Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neuro inin 1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ---Phạm Thị Hồng Nhung NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO Đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

 -Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

 -Phạm Thị Hồng Nhung

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN THỤ THỂ NEUROKININ-1 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP TRÊN DÒNG TẾ BÀO CHO ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN DƯỢC PHẨM

Chuyên ngành : Di truyền học

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS.TS Đinh Đoàn Long

2 PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung

XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ

CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN Chủ tịch hội đồng đánh giá

Luận án Tiến sĩ

Thay mặt tập thể cán bộ hướng dẫn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Đinh Đoàn Long và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các tạp chí Khoa học - Công nghệ và các báo cáo hội nghị khoa học, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kì công trình nào khác Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 08 năm 2020

TÁC GIẢ

Phạm Thị Hồng Nhung

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi nhận được rất nhiều sự ủng hộ, giúp đỡ quí báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực, cùng bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Đinh Đoàn

Long và PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo

trong suốt quá trình tôi nghiên cứu và thực hiện luận án

Nghiên cứu này nhận được sự hỗ trợ từ đề tài “Nghiên cứu sản xuất

một số thụ thể ứng dụng trong sàng lọc và phát triển thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam”, mã số ĐT-PTNTĐ2011-G/04 do PGS.TS Đinh Đoàn Long

chủ trì Nếu không có sự hỗ trợ tài chính từ đề tài và sự hỗ trợ chuyên môn từ các nhóm nghiên cứu, tôi khó có thể hoàn thành các nội dung nghiên cứu của luận án Tôi cũng xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các nhóm nghiên

cứu do PGS.TS Võ Thị Thương Lan, PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS

Trịnh Tất Cường, PGS.TS Nguyễn Lai Thành, ThS Bùi Thị Vân Khánh

phụ trách Các thầy cô và các bạn trong các nhóm nghiên cứu này đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện nghiên cứu của mình

Tôi chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Phòng thí nghiệm trọng

điểm Công nghệ Enzym và Protein - Đại học Quốc gia Hà Nội đã luôn ủng

hộ và nhiệt tình giúp đỡ cho tôi có điều kiện tốt nhất khi tiến hành các thí nghiệm tại đây

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cán bộ Bộ môn Di truyền

học - Khoa Sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận án; đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi trong các buổi seminar khoa học, báo cáo chuyên đề và báo cáo tiểu luận tổng quan luận án

Trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu, tôi cũng luôn nhận được sự

Đại học Quốc gia Hà Nội cùng sự giúp đỡ của các đồng nghiệp tại Bộ môn Y Dược học cơ sở - Khoa Y Dược Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu

sắc cho sự ủng hộ và giúp đỡ đó

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình tôi, chồng tôi đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Hà Nội, tháng 08 năm 2020

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Phạm Thị Hồng Nhung

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG 8

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

MỞ ĐẦU 12

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 12

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 14

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 15

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 15

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17

1.1 THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN 17

1.1.1 Các dạng thụ thể và phối tử 17

1.1.2 Cấu trúc của GPCR 19

1.1.3 Cơ chế hoạt động của GPCR 21

1.1.4 Các phương pháp phân tích GPCR 23

1.2 TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ 26

1.2.1 Các phối tử tachykinin 26

1.2.2 Các dạng thụ thể neurokinin 28

1.3 SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO 32

1.3.1 Các dạng thụ thể neurokinin-1 ở người 32

1.3.2 Đáp ứng tế bào được kích hoạt bởi phối tử SP thông qua NK1R 35

1.3.3 Ứng dụng của các chất đối kháng NK1R 38

1.3.4 Phân tích chức năng thụ thể dựa vào thay đổi nồng độ Ca2+ nội bào 40

1.4 CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN THỤ THỂ TÁI TỔ HỢP 44

1.4.1 Hệ thống dịch mã phi tế bào 44

1.4.2 Hệ thống biểu hiện ở tế bào nhân sơ 45

1.4.3 Hệ thống biểu hiện ở nấm men 45

1.4.4 Hệ thống biểu hiện ở các tế bào côn trùng 46

1.4.5 Hệ thống biểu hiện ở tế bào động vật có vú 47

1.5 SƠ LƯỢC VỀ CÁC CÂY THUỐC VÀ HOẠT CHẤT ĐƯỢC THỬ NGHIỆM TRONG NGHIÊN CỨU 50

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 55

2.1.1 Các vector nhân dòng và biểu hiện 55

2.1.2 Các mồi và đoạn oligonucleotide dùng trong nghiên cứu 55

2.1.3 Các dòng tế bào và môi trường nuôi cấy 56

2.1.4 Tinh chất và dịch chiết methanol thực vật 56

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 59

2.2.1 Hóa chất nghiên cứu chính 59

2.2.2 Thiết bị và địa điểm nghiên cứu 60

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 60

2.3.1 Phát triển hệ thống vector SFV biểu hiện NK1R 62

2.3.2 Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ 67

2.3.3 Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R của người 68

2.3.4 Biểu hiện NK1R tái tổ hợp thông qua lây nhiễm SFV 69

2.3.5 Đánh giá mức độ biểu hiện và hoạt tính NK1R 70

2.3.6 Nghiên cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của một số dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp 72

2.3.7 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 74

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 76

3.1 THIẾT KẾ HỆ VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI 76

3.1.1 Thiết kế cặp mồi khuếch đại gen trong PCR 76

3.1.2 Thiết kế vector biểu hiện pSFV-KLEPT1.2 78

3.1.3 Tạo vector tái tổ hợp pSFV-KLEPT1.2-NK1 80

3.1.4 Tạo vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 83

3.1.5 Nhân dòng, tách chiết và bảo quản các vector 85

3.2 TẠO HẠT SFV MANG TRÌNH TỰ NK1R TÁI TỔ HỢP CỦA NGƯỜI 87

3.2.1 Phiên mã in vitro từ vector biểu hiện và vector hỗ trợ 87

3.2.2 Tạo hạt SFV tái tổ hợp từ tế bào BHK-21 88

3.3 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TRÊN MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 90

3.4 ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN NK1R TÁI TỔ HỢP TRÊN TẾ BÀO BUỒNG TRỨNG CHUỘT HAMSTER TRUNG QUỐC (CHO) 91

3.4.1 Đánh giá động học biểu hiện protein 91

3.4.2 Kiểm tra biểu hiện NK1R trên tế bào CHO qua lai Western 92

3.4.3 Phép thử chức năng thụ thể bằng Fura-2AM 94

3.5 NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO DỊCH CHIẾT METHANOL VÀ TINH CHẤT CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU VIỆT NAM TRÊN NK1R TÁI TỔ HỢP 95

3.5.1 Xác định các thông số dược lực học của chất chủ vận và chất đối kháng đặc hiệu NK1R 95

3.5.2 Đánh giá tương tác giữa thụ thể NK1R tái tổ hợp với dịch chiết methanol và tinh chất thu từ 10 loài dược liệu Việt Nam 97

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 104

4.1 PHÁT TRIỂN VECTOR SFV BIỂU HIỆN NK1R CỦA NGƯỜI

TRÊN TẾ BÀO CHO 104 4.2 NGHIÊN CỨU CÁC DẠNG BIẾN THỂ CỦA THỤ THỂ 113

4.3 NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ IN VITRO CÁC HOẠT CHẤT

HƯỚNG ĐÍCH THỤ THỂ NK1R TÁI TỔ HỢP 118 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 125 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 127 TÀI LIỆU THAM KHẢO 129 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

2D/3D Cấu trúc không gian 2 chiều/3 chiều

AP Aprepitant (chất đối kháng đặc hiệu của NK1R)

