựối gen Theo đỗ Năng Vịnh (2002), Flor (1942) là người ựầu tiên

nghiên cứu cơ chế di truyền của khả năng ựề kháng ở chủ thể (cây chủ) và khả năng gây bệnh của thể gây bệnh Tổ hợp thể chủ và thể gây bệnh ựược

nghiên cứu là cây gai Linum usitatissimum và nấm bệnh Melampsora lini Kết

quả của công trình này ñưa ñến sự phát hiện ra tương quan gen ñối gen giữa

sức ñề kháng của cây chủ và sức gây hại của thể gây bệnh Từ ñó hình thành

lý thuyết gen ñối gen cho rằng ñối với mỗi gen ñiều khiển tính ñề kháng ở thể chủ thì lại có một gen tương ứng ñiều khiển gây hại ở thể gây hại

Từ nghiên cứu này có thể tổng quát rằng: tính kháng bệnh của cây chủ và sự mất khả năng gây bệnh của thể gây bệnh hoặc sự mất khả năng gây hại của côn trùng có thể ñược quy ñịnh bởi gen trội không hoàn toàn hoặc gen lặn hoặc một vài gen có khả năng làm thay ñổi tính kháng của cây

Nghiên cứu di truyền tập trung vào tính ñặc hiệu trong tương tác giữa giống cây trồng và thể gây bệnh, thể gây hại Sự nhận biết ñặc hiệu giữa cây chủ và thể gây hại dẫn ñến sự hoạt hóa các gen tự vệ của cây, các gen này tham gia vào sinh tổng hợp phytoalexin của cây chủ hoặc tham gia vào quá trình biến ñổi thành tế bào hoặc mã hóa các enzym thủy phân ñộc tố của nấm, hoặc bản thân các gen ñược biến nạp vào cây chủ sản sinh ra protein tinh thể ñộc tố nhằm khống chế sinh vật gây hại…Kết quả là tạo ra cây trồng có ñặc tính mới chống lại thể gây hại (ðỗ Năng Vịnh, 2002)

2.1.3 Một số hệ thống tái sinh sử dụng cho biến nạp gen

Các phương pháp chuyển gen vào các tế bào hay mô, yêu cầu mô và tế bào ñó phải có khả năng tái sinh thành cây thì biến nạp gen ñược thực hiện mới có ý nghĩa Vì vậy, khả năng tái sinh cao là ñiều kiện quan trọng ñể thực hiện thành công biến nạp gen với hiệu quả cao

Một số hệ thống nuôi cấy thường ñược sử dụng:

- Nuôi cấy phân hóa gồm: Nuôi cấy ñỉnh sinh trưởng và chồi bên; nuôi cấy tạo chồi bất ñịnh và nuôi cấy tạo phôi vô tính ðây là những phương pháp dựa trên cơ sở nuôi cấy mô, từ các cơ quan xác ñịnh có sự phân hóa hình thành nên các cơ quan mới

- Nuôi cấy không phân hóa: từ các mô, cơ quan nuôi cấy sẽ tạo nên các

khối tế bào vô tổ chức, không có hình dạng nhất ñịnh, gọi là mô sẹo (hay callus) Ở môi trường thích hợp, mô sẹo ñược nuôi cấy ñể tăng sinh khối

• Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức ñộ cấu trúc di truyền thấp, chưa phân hóa, phân chia một cách hỗn loạn và có tính

biến ñộng di truyền cao Mô sẹo thu ñược bằng nuôi cấy in vitro các cơ quan

của thực vật như thân, lá, hạt, phôi non trong môi trường nuôi cấy thích hợp

Mô sẹo có thể ñược duy trì liên tục trên môi trường nuôi cấy bằng cách cấy chuyển ñịnh kì

• Nuôi cấy tế bào huyền phù

• Nuôi cấy tế bào trần

Tuy nhiên, nhằm mục ñích xây dựng hệ thống tái sinh và ñánh giá khả năng tái sinh cây phục vụ chuyển gen, chúng ta cần nghiên cứu ñến khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển gen trên môi trường chọn lọc Do vậy, hệ thống nuôi cấy mô sẹo thích hợp hơn cả vì hệ thống cho tỷ lệ tái sinh cây cao; thời gian nuôi cấy không quá dài; thao tác nuôi cấy ñơn giản Tái sinh cây qua con ñường mô sẹo có thể hình thành phôi hay tái sinh tạo chồi trực tiếp Cây tái sinh từ phôi soma xuất phát từ một tế bào ñơn, riêng lẻ và phát triển thành một cây hoàn chỉnh nên duy trì ñược tính ñồng nhất của hệ gen, do vậy hạn chế hiện tượng khảm ở cây chuyển gen (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998)

2.1.4 Những thay ñổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy in vitro

Hiện tượng phổ biến xảy ra trong nuôi cấy mô in vitro là biến dị tế bào

soma Căn cứ vào quy luật của Vavilop, trong những ñiều kiện môi trường giống nhau có thể quan sát thấy các biến dị di truyền giống nhau ở các loài gần nhau về phân loại Nguyên nhân cơ bản dẫn ñến các biến dị (ñột biến) xảy

ra trong tế bào nuôi cấy in vitro:

- Tế bào chịu tác ñộng trực tiếp của các chất hóa học trong môi trường nuôi cấy

- Trong ñiều kiện in vitro, các gen di ñộng (tranposon) hay còn gọi là

các “gen nhảy” hoạt ñộng rất mạnh Hoạt ñộng của các gen nhảy phụ thuộc vào kiểu gen và ñiều kiện môi trường Trong nuôi cấy mô, các gen này di chuyển tích cực, nó có thể cài vào bất kì gen nào trên nhiễm sắc thể (NST) và gây ra tần số ñột biến rất cao

Orton (1984) cho biết trong thời gian nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng, hệ gen của các tế bào thực vật ñã trải qua quá trình cải tổ nhanh chóng

và ñã phát hiện những thay ñổi số lượng, cấu trúc NST, ñột biến gen Tần số ñột biến gen nhiều khi rất cao (10-2 – 10-1) tính theo locus trên cây Thay ñổi

di truyền phổ biến xảy ra trong tế bào nuôi cấy là ña bội thể Sau khi mô ñược nuôi cấy, nhân tế bào có thể xảy ra quá trình nội phân làm số lượng NST tăng lên gấp ñôi hoặc hơn nữa nhưng không xảy ra phân chia tế bào Kết quả số lượng NST của tế bào tăng lên (ðỗ Năng Vịnh, 2002)

 ðột biến di truyền trong nuôi cấy mô lúa:

