Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật elisa trong bộ kit chẩn đoán bệnh gạo heo cysticercus cellulosae

Bệnh Cysticercus cellulosae ở nội tạng khó chẩn đoán vì không thể thực hiện sinh thiết được, bệnh có thể chẩn đoánđược bằng hình ảnh học như CT scan, MRI nhưng chẩn đoán hình ảnh học đắt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LÊ QUANG ĐANG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA TRONG BỘ KIT CHẨN ĐOÁN BỆNH GẠO HEO

CYSTICERCUS CELLULOSAE

Chuyên ngành: Xét nghiệm Y học

Mã số: 60 72 03 33

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS VŨ QUANG HUY

TP Hồ Chí Minh – Năm 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợccông bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Tác giả

LÊ QUANG ĐANG

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các biểu đồ

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn Enzym 4

1.1.1 Thành phần trong kỹ thuật ELISA 4

1.1.2 Thực hiện kỹ thuật ELISA 6

1.1.3 Các công trình nghiên cứu kỹ thuật ELISA 7

1.2 Bệnh Cysticercus cellulosae 9

1.2.1 Lược sử bệnh Cysticercus cellulosae 9

1.2.2 Hình thể Cysticercus cellulosae 9

1.2.3 Chu trình phát triển 11

1.2.4 Đặc điểm dịch tễ của bệnh Cysticercus cellulosae 13

1.2.5 Miễn dịch học bệnh Cysticercus cellulosae: 16

1.2.6 Biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng: 16

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nghiên cứu xác định giá trị chẩn đoán huyết thanh bằng kỹ thuật

ELISA 21

2.1.1 Xác định độ pha loãng cộng hợp, nồng độ kháng nguyên và hiệu giá kháng thể 21

2.1.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA 26

2.1.3 So sánh kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng C.cellulosae của kỹ thuật ELISA vàobộ Kit của công ty DAG 27

2.2 Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và dịch tễ bệnh C.cellulosae 28

2.2.1 Đặc điểm lâm sàng 28

2.2.2 Đặc điểm cận lâm sàng 29

2.2.3 Đặc điểm dịch tễ 30

2.2.4 Thiết kế nghiên cứu: tiền cứu và nghiên cứu chùm ca bệnh 31

2.2.5 Cỡ mẫu 31

2.2.6 Chọn mẫu 32

2.2.7 Đối tượng nghiên cứu 32

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

3.1 Kết quả nghiên cứu 33

3.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của kỹ thuật ELISA 45

3.3 So sánh kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng C cellulosae của kỹ thuật ELISA và bộ kit của DAG 46

Chương 4 BÀN LUẬN 47

4.1 Về nghiên cứu xác định giá trị chẩn đoán huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA 47

4.1.1 Xác định thành phần của kỹ thuật ELISA 47

4.1.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của

kỹ thuật ELISA 504.1.3 So sánh kết quả xét nghiệm của kỹ thuật ELISA và bộ kit DAG 544.2 Về nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đặc điểm dịch tễ của

bệnh Cysticercus cellulosae 54

KẾT LUẬN 56 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

C cellulosae : Cysticercus cellulosae

CT scan : Computerized tomography scanner

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Trị số OD theo nồng độ KN, hiệu giá KT và độ pha loãng cộng hợp 34

Bảng 3.2: Trị số OD của kỹ thuật ELISA khi sử dụng KN dịch nang 36

Bảng 3.3 So sánh trị số OD của kỹ thuật ELISA khi dùng KN dịch nang với các HT bệnh ký sinh trùng khác 38

Bảng 3.4: Trị số OD theo nồng độ KN và hiệu giá KT 40

Bảng 3.5: Trị số OD của 46 mẫu HT nhóm chứng 42

Bảng 3.6 Kết quả ELISA của 140 mẫu HT đƣợc xác định chẩn đoán 45

Bảng 3.7 Kết quả xét nghiệm của kỹ thuật ELISA vào bộ kit của DAG 46

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

TrangBiểu đồ 3.1: Tỉ số OD+/OD-theo hiệu giá KT ở các độ pha loãng cộng hợp 35 Biểu đồ 3.2: Tỉ số OD+/OD- theo hiệu giá KT khi sử dụng KN dịch nang 37 Biểu đồ 3.3: Tỉ số OD+/OD-theo nồng độ KN và hiệu giá kháng thể 41

DANH MỤC CÁC HÌNH - ẢNH

Trang

Hình

Hình 1.1 Kỹ thuật ELISA 7

Hình 1.2 Trứng Taenia solium 10

Hình 1.3 Đầu Taenia solium, C cellulosae 11

Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm sán dãi heo 11

Hình 1.5 Tóm tắt chu trình phát triển sán dải heo và các phương pháp chẩn đoán 12 Ảnh Ảnh 3.1: Kết quả phản ứng KN-KT với cơ chất trên giá nhựa 39

Ảnh 3.2: Các băng protein đặc hiệu trong bệnh C cellulosae 44

Ảnh minh họa Hình ảnh: Gạo heo và Plate ELISA 58

Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae trong cơ 59

Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae trong cơ 59

Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae toàn thân 60

Hình ảnh X quang nhiễm C.cellulosae toàn thân 61

Nang C.cellulosae dưới da 61

Hình ảnh soi thấy ấu trùng sán ở đáy mắt 62

Tiểu phẩu bóc tách nang ấu trùng 62

Hình ảnh vi thể nang ấu trùng 63

Hình nang sán gây u não chẩm phải 63

MRI: hình ảnh tổn thương ứ nước ảnh hưởng vỏ chất xám vỏ não và dưới vỏ 64

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh GẠO HEO (Cysticercus cellulosae) ở người là bệnh tự nhiễm do nuốt phải trứng Taenia solium.