BHK Dòng tế bào thận chuột Hamster Baby (Baby Hamster Kidney)

BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine serum albumin)

cAMP AMP vòng (cyclic adenosine monophosphate)

cDNA DNA bổ sung với mRNA được tạo ra từ phản ứng phiên mã

ngược (complementary DNA) CHO Dòng tế bào buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc

(Chinese Hamster Ovary) CHO-NK1R Dòng tế bào CHO biểu hiện thụ thể NK1R tái tổ hợp

COS Dòng tế bào nguyên bào sợi thận khỉ

DMEM Môi trường Dulbecco’s Modified Eagle (DMEM Medium)

EC50 Nồng độ hiệu lực 50% (Median effective concentration)

EC80 Nồng độ hiệu lực 80% (so với hiệu lực tối đa - 100%)

E coli Chủng vi khuẩn Escherichia coli

eGFP Protein huỳnh quang lục mạnh (Enhanced Green Fluorescent

Protein) EGFR Thụ thể thúc đẩy tăng trưởng biểu mô (epidermal growth

factor receptor)

ER Mạng lưới nội chất (endoplasmic reticulum)

ERK Các kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (extracellular signal

regulated kinases) FBS Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum)

FDA Cục Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug

Agency) Fura-2 Amino acidopolycarboxylic

Fura-2AM Fura-2 acetoxymethyl este

GPCR Thụ thể kết cặp G-protein (G-protein coupled receptor) HEK Dòng tế bào thận phôi người (Human Embryonic Kidney

Cells) HeLa Dòng tế bào ung thư cổ tử cung người

IC50 Nồng độ ức chế 50% (Median inhibitory concentration)

IC50TB Nồng độ ức chế 50% trung bình

Kd Hằng số phân ly (Dissociation coefficient)

Ki Hằng số ức chế (Inhibitory coefficient)

LD50 Liều gây chết 50% (50% lethal dose)

MAPK Protein kinase hoạt hóa phân bào (mitogen-activated protein

kinases) MCS Vị trí nhân dòng đa điểm (Multicloning site)

MLC Chuỗi nhẹ của myosin (myosin regulatory light chain)

NCBI Trung tâm thông tin Công nghệ Sinh học Hoa Kỳ

(National Centre for Biotechnology Information)

NHS Dịch vụ y tế quốc gia của Anh (National Health Service) NK1R Thụ thể neurokinin 1 (neurokinin-1 receptor)

NK1R Trình tự mã hóa cho thụ thể neurokinin-1

OD Mật độ hấp thụ quang (Optical Density)

PBS Đệm PBS (Phosphate buffered saline)

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase (Polymerase Chain

Reaction) PI3K Phosphoinositide 3-kinase

pSFV-NK1R Vector pSFV mang trình tự NK1R

RFU Đơn vị huỳnh quang tương đối (Relative fluorescence unit) STAT Protein dẫn truyền tín hiệu và kích hoạt phiên mã (Signal

Transducer and Activator of Transcription Protein)

SP Substance P (chất chủ vận đặc hiệu của NK1R)

U937 Dòng tế bào ung thư bạch cầu đơn nhân người

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc các tachikinin của người 27

Bảng 1.2 Công dụng của các cây thuốc dùng trong nghiên cứu 50

Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 55

Bảng 2.2 Trình tự các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu 56

Bảng 2.3 Danh mục cây thuốc trong nghiên cứu và vị trí thu mẫu 67

Bảng 2.4 Điều kiện và thành phần của phản ứng nối và tạo DNA đầu bằng nhờ enzyme phân đoạn Klenow 63

Bảng 2.5 Thành phần và điều kiện phản ứng nối đoạn chèn vào vector pSFV 66 Bảng 2.6 Thành phần và điều kiện phản ứng colony PCR sàng lọc khuẩn lạc

có vector chứa đoạn chèn đúng chiều 65

Bảng 2.7 Chế độ xung điện đồng biến nạp RNA hệ SFV vào tế bào BHK-21

bằng thiết bị Gene pulser Xcell II (Biorad) 69

Bảng 3.1 Thông số của các cặp mồi tự thiết kế 76

Bảng 3.2 Kết quả tách plasmid 86

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các họ GPCR người và vị trí của NK1R 20

Hình 1.2 Cấu trúc chung của 3 họ thụ thể GPCR chính 21

Hình 1.3 Truyền tín hiệu từ GPCR qua thay đổi cấu trúc G-protein 22

Hình 1.4 Hoạt động của GPCR 23

Hình 1.5 Cấu trúc của thụ thể neurokinin-1 32

Hình 1.6 So sánh cấu trúc và đáp ứng tế bào của thụ thể NK1R có chiều dài đầy đủ và dạng ngắn 34

Hình 1.7 Sự dẫn truyền tín hiệu thông qua NK1R 36

Hình 1.8 Sự giải phóng Ca2+ thông qua inositol 1,4,5-trisphosphate 41

Hình 1.9 Những con đường duy trì nồng độ Ca2+ tế bào chất ở mức thấp 42

Hình 1.10 Tế bào cơ trơn nhuộm Fura-2 và kích thích với Angiotensn II 43

Hình 1.11 Các hệ thống vector biểu hiện xây dựng từ hệ gen SFV 48

Hình 1.12 Công thức phân tử và cấu trúc không gian 2 chiều của capsaicin, piperine, rotundine và rutin 52

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 61

Hình 2.2 Sơ đồ tạo vector cải biến pSFV-KLEPT1.2 62

Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-KLEPT1.2-NK1 66

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm phát triển vector pSFV-EGFP-NK1 67

Hình 2.5 Cách bố trí phép thử chức năng NK1R trên đĩa 96 giếng 73

Hình 3.1 Vị trí các mồi dùng nhân dòng đoạn chèn NK1R trong vector pSFV2-EGFP-NK1 và pSFV-KLEPT1.2-NK1 77

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự đoạn cải tiến trong vector pSFV-KLEPT1.2 79

Hình 3.3 Kết quả điện di trình tự NK1R thu được thông qua PCR trên khuôn pJET1.2-NK1 và plasmid pSFV-KLEP1.2 80

Hình 3.4 Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp

pSFV-KLEPT1.2-NK1 81

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm DNA tinh sạch sau khi cắt mở vòng pSFV2 và pEGFP-NK1 bằng XhoI và NotI 85

Hình 3.6 Kết quả sàng lọc khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pSFV-EGFP-NK1 84

Hình 3.7 Kiểm tra chất lượng DNA plasmid được mở vòng và sản phẩm RNA được phiên mã in vitro trên gel agraose 1% 87

Hình 3.8 Ảnh chụp từ kính hiển vi soi nổi tế bào BHK sau chuyển gen 18 giờ và 42 giờ 88

Hình 3.9 Biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào 90

Hình 3.10 Ảnh hiển vi huỳnh quang tế bào CHO được lây nhiễm SFV

mang trình tự mã eGFP tái tổ hợp 92

Hình 3.11 Ảnh chụp từ kính hiển vi tế bào CHO không nhiễm virus và tế bào CHO nhiễm SFV 93

Hình 3.12 Ảnh lai Western với kháng thể kháng beta-tubulin và kháng thể kháng neurokinin-1 của tế bào CHO tự nhiên và tế bào CHO nhiễm hạt SFV-NK1R 93

Hình 3.13 Sự thay đổi Ca2+ nội bào của tế bào CHO và CHO-NK1R theo thời gian sau khi bổ sung SP 95

Hình 3.14 Đường cong đáp ứng theo liều thể hiện hoạt tính biểu hiện chức năng của thụ thể NK1R tái tổ hợp của người 96

