Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn trên cây đinh lăng có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết

Em xin gửi lời cảm ơn sự hỗ trợ kính phí từ các đề tài Nhánh số 7 hợp đồng 27/HĐ-VCNMT: “Đánh giá độ an toàn của các hạt nano kim loại đến vi sinh vật, tuyến trùng và một số chỉ tiêu qua

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-   -

NGUYỄN THỊ TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN TRÊN CÂY ĐINH LĂNG CÓ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM TRÙNG HUYẾT

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

Hà Nội – 2020

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-   -

NGUYỄN THỊ TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN TRÊN CÂY ĐINH LĂNG CÓ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY NHIỄM TRÙNG HUYẾT

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN VĂN HIẾU

TS MAI THỊ ĐÀM LINH

Hà Nội – 2020

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin phép được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Văn Hiếu, Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện và tận tình chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài

Đồng thời em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Mai Thị Đàm Linh,

Bộ môn Vi sinh vật học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy đã hướng dẫn em rất tận tình trong cả quá trình thực hiện đề tài, giúp

em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Đồng thời em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị, bạn bè trong Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ, giúp đỡ để em hoàn thành tốt được đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm học vừa qua và giúp đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần

Em xin gửi lời cảm ơn sự hỗ trợ kính phí từ các đề tài Nhánh số 7 hợp đồng 27/HĐ-VCNMT: “Đánh giá độ an toàn của các hạt nano kim loại đến vi sinh vật, tuyến trùng và một số chỉ tiêu quan trọng trong đất trồng nông nghiệp” thuộc Hợp phần IV: “Nghiên cứu cơ chế tác động và đánh giá an toàn sinh học của các chế phẩm nano được nghiên cứu trong dự án”, mã số: VAST.TĐ.NANO.04/15-18 và đề tài

“Phân lập các chủng xạ khuẩn có khả năng kháng khuẩn ở vùng rễ cây thuốc đinh lăng và cây sâm (núi Giàng, Bắc Giang) định hướng ứng dụng trong y học mã số:

CNSH 2014

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở

bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2020

Học viên

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG BIỂU 1

DANH MỤC HÌNH ẢNH 1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Bệnh nhiễm trùng huyết 3

1.1.1 Tình hình nhiễm trùng huyết trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết 4

1.2 Xạ khuẩn 6

1.2.1 Xạ khuẩn – xạ khuẩn nội sinh 6

1.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 7

1.2.3 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 8

1.2.4 Phân loại xạ khuẩn 11

1.2.5 Sự sinh tổng hợp kháng sinh 11

1.2.6 Vai trò của xạ khuẩn nội sinh 12

1.2.6.1 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn với thực vật 12

1.2.6.2 Vai trò của xạ khuẩn 13

1.3 Cây đinh lăng và xạ khuẩn nội sinh trên cây 15

1.3.1 Cây đinh lăng 15

1.3.2 Tìm kiếm, phân loại xạ khuẩn sinh chất kháng sinh nội sinh trên cây đinh lăng 16

1.3.3 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh 17

1.3.3.1 Nghiên cứu các điều kiện lên men 17

1.3.3.2 Thu nhận kháng sinh 19

1.3.4 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 22

2.1.1 Vật liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 23

2.1.4 Môi trường 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phân lập xạ khuẩn từ cây đinh lăng 24

2.2.2 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch 24

2.2.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống 25

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 25

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 26 2.2.6 Xác định sinh khối 27

2.2.7 Phân tích trình tự 16S rRNA của xạ khuẩn 27

2.2.8 Phương pháp điện di gel agarose 29

2.3 Phương pháp lên men 29

2.3.1 Nhân giống 29

2.3.2 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 29

2.3.3 Xác định điều kiện lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30

2.4 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men 30

2.4.1 Xác định khả năng bền nhiệt độ và pH của CKS 30

2.4.2 Đánh giá khả năng chiết của các dung môi 30

2.4.3 Đo phổ hồng ngoại của sản phẩm sau quá trình tách chiết 31

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn từ các mẫu thu thập 32

3.1.1 Phân lập các chủng xạ khuẩn từ các mẫu đinh lăng 32

3.1.2 Tuyển chọn các chủng có hoạt tính kháng khuẩn 34

3.2 Nghiên cứu phân loại các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 39

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 39

3.2.2 Đặc điểm hình thái bào tử 44

3.2.3 Khả năng sử dụng nguồn cacbon 46

3.2.4 Phân loại chủng xạ khuẩn dựa trên trình tự 16S rRNA 49

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh ở chủng xạ khuẩn 15 50

3.3.1 Ảnh hưởng của môi trường lên men 50

3.3.2 Ảnh hưởng của pH 52

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 54

3.3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 55

3.3.5 Ảnh hưởng của thể tích dịch lên men 57

3.3.6 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 59

3.4 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men của chủng Streptomyces sp.15 61

3.4.1 Khả năng tách chiết kháng sinh của các dung môi 61

3.4.2 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến đặc tính chất kháng sinh có trong dịch lên men 63

3.4.3 Kiểm tra phổ hấp thụ hồng ngoại của chất kháng sinh 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

Kết luận 67

Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 75

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Một số thiết bị hay sử dụng trong nghiên cứu 23 Bảng 2.2 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA 28 Bảng 3.1 Số lượng xạ khuẩn có trong các mẫu đinh lăng thu thập 32 Bảng 3.2 Số lượng và tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng lại các vi sinh vật kiểm định 35 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn với các vi sinh vật kiểm định 36 Bảng 3.4 Kết quả hoạt tính kháng khuẩn và hoạt tính enzyme có trong dịch sau lên men các chủng xạ khuẩn 38 Bảng 3.5 Đặc điểm nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn sau 7 và 14 ngày nuôi cấy 40 Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái của bào tử của các chủng xạ khuẩn sau 14 ngày nuôi trên môi trường thạch đĩa ISP2 ở 300C 45 Bảng 3.7 Khả năng sử dụng nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn sau thời gian 7 ngày nuôi ở 300C 48 Bảng 3.8 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng 15 với gen tương ứng của các chủng xạ khuẩn được đăng ký trên GenBank 50 Bảng 3.9 Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng sinh trưởng và sinh hoạt chất

kháng khuẩn của chủng Streptomyces sp.15 51

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn của chủng

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của độ thông khí đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn

của chủng Streptomyces sp.15 58

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và sinh chất kháng khuẩn

của chủng Streptomyces sp.15 60

Bảng 3.15 Khả năng chiết chất kháng khuẩn có trong dịch lên men của chủng xạ

khuẩn Streptomyces sp.15 bởi các dung môi 62

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến độ bền của hợp chất kháng khuẩn

có trong dịch sau lên men của chủng Streptomyces sp.15 64

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn có trong dịch sau lên men

của chủng Streptomyces sp.15 65

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Củ đinh lăng……….15Hình 3.1 Các mẫu rễ, thân, lá đinh lăng được dùng trong nghiên cứu 33 Hình 3.2 Các chủng xạ khuẩn phân lập được 33 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các mẫu đinh lăng 34

Hình 3.4 Khả năng kháng lại vi khuẩn S aureus của các chủng xạ khuẩn phân lập

được từ cây đinh lăng 37 Hình 3.5 Khả năng kháng khuẩn của dịch lên men từ các chủng xạ khuẩn phân lập