Cùng với bệnh Taenia solium, bệnh Cysticercus cellulosae cũng là

bệnh phổ biến ở những nước kém phát triển Theo nhận định của Burneo,Gacia, Takayanagui O.M (2001) trên thế giới có khoảng 2,5 triệu người mắc

bệnh Taenia solium, 20 triệu người mắc bệnh Cysticercus cellulosae và có

khoảng 50.000 người chết mỗi năm do bệnh này [28],[45] Theo tài liệu Tổ

chức Y tế thế giới bệnh Cysticercus cellulosae phổ biến ở các nước Châu Á, Châu Phi và Châu Mỹ latinh Theo các nghiên cứu thì tỉ lệ mắc Cysticercus

cellulosae ở người trên thế giới từ 0,7% - 22,6% [20],[22],[23], [25],

[26],[28]

Tại Việt Nam theo kết quả điều tra của Viện Ký sinh trùng sốt rét và

côn trùng tỉ lệ mắc Cysticercus cellulosae ở vùng đồng bằng từ 0,5-2%, vùng trung du và miền núi từ 3,8-6% Bệnh do gạo heo Cysticercus cellulosae theo

nghiên cứu của Annette E và cs tại tỉnh Bắc Ninh tỉ lệ phát hiện kháng thể

kháng Cysticercus cellulosae là 5,7% [1], [20].

Gạo heo Cysticercus cellulosae có thể gây bệnh ở cơ, dưới da, mắt, hệ thần kinh trung ương Bệnh Cysticercus cellulosae dưới da được chẩn đoán trực tiếp bằng phương pháp sinh thiết Bệnh Cysticercus cellulosae ở nội tạng

khó chẩn đoán vì không thể thực hiện sinh thiết được, bệnh có thể chẩn đoánđược bằng hình ảnh học như CT scan, MRI nhưng chẩn đoán hình ảnh học đắttiền khó chẩn đoán phân biệt với tổn thương do các nguyên nhân khác [3],[9]

Để góp phần chẩn đoán bệnh do Cysticercus cellulosae, các nhà khoa

học có xu hướng dùng các kỹ thuật huyết thanh chẩn đoán như kỹ thuật cố

định bổ thể, ngưng kết hồng cầu, miễn dịch huỳnh quang và hiện nay là kỹthuật miễn dịch hấp phụ gắn enzyme ELISA vì kỹ thuật này có độ nhạy cao.

Ở nước ngoài, Costa J.M (1986), Wang K.H (1993), Dekumyoy P.(1998), Silva A.D (2000), Bueno E.C (2000), đã điều chế kháng nguyên từ

Cysticercus cellulosae để dùng trong kỹ thuật ELISA [29],[46],[30],[43],[26].

Ở trong nước, tại các tỉnh phía Bắc Nguyễn Thị Minh Tâm, Phan TríTuệ (1991) đã nghiên cứu kỹ thuật ELISA với kháng nguyên điều chế từ

Cysticercus cellulosae Ở phía Nam từ 1987, Trần Vinh Hiển, bộ môn Ký

sinh học cũng đã nghiên cứu về kỹ thuật ELISA để chẩn đoán các bệnh do ký

sinh trùng, trong đó có bệnh do gạo heo Cysticercus cellulosae, [12],[17],[5].

Chúng tôi nghiên cứu vấn đề sử dụng kháng nguyên dịch nang để thựchiện kỹ thuật ELISA và đã xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật này

Từ đó ứng dụng để xét nghiệm huyết thanh trên bệnh nhân nghi ngờ mắc

bệnh ký sinh trùng nhằm phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae.

Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích trên: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật

ELISA trong bộ Kit chẩn đoán bệnh do gạo heo Cysticercus cellulosae.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng quát

Xác định giá trị chẩn đoán bệnh Cysticercus cellulosae của bộ kit bằng

kỹ thuật ELISA trên những bệnh nhân tại bệnh viện Đại Học Y Dược ThànhPhố Hồ Chí Minh và các Phòng khám tại TP Hồ Chí Minh

Mục tiêu chuyên biệt

- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiênđoán âm

- So sánh những yếu tố kỹ thuật của bộ kit mới với các bộ kit nhậpngoại đang có trên thị trường

- Hoàn thiện bộ kit để đưa vào sử dụng trong xét nghiệm chẩn đoán

bệnh Cysticercus cellulosae.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn Enzym

Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn Enzym được gọi tắt là kỹ thuật ELISA(Enzym Linked Immunosorbent Assay), là kỹ thuật dùng enzym để đánh dấukháng nguyên hoặc kháng thể, từ đó phát hiện ra kháng nguyên hay kháng thểnhờ vào sự kết hợp đặc hiệu của chúng

1.1.1 Thành phần trong kỹ thuật ELISA

Enzym: enzym được dùng đánh dấu trong kỹ thuật này là một loại protein có

hoạt tính xúc tác, hoạt tính này rất quan trọng là phải hoạt động trong quátrình thực hiện kỹ thuật ELISA

Có nhiều loại enzym, enzym thường được dùng nhất là peroxydase vìgiá thành thấp dể tạo cộng hợp và phù hợp với nhiều loại cơ chất

Cộng hợp: được tạo thành bởi sự kết hợp giữa enzym và kháng thể Hóa chất

để tạo sự kết hợp gồm nhiều loại nhưng hai loại thường dùng là glutaraldehyd

và sodium periodate

 Glutaraldehyd là một diadehyd có tác động kết hợp giữa enzym đánhdấu và kháng thể nhờ nhóm amino tự do.