Hình 3.15 Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R tái tổ hợp của dịch chiết methanol

Bình vôi, Hồ tiêu và Hòe 99

Hình 3.16 Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Cỏ mần trầu, Sâm vũ diệp và tam thất hoang, Râu mèo và Đảng sâm 100

Hình 3.17 Hoạt tính ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết methanol Canhkina

và Ba kích 101

Hình 3.18 Mối tương quan giữa hàm lượng tinh chất được phân tích trong dịch chiết methanol và hoạt độ ức chế thụ thể NK1R của dịch chiết 102

Hình 3.19 Hoạt độ ức chế thụ thể NK1R được hoạt hóa bởi SP 10-7M với các

tinh chất có trong dược liệu Việt Nam 103

Hình 4.1 Kết quả so sánh trình tự protein suy diễn từ cDNA mã hóa NK1R với trình tự protein công bố trên Ngân hàng gen NCBI 114

Hình 4.2 Nghiên cứu di truyền dược lý các thuốc hướng đích GPCR 117

Hình 4.3 Phương pháp sử dụng thụ thể GPCR trong sàng lọc dược chất

có nguồn gốc tự nhiên 123

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Thụ thể neurokinin-1 (viết tắt là NK1R) nói riêng và thụ thể kết cặp với G-protein (viết tắt là GPCR) nói chung là đích tác dụng quan trọng của rất nhiều thuốc hiện nay Khi NK1R tương tác với chất chủ vận nội sinh sẽ dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi về thần kinh trung ương, gây ra trạng thái lo âu và các triệu chứng giống trầm cảm Ngoài ra, NK1R tham gia kích thích co cơ trơn và điều hòa các phản ứng miễn dịch của cơ thể Trên cơ sở những nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của NK1R, nhiều loại thuốc giảm đau cho các bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, chống nôn cho các bệnh nhân ung thư… đã và đang được các hãng dược phẩm đầu tư phát triển và thương mại hóa

Sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học hướng đích GPCR phục vụ nghiên cứu phát triển thuốc là nhu cầu mang tính thời sự trong các nghiên cứu dược lý học phân tử Có một số lượng lớn các hợp chất mới có nguồn gốc tự nhiên, bán tổng hợp hoặc tổng hợp (được gọi chung là các thuốc thử) cần xác định đích phân tử và cơ chế dược lý tác động lên cơ thể Hiện nay, việc sử dụng các GPCR tự nhiên thường gặp khó khăn do các dòng tế bào GPCR tự nhiên biểu hiện ở mức độ thấp, việc thu mẫu và phân lập từ tế bào người gặp nhiều hạn chế về mặt đạo đức cũng như kỹ thuật Ngoài ra, các GPCR có nhiều dạng biến thể (subtype) khác nhau, có thể dẫn đến những nhận định nhầm về khả năng tương tác với các thuốc thử Tuy nhiên, những khó khăn trên có thể khắc phục bằng cách sử dụng các tế bào biểu hiện GPCR tái tổ hợp của người GPCR tái tổ hợp biểu hiện ở mức độ cao và đầy đủ hoạt tính sẽ cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho các thí nghiệm xác định hoạt tính liên kết với phối tử cũng như chức năng liên kết của các G-protein Chính vì

vậy, xây dựng mô hình biểu hiện mạnh GPCR tái tổ hợp của người trên các hệ thống tế bào động vật là nghiên cứu cấp thiết và có giá trị thực tiễn trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Mặc dù nhiều hệ thống biểu hiện đã được phát triển nhằm biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào nhân sơ đến nhân chuẩn, đến nay biểu hiện hiệu suất cao và chủ động các protein xuyên màng tế bào vẫn là một thách thức lớn Sự biểu hiện GPCR mức độ thấp có liên quan chủ yếu tới yêu cầu biến đổi sau dịch mã, sự cuộn gập protein, vận chuyển nội bào và khả năng gây độc tính tế bào của thụ thể Có một thuận lợi là các GPCR dù đa dạng về trình

tự amino acid song có cấu trúc không gian tương đồng lớn (đều là đơn chuỗi peptide với 7 miền xuyên màng kị nước) Chính vì vậy, mô hình biểu hiện thành công cho một thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho rất nhiều thụ thể khác, đặc biệt là các thụ thể cùng họ GPCR Trong các hệ thống biểu hiện,

hệ thống biểu hiện của Semliki Forest Virus (viết tắt là SFV) được ghi nhận là một trong những hệ thống biểu hiện protein màng tế bào động vật trong thời gian nhanh nhất Theo tài liệu, hệ thống này đã được một số hãng dược phẩm (như Hoffman La Roche) ứng dụng biểu hiện cho hơn 100 GPCR phục vụ cho nghiên cứu và phát triển thuốc, nhưng các dòng tế bào tái tổ hợp không được thương mại hóa trên thị trường Trong bối cảnh đó, việc ứng dụng và làm chủ được hệ thống biểu hiện SFV hứa hẹn cung cấp một công cụ sinh học hữu ích trong nghiên cứu y sinh dược học ở Việt Nam

Từ cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên, tôi tiến hành thực hiện luận án:

“Nghiên cứu thiết kế vector biểu hiện thụ thể neurokinin-1 người tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO định hướng ứng dụng trong nghiên cứu và phát triển dược phẩm”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu tổng quát

Biểu hiện được NK1R tái tổ hợp của người trên dòng tế bào tự nhiên vốn không biểu hiện thụ thể này nhằm sàng lọc hoạt chất và dịch chiết dược liệu hướng đích NK1R Qua đó, tạo cơ sở xây dựng mô hình biểu hiện cho các GPCR tái tổ hợp khác phục vụ cho các nghiên cứu và phát triển dược phẩm ở Việt Nam

2.2 Mục tiêu cụ thể

Mục tiêu 1: Xây dựng được quy trình kỹ thuật biểu hiện NK1R tái tổ hợp của

người thông qua hệ thống biểu hiện SFV trên dòng tế bào động vật

Mục tiêu 2: Đánh giá được hoạt động chức năng của NK1R tái tổ hợp biểu

hiện trên tế bào động vật

Mục tiêu 3: Áp dụng được tế bào động vật biểu hiện thụ thể NK1R trong

sàng lọc một số dược liệu tiềm năng

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Phát triển hệ vector SFV biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người

Nội dung 2: Tạo hạt SFV mang trình tự NK1R tái tổ hợp của người

Nội dung 3: Đánh giá biểu hiện NK1R trên một số dòng tế bào động vật Nội dung 4: Đánh giá biểu hiện và chức năng của NK1R người tái tổ hợp

trên tế bào CHO

Nội dung 5: Tạo ra một lượng lớn tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của

người với đầy đủ chức năng, ứng dụng bước đầu trong nghiên

cứu dược lý in vitro dịch chiết methanol và tinh chất của 10 loài

dược liệu Việt Nam trên NK1R tái tổ hợp

4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống biểu hiện GPCR người tái tổ hợp, từ xây dựng vector chuyển gen mã hóa NK1R của người đến biểu hiện thụ thể tái tổ hợp trên dòng tế bào CHO Kết quả

đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất hướng đích NK1R in vitro của luận

án có giá trị khoa học và thực tiễn, có tính mới trên thế giới Dòng tế bào động vật biểu hiện thụ thể tái tổ hợp của người là công cụ hiện đại và hiệu quả phục vụ cho các nghiên cứu y sinh học

Hệ thống biểu hiện SFV đã được thiết lập để tạo được dòng tế bào CHO biểu hiện mạnh NK1R người lần đầu tiên ở Việt Nam Đây là cơ sở biểu hiện thụ thể có khả năng mở rộng áp dụng cho nhiều GPCR khác