được từ cây đinh lăng trên hai chủng vi khuẩn S aureus và E coli 38

Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc các chủng xạ khuẩn sau 14 ngày nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 43 Hình 3.7 Hình thái cuống sinh bào tử của 4 chủng xạ khuẩn dưới kính hiển vi quang học (x40) 44 Hình 3.8 Hình thái cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn dưới quan sát của kính hiển vi điện tử (x 7500) 45 Hình 3.9 Khả năng sinh trưởng trên các nguồn đường của các chủng xạ khuẩn sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ 300C 47 Hình 3.10 Điện di đồ DNA tổng số trên gen agarose 1% của chủng 15 49 Hình 3.11 Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1% Băng M: thang DNA chuẩn; Đường chạy 1 và 2: sản phẩm PCR gen 16S rRNA từ DNA tổng số của chủng 15 49 Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường ISP2 ban đầu đến khả năng sinh trưởng

của chủng Streptomyces sp.15 52 Hình 3.13 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 của dịch sau lên men của chủng

xạ khuẩn Streptomyces sp.15 khi nuôi trong MT ISP2 ở các pH khác nhau 53

Hình 3.14 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của dịch sau lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 khi nuôi ở các nhiệt độ khác nhau 54

Hình 3.15 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống ban đầu đến khả năng sinh trưởng của chủng

Streptomyces sp.15 khi lên men trên môi trường ISP2 56

Hình 3.16 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của dịch sau lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 khi lên men có tỉ lệ giống ban đầu

khác nhau 57

Hình 3.17 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của dịch sau lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 ở các điều kiện lên men có thể tích MT

khác nhau 58 Hình 3.18 Khả năng phát triển của chủng xạ khuẩn trên môi trường ISP2 theo thời gian 59

Hình 3.19 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của dịch sau lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 ở thời gian khác nhau 60 Hình 3.20 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của hợp chất thu được

từ sau quá chiết bởi các dung môi khác nhau 62

Hình 3.21 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của chất kháng khuẩn

có trong dịch lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 ở các nhiệt độ khác

nhau theo thời gian 64

Hình 3.22 Khả năng kháng vi khuẩn S aureus BN1 kiểm định của hợp chất có trong dịch lên men của chủng xạ khuẩn Streptomyces sp.15 ở các pH khác nhau theo

thời gian 65 Hình 3.23 Phổ hồng ngoại của chất kháng sinh có trong dịch sau lên men của chủng

Streptomyces sp.15 66

Colony form units - Đơn vị hình thành khuẩn lạc Chất kháng sinh

deoxyribonucleic acid Đường kính vòng kháng khuẩn Human Immunodeficiency Virus – Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

Hoạt tính kháng khuẩn International Streptomyces Project – Chương trình xạ khuẩn Quốc tế Khuẩn ty cơ chất

Khuẩn ty khí sinh Môi trường Nhiễm trùng huyết Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp Ribonucleic acid

Ribosomal ribonucleic acid

Vi khuẩn

Vi sinh vật

Xạ khuẩn

MỞ ĐẦU

Nhiễm trùng huyết (NTH) là một bệnh lý nguy hiểm có tỉ lệ tử vong cao Bệnh xảy ra do vi khuẩn, virus hay nấm giải phóng những hóa chất vào máu để chống lại các phản ứng viêm của cơ thể Trong số đó tác nhân vi khuẩn được nghiên cứu và đề

cập nhiều hơn cả, với vi khuẩn Gram âm chiếm phần lớn (60 ÷ 70%); Staphylococcus

aureus (S aureus), Streptococcus pneumoniae (S pneumoniae), liên cầu và các vi

khuẩn Gram dương khác ít gặp hơn, chiếm 20 ÷ 40%; nấm chiếm khoảng 1 ÷ 10% Nhiễm trùng huyết thường tiến triển nặng nề và không có chiều hướng tự khỏi nếu không được điều trị kịp thời bằng chất kháng sinh Trên thế giới thường xuyên có những điều tra về tình hình nhiễm trùng huyết Ở Việt Nam cũng đã có một số các công trình nghiên cứu về vấn đề này Nhiều nghiên cứu gần đây của các tác giả trong

và ngoài nước đã cho thấy tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh có khả năng đề kháng kháng sinh ngày càng cao và có tính chất đa đề kháng Hơn nữa, tình trạng các vi khuẩn này đa kháng kháng sinh có xu hướng ngày càng lan rộng và tồn tại dai dẳng, đặc biệt xuất hiện những chủng vi khuẩn đa kháng, gây ra không ít khó khăn cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, trong đó có nhiễm trùng huyết

Trong bối cảnh đó, việc nghiên cứu và lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới

là ưu tiên hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới Cho đến nay, các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau vẫn đang được nghiên cứu để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc hóa học gây ra Nguồn kháng sinh từ vi sinh vật là một trong những nguồn từ

tự nhiên có giá trị, thông qua phương pháp sàng lọc đã được sử dụng rộng rãi trong việc tìm kiếm các vi sinh vật có khả năng sản xuất chất kháng sinh Sàng lọc, tuyển chọn là việc sử dụng các thủ thuật cao cho phép phát hiện và phân lập những vi sinh vật có ích trong một quần thể vi sinh vật lớn, từ đó để thực hiện các bước nghiên cứu đánh giá hoạt chất tiếp theo

Trong số các vi sinh vật sinh chất kháng sinh thì xạ khuẩn là nhóm có tiềm năng lớn Đa số các chất kháng sinh hiện nay đang sử dụng đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ tác động

rộng, có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật khác nhau Gần đây, một số công bố cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do xạ khuẩn nội sinh tạo ra trên các cây dược liệu không chỉ có số lượng phong phú mà còn có sự đa dạng về chức năng như tính kháng vi sinh vật, chống oxi hóa, chống kí sinh trùng và thuốc ức chế miễn dịch

Cây dược liệu ở Việt Nam rất phong phú và đa dạng Trong số đó, cây đinh lăng là loài cây dược liệu có nhiều công dụng như kháng nấm, chống dị ứng, chống oxy hóa Ngoài giá trị khoa học do thành phần của cây mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây đinh lăng còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh, chất chống ung thư Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên cây đinh lăng nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam vẫn còn rất hạn chế Với mong muốn góp phần vào việc tìm ra nguồn kháng sinh mới từ đối tượng xạ khuẩn nội sinh trên cây thuốc, chúng tôi đã nghiên cứu thực

hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn trên cây đinh lăng có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết”

Mục tiêu nghiên cứu:

Tuyển chọn được chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây thuốc có hoạt tính kháng sinh có tiềm năng ứng dụng

Nội dung nghiên cứu:

1 Phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh từ các mẫu cây đinh lăng

2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết

3 Phân loại các chủng xạ khuẩn phân lập được bằng phương pháp truyền thống

và sinh học phân tử

4 Nghiên cứu một số đặc điểm của chất kháng sinh chiết xuất từ chủng xạ khuẩn chọn lọc

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Bệnh nhiễm trùng huyết

1.1.1 Tình hình nhiễm trùng huyết trên thế giới và Việt Nam

Nhiễm trùng huyết hiện nay vẫn là một trong những nguyên nhân chủ yếu gây bệnh nặng và có tỷ lệ tử vong cao Trên thế giới, mỗi năm có khoảng 18 triệu ca nhiễm trùng huyết Tỷ lệ nhiễm trùng huyết thay đổi theo từng quốc gia và tùy từng đối tượng bệnh nhân Theo nghiên cứu của Jason và cộng sự năm 2011 tại 150 khoa hồi sức tích cực của 16 quốc gia trong khu vực châu Á, tỷ lệ nhiễm trùng huyết dao động từ 5 ÷ 53% tùy theo từng quốc gia [44] Ở Châu Âu và Nhật Bản là 1,9 triệu ca

Ở Ấn Độ, Tsering và cộng sự năm 2011, đã nghiên cứu căn nguyên vi khuẩn gây NTH và các yếu tố nguy cơ ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ ở hai bệnh viện ở Ấn Độ cho thấy,

tỷ lệ NTH là 22% [59] Tại Hoa Kỳ năm 2004, có khoảng 200.000 trường hợp mắc bệnh mỗi năm và tỉ lệ tử vong khá cao, từ 35 ÷ 60% [40]

