Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men bề mặt với năng suất 1000 tấn sản phẩmnăm

Enzyme cellulase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, trích ly các chất từ thực vật, phân hủy các phế liệu giàu cellulose….. Nguồn enzyme cellulas

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI:

THIẾT KẾ NHÀ MÁY SẢN XUẤT ENZYME CELLULASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN BỀ MẶT VỚI NĂNG SUẤT

1000 TẤN SẢN PHẨM/NĂM

Người hướng dẫn: TS ĐẶNG ĐỨC LONG

Sinh viên thực hiện: NGÔ ĐỖ THỊ ÁNH NGUYỆT

Số thẻ sinh viên: 107120263

Lớp: 12SH

Đà Nẵng, 5/2017

“Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men bề mặt với

năng suất 1000 tấn sản phẩm/năm”

Nội dung đồ án tốt nghiệp gồm hai phần:

➢ Phần thuyết minh: Gồm 10 chương

- Chương 1: Lập luận kinh tế - kỹ thuật

- Chương 2: Tổng quan tài liệu

- Chương 3: Chọn và thuyết minh dây chuyền công nghệ

- Chương 4: Tính cân bằng vật chất

- Chương 5: Tính và chọn thiết bị

- Chương 6: Tính tổ chức

- Chương 7: Tính xây dựng

- Chương 8: Tính nhiệt – hơi – nước

- Chương 9: An toàn lao động và vệ sinh xí nghiệp

- Chương 10: Kiểm tra chất lượng sản phẩm

➢ Phần bản vẽ: Gồm 5 bản vẽ

- Bản vẽ số 2: Bản vẽ mặt bằng phân xưởng sản xuất chính (A0)

- Bản vẽ số 3: Bản vẽ mặt cắt phân xưởng sản xuất chính (A0)

- Bản vẽ số 4: Sơ đồ hơi- nước của phân xưởng sản xuất chính (A0)

Sau thời gian thực hiện đề tài đã giúp tôi ôn lại, nắm vững hơn những kiến thức

đã học, đồng thời thu thập được những kiến thức và kỹ năng cần thiết cho công việc của một kỹ sư sau này

LỜI CẢM ƠN

Trải qua 5 năm học tập trên giảng đường đại học, được sự tận tình dạy bảo của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô trong khoa Hoá, trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng, tôi đã tích luỹ được rất nhiều kiến thức bổ ích Và đến nay, để củng cố và vận dụng tốt các kiến thức đã học, tôi được giao thực hiện đề tài tốt nghiệp với nhiệm vụ thiết kế nhà máy sản xuất enzyme cellulase bằng phương pháp lên men bề mặt với năng suất 1000 tấn sản phẩm/năm

Quá trình làm đồ án đã giúp tôi phần nào nắm kĩ hơn những kiến thức về enzyme cellulase và cách bố trí thiết bị trong phân xưởng, cách bố trí mặt bằng cũng như cách tính toán, lựa chọn phương án lắp đặt, thiết kế nhà máy một cách kinh tế nhất

Tuy nhiên, do kiến thức bản thân, sự am hiểu về thực tế còn hạn chế nên đồ án còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô và các bạn

Cuối cùng tôi xin được cảm ơn đến thầy Đặng Đức Long đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn các quý thầy cô đã dạy bảo tôi trong suốt chặng đường đại học Cảm ơn sự quan tâm động viên của gia đình

và bạn bè đã giúp tôi vượt qua những khó khăn để hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đồ án tốt nghiệp này là của riêng tôi dựa trên sự nghiên cứu, tìm hiểu từ các số liệu thực tế và được thực hiện theo đúng sự chỉ dẫn của giáo viên hướng dẫn Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn từ các nguồn tài liệu nằm trong danh mục tài liệu tham khảo

Người cam đoan

Ký tên

Ngô Đỗ Thị Ánh Nguyệt

MỤC LỤC

NHẬN XÉT CỦA NGƯỜI HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA NGƯỜI PHẢN BIỆN