Xây dựng được mô hình sàng lọc in vitro các hoạt chất hướng đích

NK1R phục vụ các các nghiên cứu sàng lọc dược phẩm Đây là một công cụ mới và hiện đại phục vụ cho các nghiên cứu dược lý, phù hợp với định hướng phát triển các thuốc dược liệu của Việt Nam hiện nay

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ GIÁ TRỊ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

Về mặt khoa học

Trình tự NK1R của hai bệnh nhân Việt Nam đã được biểu hiện thành

công trên dòng tế bào CHO, mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật biểu hiện ổn định các thụ thể tái tổ hợp phục vụ cho các nghiên cứu về cấu trúc phân tử,

dược lý in vitro, góp phần định hướng cho các nghiên cứu phát triển thuốc ở các giai đoạn sau (nghiên cứu dược lý in vivo, nghiên cứu lâm sàng, nghiên

cứu dược động học, )

Cơ sở khoa học và hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen, biểu hiện protein tái tổ hợp với hệ thống biểu hiện SFV đã được khẳng định thông qua việc

phát triển thành công vector SFV mang trình tự NK1R của người và biểu hiện

hiệu quả cao trên dòng tế bào CHO

Luận án, các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ trong nước và quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy

Về mặt thực tiễn

Tế bào biểu hiện NK1R tái tổ hợp của người với đầy đủ hoạt tính có thể ứng dụng để sàng lọc các các hoạt chất hướng đích NK1R thu từ các cây dược liệu Việt Nam Nghiên cứu mở ra triển vọng ứng dụng mới trong thực tiễn phát triển thuốc dược liệu, tiêu chuẩn hoá và hiện đại hoá các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên, góp phần phát huy thế mạnh về nguồn tài nguyên dược liệu phong phú của Việt Nam

Không chỉ biểu hiện hiệu quả protein thụ thể, hệ thống SFV được xây dựng trong nghiên cứu này còn là công cụ hữu ích để chuyển gen và biểu hiện các loại protein khác nhau trên các dòng tế bào động vật Nhiều nghiên cứu khác nhau trên thế giới đã cho thấy đây cũng là công cụ có tiềm năng ứng dụng trong liệu pháp gen trị liệu ung thư hay công nghệ sản xuất vắc-xin

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 THỤ THỂ KẾT CẶP G - PROTEIN

1.1.1 Các dạng thụ thể và phối tử

Trong quá trình tồn tại và phát triển, tế bào liên tục tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào là các kích thích vật lý (ánh sáng, nhiệt độ hay áp lực) hay các kích thích hóa học (các peptide, chất dẫn truyền thần kinh, các pheromone, các nucleotide và các hợp chất phân tử nhỏ khác) Thụ thể là một lớp lớn các protein có chức năng tiếp nhận các tín hiệu ngoại bào được gọi là phối tử (ligand), truyền hóa và thúc đẩy quá trình truyền tín hiệu nội bào dẫn đến đáp ứng tế bào giúp cơ thể phản ứng kịp thời với sự thay đổi của môi trường [9] Chính vì vậy, thụ thể có vai trò rất quan trọng, tham gia vào nhiều cơ chế sinh

lý trong các tế bào cũng như giữa các tế bào với nhau

Dựa vào tác động lên tế bào mà phối tử có thể chia thành 2 nhóm chính

là chất chủ vận (agonist) và chất đối kháng (antagonist) [7, 144] Chất chủ vận

là những chất khi gắn vào thụ thể sẽ hoạt hóa thụ thể gây ra đáp ứng tế bào Các chất chủ vận được chia thành sáu nhóm như sau:

Nhóm 1: Chất chủ vận nội sinh (endogenous agonist): Xuất hiện tự nhiên trong cơ thể, có khả năng liên kết và kích hoạt thụ thể

Nhóm 2: Chất siêu chủ vận (super agonist): Có khả năng gắn kết với thụ thể và tạo ra phản ứng tối đa, lớn hơn so với các chất chủ vận nội sinh khác

Nhóm 3: Chất chủ vận toàn phần (full agonist): Kích hoạt thụ thể và tạo

ra hiệu quả đầy đủ tương đương với phối tử nội sinh

Nhóm 4: Chất chủ vận một phần (partial agonist): Liên kết và kích hoạt thụ thể, nhưng chỉ gây ra đáp ứng một phần so với các chất chủ vận nội sinh

Nhóm 5: Chất chủ vận ngược (inverse agonist): Liên kết với thụ thể và gây ra đáp ứng tế bào đối ngược với chất chủ vận

Nhóm 6: Chất chủ vận không thể đảo ngược (irreversible agonist): Liên kết và kích hoạt các thụ thể vĩnh viễn

Ngược lại với chất chủ vận, chất đối kháng khi gắn vào thụ thể sẽ ngăn thụ thể liên kết với chất chủ vận, qua đó không gây ra đáp ứng tế bào Chất đối kháng chia thành 2 nhóm như sau:

Nhóm 1: Chất đối kháng cạnh tranh (competitive antagonism): Liên kết chọn lọc và không gây kích hoạt thụ thể đặc hiệu, đồng thời ngăn chất chủ vận liên kết với thụ thể (do có cùng vị trí liên kết với chất chủ vận)

Nhóm 2: Chất đối kháng không cạnh tranh (non - competitive antagonism): Chặn đáp ứng bởi chất chủ vận sau khi xảy ra tương tác thụ thể của chất chủ vận Chất đối kháng không cạnh tranh làm gián đoạn sự liên kết giữa thụ thể và chất gây hiệu ứng (effector, thường là những enzyme như adenylyl cyclase, phospholipase C và A2 hoặc kênh ion)

Có bốn siêu họ thụ thể chính bao gồm thụ thể kênh ion đóng mở bởi phối tử, thụ thể kết cặp G-protein (GPCR), thụ thể tế bào chất - nhân và thụ thể tyrosine kinases [122] Trong đó, GPCR là siêu họ thụ thể lớn và đa dạng nhất ở người [105] Theo thống kê năm 2018, 108 loại GPCR là đích tác dụng của 475 (chiếm khoảng 34%) thuốc được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ (viết tắt là FDA) phê duyệt Tổng doanh thu của các thuốc này trên thế giới lên đến 180 tỷ đô la Mỹ, tương ứng 27% thị phần mỗi năm [62]

Do sự liên quan đáng kể đến sinh lý bệnh của cơ thể và giá trị trong khám phá

dược lý, các GPCR hiện nay là đích nghiên cứu thuốc có giá trị và được quan tâm nhiều nhất

1.1.2 Cấu trúc của GPCR

Ở người, các GPCR được biểu hiện trên hầu hết các tế bào và ước tính

có khoảng 950 GPCR khác nhau do gần 800 gen mã hóa (tương ứng khoảng 4% gen mã hóa protein) [61] Dựa vào sự tương đồng cấu trúc và nguồn gốc tiến hóa, GPCR ở người chia làm 6 họ chính là họ A (họ Rhodopsin), họ B1 (họ Secretin), họ B2 (họ Adhesion), họ C (họ Glutamate), họ F (họ Frizzled)

và họ T (họ Taste 2) (xem Hình 1.1) [46, 138] Đến nay, 46 thụ thể đã được

xác định cấu trúc nhưng chỉ có 11 thụ thể có cấu trúc ở trạng thái hoạt hóa được xác định, gần 90% các thụ thể không liên quan khứu giác vẫn thiếu cấu trúc tinh thể Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu GPCR phải sử dụng mô hình thụ

thể xây dựng từ các chương trình tin sinh để sàng lọc in silico, tối ưu hoá

thuốc [177]