CHO CHO

 CHO (CH2)3 CH CH (CH2)3 CH CH (CH2)3 CHO

A NH2 NH2 B

Sodium periodate: được sử dụng để tạo ra những nhóm aldehyd,

những nhóm này tác động với nhóm amin của protein đưa vào tạo thành base

Kháng nguyên hữu hình: thường được dùng trong mô học

Kháng nguyên hòa tan: phải cố định trên giá rắn, loại kháng nguyênnày được dùng trong kỹ thuật ELISA

Mẫu thử nghiệm: huyết thanh, huyết tương hoặc các dịch sinh học khác được

pha loãng vào dung dịch đệm PBS có Tween 20

Cơ chất: là chất dùng để phát hiện enzym trong cộng hợp, đó là chất sinh

màu Cơ chất có nhiệu loại, thường dùng là Ortho-phenylene-Diamine (OPD)hoặc 3,3’,5,5’ Tetramethyl benzidine (TMB)

Giá rắn: là giá dùng gắn kháng nguyên hoặc kháng thể Hiện nay giá nhựa có

nhiều giếng (96 giếng) làm bằng polystyren, polypropylene và plastic được sửdụng phổ biến

1.1.2 Thực hiện kỹ thuật ELISA

Các bước thực hiện kỹ thuật ELISA phát hiện kháng thể gồm:

Bước 1: gắn kháng nguyên vào giá rắn 96 giếng, ủ, rửa

Bước 2: cho huyết thanh thử nghiệm đã pha loãng vào, ủ, rửa

Bước 3: cho cộng hợp pha loãng vào, ủ, rửa

Bước 4: cho cơ chất vào, độ đậm màu tương ứng với nồng độ củakháng thể có trong huyết thanh thử nghiệm đã cho vào ở bước 2

Hình ảnh mô tả kỹ thuật ELISA

Hình 1.1 Kỹ thuật ELISA

1.1.3 Các công trình nghiên cứu kỹ thuật ELISA

Các nhà khoa học đã tìm ra nhiều kỹ thuật huyết thanh chẩn đoán để

phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae như kỹ thuật miễn dịch

huỳnh quang, kỹ thuật ngưng kết hồng cầu, cố định bổ thể, miễn dịch khuếchtán, miễn dịch điện di và kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzym thường đượcgọi là kỹ thuật ELISA

Trong các kỹ thuật này thì kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn enzym là có

độ nhạy cao hơn các kỹ thuật huyết thanh chẩn đoán khác nên được sử dụngrộng rãi trên thế giới

Kháng nguyên dùng trong đề tài này

Hiện nay kháng nguyên dùng trong kỹ thuật ELISA thường là kháng

nguyên hòa tan có thể điều chế từ Cysticercus cellulosae là nang của Taenia

solium Các thành phần của nang sán có thể được dùng làm kháng nguyên là

dịch nang, mô nang, chất nội ngoại tiết

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dung KN là KN dịch nang, dịchđược lấy từ trong gạo heo của nguồn heo bị nhiễm trong tự nhiên, bảo quảnbằng Sodium azid, giữ ở -700C

Shiguekawa K.Y và cs (2000) dùng kháng nguyên từ Cysticercus

cellulosae là kháng nguyên dịch nang với dung dịch tách chiết là nước muối,

[41] Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA khi dùng kháng nguyêndịch nang, pha loãng huyết thanh 1/20 là 95% và 74%, ở độ pha loãng huyếtthanh 1/100 là 90% và 96,5% Tác giả cũng ghi nhận phản ứng chéo trong kỹthuật này như sau:

 Đối với kháng nguyên dịch nang

Ở độ pha loãng huyết thanh 1/20: chéo với Ascaris lumbricoides,

Enterobius vermiculasis, Giadria lamblia, giun móc, Schistosoma spp, Strongyloides sterecoralis.

Ở độ pha loãng huyết thanh 1/100 chéo với Giadia lamblia, giun móc.

Phạm Trí Tuệ, Nguyễn Thị Minh Tâm 1991 nghiên cứu kỹ thuậtELISA, xác định kháng nguyên dịch nang đặc hiệu hơn kháng nguyên toànnang [17]

Phạm Trí Tuệ, 1997 với công trình “Đánh giá hiệu quả áp dụng kỹthuật miễn dịch để chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng xác định nồng độkháng nguyên tối ưu của kháng nguyên toàn nang hoặc dịch nang từ 5-10mcg/ml [16]

Trần Thị Kim Dung, Phan Anh Tuấn, Vũ Anh Nhị (2001), “Ứng dụng

kỹ thuật chẩn đoán ELISA để xác định các thể lâm sàng bệnh ấu trùng sán dảiheo ở người” [18]

Phan Anh Tuấn (2004) với công trình: “Ứng dụng kỹ thuật ELISA

bằng kháng nguyên dịch nang để chẩn đoán Cysticercus cellulosae và các đặc

điểm của bệnh này tại các bệnh viện TP Hồ Chí Minh năm 1992-2000” [19]