ðột biến tế bào soma ñã ñược phát hiện bởi nhiều công trình nuôi cấy

tế bào lúa Nhà khoa học Nhật Bản Oono (1978) ñã tái sinh cây qua mô sẹo có nguồn gốc từ hạt của cây nhị bội ñồng hợp gồm 75 hạt và ñã chứng minh ñầy sức thuyết phục về sự tồn tại của ñột biến tế bào soma và di truyền ñột biến của nó Phổ biến dị di truyền rộng ñã quan sát thấy ở các ñặc ñiểm như ñộ hữu thụ của hạt, chiều cao cây, thời gian trỗ ðột biến sắc tố thấy ở 8,4 % số dòng Phân tích cây tái sinh từ mô sẹo cho biết ña số các biến ñổi di truyền xảy ra trong quá trình nuôi cấy Phân tích di truyền cho thấy ñột biến xảy ra ở năm tính trạng và biểu hiện với tần số 0,03 – 0,7% trên một lần phân bào (Oono, 1978) Fukui (1983) ñã nhận ñược 12 cây tái sinh qua mô sẹo có nguồn gốc từ 1 hạt lúa, trong ñó ñã tách ñược các ñột biến khác nhau như ñột biến chín sớm, bạch tạng, ñột biến thấp cây và bất dục (Fukui, 1983) Dabarth (1983) cũng nhận ñược các dạng ñột biến lúa có ý nghĩa thực tiễn từ một mô

sẹo ban ựầu Tần số ựột biến tỷ lệ thuận với tuổi mô sẹo (đỗ Năng Vịnh, 2002)

Các công trình nghiên cứu ở trên chứng tỏ tấn số ựột biến cao và phổ biến dị rộng trong nuôi cấy mô lúa có ý nghĩa quan trọng ựối với chọn giống Phân tắch ựa hình ựộ dài ựoạn phân cắt DNA ở các cây lúa tái sinh từ nuôi cấy

mô cho thấy 23 % số cây tạo ựược từ nuôi cấy in vitro dài hạn ựã thể hiện các

biến ựổi trong cấu trúc DNA, so với 6,3 % cây tái sinh từ nuôi cấy ngắn hạn Như vậy, thời gian nuôi cấy tế bào kéo dài ở trạng thái chưa phân hóa là một yếu tố quan trọng làm phát sinh các ựột biến gen và sau ựó thể hiện ựột biến ở kiểu hình cây tái sinh (đỗ Năng Vịnh, 2005)

2.2 Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật

2.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens (A tumefaciens) là vi khuẩn gây bệnh cây

sống trong ựất, có khả năng xâm nhiễm thực vật, kắch thắch tạo khối u ngay

tại các vết thương của cây chủ Trong tự nhiên, A tumefaciens chủ yếu tấn

công cây hai lá mầm, ựặc biệt là nhóm thực vật có hoa Hoàn toàn khác với

mô và tế bào thực vật bình thường, khối u do A tumefaciens sinh ra phát triển

rất mạnh ngay trong ựiều kiện thiếu hoocmon sinh trưởng (auxin và

cytokinin) đó là do A tumefaciens ựã chuyển một ựoạn T-DNA (Transfer

DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA ựiều khiển quá trình sinh tổng hợp các các chất ựó Ngoài ra, các khối u cũng sinh tổng hợp các opin là các axit amin, ựặc biệt là các dẫn xuất của ựường Dạng opin ựược tổng hợp có thể là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin phụ thuộc vào từng

chủng A tumefaciens Trong ựó, octapin và nopalin là hai dạng opin phổ biến

Opin ựược vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn cacbon và nitơ nhờ hoạt ựộng của gen chuyển hóa opin trên plasmid gây khối u thực vật (Tumor inducing plasmid - Ti-plasmid) (Brock và cs., 1991; Hooykaas và cs., 1992) Cơ chế

phân tử của sự hình thành khối u ñã ñược quan tâm nghiên cứu nhằm tìm ra một phương thức phòng bệnh cho cây Khi phát hiện ra Ti-plasmid và khả năng tự chuyển T-DNA vào genom thực vật, người ta ñã ñặc biệt chú ý và khai thác khả năng sử dụng chúng như một vectơ tự nhiên ñể chuyển các gen quan tâm vào thực vật nhằm tạo cây trồng mang những tính trạng mong muốn

(Võ Thị thương Lan, 2006)

2.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid ñược phát hiện ở tất cả các chủng A tumefaciens gây nhiễm

và tồn tại bền vững ở nhiệt ñộ dưới 300C ðây là một phân tử DNA dạng mạch vòng, sợi kép và tồn tại trong tế bào như một ñơn vị sao chép ñộc lập,

có kích thước khoảng 200 kilo base (kb) Phân tích di truyền cho thấy, plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùng tương ñồng, trong ñó vùng T-DNA và vùng gây ñộc (Virulence Region-vùng Vir), liên quan trực tiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Vùng gây ñộc có chứa các gen mã hóa các protein/enzyme Vir Có 9 loại protein Vir là A, B, C,

Ti-G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H, J/AcvB Các protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA sang tế bào thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA ñược chuyển từ vi khuẩn sang hệ gen của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong ñó Tuy nhiên, vùng này lại không mã hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA

mà cần có sự trợ giúp ñặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi khuẩn Vùng VIR dài khoảng 40 kb ñảm nhiệm chức năng gây nhiễm Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng VIR chứa tới 24 gen gây ñộc Sản phẩm protein do các gen này mã hóa ñã kích thích sự tách biệt T-DNA, bao bọc, che chở và giúp chúng tiếp cận với hệ gen cây chủ (Hooykaas

P J J và Schilpert R A., 1992)

Hình 2.1 Bản ñồ Ti- plasmid dạng octopin

2.2.3 Cấu trúc và chức năng của các ñoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho thấy, T-DNA ñược giới hạn bởi một ñoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ khoảng 25 base pair (bp) và gọi là ñoạn biên Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật Ở ñoạn biên bên phải (Right border- RB) có yếu tố ñiều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-DNA ðoạn bên trái (Left border- LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu ñể quá trình này kết thúc bình thường (Lê Thị Thu Hiền, 2003; Narasimhulu và cs., 1996)

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-DNA xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một ñoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T- DNA là một ñoạn gen liên tục dài 13 kb T-DNA mang rất nhiều gen như: (1) các gen mã hóa những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u như tms1, tsm2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan ñến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin (Hooykaas và cs., 1992)

2.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium

tumefaciens

Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hóa học dẫn dụ vi

khuẩn như: Acetosyringon, Hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng của các

hợp chất này, A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và

chuyển T-DNA vào tế bào thực vật Quá trình này ựược sự trợ giúp ựặc biệt của các gen Vir và RB, LB (Võ Thị Thương Lan, 2006) Cũng chắnh các hợp chất này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng Vir hoạt ựộng và tăng cường biểu hiện

Hoạt ựộng của các gen Vir sinh ra sợi ựơn T-DNA làm xuất hiện bản sao sợi bên dưới của T-DNA Chỉ ựoạn sợi ựơn DNA giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T-DNA mới ựược chuyển vào tế bào thực vật, và ựược gắn

vào hệ gen của tế bào đó là yếu tố hoạt ựộng cis của hệ thống vận chuyển

T-DNA Protein Vir D1, D2 ựóng vai trò là chìa khóa trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T-DNA và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên điểm cắt là ựiểm ựầu và kết thúc của sợi tái sinh Sau ựó, protein Vir D2 vẫn còn gắn kết với ựầu cuối 5Ỗ của sợi T-DNA và tế bào thực vật Nếu gây ựột biến hay loại

bỏ ựọan RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T-DNA, còn nếu ựột biến LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T-DNA (Hill J và cs., 1983) điều ựó chứng tỏ tổng hợp sợi T-DNA là từ ựầu 5Ỗựến 3Ỗ, ựược bắt ựầu từ ựoạn RB và kết thúc ở LB