Phần lớn các GPCR đều có cấu tạo chung gồm một chuỗi polypeptide với cấu hình không gian gồm 7 chuỗi xoắn  xuyên màng sinh chất (transmembrance), đầu amino, đầu carboxyl, 3 vòng ngoại bào (exoloop) và 3 vòng nội bào (endoloop) Cấu tạo chung của ba họ thụ thể chính A, B và C

được mô tả ở hình Hình 1.2 Các thụ thể khác nhau có các biến đổi sau dịch

mã khác nhau như glycosyl, hình thành cầu disulfide và palmitoyl hóa ở các

vị trí đặc biệt Kích thước của các loại GPCR cũng rất khác nhau, từ dưới 300 amino acid như thụ thể adrenocorticotropin tới hơn 1100 amino acid như thụ thể metabotropic glutamate Tuy nhiên, sự giống nhau về cấu trúc cũng như các G-protein giữa các loài sinh vật từ nấm men đến người cho thấy các thụ thể GPCR và các G-protein có vai trò sinh lý tế bào cực kỳ quan trọng và có thể có nguồn gốc tiến hóa chung từ rất sớm [151]

Hình 1.1 Cây phát sinh chủng loại các họ GPCR người và vị trí của NK1R (mũi tên đỏ)

Các nhánh được mã hoá màu dựa trên dạng phối tử, các hình tròn xám trước tên receptor chỉ ra số lượng các phối tử (trắng: 0, xám nhạt:> 100, xám:> 500 và màu đen> 1000) [138]

Hình 1.2 Cấu trúc chung của 3 họ thụ thể GPCR chính [51] Một chuỗi

polypeptide với cấu hình gồm 7 chuỗi xoắn  xuyên màng sinh chất (đánh số từ

1-7), đầu amino (N), đầu carboxyl (C), 3 vòng ngoại bào và 3 vòng nội bào

1.1.3 Cơ chế hoạt động của GPCR

Quá trình truyền tín hiệu của GPCR có thể tóm lược qua ba giai đoạn

chính: (1) Tiếp nhận tín hiệu: phối tử đính kết vào thụ thể hình thành phức hệ phối tử - thụ thể; (2) Truyền hóa nội bào: GPCR thay đổi cấu hình, hoạt hóa protein liên kết với nucleotide guanine (G-protein); (3) Phục hồi trạng thái

ban đầu: Điều hòa bởi sự tương tác giữa các miền cấu trúc của GPCR với các

protein nội bào [58]

Tín hiệu từ GPCR được truyền đi bước đầu thông qua thay đổi cấu

hình G-protein (mô tả trong Hình 1.3) G-protein dị hình gồm 3 tiểu phần:

Gα liên kết với màng, hai tiểu phần di động Gβ và Gγ Các nhà nghiên cứu

đã nhân dòng và xác định được trình tự của 16 Gα, 5 Gβ và 12 Gγ thành công [39] Thông thường khi thiếu các chất chủ vận, GPCR ở trạng thái nghỉ ngơi hay ái lực thấp và G-protein ở dạng bất hoạt có Gα liên kết với GDP Chất chủ vận sau khi liên kết thụ thể thường làm thay đổi cấu hình thụ thể theo cơ chế dị lập thể, phá vỡ các liên kết ion giữa các chuỗi xoắn  thứ 3 và thứ 6 của GPCR dẫn đến hoạt hóa các G-protein [18] [83] Lúc này Gα sẽ

giải phóng GDP, cho phép GTP liên kết với nó gây ra sự thay đổi cấu hình vùng liên kết với phức hợp Gβγ Kết quả của việc kết hợp với GTP là G-protein phân tách thành hai phần: Gα và phức hợp Gβγ ở dạng hoạt hóa Sự thay đổi của Gα cũng cho phép nó tương tác với các protein đích Phức hợp Gβγ dù không thay đổi cấu hình, nhưng vùng liên kết với Gα trước đây giờ

có thể liên kết với protein đích thứ hai Các protein đích của các tiểu phần là các enzyme hoặc các kênh ion trong màng tế bào và chúng có thể truyền tiếp tín hiệu đi Các Gα là một GTPase có khả năng thủy phân GTP liên kết với

nó thành GDP, tái kết hợp với phức Gβγ để tái hình thành G-protein dạng bất hoạt (sự giải nhạy cảm thụ thể - receptor desensitization) Thời gian Gα

và phức hợp Gβγ tách rời và ở dạng hoạt hóa thường ngắn, phụ thuộc vào tốc độ thủy phân GTP của Gα

Hình 1.3 Truyền tín hiệu từ GPCR qua thay đổi cấu trúc G-protein [12]

Hình 1.4 Hoạt động của GPCR [179]

GPCR sau khi gắn kết và hoạt hóa bởi chất chủ vận, sự hình thành chất truyền tin thứ hai xảy ra rất nhanh chóng, có thể chỉ diễn ra trong vài phút Tùy thuộc vào loại Gα mà thụ thể bắt cặp (Gαs, Gαi/o, Gαq/11 hay Gα11/12), tín hiệu được truyền qua tế bào theo một trong hai con đường chính: (1) tăng nồng độ cAMP nội bào; (2) tăng nồng độ Ca2+ nội bào bởi inositol (1,4,5)-triphosphat (IP3) như mô tả trong Hình 1.4

1.1.4 Các phương pháp phân tích GPCR

Ngành dược phẩm đã đầu tư rất nhiều nỗ lực và nguồn lực để phát hiện các thuốc hướng đích GPCR vì GPCR được xem là những đích điều trị hấp dẫn Trong đó, việc thiết lập được các phân tích GPCR cho phép sàng lọc hiệu quả các thư viện hợp chất lớn là nhu cầu cấp thiết Nhiều phương pháp phân tích GPCR đã được phát triển, từ các phân tích liên kết thụ thể - phối tử đơn

giản đến các phân tích chức năng thụ thể chuyên sâu Dưới đây, tôi sẽ tổng quan về các phương pháp phân tích GPCR chính được sử dụng hiện nay

Phân tích liên kết thụ thể (Receptor binding assay)

Phân tích liên kết thụ thể với phối tử được đánh dấu huỳnh quang hoặc phóng xạ có thể áp dụng với tất cả GPCR, sử dụng để mô tả rất chi tiết sự tương tác giữa thụ thể và phối tử của nó, chẳng hạn như ái lực của phối tử với thụ thể, tốc độ liên kết/ phân ly và mật độ của thụ thể trong mô hoặc tế bào [27] Tuy nhiên, sự không sẵn có các phối tử đánh dấu bằng cách gắn phóng

xạ hoặc huỳnh quang đã hạn chế rất nhiều việc áp dụng phân tích này Ngoài

ra, phân tích này không phân biệt được hợp chất ứng viên là chất chủ vận, chất đối kháng hay chất chủ vận đảo ngược Để đánh giá được tác động lên tế bào của phối tử, chúng ta cần thực hiện thêm các phân tích thứ cấp khác như các phân tích chức năng thụ thể

Phân tích chức năng phụ thuộc G-protein (G-protein dependent functional assays)

Phân tích chức năng phụ thuộc G-protein bao gồm các phân tích đánh giá sự hoạt hóa G-protein hoặc các sự kiện qua trung gian G-protein bao gồm quá trình tạo ra chất truyền tín hiệu và kích hoạt thụ thể [83] Phân tích liên kết GTPγS (GTPγS binding assay) áp dụng với các GPCR kết cặp protrin