1.2 Bệnh Cysticercus cellulosae

1.2.1 Lược sử bệnh Cysticercus cellulosae

Vào khoảng thế kỷ 16 người Hy Lạp đã phát hiện nang sán của Taenia

solium ở lưỡi của heo bị bệnh, lúc bấy giờ họ gọi là “sởi heo” Người ta nghĩ

đây là một loài sán của thú được Linnaeus gọi là Cysticercus Từ Cysticercus

xuất phát từ chữ Hy Lạp Kustis (cyst, verside) và kecos (tail) vì hình thể củanang sán giống như một cái túi, bên trong chứa ấu trùng sán giống như cáiđuôi Năm 1809, dựa vào đặc điểm, vị trí của nang thường ký sinh trong mô

liên kết, Rudolphi đã đặt tên là Cysticercus cellulosae Năm 1855, Kuchenmeister tìm ra chu trình phát triển của Taenia solium Những năm đầu của thế kỷ 19, các nhà khoa học đã phát hiện Cysticercus cellulosae ký sinh ở

người khi khám nghiệm tử thi tại các bệnh viện ở Berlin Năm 1944, Mazzotti

và năm 1946 Robles báo cáo các ca bệnh Cysticercus cellulosae tại Mexico Năm 1957, Deut báo cáo ca bệnh Cysticercus cellulosae tại Louisiana Đến nay từ “Cysticercus cellulosae” vẫn tiếp tục được sử dụng dù rằng chu trình phát triển của Taenia solium đã được xác định.

1.2.2 Hình thể Cysticercus cellulosae

Cysticercus cellulosae là nang sán co kích thước từ 0,5cm – 1,5cm Tuy

nhiên cũng có những nang có kích thước từ 3cm – 4cm nhưng hiếm gặp

Các nang sán ký sinh ở não thất thường lớn hơn các nang ở khoảngdưới màng nhện Hình dạng nang sán có thể thay đổi tùy áp suất nơi nó kýsinh:

- Ở cơ: nang sán có hình bầu dục giống như hạt gạo

- Ơ mô dưới da: hình hạt đậu.

- Ở thùy tinh dịch, não thất: hình lhá tròn

- Ở nhu mô não: nang tròn [16]

Hình 1.2 Trứng Taenia solium

Hình 1.3 Đầu Taenia solium, C cellulosae

1.2.3 Chu trình phát triển

Hình 1.4 Chu trình lây nhiễm sán dãi heo

Hình 1.5 Tóm tắt chu trình phát triển sán dải heo

và các phương pháp chẩn đoán

Taenia solium sống trong ruột non của người, bám vào niêm mạc ruột

nhờ đĩa hút và móc ở đầu Mỗi ngày, sán trưởng thành phóng thích 4-5 đốt giàtrong lòng ruột, mỗi đốt chứa 60.000 – 75.000 trứng, các đốt này theo phân rangoài Ra ngoại cảnh, các đốt tan rã và phóng thích khoảng 200 – 400 ngàn

trứng Tùy theo môi trường trứng có thể tồn tại rất lâu trong môi trường bênngoài Ở môi trường khô ráo, trứng tồn tại 14 ngày, ở 0oC sống được 2 tháng,

ở -5o

C sống được 2 tuần, ở -10oC sống được 5 ngày, ở đồng cỏ sống được 150ngày Khi heo hay người nuốt trứng, vào hệ tiêu hóa dưới tác dụng của mentiêu hóa, vỏ trứng sẽ bị tan rã trong khoảng 24 – 72 giờ, phôi 6 móc đượcphóng thích Nhờ móc và chất nội ngoại tiết do phôi tiết ra giúp phôi xuyênvách ruột non vào mạch máu mạc treo ruột theo hệ thống tĩnh mạch, đến tim,vào hệ thống động mạch đến các cơ quan ký chủ Tại đây phôi mất các cặpmóc, phát triển dần thành nang sán sau 9 – 10 tuần

Chu trình tự nhiễm ở người:

Khi xâm nhập vào mô ký chủ, để tồn tại, ký sinh trùng phải tranh giànhcác amino acid của ký chủ để tổng hợp thành các protein cần thiết cho ký sinhtrùng

Trong cơ thể ký chủ, sự tồn tại của nang sán phụ thuộc vào vị trí kýsinh và sự đáp ứng miễn dịch của ký chủ Nang ở mắt có thể tồn tại 20 năm, ởnão từ 3 -6 năm, còn ở cơ, dưới da nang hóa vôi sau vài năm

1.2.4 Đặc điểm dịch tễ của bệnh Cysticercus cellulosae

Bệnh Cysticercus cellulosae phổ biến khắp thế giới nhưng tỉ lệ mắc

bệnh phụ thuộc vào tập quán ăn uống, tình hình vệ sinh công cộng và phươngthức chăn nuôi heo Nơi nào quản lý vệ sinh không tốt, sử dụng phân người

để bón rau, sử dụng nước bẩn để tưới rau quả, dùng cặn bùn ở cống rãnh làmphân bón cho các bãi cỏ dành cho gia súc, thả heo rông, ăn thịt heo nấu khôngchín, uống nước không đun sôi thì tỉ lệ mắc cao

Châu Mỹ:

Tại Hoa Kỳ, ngoài một số bang có bệnh Carolina, Massachusetts,California, Chicago, với dòng người nhập cư mang sẵn bệnh nên tỷ lệ bệnh

Cysticercus cellulosae càng gia tăng như ở các bang Houston, Texas, New

York Nghiên cứu của Moore cho thấy những thành viên trong cộng đồngngười Do Thái ở thành phố New York tỉ lệ phát hiện kháng thể kháng

Cysticercus cellulosae là 1,3%, [22],[23].