Nhiều nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mắc nhiễm trùng huyết cao ở các bệnh nhân nằm viện Số liệu tại Bệnh viện Trung ương Huế năm 1999 cho thấy tỉ lệ nhiễm trùng huyết là 6,7% [13] Một nghiên cứu khác tại Trung tâm Bệnh viện Nhiệt đới – Thành phố Hồ Chí Minh trong thời gian 5 năm (1995-2000) cho thấy trong tổng số 3.000 bệnh nhân nặng, tỉ lệ nhiễm trùng huyết nói chung là 20% [21] Tại Viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia năm 2007 [26] và Bệnh viện Bạch Mai năm

2008 [20], tỉ lệ nhiễm trùng huyết lần lượt là 9,5% và 8,1%

Mặc dù có sự khác nhau về con số cụ thể của nhiễm trùng huyết theo các nghiên cứu, một điều thống nhất là tỉ lệ mắc bệnh ngày càng tăng Có nhiều yếu tố khác nhau liên quan đến việc tăng cao tỉ lệ mới mắc này Yếu tố quan trọng nhất tác động đến sự tăng cao tỉ lệ mắc liên quan đến các bệnh lý do tình trạng suy giảm miễn dịch mạn tính như AIDS, do sử dụng các thuốc ức chế miễn dịch hay độc tế bào, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, bệnh lý ác tính, suy thận, đái tháo đường, và các trường hợp bệnh nhân ghép tạng Các yếu tố khác có thể là gia tăng do việc cấy các dụng cụ

y khoa dài ngày vào cơ thể (catheter tĩnh mạch, các dụng cụ chỉnh hình…) khi bệnh

nhân bắt buộc phải sử dụng thuốc chống đào thải và cuối cùng là sự gia tăng các vi sinh vật đề kháng kháng sinh xuất hiện ngày càng nhiều

1.1.2 Nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết

Nguyên nhân nhiễm trùng bệnh viện ngày càng gia tăng, do việc sử dụng kháng sinh rộng rãi không theo đúng qui trình và liều lượng, nhiều bệnh nhân tự ý dùng kháng sinh khi chưa có chỉ định của bác sỹ, việc sử dụng các thuốc corticoid hay các thuốc ức chế miễn dịch gây suy giảm miễn dịch… dẫn đến tình trạng xuất hiện nhiều chủng vi sinh vật kháng thuốc,

Tác nhân gây nhiễm trùng huyết có rất nhiều nhóm vi sinh vật bao gồm vi

khuẩn Gram âm (E coli; Pseudomonas); vi khuẩn Gram dương (Staphylococus

aureus); nấm

* Nhiễm trùng huyết do vi khuẩn Gram âm

Nhóm vi khuẩn Gram âm là nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng và tử vong, đặc biệt là các trực khuẩn Gram âm Nhóm phổ biến nhất thuộc họ

Enterobacteriaceae tiêu biểu là nhóm E coli Nghiên cứu của Chamberland năm

1992 ở bệnh viện tại Canada cho thấy vi khuẩn gây nhiễm trùng đường huyết do

nhóm vi khuẩn Gram âm thì vi khuẩn E coli có tỉ lệ lớn nhất là 52,5% [31] Nghiên

cứu của Tsering và cộng sự ở Ấn Độ năm 2011 cho thấy tỷ lệ nhiễm trùng đường huyết do vi khuẩn Gram âm là 61% [59]

Ở Việt Nam, nghiên cứu tại Bệnh viện Y dược Thành phố Hồ Chí Minh (2017), trong tất cả các tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết chủ yếu là vi khuẩn Gram

âm chiếm 76,6% Trong đó, tác nhân chiếm tỷ lệ cao nhất là Klebsiella pneumonia chiếm 12,4% và kế đến là Acinetobacter baumannii chiếm 8,6% [16] Theo nghiên

cứu của Trần Thị Thanh Thư (2018) tại Bệnh viện Nhi đồng 1 thì tỉ lệ nhiễm khuẩn

huyết do vi khuẩn Gram âm chiếm 51,5%, trong đó E coli, Ralstonia pickettii,

Stenotrophomonas maltophilia chiếm đa số [23] Tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2010,

nghiên cứu cũng cho kết quả tương tự với tỉ lệ nhiễm trùng huyết do vi khuẩn Gram

âm là 71,9%, trong đó E coli chiếm cao nhất 18,3%, K pneumoniae là 17,6% [20]

Ở nước ta hiện nay, vi khuẩn E coli đứng hàng thứ hai trong các vi khuẩn

kháng thuốc Theo tổng hợp của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung Ương, tỉ lệ đa kháng của

E coli ở nước ta hiện nay khoảng 20 ÷ 25% Theo số liệu giám sát năm 2012 của

Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương, tỷ lệ kháng ampicilin của E coli

lên tới 81,4%; kháng amoxicillin/clavunanic và ampicillin/sulbactam khoảng 40% Các kháng sinh nhóm cephalosporin thế hệ ba cũng bị kháng đến gần một nửa, và nhóm fluoro – quinolon cũng bị kháng khoảng 45% [2] Theo báo cáo của Tổ chức

Y tế thế giới (WHO), khu vực Tây Thái Bình Dương năm 1997, E coli kháng với

ampicillin ở mức độ cao từ 53,3 ÷ 88,2% tùy theo từng nước Mức độ đề kháng fluoroquinolone thay đổi theo từng nước như 37,3% ở Trung Quốc, 31,9% ở Singapore và 13% ở Việt Nam [9]

Trong số các chủng vi khuẩn Gram âm gây nhiễm trùng huyết thì vi khuẩn P

aeruginosa cũng nằm trong nhóm có tỷ lệ nhiễm cao Kết quả nghiên cứu từ 4 bệnh

viện tại Hà Nội: Việt Đức, Xanh Pôn, Bệnh viện 108 và Bệnh viện 103 giai đoạn

2005-2008 cho thấy P aeruginosa phân lập từ các bệnh phẩm đề kháng rất cao với

các loại kháng sinh như tetracyclin là 92,1%, ceftriaxon là 58,5% và gentamicin là 54% [12]

Tỷ lệ kháng của P aeruginosa với các kháng sinh là một vần đề nghiêm trọng

trên toàn cầu Điều đáng lo ngại hơn, phần lớn những bệnh nhân bị nhiễm trùng bởi

P aeruginosa là các bệnh nhân bị bệnh mạn tính, bệnh hệ thống, bệnh các tổ chức

liên kết ức chế Sự lựa chọn kháng sinh cho những bệnh nhân này ngày càng bị giới hạn và thuốc colistin là sự lựa chọn cuối cùng

* Nhiễm trùng huyết do vi khuẩn Gram dương

Các cầu khuẩn Gram dương đã trở thành căn nguyên gây nhiễm trùng đường huyết phổ biến ở các nước trên thế giới Các nhiễm trùng huyết Gram dương thường

gặp ở các bệnh nhân đặt catherter đường tĩnh mạch thuộc họ Staphylococci,

Enterococci và Streptococci [8]

Các nghiên cứu trên thế giới đều cho thấy rằng S aureus là nguyên nhân hay

gặp nhất trong số các vi khuẩn Gram dương gây nhiễm trùng huyết Trong nghiên

cứu của Stefaw Riedel và cộng sự năm 2008, cho thấy trong số 54,1% nhiễm trùng

huyết do vi khuẩn Gram dương thì do vi khuẩn S aureus đứng hàng đầu trong các

loài cầu khuẩn Gram dương gây bệnh [58] Tỷ lệ này trong nghiên cứu của Chiang năm 1991 tại Đài Loan là 11,1% [32]