Gαi/o là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để đánh giá sự hoạt hóa thụ thể của G- protein Phương pháp này cho phép đo trực tiếp sự thay đổi nucleotide guanine của G-protein sau khi GPCR kích hoạt, phân biệt được chất chủ vận, chất đối kháng, chất chủ vận đảo ngược Tuy nhiên, phân tích này đòi hỏi bước lọc qua sợi thủy tinh để tách [35S]-GTPγS dạng tự do và liên kết, do đó giới hạn hiệu năng của phân tích [59]

Trong nhóm phương pháp phân tích chức năng phụ thuộc G-protein, phân tích sự thay đổi nồng độ của các chất truyền tin trung gian sau khi thụ thể tương tác với phối tử được đánh giá là các phương pháp sàng lọc có nhiều

ưu thế Ưu điểm đầu tiên của các phương pháp này là sàng lọc hiệu năng cao

và phân tích được trên tế bào sống Sự thay đổi nồng độ các chất truyền tin có thể đo được bằng các máy đo tín hiệu huỳnh quang Phân tích nồng độ cAMP được áp dụng với các GPCR kết cặp với Gαs hay Gαi/o Ưu điểm của phân tích cAMP là rất nhạy nhưng có nhược điểm là cần biết cơ chế kết cặp, không phù hợp với các GPCR chưa rõ phối tử [183] Phân tích nồng độ IP3 và Ca2+ áp dụng với các GPCR kết cặp Gαq Phương pháp đo IP3 phân tích tốt cho các chất chủ vận liên kết chậm nhưng khó mở rộng quy mô phân tích Phương pháp đo Ca2+ cóưu điểm là trong một phân tích phân biệt tốt chất chủ vận, chất đối kháng và chất điều biến dị lập thể Ngoài nhiều dòng thuốc nhuộm liên kết với Ca2+, các cảm biến sinh học nhạy cảm với Ca2+ cũng đã được phát triển cung cấp thêm một công cụ phân tích mới [198] [188]

Phân tích chức năng không phụ thuộc G-protein

Phương pháp phân tích chức năng không phụ thuộc G-protein được sử dụng phổ nhiều nhất là phân tích nội bào hóa thụ thể (receptor internalization assay), phân tích liên kết β-arrestin (β-arrestin recruitment assay) và các phân tích toàn bộ tế bào không đánh dấu (label-free whole cell assays) [198] Phân tích nội bào hóa thụ thể có và phân tích liên kết β-arrestin dựa trên hiện tượng giải mẫn cảm GPCR (GPCR desensitization) [155] Phân tích nội bào hóa thụ thể phân tích được nhiều thông số dựa trên các máy thu nhận hình ảnh đặc biệt; phân tích chức năng cho các tế bào sống nhưng có nhược điểm là hiệu năng thấp, cần các thiết bị phân tích đặc thù đắt tiền, không sẵn có trong đa số các phòng thí nghiệm ở Việt Nam Phân tích liên kết β-arrestin có ưu điểm là

áp dụng được trên các thụ thể chưa tìm được phối tử và chưa biết chất truyền

tin thứ hai, tuy nhiên có độ nhạy thấp và cần thêm các phân tích khác để làm

rõ cơ chế hoạt động của thụ thể [82] [171] Phân tích trên tế bào không đánh dấu thường sử dụng cảm biến sinh học đo tín hiệu như điện, nhiệt, từ tính thay đổi do phối tử gây ra trong các tế bào sống Tuy nhiên, phân tích trên tế bào không đánh dấu được đánh giá là có tỉ lệ âm tính giả và dương tính giả cao; cần thiết bị đặc biệt và đắt tiền; cần kết hợp thêm các phân tích khác mới làm rõ được cơ chế hoạt động của GPCR [42]

1.2 TACHIKININ VÀ CÁC THỤ THỂ NEUROKININ

1.2.1 Các phối tử tachykinin

Tachykinin là các phối tử có bản chất là các peptide, có vai trò như các chất dẫn truyền thần kinh Các phối tử tachykinin có trình tự đầu tận cùng cacboxyl chung là Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2 với X là amino acid vòng thơm hoặc amino acid không phân cực và kị nước Đầu cacboxyl có vai trò trong hoạt hóa các thụ thể Chỉ có 3 tachykinin chính được phân lập và xác định cấu trúc ở tế bào động vật cho đến nay là Substance P (viết tắt là SP), neurokinin

A (NKA) và neurokinin B (NKB) NKA có 2 dạng kéo dài tại đầu tận cùng amino là neuropeptide K (NPB) và neuropeptide γ (NPγ) Ngoài ra còn một số tachykinin phụ khác như hemokinin-1 (HK-1) và dạng kéo dài đầu amino của

nó là endokinin A (EKA) và EKB

SP, NKA, NKB và NPK đã được phân lập, giải trình tự Các phân tử

này được tổng hợp từ các gen Tac Ba gen mã hóa cho các tachykinin bao gồm Tac1 (hay Ppt-a), Tac3 (hay Ppt-b) và Tac4 (hay Ppt-c) Tac1 mã hóa

SP, NKA, NPK và NPγ; Tac3 mã hóa NKB; Tac4 mã hóa HK-1 và EKA, EKB [174] Gen Tac2 ban đầu được xác định mã hóa cho tiền thân của NKA, tuy nhiên sau đó, nó được xác định có trình tự giống hệt với Tac1 Cấu trúc cụ

thể của các tachikinin người được trình bày trong Bảng 1.1

Bảng 1.1 Cấu trúc các tachikinin của người [174]

SP được phát hiện bởi Von E và cộng sự năm 1931, đây được coi là neuropeptide tiên phong vì những kiến thức thu được từ các nghiên cứu về tachykinin đã cho chúng ta hiểu về nhiều loại neuropeptide khác Các

tachikinin do hai gen PTT-A và PPT-B mã hóa Gen PPT-A mã cho SP, NKA

và neuropeptide K và neuropeptide 1, trong khi đó gen PPT-B mã cho NKB Quá trình cắt - nối RNA phiên mã từ PPT-A sẽ tạo ra 3 loại mRNA khác nhau

với các điểm cắt đặc hiệu giữa Lys-Arg, Arg-Arg và Arg-Lys được thực hiện bởi 6 nhóm endoproteases [173]

Giống như các chất dẫn truyền thần kinh khác, các tachykinin được giải phóng từ đầu tận cùng của tế bào thần kinh để đáp ứng với các kích thích sinh

lý hoặc phi sinh lý khác nhau Tại các đầu dây thần kinh, đặc biệt là ở não và

hệ thần kinh tự chủ (còn được gọi là hệ thần kinh thực vật), các chất truyền tín hiệu khác nhau thường được cho rằng giải phóng đồng thời [66] Sau khi

được giải phóng, các tachykinin có thể bị gắn thêm nhóm chức, cắt ngắn hoặc bất hoạt bởi các enzyme Với SP, có 3 enzyme biến đổi chính là dipeptidyl-amino peptidase, postproline endopeptidase và cathepsin D [146]

Các tachykinin có mặt trên hệ thần kinh và miễn dịch, điều chỉnh một loạt các quá trình sinh lý cực kỳ đa dạng và liên quan đến các điều kiện bệnh

lý quan trọng Ở động vật có vú, các tachykinin phân bố chủ yếu ở mô thần kinh, tại một số vùng não nhất định, nồng độ có thể đạt đến nanomole [68] Các tế bào thần kinh chứa tachykinin có mặt trong các cơ quan bạch huyết như tuyến ức, lá lách, hạch bạch huyết, các khối u lymphô trong phổi và niêm mạc mũi Tại ruột, các tachykinin bao gồm SP, NKA và các dạng biến thể của các tachykinin này có mặt phần lớn tại hệ thần kinh ruột Trong hệ hô hấp, SP

và NKA được tìm thấy trong khí quản và phế quản [111] Tại một số loài khác SP và NKA được tìm thấy xuất hiện ở bàng quang tiết niệu, niệu quản

và xương chậu thận [54] Việc nhận ra rằng các tachykinin là trung gian cho các quá trình bệnh lý, nền tảng của các rối loạn quan trọng trong cơ thể đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu nỗ lực tìm và phát triển các chất đối kháng của chúng trong ngành dược phẩm