Châu Mỹ La Tinh:

Tình hình mắc bệnh Taenia solium, Cysticercus cellulosae tương đối

cao Theo Baily G G nhận định, tại châu Mỹ La Tinh có khoảng 75 triệungười sống trong vùng bệnh lưu hành, 400.000 ngàn người đã có triệu chứng

bệnh Cysticercus cellulosae [22].

Tùy từng nơi, tỉ lệ mắc bệnh Taenia solium từ 0,2 – 2,7% và tỉ lệ phát hiện có kháng thể kháng Cysticercus cellulosae từ 4,9 – 22,6% [20].

Châu Phi:

Kết quả nghiên cứu cũng đã phát hiện trong số bệnh nhân có triệu

chứng thần kinh, tỉ lệ phát hiện kháng thể kháng Cysticercus cellulosae từ

1,54 – 54,1% [31]

Châu Âu:

Đã có lúc bệnh Cysticercus cellulosae phổ biến tại trung tâm châu Âu,

tại thủ đô Berlin của Đức, trong nửa đầu thế kỷ 19, trong số các trường hợp

mở tử thi có 2% bệnh Cysticercus cellulosae ở não Ngày nay, ở Tây Âu nhờ cải thiện về môi trường và cách chăn nuôi hợp vệ sinh, bệnh Cysticercus

cellulosae rất hiếm gặp, chỉ còn tồn tại vài nơi ở Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha,

Phú Hòa, huyện Lương Tài, Bắc Ninh cho biết tỉ lệ phát hiện kháng thể kháng

Cysticercus cellulosae là 5,7% (12/2010) [1], [2].

Tuổi và giới mắc bệnh Cysticercus cellulosae:

Tuổi mắc Cysticercus cellulosae, ở Việt Nam từ 10/1991 đến 4/1999,

Ngô Đăng Thục và cộng sự đã ngiên cứu 118 trường hợp bệnh thể thần kinhtại bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Hai Bà Trưng (Hà Nội) có tuổi mắc từ

12 – 82 tuổi, nhóm tuổi có số bệnh nhân cao là từ 30 – 50 tuổi, số bệnh nhânnam cao gấp 3,5 lần số bệnh nhân nữ [14]

Nghề nghiệp:

- Những nơi có tỉ lệ mắc bệnh cao là những nơi chăn nuôi heo

- Các hành vi và thói quen liên quan đến bệnh Cysticercus cellulosae:

o Ăn uống không hợp vệ sinh: ăn rau sống, thịt heo không nấuchín

o Tập quán, thói quen nuôi heo thả rông, nuôi heo bên cạch nhà

- Cơ sở hạ tầng kém, môi trường bị ô nhiễm:

o Các trẻ nhỏ bị mắc bệnh là do tiếp xúc với môi trường kém vệsinh khi bé bò, trườn, chơi giỡn dưới đất

1.2.5 Miễn dịch học bệnh Cysticercus cellulosae:

Khi ấu trùng của Taenia solium xâm nhập vào cơ thể, bản thân ký sinh

trùng và các chất do ký sinh trùng tiết ra kích thích hệ thống miễn dịch gâyđáp ứng miễn dịch Mức độ đáp ứng miễn dịch có thễ yếu hoặc mạnh.Có thểchia đáp ứng miễn dịch làm 2 loại là đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứngmiễn dịch tế bào

- Đáp ứng miễn dịch dịch thể đối với Cysticercus cellulosae chủ yếu là

tạo globulin miễn dịch Globulin miễn dịch có khả năng hoạt hóa bổthể, opsonin hóa ký sinh trùng để tăng thực bào, giết ký sinh trùng.Hiệu giá kháng thể IgG cao được tìm thấy trong huyết thanh và dịchnão tủy của các bệnh nhân

- Đáp ứng miễn dịch tế bào đối với Cysticercus cellulosae ở người cho

đến nay vẫn chưa được nghiên cứu nhiều

1.2.6 Biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng:

Biểu hiện lâm sàng:

 Mắc bệnh: khi người vô tình nuốt phải trứng sán hoặc người đang

mắc bệnh Taenia solium, nhu động ruột đẩy các đốt sán ngược lên

dạ dày, tại đây dưới tác động của dịch tiêu hóa, phôi được phóngthích xuyên qua vách ruột vào mạch máu, theo hệ tuần hoàn đến các

cơ quan trong cơ thể, tạo thành nang sán

 Dựa vào vị trí nang sán định vị ký sinh có các thể bệnh sau:

Thể dưới da, cơ:

Thời kỳ ủ bệnh thường 60 – 70 ngày sau khi nuốt trứng mới có triệuchứng, giai đoạn đầu không được chú ý, có thể bệnh nhân thấy xuất hiện nốtnhỏ dưới da kich thước 1cm, hoặc nốt phồng trong cơ

- Ở dưới da, trường hợp nhẹ nang sán là những nốt nhỏ như hạt đậu,không đau, di động Quan sát đại thể thấy bao xơ với vài tế bàokhổng lồ Langerhans, thâm nhiễm bạch cầu ái toan, bên trong cácthành phần ấu trùng sán như đầu sán và các móc.