Sau khi T-DNA qua màng tế bào chúng ựi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật, bắt ựầu hoạt ựộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn ựến sự hình thành khối u

Hình 2.2 Quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

2.2.5 Tương tác giữa T-DNA và genome tế bào thực vật

Trong tế bào thực vật, phức ss-T-DNA ñược ñưa qua màng nhân vào nhân Hai protein ñóng vai trò quan trọng trong bước này là Vir D2 và Vir E2 Tín hiệu ñịnh vị trong nhân của Vir D2 và Vir E2 ñóng vai trò chủ yếu Protein Vir D2 có chức năng xác ñịnh vị trí cho T-DNA trong nhân Phức ss-T-DNA là phức nucleoprotein lên ñến 20 Kb chứa một ñầu 5’ gắn với protein Vir D2 Nhưng phức ñược bao bọc bởi số lượng lớn phân tử Vir E2 (xấp xỉ 600/ 20 kb T-DNA) và mỗi phức này có hai tín hiệu ñịnh vị trong nhân Hai tín hiệu này của Vir E2 ñóng vai trò quan trọng ñối với việc nhận liên tục phức T-DNA của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân Khả năng nhận phức của nhân ñược ñiều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu ñịnh vị ñặc trưng trong nhân, protein ñược tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật (Gustavo A ,1998)

Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-DNA là sự tương tác trong genom tế bào thực vật Các phản ứng trong sự tương tác T-DNA không

có tính ñiển hình Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật Theo cách nhìn nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, ñược

cần ñến ñối với bước lặp lại giữa cặp vận chuyển T-DNA với Vir D2 và DNA thực vật Sự tương ñồng này rất thấp và cung cấp ñặc trưng nhỏ nhất ñối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác ñịnh vị trí của Vir D2 ñể gắn kết Ở trình tự gần

kề hay ñầu 3’ của T-DNA tìm thấy một vài sự tương ñồng nhỏ với DNA thực vật, kết quả ở sự tương tác ñầu tiên giữa sợi T-DNA và DNA thực vật là tạo

lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của DNA thực vật Sau ñó DNA thực vật ñược cắt ở vị trí ñầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit của ñầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit của ñầu 5’ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit trong ñầu sợi (5’-3’) DNA thực vật Phần 3’ nhô ra của T-DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị phân hủy bởi endonuclease hay 3’-5’ enxonuclease ðầu 5’ của T-DNA gắn với Vir D2 còn ñầu 3’ kia cặp ñôi với DNA thực vật kéo dài từ bước ñầu của quá trình tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật Sự ñưa vào của sợi T-DNA trong sợi 3’-5’ của DNA thực vật ñược bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi ñối ngược ñược sản sinh

Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi

bổ sung ñược tổng hợp sử dụng ñể chèn dễ dàng sợi T-DNA như là sợi khuôn Vir D2 có vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T-DNA vào nhiễm sắc thể thực vật Phóng thích protein Vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa ñựng trong các liên kết phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit ñầu tiên của sợi T-DNA, qui ñịnh ñầu 5’ của sợi T-DNA không còn (Tinland B và cs., 1995) Ngoài ra, quá trình chuyển T-DNA còn có sự tương tác với các protein

do gen trên nhiễm sắc thể của A tumefaciens quy ñịnh và protein trong tế bào

thực vật

2.2.6 Một số phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens

Kể từ khi vai trò của A tumefaciens ñược phát hiện và nghiên cứu thì

chúng ñã trở thành công cụ chuyển gen hữu hiệu vào thực vật Phương pháp biến

nạp gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens gồm có 2 hệ thống chính

2.2.6.1 H ệ thống chuyển gen in vitro

Khó khăn chính trong việc xây dựng hệ thống chuyển gen in vitro là phải có ñược sự kết hợp giữa sự xâm nhiễm của A tumefaciens và khả năng

tái sinh của các tế bào sau khi lây nhiễm với vi khuẩn (Birch R G., 1997)

Một số trợ giúp kỹ thuật trong quá trình biến nạp ñã cải thiện hiệu quả

của hệ thống chuyển gen in vitro nhờ A tumefaciens bao gồm:

X ử lý sóng siêu âm

Xử lý một thực vật với A tumefaciens trong ñiều kiện sóng siêu âm tạo

ra các tổn thương nhỏ, ñồng nhất ở mô thực vật, cho phép A tumefaciens dễ

dàng xâm nhập vào tế bào thực vật Bằng phương pháp này ñã cải thiện rõ rệt

hiệu quả chuyển gen, biểu hiện gus tạm thời ñã tăng từ 100 lên 1400 lần ở các

tế bào ñậu tương, ñậu ñũa, lúa mỳ và ngô (Trick H N., 1997)

Ly tâm t ế bào

Phương pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens kết hợp với ly tâm

ñã ñược áp dụng thành công khi biến nạp vào huyền phù tế bào phôi hóa nhận ñược từ hoa chuối ñực nuôi cấy in vitro của hai giống chuối thương mại Cavendish và Lady Finger Tần số chuyển gen ñã ñược cải thiện ñáng kể bằng cách áp dụng chế ñộ ly tâm tế bào thực vật trong quá trình nuôi cấy cộng sinh với vi khuẩn (Khanna H và cs., 2004)

2.2.6.2 H ệ thống chuyển gen in vivo

Phương pháp này dựa trên cơ sở của việc chuyển gen vào nguyên cây

(in planta) và rất phổ biến ñối với loài A thaliana, một trong những loài cây

mô hình ñối với các nghiên cứu về di truyền học Phương pháp chuyển gen này tốn ít thời gian, bỏ qua công ñoạn nuôi cấy mô và tái sinh sau biến nạp, vì thế loại bỏ ñược các biến dị soma và số lượng cây chuyển gen thu ñược lớn hơn Kỹ thuật này ñã ñược mô tả ở các cây trồng khác nhau như ñậu tương,

Arabidopsis, hoa hướng dương và cây lạc (Rohini V K., 2000) Hệ thống

chuyển gen in vivo sử dụng một số phương pháp sau:

Ph ương pháp chuyển gen vào hạt

Ph ương pháp ngâm cụm hoa

Ph ương pháp thấm lọc chân không

2.3 Hệ thống vector biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens

Ti-plasmid của A tumefaciens ñã ñược nghiên cứu cải biến như cắt bỏ

các gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng tạo dòng ña năng, tạo hai hệ thống vector chuyển gen hiệu quả như vector hai nguồn (binary vector) và vector liên hợp (co intergrate vector) (Walkerpeach và cs., 1994) Nhờ vậy, cây trồng ñược biến nạp Ti-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và phát triển bình thường (Hajdukiewicz

và cs., 1994)

2.3.1 Hệ vector hai nguồn

Nghiên cứu gần ñây của Zhao và Ranch (2006) ñã thành công trong việc chuyển gen sử dụng hệ thống vector mới: vector liên hợp hai nguồn Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không cần nằm trên cùng một plasmid với vùng T-DNA mà vẫn ñiều khiển ñược sự chuyển và xâm nhập của T-DNA vào hệ gen thực vật, người ta ñã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector hai nguồn trong ñó vùng T-DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau

nhưng trong cùng một chủng A tumefaciens (Zhao và Ranch, 2007)