Các nghiên cứu thực hiện trong nước cũng cho thấy tỷ lệ khá cao S aureus

gây nhiễm trùng huyết Ở Bệnh viện Các bệnh Truyền nhiễm và Nhiệt đới Quốc gia

(năm 2009), vi khuẩn S aureus chiếm tỷ lệ 14,4% [25] Tại Bệnh viện Bạch Mai năm

2010, do vi khuẩn S aureus được phân lập từ máu chiếm tỷ lệ là 11,9% [20]

* Nhiễm trùng huyết cơ hội do nấm

Tại Mỹ các nghiên cứu đã cho biết một trong các yếu tố gây ra nhiễm trùng

huyết là nấm Trong đó nấm Candida là một trong bốn căn nguyên hàng đầu gây

nhiễm trùng huyết tại bệnh viện, chiếm 9% tổng số chủng vi sinh vật gây bệnh [40] Tại Khoa hồi sức của một bệnh viện của Ấn Độ (năm 1978), 18% các trường hợp nhiễm trùng huyết do nấm gây nên; trong các chủng vi sinh vật gây bệnh nấm

Candida là căn nguyên đứng thứ hai, chiếm 17,5% [57]

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Hà và Phạm Hồng Nhung năm 2017 [10], tại Khoa Hồi sức tích cực, Bệnh viện Bạch Mai các chủng nấm gây bệnh chủ

yếu được phân lập từ đường huyết thì Candida sp đứng hàng thứ tư trong tổng số chủng vi sinh vật gây bệnh Căn nguyên gây nhiễm nấm máu là Candida, các loài thường gặp là C albicans (38,2%) và C tropicalis (36,1%), ngoài ra còn gặp

Talaromyces marneffei (6,0%) và Pichia ohmeri (4,3%)

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Xạ khuẩn – xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn có mặt chủ yếu trong đất, trong nước ao hồ, trong bùn và trong chất hữu cơ khác, thậm trí trong cả cơ chất mà các vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Xạ khuẩn có cấu tạo dạng hệ sợi, phân nhánh Khác với nấm sợi, thành tế bào của xạ khuẩn không chứa cenlulose hay kitin Trên môi trường thạch, hệ sợi phát triển tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS) KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy thức ăn còn KTKS phát triển ra ngoài không khí và một phần của

khuẩn ty được biệt hóa thành cuống sinh bào tử Đường kính của khuẩn ty thay đổi trong khoảng từ 0,2 ÷ 1,0 µm đến 2 ÷ 3 µm Màu sắc ở khuẩn ty biến đổi một cách rất phong phú, có thể bắt gặp các màu trắng, vàng, da cam, đỏ lục, lam, tím, nâu và đen KTCC có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước và

có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ Thời gian nhân đôi tế bào ở xạ khuẩn trong môi trường lỏng khoảng 90 phút [11, 14]

Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí Tùy theo nguồn gốc phân lập mà chúng có thể ưa nhiệt có loài phát triển được ở những nhiệt độ bằng hoặc cao hơn 50oC Tuy nhiên hầu hết các xạ khuẩn thuộc nhóm ưa ấm phát triển tốt ở dải nhiệt

độ từ 25 ÷ 37oC Xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung tính và hơi kiềm, phát triển chậm hoặc không phát triển khi pH của môi trường quá axit hoặc kiềm [11, 14]

Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được Bacon và White (2000) định nghĩa: “Vi sinh vật (VSV) nội sinh bao gồm cả xạ khuẩn là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [28] Theo định nghĩa này hàm chứa một ý rất quan trọng: VSV nội sinh không những không gây ảnh hưởng mà còn tăng cường khả năng trao đổi chất, kích thích sinh trưởng, miễn dịch cho vật chủ bằng cách tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất

Trong số các VSV nội sinh, xạ khuẩn được chú ý bởi hơn 70% các chủng xạ khuẩn đã biết có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh có thể ức chế nhiều nhóm VSV gây bệnh Với tác dụng sinh tổng hợp kháng sinh bởi xạ khuẩn nội sinh, một số nhà sinh học đã nghiên cứu sử dụng xạ khuẩn như một yếu tố kiểm soát sinh học (Biocontrol) trong suốt hai thập kỷ qua Khi sử dụng trong kiểm soát sinh học, vai trò

xạ khuẩn đã được chứng minh giúp tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [28, 29, 38]

1.2.2 Phân lập xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn nội sinh cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa,

cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ… Thêm vào đó, mật độ xạ khuẩn

nội sinh nhìn chung thấp và phụ thuộc vào loại mô khác nhau trên thực vật

Theo các kết quả nghiên cứu đã công bố, quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh cần xử lý bề mặt thực vật nhằm loại bỏ vi khuẩn, vi nấm trên bề mặt Vì vậy, phải khử trùng bề mặt mẫu và cắt mẫu thành từng mảnh bằng dụng cụ đã khử trùng trước khi phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt Ngoài ra, mẫu thực vật có thể được ngâm trong ethanol nồng độ 70 ÷ 90 % trong thời gian 1 ÷ 5 phút, sau đó được ngâm trong dung dịch NaOCl nồng độ 1 ÷ 5 % trong khoảng thời gian 3 ÷ 20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư Ngoài ra, hydroperoxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt hiệu quả Năm 1992, Sardi và cộng sự đã sử dụng hơi của propylene oxit để khử trùng

bề mặt thay vì hóa chất khử trùng dạng lỏng Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của cơ chất khử trùng với bề mặt thực vật [28, 30]

Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25 ÷ 30oC Trong quá trình phân lập, các nhà nghiên cứu thường gặp phải VSV phát triển mạnh trong hai tuần đầu vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loại xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường humic acid - vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men có bổ sung thêm dịch chiết thực vật,… Ngoài ra, bổ sung thêm các hợp chất kháng sinh như nystatin hoặc cycloheximide - ampicilin, acid nalodixic

và trimethoprim… Để ức chế vi khuẩn, nấm nội cộng sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [29, 37, 39, 45]

1.2.3 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc hệ sợi bao gồm các thành phần chính: Thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, vùng nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạ

khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 ÷ 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn

ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 ÷ 120A0, khi già có thể đạt tới 150 ÷ 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc

N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - β glucozit Thành tế bào XK không chứa cellulose và kitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia

vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [4, 7, 14]:

- Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic

(L - ADP) và glycin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

- Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 diaminopimelic (meso - ADP) và glycin Thuộc nhóm này gồm các chi:

Micromonospora, Actinoplanes, Ampullarriella…

Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6

-diaminopimelic Thuộc nhóm này có các chi: Dermatophilus, Geodermatophilus,

Frankia…

Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso 2,6 diaminopimelic, arabinose và galactose Thuộc nhóm này gồm các chi:

-Mycobacterium, Nocardia, Pseudonocardia…

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK Tế bào chất của

XK có chứa mezoxom, vùng nhân, và các thể ẩn nhập gồm các hạt polyphotphat và polysacarit Tế bào XK không có cấu trúc nhân điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng bao bọc Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau

đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty

Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi XK có đường kính thay đổi trong

khoảng 0,2 ÷ 1 µm đến 2 ÷ 3 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm Xạ khuẩn phát

triển theo kiểu mọc chồi, phân nhánh

Hệ sợi của XK phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc Hình thái của khuẩn lạc XK rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như: thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Khuẩn lạc thường có đường kính 0,5 ÷ 2 mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1 cm hoặc lớn hơn nữa Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, có dạng thô ráp, xù xì, có dạng vôi, dạng nhung tơ hay màng dẻo… với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh…, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch Khuẩn lạc thường có cấu tạo 3 lớp: Lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như chất kháng sinh (CKS), độc tố, enzyme… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ [4, 7, 14]