TÓM TẮT

LỜI CẢM ƠN i

CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

DANH MỤC BẢNG BIỂU x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: LẬP LUẬN KINH TẾ - KỸ THUẬT 2

1.1 Sự cần thiết phải đầu tư 2

1.2 Đặc điểm tự nhiên và vị trí xây dựng 2

1.3 Giao thông vận tải 2

1.4 Vùng nguyên liệu 3

1.5 Hợp tác hóa 3

1.6 Nguồn cung cấp nhiên liệu 3

1.7 Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lý nước thải 3

1.8 Vấn đề tiêu thụ 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về enzyme cellulase 4

2.1.1 Khái niệm về enzyme 4

2.1.2 Định nghĩa enzyme cellulase 4

2.1.3 Tính chất và cơ chế hoạt động của enzyme cellulase 4

2.1.4 Ứng dụng của enzyme cellucase 6

2.1.5 Tình hình sản xuất enzyme cellulase 9

2.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cellulase 11

2.2.1 Vi khuẩn: 11

2.2.2 Xạ khuẩn: 11

2.2.3 Nấm sợi: 12

2.3 Phương pháp sản xuất enzyme cellulase 14

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chìm 14

2.3.2 Phương pháp lên men bề mặt 14

2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy VSV 15

2.4.1 Nguồn carbon 15

2.4.2 Nguồn Nitơ 16

2.4.3 Nguồn khoáng chất 16

2.4.4 Chất kích thích sinh trưởng 16

2.4.5 Một số lưu ý trong quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 16

2.5 Giới thiệu về nguyên liệu rơm rạ khô 17

2.5.1 Đặc điểm: 17

2.5.2 Lượng cung cấp và giá cả 17

CHƯƠNG 3: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ 19

3.1 Chọn dây chuyền công nghệ 19

3.2 Sơ đồ dây chuyền công nghệ 20

3.3 Thuyết minh dây chuyền công nghệ 21

3.3.1 Nguyên liệu 21

3.3.2 Phối trộn 22

3.3.3 Thanh trùng 22

3.3.4 Làm nguội 23

3.3.5 Nhân giống 23

3.3.6 Cấy giống 24

3.3.7 Nuôi cấy 24

3.3.8 Thu nhận canh trường sau nuôi cấy 26

3.3.9 Nghiền 26

3.3.10 Trích ly 26

3.3.11 Cô đặc 26

3.3.12 Đóng chai 27

CHƯƠNG 4: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT 28

4.1 Lập kế hoạch sản xuất 28

4.2 Thông số ban đầu 28

4.3 Tính toán hao hụt 29

4.4 Tính cân bằng vật chất 30

4.4.1 Dây chuyền sản xuất chế phẩm enzyme 31

4.4.2 Các công đoạn chuẩn bị nguyên liệu cho phối trộn 39

4.4.3 Nhân giống các cấp 43

4.4.4 Tính lượng nước cần dùng cho quá trình sản xuất 46

CHƯƠNG 5: TÍNH VÀ CHỌN THIẾT BỊ 49

5.1 Công thức tính số thiết bị 49

5.2 Tính thiết bị 49

5.2.1 Thiết bị làm sạch rơm rạ 49

5.2.2 Thiết bị băm cắt rơm 50

5.2.3 Thiết bị nghiền ngô 51

5.2.4 Thiết bị làm sạch vỏ trấu 52

5.2.5 Thiết bị định lượng nguyên liệu 53

5.2.6 Thiết bị phối trộn 54

5.2.7 Thiết bị tiệt trùng 55

5.2.8 Thiết bị làm nguội 56

5.2.9 Thiết bị cấy giống nuôi cấy 57