Có hai loại vector ñược sử dụng trong hệ thống vector hai nguồn:

(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có

phổ vật chủ rộng với ñoạn T-DNA ñược cắt bỏ hết các gen không cần thiết ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra cấu trúc mới: i) các ñơn vị sao chép ñể DNA plasmid có thể vừa tự nhân trong cả

E coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen chỉ thị; iii) vùng có chứa

nhiều ñiểm cắt của các enzyme giới hạn (vùng tạo dòng ña năng nằm ở giữa

hai trình tự biên trái và biên phải ñể chèn gen mong muốn

(b) Vector bổ trợ: nằm trong A tumefaciens, với toàn bộ vùng Vir ñược

giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB Plasmid này ñược cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật

Hai cấu trúc này cũng ñược ñưa vào A tumefaciens, khi các gen trên

vector bổ trợ hoạt ñộng thì các sản phẩm của nó sẽ tác ñộng tới ñoạn T-DNA trên vector chuyển gen dẫn ñến sự chuyển ñoạn T-DNA sang tế bào thực vật Quá trình biến nạp ở vectơ hai nguồn diễn ra như sau: (i) Plasmid nhỏ ñược

nhân lên trong E coli, sau ñó ñược chuyển trực tiếp hoặc qua quá trình tiếp hợp vào tế bào A tumefaciens ñể chuyển T-DNA vào hệ gen thực vật; (iii) chọn

lọc tế bào thực vật trong những ñiều kiện thích hợp (Amstrong , 1991)

Thực tế cho thấy, plasmid với hai ñơn vị sao chép có thể không bền vững

trong E coli khi cả hai vùng này cùng hoạt ñộng Tuy nhiên, vector hai nguồn

có một số ưu ñiểm như: (i) Không xảy ra quá trình tái tổ hợp giữa các plasmid; (ii) Kích thước của vector khá nhỏ Nhờ vậy, hiệu quả quá trình

chuyển gen từ E coli sang A tumefaciens ñã tăng lên

2.3.2 Hệ vector liên hợp

Vector liên hợp ñược xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương

ñồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E coli) với vùng T-DNA

trên Ti-plasmid của A tumefaciens Trong ñó, người ta giữ lại vùng Vir, loại

bỏ vùng mã hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những ñoạn DNA mới trong Ti-plasmid (hình 2.3)

Hình 2.3: Sơ ñồ cấu trúc vector liên hợp

Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:

(a) Ti-plasmid: các gen gây khối u ñã bị thay bởi gen kháng kanamycin

của vi khuẩn (Hệ thống vector SEV) hoặc một ñoạn trình tự của vector pBR322 (Hệ thống vector pGV)

(b) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và

ñược bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid Chúng ñược nhân lên

trong E coli và chuyển sang A tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp Do không thể sao chép trong A tumefaciens nên chúng mang những ñoạn tương ñồng

với T-DNA

(c) Vector trợ giúp: tồn tại trong E coli, có kích thước nhỏ, chứa các

gen di ñộng (mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển

vào A tumefaciens (Walkerpeach ,1994)

2.3.3 Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vector

biến nạp

Việc xem xét tính hữu hiệu của vector chuyển nạp cần chú ý ñến việc chọn gen chỉ thị phù hợp cho chọn lọc các sản phẩm chuyển gen và có tác dụng trong sự phối hợp với các quy trình nuôi cấy mô và tế bào Có hai loại chỉ thị chọn lọc ñó là chỉ thị chọn lọc di truyền và chi thị chọn lọc sinh hóa

2.3.3.1 Các gen ch ỉ thị chọn lọc di truyền

Bảng 2.1 là danh mục các chỉ thị chọn lọc di truyền ñã và ñang ñược sử dụng phổ biến hiện nay trong quá trình biến nạp gen Việc chọn các gen chỉ thị di truyền cần chú ý một số yêu cầu: thứ nhất là chất chọn lọc ức chế sinh trưởng các tế bào không ñược biến nạp; thứ hai là sự thể hiện của gen chọn lọc không ảnh hưởng tới trao ñổi chất của các tế bào chuyển nạp; thứ ba là sự thể hiện của gen chọn lọc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng của chất chọn lọc và cho thấy rõ ràng sự khác nhau về sinh trưởng giữa tế bào ñược chuyển nạp và

tế bào không ñược chuyển nạp, thứ tư là không ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây hoàn chỉnh tạo ñược từ cây chuyển gen

Bảng 2.1: Các gen chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen

Gen chỉ thị Chất trao ñổi chất ñối kháng Tài liệu tham khảo

NptII Aminoglycoside Bevan và cs.,1983

Gent Gentamycin Hayford và cs., 1988

Bleo Bleomycin Hille và cs.,1986

str/spc Streptomycin, spectinomycin

(Nguồn trích dẫn: Tạ Kim Nhung, 2009)

Ngoài ra ñể ñảm bảo mức ñộ an toàn sinh học ñối với những cây trồng biến ñổi gen, một số hệ thống chọn lọc tích cực (positive selection system) ñang ñược sử dụng nhằm thay cho các gen kháng sinh và kháng thuốc diệt cỏ

Các gen này như: isopentyl transferasr (ipt) (Sugita và cs., 1994) và gen tăng

trưởng rễ (root proliferation-rol gen system) (Puddephat và cs., 2001) thuộc

hệ thống biến dưỡng hocmon sinh trưởng; xylose isomerase (xylA) (Haldrup

và cs., 1998) và phosphomanose isomerase (pmi) (Joersbo M., 1996) thuộc hệ thống biến dưỡng ñường Tế bào thực vật ñược chuyển gen pmi có khả năng

biến dưỡng mannose 6-phosphate thành fructose 6-phosphate, dạng ñường ñược hấp thụ bởi tế bào thực vật Hệ thống chọn lọc bằng mannose ñã ñược

sử dụng thành công trong chuyển gen cho lúa (Hille Và komari , 2006), lúa

mì và ngô (Wright và cs., 2001)

2.3.3.2 Các gen thông báo ch ỉ thị sinh hóa

ðể phân biệt thể chuyển gen, các nhà nghiên cứu ñã ñưa vào các gen thông báo ñược ñiều khiển bởi chuỗi khởi ñộng ñặc thù của thực vật và sản phẩm của các gen này có thể phân tích bằng con ñường sinh hóa Một gen thông báo thực vật lý tưởng cần có một số ñặc ñiểm như sản phẩm của nó là ñộc nhất và không ñộc ñối với tế bào thực vật chủ; các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn ñịnh cao; có các phương pháp phân tích sản phẩm của gen thuận tiện rẻ tiền, nhạy và ñặc thù, có khả năng kết hợp với các polypeptide bên ngoài mà vẫn giữ ñược hoạt tính của enzym Một số gen thông báo chỉ thị sinh hóa ñược thể hiện trong Bảng 2.2