1.2.2 Các dạng thụ thể neurokinin

Thụ thể neurokinin là thụ thể có phối tử là các tachykinin, thuộc họ thụ thể A (họ rhodopsin) Họ thụ thể A là họ thụ thể lớn nhất của siêu họ thụ thể GPCR với đuôi amino ngắn và trình tự protein trong chuỗi xoắn xuyên màng

có tính bảo thủ cao Ở người cũng như động vật có vú, có ba loại thụ thể neurokinin là neurokinin-1 (viết tắt là NK1R), neurokinin-2 (viết tắt là NK2R)

và neurokinin-3 (viết tắt là NK3R) Các gen Tacr phụ trách mã hóa cho các thụ thể neurokinin (Tacr1 mã hóa cho NK1R, Tacr2 mã hóa cho NK2R,

Tacr3 mã hóa cho NK3R) Các gen này gồm có 5 exon và 4 intron Nhân

dòng thành công các thụ thể này có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu

về cấu trúc, chức năng của thụ thể, cũng như các nghiên cứu xác định các chất đối kháng chọn lọc của thụ thể

Thụ thể neurokinin-1 (NK1R)

NK1R có phối tử nội sinh chính là SP Từ năm 1987, NK1R được biết như là thụ thể của SP đã được nhân dòng thành công từ cDNA não chuột thông qua đánh giá điện sinh lý biểu hiện thụ thể trên các tế bào trứng

Xenopus và lai chéo với NK2R bò [194] Qua đó, 3408 nucleotide đã được

xác định mã hóa cho một GPCR có độ dài 407 amino acid Khi được biểu hiện trong các tế bào thận khỉ COS, thụ thể này có ái lực liên kết cao với SP, NKA và NKB (IC50 SP >NKA >NKB) Mặc dù có sự tương đồng cao về cấu trúc của NK1R giữa các loài khác nhau (94,5% tương đồng giữa chuột và người), những khác biệt ở một số amino acid quan trọng cũng có thể tạo ra thay đổi trong tương tác với các chất đối kháng

NK1R phân bố ở các vùng khác nhau của não bộ và dây sống, thận, niệu quản, bàng quang và phổi Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy ở các tế bào mạch máu, nội mô ruột, cơ trơn, các tế bào lympho, đại thực bào ở người

và một số động vật có vú khác [29] Tuy nhiên không phải lúc nào NK1R cũng biểu hiện Thụ thể này được biểu hiện tại các vùng bị sưng viêm, có thể biểu hiện mạnh hơn khi có tác động SP Trong vùng không sưng viêm, NK1R tìm thấy trên tế bào thần kinh cột sống của chuột bị căng thẳng mãn tính và vỏ não của bệnh nhân nhiễm HIV [174]

Yếu tố nhân kappa B (NF-κB) tham gia điều hòa chính trong biểu hiện NK1R khi bị viêm sưng Vị trí gắn kết của NF-κB trong promoter của gen mã hóa NK1R người đã được xác định bằng thực nghiệm [165] NF-κB là trung

gian phiên mã NK1R được cảm ứng bởi interleukin (IL)-12 và IL-18 trong các

tế bào T lách, biểu hiện NK1R kích hoạt bởi IL-1β trong tế bào hình sao và biểu hiện của NK1R bị cắt ngắn trong các tế bào ung thư vú SP và NK1R có thể lần lượt kích hoạt NF-κB, dẫn đến phiên mã các gen tiền viêm [174]

Promoter của gen mã hóa NK1R còn chứa các vị trí liên kết với các yếu

tố phiên mã khác có vai trò điều hòa các gen gây viêm bao gồm AP-1, Sp1 và Oct-2 Yếu tố ức chế bệnh bạch cầu (một cytokine thuộc họ IL-6) thúc đẩy biểu hiện NK1R trong các tế bào biểu mô trên đường hô hấp thông qua Janus kinase (JAK)/ các protein dẫn truyền và kích hoạt phiên mã (STAT), protein kinase hoạt hóa phân bào (MAPK)/ các kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK) và c-Jun N-terminal kinase (JNK) điều hòa NK1R trên các tế bào hạt trong viêm tụy [174]

Thụ thể neurokinin-2 (NK2R)

NK2R là thụ thể neurokinin đầu tiên được nhân dòng Năm 1987, nhóm nghiên cứu của Nakanishi đã tạo ra thư viện cDNA từ mRNA được phân lập

từ dạ dày bò, sau đó biểu hiện trong tế bào trứng Xenopus [116] Từ khoảng

3x105 dòng, một dòng duy nhất được xác định đã tạo ra phản ứng điện sinh lý cho NKA Đoạn trình tự 2458 nucleotide mã hóa cho NK2R dài 384 amino acid Các tế bào trứng biểu hiện NK2R này có ái lực tương tác với các tachykinin khác nhau như sau: NKA >NKB >SP

NK2R biểu hiện trong ruột non của chuột bị viêm hoại tử cấp tính và trong các tế bào viêm ở đại tràng của bệnh nhân viêm đường ruột, giải thích cho tác dụng chống viêm của chất đối kháng NK2R [163] Trong nguyên bào sợi, yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta (TGF-β1) và IL-1 kích thích biểu hiện NK2R Trong khi đó, IL-3 và yếu tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt - đại thực bào (GM-CSF) có tác dụng ức chế biểu hiện NK2R Hai trình tự p53

trên promoter NK2R có vai trò quan trọng trong khả năng ức chế của NKA đối với sự tăng sinh của các tế bào tiền thân tạo máu [174]

Thụ thể neurokinin-3 (NK3R)

cDNA mã hóa NK3R được nhân dòng đầu tiên từ não chuột bằng cách lai với cDNA mã hóa NK2R và được dự đoán mã cho protein dài 452 amino

acid [164] Khi biểu hiện trong tế bào trứng Xenopus¸ thụ thể này có đáp ứng

điện sinh lý với các tachykinin Thông qua phân tích liên kết với phối tử trên màng của tế bào COS biểu hiện NK3R, ái lực với các phối tử tachykinin là NKB>NKA>SP

Sự biểu hiện NK3R trong quá trình viêm được điều hòa bởi các con đường khá phức tạp Viêm ở vùng ngoại vi cảm ứng bởi carrageenan được ghi nhận làm giảm khả năng đáp ứng của các tế bào thần kinh sừng ở cột sống với chất chủ vận NK3R [10] Sự thay đổi biểu hiện của NK3R và NKB trong tử cung khi mang thai được ghi nhận có vai trò quan trọng trong sinh sản và rối loạn sinh sản Trong nhau thai chuột, giai đoạn cuối thai kì khỏe mạnh có liên quan đến sự điều hòa ngược của NKB và NK3R [136] Các nghiên cứu chỉ ra

có sự gia tăng rõ rệt nồng độ NKB ở những người bị tiền sản giật, sự tăng cao nồng độ NKB và NK3R ở nhau thai phụ nữ tiền sản giật và tăng biểu hiện NK3R ở các tế bào nội mô tĩnh mạch dây rốn Những kết quả này cho thấy vai trò của NKB và NK3R trong tăng huyết áp và sản giật, trong đó phong tỏa NK3R là liệu pháp điều trị tiềm năng