- Ở cơ: thường không có triệu chứng, đôi khi làm phồng cơ gây đau ở

cơ, người ta phát hiện được bệnh Cysticercus cellulosae khi tình cờ

chụp X-quang lúc nang sán đã hóa vôi Vị trí nang sán có thể gặp ởbất kỳ vị trí nào trên cơ thể

Phạm Hoàng Thế và Phạm Trí Tuệ, năm 1985 đã nghiên cứu 61 bệnhnhân được điều trị tại bộ môn ký sinh Trường Đại Học Y Hà Nội và phát hiện

tỉ lệ nang sáng ký sinh ở chi trên là 26,2%, bụng ngực là 24,5%, lưng là 9,3%,chi dưới là 20,2%, đầu mặt là 10,5% và cổ là 9,3%, [12], [16], [17]

Hứa Văn Thước và cs năm 2001 đã nghiên cứu 10 bệnh nhân có nangsán dưới da tại bệnh viện đa khoa Trung Ương Thái Nguyên và phát hiện tỉ lệnang san ở chi trên là 10/10, chi dưới là 8/10, đầu mặt và lưng là 7/10, cổ là4/10 [15]

Thể ở mắt

Các nhà nghiên cứu nhận thấy ký sinh trùng có tính hướng đến mô mắtnhư: hốc mắt nang sáng gặp ở các cơ xung quanh nhãn cầu làm lồi mắt, lémắt

 Mí mắt, kết mạc, giác mạc, triệu chứng thường gặp là nhìn mờ, chảynước mắt

 Thể phale, võng mạc gây giảm thị trường, mù mắt

 Ở dây thần kinh thị giác: gây viêm dây thần kinh thị giác

Thể thần kinh

Bệnh C Cellulosae là bệnh ký sinh trùng phổ biến ảnh hương hệ thần

kinh trung ương.Dù rất hiếm khi gây chết người nhưng bệnh ở hệ thần kinhthường gây ra những triệu chứng thần kinh ảnh hưởng đến cuộc sống bệnh

nhân[29] Các triệu chứng thường gặp của bệnh C Cellulosae thể thần kinh

là: động kinh, nhức đầu, rối loạn thị giác, rối loạn thính lực, buồn nôn

- Nang sán ký sinh ở màng não:

Có nhiều nghiên cứu Silva A D, Rogel, Mc Cormick đã phát hiện nangsáng ký sinh tại màng não tỷ lệ từ 5 – 50% Vì chúng nằm sâu trong nhữngđường rãnh não nên rất khó phát hiện, nang sán ở màng não gây viêm màngnão, [41]

- Nang sán ký sinh ở nhu mô não:

Nang sán ký sinh ở nhu mô não thường gặp nhất Trong nhu mô não,nang sán thường gặp ở vùng vỏ não và vùng chuyển tiếp giữa chất xám vỏ vàchất trắng cận vỏ

Nang sán ở nhu mô não gây các triệu chứng rối loạn tâm thần, sa sút trínhớ, nhức đầu, động kinh, giảm thị lực, liệt từng phần, liệt nửa người, rốiloạn, đi đứng nói năng

- Ngoài ra nang sán còn ký sinh ở não thất, mạch máu não, cột sống…

Thể lan tỏa còn gọi là thể phối hợp

Thể lan tỏa là các trường hợp bệnh mà nang sán ký sinh tại hai haynhiều cơ quan khác nhau trên cùng một bệnh nhân, thể này thường gặp ởngười trẻ, hàng trăm nang sán trong não kèm với nang sán ở cơ và mô dưới

da Sự phối hợp giữa các cơn động kinh, sa sút trí tuệ và thấy co các nốt dưới

da, cơ là thể lan tỏa

Thể cơ quan nội tạng

 Ở cơ tim: nang sán trong cơ tim sẽ dẫn tới rối loạn nhịp tim như timđập nhanh, tiếng tim thay đổi, bệnh nhân khó thở, ngất xỉu

 Ở phổi: Gặp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch

Cận lâm sàng

- Từ 10/1991- 4/1999 Ngô Đăng Thục và cs đã nghiên cứu 118 bệnhnhân thể thần kinh Kết quả xét nghiệm 97 mẫu dịch não tũy (DNT)

có 57,7% trường hợp DNT bình thường, 42,3% DNT bất thường và42,3% tăng protein, 28,9% tăng tế bào và 18,6% tăng bạch cầu toantính [14]

- Từ 1999 – 2000, Trần Kim Ngọc, Phan Văn Ý, Nguyễn Hữu Hoàn,

Vũ Anh Nhị đã nghiên cứu 15 bệnh nhân thể thần kinh Kết quả xétnghiệm 13 mẫu DNT có 10 mẫu tăng đạm, 7 mẫu tăng bạch cầutoan tính và 8 mẫu tăng Lympho [3]

Chẩn đoán hình ảnh học

Từ 1991 – 1999 Ngô Đăng Thục và cs đã nghiên cứu 118 trường hợp

thần kinh Chụp CT scan não có 100% nang ở nhu mô đại não, 14% nang ởnhu mô tiểu não, 9% nang ở nhu mô thân não, 8% nang ở não thất và 4%nang ở nhãn cầu [14]

Chụp X quang chỉ phát hiện khi nang sán chết đã hóa vôi.

MRI: Rất có giá trị trong chẩn đoán

Các xét nghiệm:

- Xét nghiệm máu có thể thấy bạch cầu toan tính tăng

- Xét nghiệm dịch não tủy

- Kỹ thuật huyết thanh chẩn đoán (các kết quả nghiên cứu về kỹ thuật

ELISA trong chẩn đoán bệnh Cysticercus cellulosae.