Bảng 2.2: Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa

Sinh hóa

gus (Ecoli uidA) βεσαδινορυχυλγ − Jefferson và cs.,1987

gus cải tiến α-glucuronidase Vancanneyt và cs.,1990

GUS::NPT

lac (Ecoli lacZ) βεσαδινορυχυλγ− Helmer và cs.,1984

Phosphotransferase

Lux Luciferase (P.pyralis) Ow và cs.,1986

Luciferase (vibrio spp.) Boylan và cs., 1991 (Nguồn trích dẫn: Tạ kim Nhung, 2009)

2.4 Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry

2.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) có thể tìm thấy ở nhiều nơi như ñất rừng, bụi cát, phân dơi, nước biển, xác chết côn trùng Bt là vi khuẩn hiếu khí,

hình que, gram dương, có khả năng hình thành bảo tử trong ñiều kiện môi trường bất lợi và sản sinh protein tinh thể ñộc ở dạng ngoại bào (a, b, γ exotoxin) và nội bào (δ-endotoxin) Trong ñó, δ-endotoxin là một họ protein tinh thể ñộc chính Mặc dù ñược coi là thuốc trừ sâu vi sinh hiệu quả, một số hạn chế nhất ñịnh về phương diện sinh học như thời gian ảnh hưởng ngắn, không tiếp xúc ñược với côn trùng ẩn sâu dưới lá, ñất, ñã phần nào giảm mức

ñộ sử dụng chế phẩm Bt Những ñiểm bất lợi này hoàn toàn bị loại trừ khi

chuyển và biểu hiện gen cry vào cây trồng (Tạ Kim Nhung, 2009)

Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens ñược sử

dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật So sánh với các phương pháp chuyển gen trực tiếp như súng bắn gen, xung ñiện, PEG (polyethylene glycol), vi tiêm thì phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua

Agrobacterium cho hiệu quả hơn như:

- Số bản sao của gen ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp Do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao

- Tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm

- Kỹ thuật ñơn giản dễ thực hiện

Vi khuẩn A tumefaciens là một loài vi khuẩn ñất thuộc vi khuẩn gram

âm Nó là nguyên nhân gây các bệnh khối u (crown gall) cho cây Vi khuẩn A

(Ti) vào nhân của các tế bào mắc bệnh, nơi mà nó tương tác với gen vật chủ ðoạn T-DNA có chứa hai loại gen: gen ñột biến gây bệnh ung thư mã hóa các enzym tham gia tổng hợp auxin, cytokinin và phản ứng hình thành khối u; các gen mã hóa cho tổng hợp các opine, một sản phẩm kết quả từ quá trình cô ñặc giữa các amino axit và ñường, nó ñược sản xuất và tiết ra ở khối u, ñược sử

dụng như nguồn cacbon và nitơ của A tumefaciens Bên ngoài T-DNA, vị trí

các gen tổng hợp opine dị hóa, các gen tham gia vào quy trình chuyển T-DNA

từ các tế bào vi khuẩn vào tế bào cây trồng và vào các tế bào vi khuẩn - tế bào

vi khuẩn plasmid kết hợp các gen chuyển

Chủng vi khuẩn A tumefaciens chứa một plasmid lớn (hơn 200 kb), có

vai trò chính sinh ra khối u (Tumour induction - Ti) và ñược ñặt tên Ti

plasmid Vùng vir mang các gen mã hóa cho các protein gây ñộc có kích

thước khoảng 30 kb và có 6 operon cần thiết cho quá trình chuyển T-DNA

vào hệ gen thực vật (vir A, vir B, vir D, vir C, vir E và vir G)

Quá trình chuyển T-DNA vào hệ gen của tế bào thực vật gồm ba sự kiện quan trọng:

• Sự kiện thứ nhất: Hình thành khối u là quá trình biến ñổi tế bào thực vật do xâm nhập và hợp nhất của T-DNA vào tế bào thực vật, sau ñó biểu hiện các gen trong vùng T-DNA

• Sự kiện thứ hai: Các gen nằm trong vùng T-DNA sao chép trong các tế bào bị xâm nhiễm và không có vai trò trong quá trình chuyển

• Sự kiện thứ ba: Vùng DNA lạ ñặt giữa các vùng biên của T-DNA có thể ñược chuyển cho tế bào cây trồng

Dựa vào quá trình này mà người sử dụng có thể xây dựng hệ thống vector cho mục ñích chuyển gen ở mỗi ñối tượng ðến nay nhờ cải tiến các

vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển gen bằng A tumefaciens ñã thành

công cả ở cây ngũ cốc ñặc biệt là lúa (Hiei Y và cs., 1997)] Kỹ thuật này trở thành một kỹ thuật ñầy triển vọng cho chiến lược chuyển gen ở thực vật

Chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens ñã thực hiện có hiệu

quả trên nhiều loài cây hai lá mầm như: thuốc lá, cà chua, khoai tây, ñậu

tương, bông, Arabidopsis, ngô Những thành công mới nhất nhờ kỹ thuật

này trên cây lúa (Hiei Y., Komari T., 2006) ñã giúp cho phương pháp chuyển

gen gián tiếp bằng A tumefaciens trở nên hấp dẫn với các nhà khoa học Cho

ñến nay, chuyển gen gián tiếp thông qua A tumefaciens là phương pháp cho tần số biến nạp cao hơn cũng như có thể xác ñịnh ñược sự xâm nhập ổn ñịnh hơn bất cứ phương pháp chuyển gen nào

Trong chuyển gen, những protein ñộc có khả năng diệt sâu của Bt ñã ñược

sử dụng ñể tạo nên các sản phẩm kháng côn trùng như ngô, bông, khoai tây,

lúa, ðiểm ñặc biệt của Bt ñó là dạng protein tinh thể ñược hình thành trong quá trình hình thành bào tử (Kumar và Bambawale, 2002) Những phân tử protein

này ñược biết ñến là có tính ñộc ñối với các ấu trùng và những dạng côn trùng gây hại khác (như bộ cánh cứng, bộ hai cánh, bộ cánh vảy, bộ cánh màng) với

hiệu lực khác nhau ðộc tốc của Bt có tính ñặc hiệu rất cao, không gây ñộc cho

ñộng vật có vú và những côn trùng có ích khác

2.4.2 Những nghiên cứu về gen cry

Theo Held và cs., (1982) là những tác giả ñầu tiên ñã sử dụng chữ viết

tắt “cry” (crystal) ñể chỉ các gen tạo tinh thể ñộc tố Dựa trên tính tác ñộng

chuyên biệt vào sâu mục tiêu và sự tương ñồng về trình tự, gen tạo protein ñộc tố có thể ñược phân thành 6 loại chính:

(a) Các gen mã hóa tiền ñộc tố 130-140 kDa gây hại sâu bộ cánh phấn ñược xếp vào nhóm (class) cryI- ñược phân loại sâu hơn (subclass) từ cryIA ñến cryIG Dựa trên sự tương ñồng về trình tự acid amin ( > 80%), gen cryIA

có thể ñược phân loại sâu hơn nữa thành IA(a), IA(b), IA(c)

(b) Gen cryII tạo tiền ñộc tố 66 kDa gây hại sâu bộ cánh phấn (cryIIB) hoặc gây hại cả sâu bộ cánh phấn và sâu hai cánh (cryIIA)