Các nghiên cứu di truyền cho thấy vai trò quan trọng của NKB và NK3R trong trục hạ đồi-tuyến yên-tuyến sinh dục ở người [93] Nghiên cứu

về ảnh hưởng của di truyền liên quan đến giảm năng tuyến sinh dục (hypogonadotropic hypogonadism) ở bốn thế hệ gia đình người Thổ Nhĩ Kỳ

có suy giảm gonadotropin bẩm sinh nghiêm trọng và gặp vấn đề trong quá

trình dậy thì cho thấy tất cả các đối tượng đều có kiểu gen đồng hợp tử dạng đột biến mất chức năng ở gen mã hóa NKB hoặc NK3R [180] Một nghiên

cứu với số mẫu lớn hơn, đa dạng chủng tộc hơn cho thấy đột biến trên NKB

và NK3R chiếm khoảng 5% trong quần thể người giảm năng tuyến sinh dục

[53] Do đó, NKB và NK3R có thể có vai trò quan trọng trong điều hòa chức năng tuyến sinh dục

1.3 SỰ BIỂU HIỆN CỦA NK1R TRÊN CÁC DÒNG TẾ BÀO

1.3.1 Các dạng thụ thể neurokinin-1 ở người

Ở người, gen Tacr1 là gen đơn bản nằm trên nhiễm sắc thể số 2 (2p12)

Ở Việt Nam, gen Tacr1 người đã được tách dòng thành công từ mẫu mô não

và mô phổi [4, 5] và nguồn cDNA này đã được lựa chọn phục vụ cho nghiên cứu hiện tại Tổng quan về sự biểu hiện của NK1R ở trên cho thấy thụ thể này không biểu hiện sẵn ở tất cả các dòng tế bào, và sự biểu hiện của chúng còn tùy thuộc vào trạng thái cũng như các điều kiện kích hoạt biểu hiện cụ thể cho từng loại tế bào

Hình 1.5 Cấu trúc của thụ thể neurokinin-1 [157] [161]

NK1R ở người có chiều dài đầy đủ gồm 407 amino acid (xem Hình 1.5

và 1.6A), khối lượng 46,4 kDa, cấu trúc không gian 2 chiều đã được xây dựng

thành công [157, 161] Theo đó, có ba vị trí amino acid đặc biệt quan trọng liên quan đến hoạt động chức năng của NK1R (đã được đánh số 1-3 trên cấu

trúc không gian 2 chiều trong Hình 1.5): Vị trí số 1 gần đầu amino có 2

amino acid bị glycosyl hóa; vị trí số 2 gồm hai cysteine hình thành cầu disulfide ở hai vòng ngoại bào thứ nhất và thứ hai, đảm bảo sự ổn định cấu trúc của thụ thể; vị trí số 3 là cysteine gần đầu carboxyl bị palmitoyl hóa Các vùng xuyên màng của NK1R được cho là quyết định ái lực liên kết với SP gồm các vùng xuyên màng 1, 2 và 7 [13] Đồng thời, trình tự đầu amino cũng trực tiếp tham gia vào liên kết với SP Các amino acid được đánh dấu đậm hơn trong hình là các amino acid có tính bảo thủ cao được tìm thấy ở cả 3 thụ thể NK1R, NK2R và NK3R Mức độ tương đồng về trình tự amino acid của NK1R với NK2R và NK3R lần lượt là 47% và 51% [72] Năm 2004, cấu trúc không gian ba chiều của NK1R, dopamine D2 và thụ thể neuropeptide Y Y1 xây dựng bằng mô hình PREDICT đã được công bố [161] Sàng lọc thuốc ảo

sử dụng 3 mô hình PREDICT mang lại hiệu quả cao hơn 9 đến 44 lần so với sàng lọc một cách ngẫu nhiên Năm 2018, cấu trúc tinh thể của NK1R đã được công bố, cung cấp cơ sở phân tử giải thích sự nhận biết và chọn lọc với các phối tử cho nhiều ứng dụng lâm sàng [192]

Phân tử mRNA phiên mã từ gen Tacr1 được cắt nối exon - intron khác

nhau tạo ra 2 loại NK1 là loại chiều dài đầy đủ 407 amino acid và loại ngắn không có đầu carboxyl nội bào dài 311 amino acid Cấu trúc và đáp ứng tế bào của thụ thể NK1R có chiều dài đầy đủ và dạng ngắn được mô tả trong

Hình 1.6B Tùy thuộc vào các mô khác nhau mà NK1R được biểu hiện ở

dạng dài đầy đủ hay dạng ngắn Trong mô não, dạng NK1 dài đầy đủ là dạng

biểu hiện phổ biến nhất, có liên quan chặt chẽ đến sự điều hòa tâm trạng và căng thẳng trong não người [28]

Hình 1.6 So sánh cấu trúc và đáp ứng tế bào của thụ thể NK1R có chiều

dài đầy đủ (A) và dạng ngắn (B) [174]

Biến thể NK1R dài 311 amino acid được phát hiện trong các tế bào đơn nhân, đại thực bào, các vùng não riêng biệt (vỏ não, tiểu não) và các tế bào biểu mô đại tràng của bệnh nhân ung thư liên quan đến viêm đại tràng [174]

Sự khác biệt về cấu trúc so với NK1R có độ dài đầy đủ khiến dạng biến thể này có những khác biệt quan trọng về chức năng trong quá trình truyền tín hiệu nội bào NK1R có chiều dài đầy đủ được phosphoryl hóa bởi các GRK

và protein kinase C (PKC) tại đầu caboxyl và tương tác với β-arrestin là trung gian cho quá trình giải mẫn cảm, nhập bào và truyền tin nội bào [38] Qua đó, NK1R có chiều dài đầy đủ kích hoạt ion Ca2+, các kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào 1 và 2 (ERK1/2), NF-κB và protein kinase C-δ (PKCδ) và kích thích tiết IL-8 [86] NK1R dạng cắt ngắn thiếu hầu hết amino acid tại đầu caboxyl, không bị phosphoryl hóa và không tương tác với β-arrestin Kết quả

là thụ thể NK1R dạng cắt ngắn bị khuyết thiếu giải mẫn cảm, nhập bào và không dẫn truyền tín hiệu qua β-arrestin [38] [88] Các thụ thể cắt ngắn không tạo ra sự thay đổi Ca2+ và NF-κB, ức chế phosphoryl hóa PKC và giảm giải phóng IL-8 [86]

1.3.2 Đáp ứng tế bào được kích hoạt bởi phối tử SP thông qua NK1R

NK1R có vai trò sinh lý quan trọng, tham gia trực tiếp vào sự truyền tín hiệu kích hoạt bởi chất chủ vận SP, qua đó điều chỉnh các quá trình sinh lý khác nhau, liên quan đến nhiều bệnh lý quan trọng [174] Cụ thể hơn, sự dẫn truyền tín hiệu thông qua NK1R gồm 3 giai đoạn cơ bản được sơ đồ hóa trong

Hình 1.7 Giai đoạn 1: SP kích hoạt NK1R trên màng, bắt đầu quá trình

truyền tín hiệu qua trung gian G-protein Giai đoạn 2: G-protein hoạt hóa các proteases chứa các disintegrin và metalloproteinase trên màng, qua đó tạo ra

phối tử hoạt hóa thụ thể thúc đẩy tăng trưởng biểu bì theo cơ chế trans Kết

quả của sự kích hoạt NK1R là gây tăng Ca2+ nội bào, kích hoạt ERK1/2, protein kinase A và C và leukotriene, thromboxane A2, phosphoryl hóa chuỗi