* Bào tử của xạ khuẩn

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh (gọi là cuống sinh bào tử) Trên mỗi cuống sinh bào tử mang từ 30 ÷ 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang một bào tử hoặc hai bào

tử Sự hình thành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự kết đoạn (fragmenlation) hoặc do

sự cắt khúc (segmentation) của cuống sinh bào tử

Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thước trung bình khoảng 0,7 ÷ 0,9 × 0,7 ÷ 1,9 µm Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy loài, tùy cá thể trong loài thậm chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử Bề mặt bào tử XK có thể nhẵn (Sm - Smooth), có gai (Sp - Spiny), khối

u (Wa - Warty), nếp nhăn (Ru - Rugose) hay dạng tóc Ha - Hair like

Bào tử XK được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 ÷ 400 Ao gồm có 3 lớp, các lớp này giúp cho bào tử tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước

của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường

có nguồn nitơ khác nhau [14, 49, 54]

* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu

cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài

Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 ÷ 30oC Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 ÷ 28oC Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong khoảng 40 ÷ 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 ÷ 7,5 Xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme và các CKS nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống [54]

1.2.4 Phân loại xạ khuẩn

Ba phương pháp phân loại xạ khuẩn thường dùng hiện nay là phương pháp phân loại truyền thống (dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy), phương pháp phân loại bằng kỹ thuật phân tử (lai DNA, RNA và phân tích rRNA 16S) và phân loại số (dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các vi sinh vật theo một độ lớn các đặc điểm, chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

để so sánh các chủng theo từng đôi một)

1.2.5 Sự sinh tổng hợp kháng sinh

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành CKS Hầu hết CKS có nguồn gốc XK đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại XK Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:

- Việc tổng hợp CKS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của

các loài khác trong hệ sinh thái

- Việc tổng hợp CKS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống

sót cao của chủng trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử

Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như chloramphenicol, các kháng sinh thuộc nhóm nucleoside

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như lincomycin, novobiocin

- Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor [6]

1.2.6 Vai trò của xạ khuẩn nội sinh

1.2.6.1 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn với thực vật

Xạ khuẩn nội sinh với thực vật là xạ khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong thực vật Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên; thông qua lông hút; giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá, khi xâm nhập vào cây chủ, các xạ khuẩn nội sinh sẽ cư trú tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch Những xạ khuẩn này được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây như rễ, thân, lá, quả và kể cả hạt [50]

Mật độ của quần thể xạ khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài xạ khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát

triển của cây chủ và các điều kiện môi trường [30] Nhìn chung, mật độ vi khuẩn nội sinh thường cao nhất ở mô rễ và thường dao động ở khoảng 102-106 CFU/g rễ tươi [47] Mật độ này được cho là thấp hơn so với mật độ vi khuẩn kí sinh gây hại thực vật (dao động ở khoảng 106-108 CFU/g rễ tươi) [37] Ở các bộ phận như hoa, quả và hạt có mật độ vi khuẩn nội sinh thường thấp nhất Các nhà khoa học đã khám phá được nhiều nhóm xạ khuẩn nội sinh khác nhau từ các loại cây khác nhau nhờ sự đa dạng các chủng vi khuẩn và các loài thực vật mà chúng nội sinh [48]

1.2.6.2 Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn được biết đến như một nguồn sản xuất CKS tiềm năng và các chất

có hoạt tính sinh học khác có giá trị cao đối với cây trồng như vitamin, alkaloid, yếu

tố tăng trưởng thực vật, enzyme và chất ức chế enzyme Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng xạ khuẩn rất quan trọng đối với vùng rễ vì nó có thể ảnh hưởng đến sự tăng trưởng thực vật và bảo vệ rễ cây chống lại sự xâm hại của nấm gây bệnh Sự có mặt của xạ khuẩn trong các tế bào của cây sẽ nâng cao sự ổn định và tăng hiệu quả kháng bệnh cho cây như các tác nhân kiểm soát sinh học [61]

Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỉ lệ mắc bệnh của cây thuốc Thông thường một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh

có trong đất

Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4 ÷ 5 %) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất

có mầm gây bệnh Chúng có khả năng tiết các chất chuyển hóa thứ cấp ức chế sinh trưởng (kháng sinh, độc tố, chất hoạt động bề mặt, chất dễ bay hơi) có thể ngăn chặn hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác Đặc tính này thường được sử dụng để ức chế, ngăn chặn các tác nhân gây bệnh trên thực vật [29, 34, 38, 39]

* Với con người

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật có khả năng hình thành nhiều loại CKS sử dụng trong y học Có đến 80% chủng xạ khuẩn phân lập được tiết CKS có giá trị trong y học Kể từ khi CKS được sử dụng và cứu sống được bệnh nhân bị nhiễm trùng máu năm 1941, đến nay, hàng loạt CKS đã được phát hiện và ứng dụng trong y học Điều này góp phần không nhỏ trong phòng chống và điều trị bệnh tật, nhất là các bệnh nhiễm khuẩn Nhờ có CKS mà con người đã khống chế được nhiều bệnh dịch nguy hiểm như dịch tả, thương hàn Hiện nay CKS còn được sử dụng trong điều trị ung thư, kết hợp với các phương pháp hóa trị và xạ trị, giúp kéo dài tuổi thọ của con người

* Với cây trồng

Ngoài khả năng tiết CKS, xạ khuẩn còn có thể giúp cây trồng tăng khả năng sinh các enzyme có lợi, kích thích cây trồng sinh trưởng, tăng cường sự hấp thu chất dinh dưỡng Giúp kiểm soát bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra trên cây, hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật Các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng sáng của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến nhiều khía cạnh của sự tăng trưởng

và phát triển của thực vật, bao gồm sự mở rộng tế bào, ức chế sự phát triển của các chồi phụ và sự đâm rễ

Ở Ấn Độ (năm 2014), người ta đã phân lập được 40 xạ khuẩn nội sinh từ rễ, thân, lá của các cây thuốc: lô hội, bạc hà, hương nhu tía Đa số các chủng phân lập

đều thuộc chi Streptomyces, một số ít thuộc các chi Saccharopolyspora,

Micromonospora và Actinopolyspora Các thử nghiệm cho thấy phổ kháng nấm của

các xạ khuẩn phân lập được đối với các nấm gây bệnh là tương đối lớn, 90% xạ khuẩn phân lập được ức chế sự tăng trưởng của một hay nhiều loại nấm, 9 xạ khuẩn thuộc

chi Saccharopolspora thể hiện khả năng ức chế mạnh với nấm Aspergillus niger,

Aspergillus flavus, Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Penicillium digitatum, Fusarium oxysporum, Penicillium pinophilum, Phytophthora dresclea và Colletotrichum fulcatum [34] Trong một nghiên cứu khác khi thu nhận xạ khuẩn từ

ba cây thuốc trên, Gang và cộng sự (năm 2011) đã chọn được 22 chủng xạ khuẩn để

thử nghiệm, kết quả là có 12 chủng cho thấy khả năng hòa tan phosphat, 16 chủng sản xuất indole - 3 axit axetic (IAA), 9 chủng được sản xuất hydroxamate và 4 chủng

có thể tạo ra catechol [33]

1.3 Cây đinh lăng và xạ khuẩn nội sinh trên cây

1.3.1 Cây đinh lăng

Đinh lăng hay còn gọi là cây gỏi cá hoặc nam dương sâm là một loài cây nhỏ

thuộc chi Đinh lăng (Polyscias) của họ Cam tùng (Araliaceae) Đinh lăng thuộc loại

cây nhỏ, cây trưởng thành có thể cao từ 0,8 ÷ 1,5 m, thường được trồng làm cây cảnh Cây có lá kép, mọc so le, lá 3 lần xẻ lông chim, mép khía có răng cưa Hoa nhỏ màu trắng, mọc thành tán Quả dẹt, dài 3 ÷ 4 mm, dày khoảng 1mm Lá đinh lăng phơi khô, nấu lên có mùi thơm đặc trưng, dân gian gọi nôm na là mùi “thuốc bắc”, lá tươi không có mùi thơm này [17]