- Các công trình ứng dụng huyết thanh chẩn đoán miễn dịch:

1 Trần Vinh Hiển, Trần Thị Kim Dung (1997), “Nhân 23 trường hợpbệnh gạo ở người phát hiện bằng phương pháp huyết thanh miễn dịch học”

2 Phạm Trí Tuệ, Nguyễn Thị Minh Tâm (1991), “Điều chế thăm dòtính đặc hiệu của kháng nguyên ấu trùng sán lợn và ứng dụng phản ứng miễndịch men ELISA trong chẩn đoán bệnh ấu trùng sán lợn ở người” Tạp chí Yhọc thực hành, 4, tr 23-28

3 Phạm Trí Tuệ (1997), “Đánh giá hiệu quả áp dụng kỹ thuật miễndịch để chẩn đoán một số bệnh ký sinh trùng” Kỷ yếu công trình nghiên cứukhoa học, tr 100-108

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Công trình nghiên cứu này được thực hiện từ tháng 3/2015 đến 6/2016tại bộ môn ký sinh học, Khoa Y, Đại Học Y Dược Tp Hồ Chí Minh

2.1 Nghiên cứu xác định giá trị chẩn đoán huyết thanh bằng kỹ thuật ELISA

2.1.1 Xác định độ pha loãng cộng hợp, nồng độ kháng nguyên và hiệu

giá kháng thể

Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu thực nghiệm tại labo

Nguyên vật liệu và dụng cụ

Kháng nguyên: được điều chế từ C Cellulosae ở heo mắc tự nhiên

Huyết thanh: có 560 mẫu huyết thanh gồm:

Huyết thanh nhóm bệnh C Cellulosae (HT chứng dương)

Tiêu chuẩn chọn mẫu dựa vào:

Bệnh nhân có kết quả giải phẫu bệnh sinh thiết thấy C Cellulosae.

Không phân biệt tuổi, giới, địa phương, nghề nghiệp

Tiêu chuẩn loại ra: bệnh đã được điều trị bằng bất cứ thuốc diệt ký sinh

nào

Có 4 mẫu của 4 bệnh nhân đã được xác định bệnh C Cellulosae

Huyết thanh nhóm chứng (HT chứng âm)

Tiêu chuẩn chọn mẫu, tiêu chuẩn dựa vào:

Khỏe mạnh

Đồng ý cho lấy máu

Không phân biệt tuổi, giới, địa phương

Xét nghiệm phân 3 lần, 1 lần 2 ngày, mỗi lần cách nhau một tuần,không tìm thấy ký sinh trùng đường ruột

Xét nghiệm máu có tỉ lệ bạch cầu ái toan < 4% mỗi lần xét nghiệmphân

Tiêu chuẩn loại ra: có tiền căn bị bệnh một hay nhiều loại ký sinh

Tiêu chuẩn chọn mẫu:

Có trứng trong phân: 25 mẫu huyết thanh những người bị giun móc và

16 mẫu huyết thanh những người bệnh Ascaris lumbricoides.

Có tìm thấy ấu trùng trong phân khi soi trực tiếp hoặc sau khi tập trung

bằng phương pháp Baermann: 5 mẫu bệnh Strongyloides stercoralis.

Có xét nghiệm Elisa dương tính, có triệu chứng của bệnh, đáp ứng tốtcác triệu chứng đặc trị gồm:

06 Echinococcus spp

32 mẫu huyết thanh bệnh Toxocara spp

13 mẫu huyết thanh bệnh Gnathostoma spp

15 mẫu huyết thanh bệnh Entamoeba histolytica

13 mẫu huyết thanh bệnh Fasciola spp

Huyết thanh nhóm nghi ngờ

Huyết thanh nhóm nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng dự kiến gồm 500mẫu thỏa ít nhất một trong các điều kiện sau:

 Có triệu chứng thần kinh không đáp ứng điều trị thông thường

 CT scan não có hình ảnh nang, nốt

 Có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ mắc bệnh ký sinh trùng ở da có unốt dưới da

 Có triệu chứng ở mắt như đau mắt, nhìn mờ, giảm thị lực

Tất cả các huyết thanh này được cho thêm azid de natri 0,5% và lưu giữ

ở nhiệt độ -20o

C

HÓA CHẤT

- Azid de natri: dùng bảo quản huyết thanh, kháng nguyên

- Ether, nước muối sinh lý: dùng trong quy trình điều chế kháng

Điều chỉnh pH 9,6 với dung dịch Na2CO3 (1,06 gram trong 200 mlnước cất)

Dung dịch này được giữ ở nhiệt độ 4oC

Thêm 0,5 ml Tween 20 vào 100 ml PBS pH 7,4

Thêm 50 gramBSA vào khuấy tan đều

Dung dịch này được giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 tháng

 Rửa nang bằng nước muối sinh lý 0,85%, 3 lần

 Hút dịch nang: dùng kim chích hút dịch từ nang sán

 Thêm dung dịch azid de natri: 10 mcl/10ml dịch nang với dungdịch azid de natri 2%

 Đo nồng độ protein của kháng nguyên: 5,25 mg/ml

 Lưu giữ ở nhiệt độ -20o

C

 Thực hiện kỹ thuật ELISA

Kỹ thuật được thực hiện trên giá nhựa polystyrene gồm các bước:

Pha kháng nguyên: Dùng dung dịch đệm 0,05% carbonat-bicarbonate pha

 Rửa giá nhựa 4 lần bằng dung dịch đệm PBS-T

Gắn kháng thể: Pha loãng huyết thanh bệnh nhân với dung dịch PBS-T-BSA

theo tỉ lệ pha loãng hiệu giá tăng dần từ 1/50; 1/100; 1/200; 1/400; 1/800;1/1600; 1/3200; 1/6400