(c) Gen cryIII tạo protein 73 kDa gây hại sâu bộ cánh cứng

(d) Gen cryIV-phân lập từ chủng Bt (israelensis) tạo protein các loại 135,

128, 74, và 72 kDa có tác dụng gây hại sâu bộ hai cánh

(e) Gen cryV tạo protein 80 kDa có tác dụng gây hại sâu bộ cánh phấn và

sâu cánh cứng

(f) Gen cryVI có hoạt tính gây hại tuyến trùng

2.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể ñộc

Cho ñến nay, hơn 150 loại ñộc tố CRY khác nhau ñã ñược phân lập và kiểm tra tính ñộc trên nhiều loại côn trùng (Tạ Kim Nhung, 2009) Trong khi

ñó danh sách những gen hay protein mới liên tục ñược kéo dài, những danh pháp mới cũng ñược ñặt thêm, theo ñó những mỗi gen/protein có tên dài gồm

4 chữ cái, dựa vào trình tự amino acid ñược xác ñịnh (Crickmore N và cs., 1998) Protein tinh thể ñộc có cấu trúc ñặc thù Các nghiên cứu về cấu trúc của chúng thường bắt ñầu bằng những nghiên cứu về chức năng của những vùng cấu trúc này ðặc ñiểm ñiển hình trong cấu trúc của protein tinh thể ñộc

là có các vùng bảo thủ nằm xen kẽ những vùng biến ñổi Các vùng bảo thủ

này ñóng vai trò quan trọng về mặt cấu trúc và chức năng Bt và δ-endotoxins

của nó ñược nghiên cứu ở mức ñộ phân tử ñể có thể hiểu rõ mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, hoạt ñộng của ñộc tố

2.4.3.1 C ấu trúc của Bt δ-endotoxins

Bt δ-endotoxins là phân tử protein hình cầu, chúng ñược tích lũy dưới

dạng tiền ñộc tố trong suốt giai ñoạn cuối của sự hình thành bào tử Tiền ñộc

tố ñược ñưa vào ruột giữa, sau khi ñược hòa tan nó ñược phân tách thành phần ñầu C chứa phân tử khoảng 66 kDa và phần ñầu N chứa phân tử ñộc tố ñược hoạt hóa Phân tử tiền ñộc tố (protoxin) bao gồm những phần bảo thủ chứa phân tử cysteine (khoảng 16 phân tử trong CRYIAc), ñóng vai trò cầu nối trong việc giúp phân tử protoxin liên kết với cầu nối disulphide và tạo thành cấu trúc tinh thể (Saraswaythy và cs., 2004) Hiện nay, cấu trúc thứ

nguyên của phân tử protein tạo nên ba ñộc tố Bt ñã ñược xác ñịnh Giữa chúng có dạng tinh thể CRY hoặc δ-endotoxins viz CRYIAa ñặc hiệu với bộ

cánh vảy và CRYIIIA ñặc hiệu với bộ cánh cứng (Li và cs., 1991) Những phân tử amino acid tạo nên kết cấu trong cấu trúc cuối cùng của phân tử protein, có mối quan hệ gần gũi với những protein, CRYIAa và CRYIIIA, có khoảng 36 % trình tự amino acid ñược xác ñịnh là rất giống về cấu trúc và thể hiện cùng một phương thức hoạt ñộng, trong khi ñó phân tử protein CRYIIA, với ít hơn 20 % trình tự amino acid giống, tạo thành một domain với chức

năng khác hẳn (Schnepf và cs., 1998) Cấu trúc thứ 3 của δ-endotoxins ñược

bao gồm 3 phần chính ñược liên kết với nhau bởi một trình tự ngắn bảo thủ

Mỗi phần chính của δ-endotoxins ñộc lập và tương tác chức năng với tế bào

biểu mô ruột của ấu trùng (Knowles và cs., 1994) Phân tích phát sinh loài của

δ-endotoxins chỉ ra rằng phần chính I có tính bảo thủ cao nhất, và phần chính

II là thay ñổi nhiều nhất giữa các dạng khác nhau của δ-endotoxins (Bravo

Angel và cs., 1998)

2.4.3.2 C ơ chế và hoạt ñộng của protein tinh thể ñộc tố

Cơ chế tác dụng của tiền ñộc tố lên côn trùng ñích ñã ñược nghiên cứu khá sâu ðầu tiên tinh thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng theo thức ăn qua ñường miệng Sau ñó dưới tác ñộng của môi trường có ñộ pH > 10 ở ruột giữa của sâu cùng với sự hoạt ñộng của proteaza ruột sâu, tương tự trypsin, các tiền ñộc tố ñược hoạt hóa Tiền ñộc tố CRYI và CRYIV với kích thước 130-140 kDa khi ñã ñược hoạt hóa ñã hình thành ñộc tố, kích thước 65- 75 kDa có hoạt tính bền vững Trong khi tiền ñộc tố CRYII và III (70-75 kDa) sau quá trình biến ñổi ñã tạo ra ñộc tố kích thước 60-65 kDa Sau khi ñược hoạt hóa, protein tinh thể ñộc ñã liên kết ái lực mạnh với các chất nhận glycoprotein tại những vị trí ñặc hiệu nằm trên các vi nhung mao của các tế bào biểu mô ruột giữa của ấu trùng Chính mối liên kết của các ñộc tố với các chất nhận ở vi nhung mao này ñã quyết ñịnh tính ñặc hiệu của các ñộc tố Ở những côn trùng không mẫn cảm, mối liên kết này rất lỏng lẻo Hiện nay, người ta xác ñịnh ñược ba nhóm vị trí gắn Một số vị trí có thể liên kết với một loại ñộc tố, một

số vị trí khác có thể liên kết với hai hay nhiều loại Như vậy, một ñộc tố ñặc thù có thể liên kết với nhiều vị trí nhận trong ruột côn trùng Sau khi gắn kết, protein tinh thể ñộc tố ñính trên bề mặt tế bào biểu mô ruột giữa, gây tổn

thương và phá hủy tế bào, tiêu diệt côn trùng mẫn cảm ðộc tố Bt gắn vào

glycoprotein niêm mạc ruột, ñặc biệt là ñoạn giữa ruột làm cho ruột bị thủng,

rò rỉ dịch tiêu hóa vào ñường dẫn máu gây nên hiện tượng bị loãng dịch tiêu hóa và nhiễm trùng máu (Hofte và cs., 1989)

2.4.4 Một số nghiên cứu về gen cry1Ac

Trong số các nghiên cứu về ñộc tố CRY, CRY1Ac là một trong những protein CRY ñược nghiên cứu kĩ, nổi bật với ñộc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ cánh vẩy, ñặc biệt ñược sử dụng trong việc bảo vệ nông nghiệp

Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của protein CRYIAc vẫn chưa được hiểu rõ và cần những nghiên cứu sâu hơn Nghiên cứu về tinh thể bào tử bao gồm mảnh DNA dị hợp 20 kb liên kết với tiền độc

tố, nĩ cĩ thể đĩng vai trị chìa khĩa trong việc đảm bảo cấu trúc ổn định của những hạt tinh thể cũng như sự hoạt hĩa tinh thể độc tố trong ruột giữa của

sâu đích Tuy nhiên, mối tương tác tự nhiên của tiền độc tố Bt với DNA, trình

tự và nguồn gốc của DNA 20 kb cịn lại được nghiên cứu kĩ Học thuyết hiện đại nghiên cấu cấu trức khơng gian 3 chiều của CRYIAc đã được dự đốn khi nghiên cứu cầu trúc của đồng đẳng của nĩ là CRYIAa, và sự khác biệt về cấu trúc giữa CRY IAa, CRY IIAa, CRY IIIAa và CRY IV4Aa Cấu trúc của nĩ gồm 3 “domain” chính Domain 1 bao gồm 7 chuỗi xoắn alpha, trong đĩ chuỗi thứ 5 được bao quanh bởi các chuỗi khác, tạo nên một bĩ xoắn Domain