Hình 1.1 Củ đinh lăng

Trong củ đinh lăng có chứa nhiều saponin có tác dụng như nhân sâm, nhiều vitamin, ngoài ra rễ còn chứa khoảng 13 loại axit amin không thể thay thế, rất cần thiết cho cơ thể con người, nhờ hoạt chất trong củ đinh lăng giúp cho tăng trí nhớ cho não bộ, một số đơn vị dược trong nước đã ứng dụng hoạt chất trong cây đinh lăng để làm thuốc bổ não Cây đinh lăng không chỉ là cây cảnh thông dụng, cây rau được ưa dùng mà còn là một vị thuốc nam có tính năng chống dị ứng, giải độc thức ăn, chống mệt mỏi và làm tăng sức dẻo dai của cơ thể Trong dân gian, đinh lăng thường dùng

để trị ho ra máu, chữa tắc tia sữa, làm mát huyết, lợi tiểu, chữa mẩn ngứa Lá đinh

lăng cũng được dùng để nấu canh với thịt, cá để bồi bổ cho sản phụ, người già hoặc người ốm mới dậy [17]

Theo y học cổ truyền, rễ đinh lăng có vị ngọt, hơi đắng, tính mát có tác dụng thông huyết mạch, bồi bổ khí huyết, lá có vị đắng, tính mát có tác dụng giải độc thức

ăn, chống dị ứng, chữa ho ra máu, kiết lỵ Nói chung, ngoài tác dụng lương huyết và

giải độc thức ăn, những tính chất khác của đinh lăng gần giống như nhân sâm [17]

1.3.2 Tìm kiếm, phân loại xạ khuẩn sinh chất kháng sinh nội sinh trên cây đinh lăng

Xạ khuẩn nội sinh trên thực vật là xạ khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng Việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây đinh lăng cũng giống như các loài thực vật khác Xạ khuẩn nội sinh trên cây đinh lăng chúng có thể xâm nhập từ vùng rễ, rồi xâm nhập vào mô xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: Bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên; thông qua lông hút; giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các xạ khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch Mật độ của quần thể xạ khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài xạ khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường Do vậy cần thu thập các mẫu vật khác nhau trên cây như rễ, lá, cành xử lý theo các bước khử trùng, làm sạch trước khi nuôi trên các môi trường đặc hiệu, sau thời gian từ 7 ÷ 21 ngày xạ khuẩn xuất hiện, căn cứ vào hình thái khuẩn lạc đặc trưng, chúng sẽ được tách ra làm sạch trước khi sử dụng cho các mục đích khác

Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, sinh các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các cơ chất khác nhau nhờ hệ thống enzyme Bên cạnh đó, khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh với các điều kiện pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối, chất kìm hãm sinh trưởng, tính chất đối kháng và nhạy

cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời để có được một bộ cơ sở dữ liệu

phục vụ cho lên men sản xuất chất kháng sinh về sau

1.3.3 Nghiên cứu thu nhận chất kháng sinh

1.3.3.1 Nghiên cứu các điều kiện lên men

Chất kháng sinh từ vi sinh vật còn chịu ảnh hưởng của cơ chế điều hoà ngược Chất kháng sinh do chúng sinh ra tích luỹ trong môi trường đến một nồng độ nhất định nào đó sẽ ức chế sự sinh trưởng và phát triển của chúng dẫn đến làm giảm hiệu suất sinh kháng sinh [4] Do vậy cần có các nghiên cứu về các điều kiện môi trường (nguồn cacbon, nitơ, khoáng chất) và các điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ

* Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng do nguồn cacbon không những tham gia vào cấu tạo thành tế bào mà còn tham gia quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm [7] Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như glucose, fructose…, các loại đường kép như maltose, saccarose…, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường Đối với tinh bột chủng có khả năng sử dụng để tạo ra chất kháng sinh bởi khả năng sinh amylase thuỷ phân tinh bột sử dụng vào quá trình tổng hợp chất kháng sinh, với nguồn cacbon là glucose thì cho hoạt tính kháng khuẩn thấp do ảnh hưởng của quá trình ức chế ngược đồng thời glucose chỉ được sử dụng vào quá trình tăng trưởng Với nguồn cacbon là saccarose cho hoạt tính tốt nhất [11, 14]

* Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương,…, còn nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng

là các muối amon, muối nitrat Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ có ảnh hưởng tốt đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh do nó cung cấp các nguồn axit amin quan trọng dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để hình thành nên mạch cơ bản [11, 14]

*Ảnh hưởng của khoáng chất

Vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng Một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn Sự có mặt của một số muối khoáng như Na, Fe, Al, Bo, K, Cr, Cu, Mn, Zn trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV Có thể sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia Một

số muối khoáng như Ca2+, Cu2+… được cho là có ảnh hưởng tới khả năng sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có vancomycin Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong sinh tổng hợp kháng sinh [11, 14]

* Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Đối với các chủng xạ khuẩn nội sinh trên thực vật nguồn mẫu sử dụng để phân lập sẽ có những ảnh hưởng đến đặc tính của chủng phân lập:

- Nhiệt độ: Chủng xạ khuẩn có khả năng phát triển tốt từ nhiệt độ 20 ÷ 350C, ở khoảng nhiệt độ này chủng sinh trưởng và phát triển tốt, cũng có thể thích hợp cho việc sinh tổng hợp kháng sinh Ngoài khoảng nhiệt độ trên lượng sinh khối tạo thành thấp đồng thời lượng kháng sinh tạo ra thấp

- Độ pH: pH ban đầu thích hợp cho chủng sinh kháng sinh là trung tính (pH 6,0

÷ 7,5), môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này

- Độ thông khí: xạ khuẩn có nhu cầu thông khí cao hơn so với các vi sinh vật khác, nhất là trong giai đoạn nhân giống Do đó, nồng độ oxy trong môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất của quá trình lên men Theo kết quả của các nghiên cứu

đã công bố trước thì lượng dịch lên men bằng 15 ÷ 30% so với thể tích bình lên men

là thích hợp cho việc tạo kháng sinh, khi độ thông khí cao hơn hoặc thấp hơn đều ảnh hưởng đến quá trình này

- Sinh tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp CKS cao hơn Lượng giống và tuổi giống được bổ sung vào môi trường lên men cũng có ảnh

hưởng không nhỏ đến khả năng tổng hợp KS Thông thường lượng giống bổ sung vào môi trường lên men là 2 ÷ 10 % [11, 14]

Một trong những cách tách chiết vancomycin là một loại kháng sinh sử dụng

trong điều trị các bệnh nhiễm trùng đường huyết bởi chủng vi khuẩn S aureus có trong dịch lên men của chủng xạ khuẩn S orientalis, đã trải qua một số bước: đầu

tiên được ly tâm loại sinh khối xạ khuẩn và chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 2N (HCl), chạy qua cột nhựa hấp phụ kị nước Vancomycin bị giữ lại trong cột, chỉ có các tạp chất đi ra khỏi cột Sau đó vancomycin được tách ra bằng cách cho dung dịch etanol 5 ÷ 15% chạy qua cột Dung dịch thu được có chứa vancomycin được cho chảy tiếp qua cột nhựa cation acid mạnh Ở đó, các tạp chất bị giữ lại trong cột, dung dịch chứa vancomycin chảy ra lại tiếp tục được đưa qua cột nhựa trao đổi anion acid yếu