 Cho vào mỗi giếng 100 mcl huyết thanh đã pha loãng vào các giếng

 Ủ giá nhựa ở nhiệt độ 37o

C trong 1 giờ

 Rửa giá nhựa 4 lần bằng dung dịch đệm PBS-T

Phủ cơ chất:

 Cho vào mỗi giếng 50mcl 3,3’,5,5’ Tetrametyl-benzidin

 Để giá nhựa ở nhiệt độ phòng thí nghiệm

 Sau 20’ cho ngừng phản ứng bằng cách thêm vào mỗi giếng 50mcl

dd H2SO4 2N

2.1.2 Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của kỹ thuật ELISA

Để tính độ nhạy và độ đặc hiệu của ELISA ta dùng bảng 2x2

Giá trị tiên đoán âm : c d

d



2.1.3 So sánh kết quả xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng C.cellulosae

của kỹ thuật ELISA vàobộ Kit của công ty DAG

Sau khi có kết quả ELISA chúng tôi gửi các mẫu HT này đến bệnh việnChợ Rẫy hoặc một Khoa xét nghiệm của viện Pasteur là nơi đang sử dụng bộkit DAG

Bộ Kit DRG gồm các bước:

 Pha loãng huyết thanh tỉ lệ 1/100

 Cho vào mỗi giếng 100mcl HT đã pha loãng, ủ giá nhựa 15’ ở nhiệt

độ phòng, rửa giá nhựa 5 lần bằng dung dịch rửa

 Cho 100ml dung dịch enzyme ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng

 Đo 100mcl cơ chất A+B chờ phản ứng trong 15 phút ở nhiệt độphòng

 Đo thị số OD bằng máy đọc ELISA

*Tính tỉ số: OD HT thử nghiệm/ OD của HT chứng

*Cách đọc:

Giá trị tỉ số lớn hơn 10: phản ứng dương tính

Để so sánh mức độ phù hợp của kỹ thuật ELISA và bộ: kit củaDRG, chúng tôi dựa vào chỉ số Kappa Chỉ số này được tính như sau:

Từ tháng 1/2015 đến tháng 5/2016 tại bộ môn Ký Sinh Học chúng tôi

đã xét nghiệm 2800 mẫu HT của các bệnh nhân xét nghiệm theo dõi nhiễmbệnh ký sinh trùng, ở lứa tuổi từ 2 đến 80, gồm 1.555 nam và 1.245 nữ, chúngtôi chọn hơn 600 ca nghi ngờ có huyết thanh dương tính với các loại ký sinh

trùng trong đó có 88 trường hợp có kháng thể kháng Cysticercus cellulosae tỷ

Trong số 82 trường hợp còn lại bao gồm các thể bệnh ở da, mắt, thầnkinh…

2.2.2 Đặc điểm cận lâm sàng:

- Bạch cầu ái toan/máu (BCAT/máu)

+ Tỷ lệ tăng BACT/máu (> 5,5%)

Trong số 88 bệnh nhân có kháng thể kháng Cysticercus cellulosae có 3

trường hợp có tăng BCAT/máu 56,25% Bao gồm các thể bệnh ở da, mắt,thần kinh…

Ở thể bệnh thần kinh, BCAT/máu có chiều hướng tăng cao hơn các thểbệnh khác

- Hình ảnh CT scan não:

+ Ở thể bệnh thần kinh của Cysticercus cellulosae thì kết quả chụp CT

scan não rất có ý nghĩa chẩn đoán

+ Các loại tổn thương: phù não, nhũn não, giãn não thất, nang ở thànhnão thất, nang hoặc nốt ở nhu mô đại não, nang hoặc nốt ở tiểu não, nanghoặc nốt ở màng não

+ Tỷ lệ HT dương tính theo triệu chứng:

Tỷ lệ HT dương tính cao ở những bệnh nhân có BCAT/máu > 6% và ởcác bệnh nhân thể bệnh thần kinh

+ Tỷ lệ HT dương tính theo nghề nghiệp:

Nghiên cứu cho thấy số người mắc Cysticercus cellulosae phân bố

không đồng đều theo nghề nghiẹp, nhóm chiếm tỷ lệ nổi trội là nhóm làmruộng, làm rẫy, làm vườn có tỷ lệ 23,9% và giết mổ, chăn nuôi chiếm 18,5%[19]

+ Tỷ lệ HT dương tính theo trình độ học vấn:

Nghiên cứu cho thấy số người mắc Cysticercus cellulosae có HT

dương tính thường có trình độ học vấn thấp (mù chữ, cấp I, cấp II) chiếm90%

+ Các yếu tố liên quan đến bệnh Cysticercus cellulosae:

 Ăn rau sống

 Uống nước không đun sôi

 Không rửa tay trước khi ăn

 Đi tiêu ngoài đồng, rẫy, ruộng, ao cá

 Chăn nuôi heo

 Ăn thịt heo không nấu chín

 Bón phân người

 Tiền căn có nhiễm T solium

2.2.4 Thiết kế nghiên cứu: tiền cứu và nghiên cứu chùm ca bệnh.

2.2.5 Cỡ mẫu: được tính bởi công thức

2 2

Z 1 P n

P







Trong nghiên cứu Pilot thì tỉ lệ phát hiện kháng thể kháng C

Cellulosae ở các bệnh nhân mắc bệnh do ký sinh trùng đến khám tại khoa

khám bệnh Viện sốt rét côn trùng và ký sinh trùng trung ương là 15% [40]

Với độ tin cậy 95%, Z = 1,96

Vậy cỡ mẫu tối thiểu là: 545

Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn cở mẫu là 560