2 bao gồm 3 tấm b tạo nên cấu trúc hình học Greek, được xếp trong 1 hình lăng trụ Domain 3 được tạo ra bởi 2 tấm b khơng song song thành dạng bánh b-sandwich trong một cấu trúc hình trụ ðoạn gen cry1Ac5 đầy đủ được phân

lập và tách ra từ chủng Bt 4.0718, qua plasmid biểu hiện pHTAc35 được cài

gen cry1Ac5

Tinh thể độc tố Bt được chuyển cùng với pHTAc35 và được biểu hiện

thành dạng tiền độc tố CRY IAc5 130 kDa, trong những nghiên cứu trước đây

đã phát hiện ra 20 kb-DNA và CRY IAc được tinh sạch, và mối tương tác của chúng được phân tích bằng cách sử dụng phép thử huỳnh quang Những vùng liên kết đều nằm trong 3 phần domain chính Trong đĩ nhận thấy so với cấu trúc DNA thơng thường, DNA 20kb cĩ liên kết rất chặt chẽ Bên cạnh cĩ cấu trúc chung giống với tất cả các phân tử DNA khác, độc tố cĩ thể là do các trình từ nu đặc hiệu tạo nên thể hiện trong nhiều đoạn của phân tử DNA 20kb Phân tử được mơ phỏng sử dụng CRY IAc và một đoạn của 20-bp DNA chứa một vài vị trí liên kết với 3 domain của cry1Ac5 Vị trí liên kết Ser283-

Ala284-Gln285, Ser440-Ser441-Ser442 DNA Ser555-Leu556-Asn557 ựược tạo nên nhờ liên kết tương tác hidro đó là tương tác hidro giữa phân tử phosphor trên ựoạn DNA với 3 phân tử amino acid (Arg209, Asn212 DNA Gly339) của cry1Ac5 Phần thêm của phân tử 20kb - DNA hoạt hóa cry1Ac

trong ựiều kiện in vitro ựã làm giảm ựộc tắnh của Bt dưới ựiều kiện có trypsin

và tia cực tắm ựã chỉ ra rằng sự tồn tại của 20kb - DNA trong những phân tử ựộc tố ựóng vai trò bảo vệ tắnh ựộc

2.5 Nguồn gốc và phân loại cây lúa

Cây lúa là một trong những cây cốc có lịch sử trồng trọt lâu ựời nhất

Về nguồn gốc thực vật học, cây lúa thuộc họ hòa thảo (Gramineae), chi

Oryza Lúa trồng hiện nay là do lúa dại Oryza fatua hình thành thông qua một

quá trình chọn lọc nhân tạo lâu dài Loài lúa dại này thường gặp ở Ấn độ, Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc Họ hàng với cây lúa trồng là các loài trong

chi Oryza Các công trình nghiên cứu cho thấy có 22 loài trong chi Oryza với

24 hoặc 48 nhiễm sắc thể Trong số 22 loài của chi Oryza chỉ có 2 loài là

Oryza sativa và Oryza glaberrima là lúa trồng

Kết quả của sự tiến hóa và ảnh hưởng của hệ thồng chọn lọc giống qua hàng ngàn năm ựã hình thành một tập ựoàn các giống lúa, các loại hình thái rất ựa dạng phong phú để sử dụng có hiệu quả nguồn gen quý giá này rất cần thiết phải phân loại giống lúa Tuy nhiên, có nhiều cách phân loại khác nhau theo các tiêu chắ khác nhau (theo ựiều kiện sinh thái, theo thời gian sinh trưởng, theo nguồn gốc hình thành, theo tắnh trạng ựặc trưng ) Cho ựến nay, phân loại cây lúa theo hệ thống phân loại thực vật học của loài lúa trồng

Oryza sativa L ựã ựạt ựược sự thống nhất Theo các tài liệu chắnh thức thì loài

Oryza sativa L gồm 3 loài phụ (indica, japonica và javanica), 8 nhóm biến

chủng và 284 biến chủng Theo cấu tạo của tinh bột còn phân biệt lúa nếp (glutinosa) và lúa tẻ (utilissima) Tuy nhiên, theo ựịnh luật về dãy biến dị

tương ựồng của Vavilov thì cây lúa vẫn tiếp tục tiến hóa và nhiều biến chủng mới vẫn tiếp tục xuất hiện, các nhà khoa học vẫn ựang tiếp tục nghiên cứu, tâp hợp và bổ sung thêm cho hệ thống phân loại này (Nguyễn Văn Hoan, 2006)

Theo tác giả Nguyễn đình Giao, Nguyễn Thiện Huyên và cộng sự

(2001) thì loài phụ indica (lúa tiên) và japonica (lúa cánh) ựược phân loại theo ựiều kiện sinh thái và vĩ ựộ ựịa lý Về mặt phân bố: lúa indica ở vùng vĩ

ựộ thấp như: Ấn độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Indonexia Lúa japonica phân bố ở vùng vĩ ựộ cao như Nhật Bản, Triều Tiên, Bắc Trung Quốc, Châu

âu, v.v (Nguyễn đình Giao và cs., 2001).Một số hình thái lúa loài phụ indica

và loài phụ japonica ựược thể hiện trong Bảng 2.3

Bảng 2.3 : Phân biệt hình thái lúa loài phụ indica và loài phụ japonica

đặc ựiểm Loài phụ Indica Loài phụ Japonica

Ngày nay, do nhu cầu giao lưu, việc phân bố của lúa indica và japonica

không nguyên dạng ban ựầu Mặt khác, do tiến bộ khoa học kỹ thuật, có nhiều phương pháp chọn tạo giống lúa mới cho phép tạo ra nhiều giống lúa mới với những tắnh năng ưu việt Các phương pháp lai xa nhằm khai thác ưu thế lai, các phương pháp ựột biến, các phương pháp chọn tạo giống sử dụng công nghệ sinh học ựã tạo ra nhiều giống lúa mới khiến cho việc phân loại truyền thống gặp nhiều khó khăn

2.6 Tình hình nuôi cấy mô lúa và chuyển gen vào lúa thông qua

Agrobacterium tumefaciens

2.6.1 Trên thế giới

Tái sinh cây từ mô sẹo ñược thông báo lần ñầu tiên ở loài cây ngũ cốc bởi Tamaoki và Ullstrup (năm 1958) Cho ñến nay mô sẹo ñã ñược tạo ra từ các mô lúa khác nhau như nát cắt thân (Furuhashi và Yatazawa, 1964), hoa

non, bao phấn, tiểu bào tử, ñỉnh rễ (Visarada và cs., 1998, Mandal và cs.,

2003), bao lá mầm (Oinam và Kothari 1995, Chand và Sahrawat 1997, Sahrawat và Chand 2001), trụ dưới lá mầm (Wu và Li, 1971), hạt trưởng thành (Lin và cs., 2005; Rachmawati, 2006)

Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các giống lúa indica có sự khác nhau

ñáng kể về phản ứng tạo mô sẹo và tái sinh cây (Khanna, 1999; Amin M A., 2004) Do ñó, ñể cải thiện hiệu quả tạo mô sẹo và tái sinh cây, cần thiết tối ưu

hóa môi trường cho các giống lúa indica

Zhenyu (1999) ñã nghiên cứu và chỉ ra một số nhân tố ảnh hưởng ñến

tạo mô sẹo và tái sinh cây ở các giống lúa indica Lin và Zhang (2005), Ge và

Cs., 2006) ñã tối ưu hóa môi trường và các ñiều kiện nuôi cấy phuc vụ biến

nạp gen cho hiệu quả cao ở các giống lúa indica

Hiei và cs., (1994) thông báo thu ñược tần số biến nạp cao vào lúa bằng

(1996) cũng thông báo biến nạp thành công vào lúa javanica bằng

Rachmawati và Anzai (2006) ñã nghiên cứu tối ưu hóa môi trường tạo

mô sẹo và tái sinh cây lúa và sử dụng hệ thống tái sinh ñã ñược tối ưu hóa này

ñể biến nạp gen vào các giống lúa javanica Họ cũng nhận thấy hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc nhiều vào giống (Rachmawati và Anzai, 2006)

Lin và Zhang (2005) ñã chỉ ra rằng nguyên nhân chính thu ñược tỷ lệ

biến nạp thành công thấp ở các giống lúa indica (so với các giống lúa

japonica ) có thể do hiệu quả tái sinh của các giống lúa indica thấp hơn Họ ñã

tìm ra ñược 2 môi trường mới ñể cấy chuyển, phân hóa mô sẹo và sử dụng

quy trình tái sinh cây ñể biến nạp cho các giống lúa indica (Lin, 2005)

Hiei và cs (2006) ñã tối ưu hóa quy trình biến nạp cho các giống lúa

indica bằng Agrobacterium tumefaciens sử dụng phôi non của hạt non sau thu

phấn 8-12 ngày Quy trình ñã ñược áp dụng ñể biến nạp thành công với hiệu

quả cao (trên 7 dòng/phôi) cho các giống lúa indica IR8, IR24, IR26, IR36,

IR54, IR64, IR72, Xin Qing Ai 1, Nan Jin 11 và Suewon 258 (Hiei và Komari, 2006)

2.6.2 Ở Việt Nam

Kế thừa tiến bộ khoa học trên thế giới, nhiều nhà khoa học tâm huyết

và nhiều trung tâm, viện nghiên cứu ở Việt Nam ñã nghiên cứu và áp dụng nuôi cấy mô trong chọn tạo giống lúa Trong ñiều kiện còn nhiều hạn chế về kinh phí, cơ sở vật chất và thiết bị nên các kết quả nghiên cứu chưa làm thỏa mãn các nhà khoa học, cũng như chưa thể ñưa ra giống lúa mới ñáp ứng nhu cầu thực tiễn sản xuất như ñã kì vọng

Nghiêm Thị Như Vân ñã nghiên cứu sự hình thành mô sẹo từ hạt phấn

lúa trong ñiều kiện in vitro Trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung 2mg/l

2,4D, nuôi cấy trong tối, các kết quả tác giả cho thấy quá trình hình thành mô sẹo, hình thái mô sẹo và mức ñộ ña bội xảy ra trong quá trình nuôi cấy (Nghiêm Thị Như Vân, 1989, tr.27-30)

Hồ Hữu Nhị, Hoàng Thị Yên (1996) nghiên cứu khả năng tái sinh in

vitro của các dòng lúa bất dục phục vụ cho công nghệ sản xuất lúa lai Tác giả

sử dụng môi trường nền Murashige- Skoog (MS, 1962) có bổ sung acid amin (arginin, casein hydrolysate) và các phytohocmon (BAP, NAA) cho nuôi cấy tái sinh mô phân sinh và hoa non Kết quả nghiên cứu này khẳng ñịnh vai trò

cụ thể của từng yếu tố ảnh hưởng ựến khả năng tái sinh in vitro của mô phân

sinh và hoa non lúa (Hồ Hữu Nhị và cs., 1996)

Bùi Bá Bổng ựã sử dụng môi trường có bổ sung thêm kinetine (1mg/l)

trong nuôi cấy túi phấn lúa lai thuộc tổ hợp Japonica x indica Tác giả ựã cho

thấy môi trường nền N6 có hiệu quả trong tạo mô sẹo, tái sinh trên môi trường nền MS Tác giả ựồng thời khẳng ựịnh: Ộcallus không thành lập nếu chỉ bổ sung 2,4D (2mg/l)Ợ (Bùi Bá Bổng, 1997)

Nguyễn Mạnh đôn nuôi cấy bao phấn lúa indica trên môi trường tạo mô

sẹo (G1, Fj và L8) trong tối ở nhiệt ựộ 25 ổ 10C Tái sinh cây trên môi trường

MS trong ựiều kiện chiếu sáng có bổ sung chất ựiều hòa sinh trưởng Tác giả

bố trắ thắ nghiệm theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên, số liệu ựược thu thập

và xử lý thống kê theo chương trình SAS Tỷ lệ tạo mô sẹo dao ựộng từ 1,2% (giống VN23) ựến 28,4% (giống VN15) (Nguyễn Mạnh đôn, 2001)

Nguyễn Thị Hồng Châu và cs đã thực hiện chuyển gen vào giống lúa

C71 thông qua A tumefaciens Nhóm tác giả ựã sử dụng môi trường MS làm

nền cho tất cả các giai ựoạn nuôi cấy, chuyển gen và tái sinh Gen ựược chuyển gồm 3 gen là CryIA(b), CryIA(c) (gen mã hóa cho protein ựộc tố trừ sâu của vi

khuẩn Bt và gen Xa21 Ờ gen kháng bệnh bạc lá) Vật liệu là giống lúa C71 Kết

quả cho thấy tỷ lệ tạo callus của giống lúa C71 khoảng 92%.Tỷ lệ biến nạp gen

CryIA(c) ựạt 6,6% Tác giả cũng cho rằng khả năng tái sinh của lúa indica là thấp hơn so với lúa japonica Thời gian cho cây chuyển gen mất từ 4,5 ựến 5

tháng (Nguyễn Thị Hồng Châu và cs., 2003)

Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cs ựã nghiên cứu và ựánh giá ảnh hưởng của mối tương tác giữa nguồn gen lúa và môi trường nuôi cấy Tác giả sử dụng giống lúa C70 làm ựối chứng ựể ựánh giá cho tập ựoàn các giống lúa ựịa phương; Nghiên cứu này cho rằng ựối với các nguồn gen trong thắ nghiệm, môi trường N6 tỏ ra thắch hợp cho tạo mô sẹo hơn so với L8 và MS (Nguyễn Thị Thanh Huyền và Cs., 2003) Nhóm tác giả ựã sử dụng vật liệu là bao phấn