để loại bỏ tiếp tạp chất Xử lý dung dịch thu được với than hoạt tính để loại màu và tạp chất Dung dịch đã được loại màu đem xử lý với Al2O3 hoạt tính Vancomycin được nhả hấp phụ ra khỏi nhựa bằng dung dịch izopropanol 35 ÷ 60% Dịch thu được

có chứa 93% vancomycin Bước cuối cùng là kết tinh nhờ ethanol lạnh, lọc và sấy khô ở 40oC, nhận được chất bột trắng vancomycin HCl có độ tinh khiết 95% [14]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh từ xạ khuẩn nội sinh

Trong số các xạ khuẩn nội sinh trên thực vật, chi Streptomyces chiếm đa số các chủng phân lập được, ngoài ra còn có các chi Micromonospora, Actinopolyspora,

Nocardia, Saccharopolyspora …[53]

Ở Ấn độ (năm 2002) đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp 201

có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z-methyl heptyl iso-nicotinate có khả năng

kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fussarium oxysporum, F solani

Tại Hàn Quốc (năm 2007) phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684

sinh kháng sinh laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin

Ở Việt Nam, năm 2016, Phan Thị Hồng Thảo và cộng sự đã nghiên cứu xạ

khuẩn nội sinh Streptomyces parvulus HNR3X4 trên cây bưởi Diễn Hà Nội và thấy

chủng này thể hiện hoạt tính sinh học cao, kháng vi khuẩn Gram âm, Gram dương và

một số chủng nấm gây bệnh G candidum, F oxysporum và F udum kiểm định [22]

Trịnh Thị Trang và cộng sự (2016), đã phân loại và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây màng tang đối với vi khuẩn gây bệnh trên

cá chép và rô phi Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và tuyển chọn các chủng

xạ khuẩn trên cây Màng tang (Litsia cubeba) có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila GL14; Aeromonas caviae HD60 và S agalactiae

HY10 gây bệnh trên các đối tượng cá trên Kết quả cho thấy, trong tổng số 32 chủng

xạ khuẩn được phân lập từ cây màng tang thì có 9 chủng (28,2%) có khả năng đối kháng với ít nhất 1 chủng vi khuẩn Ba chủng MTR711, MTR622 và MTL121 có tính kháng khuẩn lớn nhất với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dao động từ 93,3 - 300,0 µl/mL [24]

Vũ Thị Hạnh Nguyên và cộng sự (2018), đã phân loại và nghiên cứu đặc tính

của xạ khuẩn nội sinh Streptomyces cavourensis YBQ75 phân lập từ cây quế tại tỉnh Yên Bái Chủng S cavourensis YBQ75 kháng được 5 loại VSV (gồm Salmonella

enterica ATCC 14028 (22,0 mm); Pseudomonas aeruginosa CNLM (19,3 mm); Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (19,3 mm); Enterobacter aerogenes

ATCC 13048 (17,7 mm); Proteus vulgaris CNLM (16,3 mm)) trên tổng số 9 VSV kiểm định Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy chủng S cavourensis YBQ75 cũng thể

hiện khả năng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin Kết quả nghiên cứu trên

chứng tỏ tiềm năng của xạ khuẩn nội sinh S cavourensis YBQ75 trong tổng hợp

kháng sinh kháng VSV và kháng sinh nhóm anthracyclin có thể có khả năng ức chế phát triển của tế bào ung thư [19]

Cho đến thời điểm hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào lĩnh vực

xạ khuẩn trên cây đinh lăng có triển vọng ức chế một số vi khuẩn gây nhiễm trùng huyết

Như vậy, việc sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thực vật để thay thế kháng sinh đang được quan tâm nhiều cho cả con người và vật nuôi nhằm hạn chế hiện tượng kháng kháng sinh Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, khả năng kháng khuẩn của các cây thảo dược có liên quan tới các chủng xạ khuẩn có lợi, sống nội cộng sinh trong cây, do chúng có khả năng tổng hợp các hợp chất sinh học có khả năng diệt khuẩn mạnh và an toàn với con người Chính vì vậy, việc tuyển chọn các chủng xạ khuẩn tiềm năng từ các cây thảo dược là một hướng đi nhiều triển vọng

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

- Mẫu rễ thân lá: 12 mẫu rễ, thân, lá đinh lăng thu thập ở Nam Định

- Các chủng vi sinh vật gây nhiễm khuẩn huyếtđược cung cấp từ Khoa Xét nghiệm Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương:

• Staphylococcus aureus BN1 kháng kháng sinh oxacillin nồng độ 1µg,

ciprofloxacin nồng độ 5µg và erythromycin nồng độ 15µg

• Staphylococcus aureus BN4 kháng kháng sinh oxacillin nồng độ 1µg,

erythromycin nồng độ 15µg, gentamycin nồng độ 10µg và clindamycin nồng độ 2µg

• Staphylococcus aureus BN7 kháng kháng sinh oxacillin nồng độ 1µg,

clindamycin nồng độ 2µg, erythromycin nồng độ 15µg và tetracycline

nồng độ 30µg

• Pseudomonas aeruginosa BN3 kháng kháng sinh amikacin nồng độ 30µg,

ciprofloxacin nồng độ 5µg và imipenem nồng độ 10µg

• Pseudomonas aeruginosa BN6 kháng kháng sinh imipenem nồng độ 10µg

• Pseudomonas aeruginosa BN9 kháng kháng sinh amikacin nồng độ 30µg, ciprofloxacin nồng độ 5µg và imipenem nồng độ 10µg

• Escherichia coli BN2 kháng kháng sinh ampicillin nồng độ 10µg,

ceftriaxone nồng độ 30µg và levofloxacin nồng độ 5µg

• Escherichia coli BN5 kháng kháng sinh ampicillin nồng độ 10µg,

cefotaxime nồng độ 30µg, ciprofloxacin nồng độ 5µg và gentamicin nồng

- Các loại muối: KH2PO4, K2HPO4, MgSO4, CuSO4, ZnSO4, FeSO4, MnCl2, NaCl, CaCO3, KNO3…(Trung Quốc)

2.1.3 Thiết bị

Bảng 2.1 Một số thiết bị hay sử dụng trong nghiên cứu

7 Môi trường ISP9 (g/l): (NH4)2SO4 2,64; KH2PO4 2,38; K2HPO4 5,65; MgSO41,0; dung dịch muối B 1ml; nguồn cacbon 10,0; thạch 20,0; nước 1l; pH 6,8 ÷ 7,0

Dung dịch muối B (%): MnCl2 0,79; FeSO4 0,11; CuSO4 0,64; nước cất 100 ml

8 Các hóa chất khác: các khoanh giấy kháng sinh (khoanh giấy có tẩm ampicillin, tetracyline…), bộ thuốc nhuộm Gram (Bio Merieux, Pháp),…

Các môi trường nghiên cứu đặc điểm sinh học và lên men thu nhận kháng sinh được sử dụng theo tài liệu đã công bố [14, 43, 52]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập xạ khuẩn từ cây đinh lăng

Phương pháp phân lập các chủng xạ khuẩn được tiến hành phương pháp Bacon

và White năm 2000 với các bước tiến hành như sau: Các mẫu rễ, thân, lá đinh lăng được rửa sạch dưới vòi nước chảy, cắt nhỏ, sau đó ngâm trong cồn 70º từ 2 phút Mẫu sau khi ngâm được rửa sạch với nước tiệt trùng hai lần rồi ngâm lại vào dung dịch sodium hypochlorit (hay nước Javel) trong 3 phút, sau đó được rửa lại hai lần bằng nước tiệt trùng Nhặt mẫu đã làm sạch đặt vào đĩa Petri có chứa môi trường ISP2 và nuôi trong tủ ấm 30ºC từ 7 ÷ 14 ngày Trên mỗi mẫu, căn cứ vào hình thái khuẩn lạc của xạ khuẩn, tách và thuần khiết chủng sang ống nghiệm thạch nghiêng có chứa môi trường ISP2 Nuôi tiếp trong tủ ấm 7 ngày ở 30ºC [28]

2.2.2 Phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch

Sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, đếm số lượng khuẩn lạc trong mỗi đĩa petri, để từ đó tính số lượng tế bào trong 1g mẫu [4, 7]

Số lượng tế bào (CFU) có trong 1g đất được tính theo công thức sau:

CFU/g = A x 1/K x 1/V Trong đó:

A: số lượng khuẩn lạc trung bình mọc trên các đĩa thạch có cùng độ pha loãng (A nằm trong khoảng từ 30 ÷ 300 khuẩn lạc)

V: thể tích dịch nước đất pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch

K: độ pha loãng của dịch đất được cấy gạt trên thạch

2.2.3 Phương pháp thuần khiết và bảo quản giống

Do mật độ của khuẩn lạc giảm dần theo độ pha loãng của dịch huyền phù nên

ở các đĩa thạch có độ pha loãng thấp, các khuẩn lạc thường mọc tách rời nhau và có khả năng được hình thành từ 1 tế bào riêng rẽ

Dùng que cấy vô trùng lấy một ít tế bào từ các khuẩn lạc riêng rẽ trên đĩa cấy vào các ống thạch nghiêng có chứa môi trường ISP2, để vào tủ ấm 30ºC từ 7 ÷ 14 ngày, sau đó kiểm tra thật kỹ độ thuần chủng của các chủng giống, loại bỏ các ống bị nhiễm Giữ các ống giống này trong tủ lạnh từ 4 ÷ 6ºC Sau 2 ÷ 3 tháng cấy truyền lại 1 lần [4, 7]

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

• Phương pháp đặt thỏi thạch: Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên MT thạch

ISP2 trong đĩa petri ở 30oC Sau 5 ngày dùng khoan nút chai đục các thỏi (cục) thạch chuyển sang đĩa khác có MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định Đặt đĩa petri ở 6oC trong 6 giờ cho chất kháng sinh khuếch tán vào MT, sau đó đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong 16 giờ để vi sinh vật kiểm định phát triển Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn (mm) xung quanh thỏi thạch, vòng càng lớn thì hoạt

tính kháng khuẩn càng mạnh [4, 7]

• Phương pháp khuếch tán trong lỗ thạch: Phương pháp đục lỗ được sử dụng

để xác định hoạt tính kháng khuẩn có chứa trong MT lỏng ISP2 sau quá trình lên men Dùng thiết bị đục lỗ, đục trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, nhỏ vào

lỗ dung dịch cần thử Các bước tiếp theo làm như phương pháp cục thạch Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng đường kính vòng vô khuẩn (mm) xuất hiện xung quanh lỗ đã nhỏ dịch [4, 7]

• Phương pháp khoanh giấy lọc

Phương pháp này được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn trong dung môi Các khoanh giấy lọc có đường kính 6 mm được tẩm một lượng dịch kháng sinh (thường là 1 ml/10 khoanh giấy lọc) Sau đó sấy khô ở 40oC Đặt khoanh giấy lọc đã

tẩm dịch kháng sinh trên MT thạch đã cấy vi sinh vật kiểm định, các bước tiếp theo

giống phương pháp cục thạch [4, 7]

2.2.5 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

Nghiên cứu định tên chủng xạ khuẩn theo đặc điểm phân loại của Waksman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gause, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vật của Bergey, 1989

và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của chương trình xạ khuẩn quốc tế (ISP) năm

1966 và 1970

* Để quan sát đặc điểm hình thái của bào tử các chủng xạ khuẩn được nuôi trên

MT Gause2 có cắm lamen nghiêng trên mặt MT, ở nhiệt độ 30oC Sau 7 ÷ 14 ngày, quan sát khuẩn ty và hình dạng cuống sinh bào tử trên lamen bằng kính hiển vi quang học

* Đối với bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử bằng cách sử dụng lưới đồng có phủ lớp collodion đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có dính bào tử: Bề mặt bào tử được ký hiệu như sau: trơn nhẵn (Sm); gai (Sp);

xù xì, mụn tóc (W); tóc (H) Hình dạng chuỗi bào tử được ký hiệu như sau: thẳng hay lượn sóng (RF); hình móc câu (RA); dạng xoắn lò xo (S)

* Đặc điểm nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn được nuôi trên các Gause2, 48, ISP1, ISP2, ISP4, ISP6, ISP9 ở 30oC Sau 7, 14 và 21 ngày, quan sát khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra MT theo phương pháp của Tresner và Backus Sự hình thành sắc tố melanin: xạ khuẩn được nuôi trên MT ISP6 ở 28 và 37oC, quan sát màu của MT sau 24 giờ đến ngày thứ 14

* Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường lỏng ISP2 ở nhiệt độ 30C lắc 180 vòng/phút, sau thời gian 5 ngày ly tâm 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ 4C trong thời gian 10 phút để loại sinh khối, thu dịch Dịch sau

li tâm sẽ được nhỏ trên các môi trường có thạch có thêm các cơ chất: tinh bột để xác định hoạt tính amylase, casein để xác định hoạt tính protease, CMC (cacboxyl methyl cellulose) để xác định hoạt tính cenlulase Sau 24 giờ nuôi ở 30ºC, xác định vòng thủy phân cơ chất tinh bột bằng thuốc thử Lugol 1% (w/v) cho amylase; dung dịch acid tricloacetic 50% (w/v) xác định vòng thủy phân cơ chất casein bởi protease; dung

dịch Congo đỏ 0,5 % (w/v) để xác định vòng thủy phân cơ chất CMC bởi xenlulase Hoạt tính enzyme được xác định bằng giá trị D-d (mm), trong đó D là đường kính vòng thủy phân cơ chất, d là đường kính khuẩn lạc

* Khả năng sử dụng các nguồn cacbon các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP9 có bổ sung thêm 1% các nguồn đường tương ứng: glucose, saccarose, D-manitol, L-arabinose, raffinose, lactose, sorbitol, rhamnose, xylose, maltose, fructose Sau 7 ÷ 14 ngày nuôi ở nhiệt độ 300C quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn, với MT có nguồn cacbon là glucose (đối chứng dương) và không có nguồn cacbon (đối chứng âm)

2.2.6 Xác định sinh khối

Môi trường nuôi xạ khuẩn sau khi thu hồi được lọc bằng giấy lọc, rửa lại bằng nước cất vô trùng Lượng sinh khối có trên giấy lọc được xác định bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khi trọng lượng không đổi (sấy và cân giấy lọc trước

và sau khi lọc) [4]

2.2.7 Phân tích trình tự 16S rRNA của xạ khuẩn

Tách DNA tổng số của xạ khuẩn: Nuôi các chủng xạ khuẩn trên môi trường

ISP2 lỏng ở nhiệt độ 30C lắc 180 vòng/phút, sau 48 ÷ 72 giờ, hút 2 ml dịch vào ống eppendorf đem ly tâm lạnh ở 4°C, 8000 vòng/phút, trong 10 phút, loại bỏ dịch và thu sinh khối dưới đáy Bổ sung 1 ml TE, voltex, ly tâm 4°C, 8000 vòng/ phút, trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi (lặp lại 3 lần) Bổ sung 300 µl lysozyme nồng độ 10 mg/ml ủ

ở 65°C trong 5 phút Sau đó đun sôi trong vòng 5 phút Tiếp đến thu nhận DNA theo các bước thu nhận DNA thực hiện theo Kit, DNA thu được giữ ở 4°C

- Khuếch đại trình tự 16S rRNA: Trình tự 16S rRNA của xạ khuẩn được khuếch

đại bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi 27F và 1429R có trình tự như trong bảng 2.3 với các bước thể hiện như sau:

Bảng 2.2 Trình tự đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự

- Phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt:

Nhiệt độ Thời gian

Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1 % Kích thước của các đoạn DNA thu được sau phản ứng PCR được so sánh với thang