5.2.10 Thùng phối trộn giống sản xuất 58

5.2.11 Thiết bị thanh trùng khay 59

5.2.12 Thiết bị định lượng vào khay 60

5.2.13 Thiết bị nuôi cấy 60

5.2.14 Thiết bị nghiền bi FL600 62

5.2.15 Thiết bị trích ly 62

5.2.16 Thiết bị cô đặc 63

5.2.17 Thiết bị đóng chai 65

5.2.18 Thiết bị nhân giống 66

5.2.19 Thiết bị nhân giống sản xuất 69

5.2.20 Tính bunke 70

5.2.21 Tính thùng chứa 73

5.2.22 Tính gàu tải 76

5.2.23 Vít tải 80

5.2.24 Băng tải: 81

5.2.25 Bơm ly tâm 81

CHƯƠNG 6: TÍNH TỔ CHỨC 85

6.1 Sơ đồ tổ chức của nhà máy 86

6.2 Tổ chức lao động của nhà máy 86

6.2.1 Tính nhân lực lao động 86

6.2.2 Nhân lực nhà máy 87

CHƯƠNG 7: TÍNH XÂY DỰNG 89

7.1 Phân xưởng sản xuất chính 89

7.2 Kho nguyên liệu 89

7.3 Kho chứa thành phẩm 90

7.4 Kho chứa khay 90

7.5 Phòng nhân giống 90

7.6 Phòng điều hòa 91

7.7 Phòng KCS 91

7.8 Trạm biến áp 91

7.9 Trạm bơm: 91

7.10 Nhà hành chính: 91

7.11 Xưởng cơ điện: 92

7.12 Gara Ô tô: 92

7.13 Nhà để xe máy cho cán bộ nhân viên: 92

7.14 Nhà ăn 93

7.15 Nhà vệ sinh 93

7.16 Đài chứa nước 93

7.17 Khu xử lý nước: 93

7.18 Khu xử lý nước thải: 93

7.19 Khu xử lý chất thải rắn: 93

7.20 Phân xưởng lò hơi: 93

7.21 Nhà bảo vệ: 94

7.22 Trạm phát điện dự phòng: 94

7.23 Kho vật tư thiết bị: 94

7.24 Khu đất mở rộng: 94

7.25 Quy chuẩn bố trí mặt bằng nhà máy 94

CHƯƠNG 8: TÍNH NHIỆT – HƠI – NƯỚC 97

8.1 Tính nhiệt hơi 97

8.1.1 Công đoạn tiệt trùng 99

8.1.2 Tính nhiệt hơi dùng trong trích ly 103

8.1.3 Lượng nhiệt hơi trong quá trình cô đặc 107

8.1.4 Công đoạn thanh trùng khay 108

8.1.6 Tổng lượng hơi dùng trong nhà máy 108

8.2 Tính nước 109

8.2.1 Nước dùng cho sản xuất 109

8.2.2 Nước sử dụng phục vụ cho việc sản xuất 110

8.2.3 Nước cần cho sinh hoạt 110

CHƯƠNG 9: AN TOÀN LAO ĐỘNG VÀ VỆ SINH XÍ NGHIỆP 112

9.1 An toàn lao động 112

9.1.1 Tai nạn lao động và các nhóm yếu tố nguy hiểm trong sản xuất 112

9.1.2 Các biện pháp dự phòng đảm bảo an toàn 112

9.1.3 An toàn lao động trong công nghiệp vi sinh 113

9.1.4 Trạm nén khí: 113

9.1.5 Máy lọc để làm sạch không khí và thu hồi bụi: 114

9.1.6 Máy sấy, nghiền: 114

9.1.7 An toàn thiết bị vận chuyển: 114

9.1.8 Kỹ thuật an toàn khi nuôi cấy trên môi trường rắn: 115

9.2 Bảo vệ môi trường: 115

9.2.1 Làm sạch không khí: 116

9.2.2 Làm sạch nước thải: 116

CHƯƠNG 10: KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM 117

10.1 Kiểm tra nguyên liệu sau công đoạn xử lý nguyên liệu 117

10.2 Kiểm tra các thông số của quá trình nuôi cấy 117

10.3 Kiểm tra hiệu suất của công đoạn trích ly 117

10.4 Kiểm tra chất lượng enzyme cellulase 117

10.4.1 Nguyên tắc 117

10.4.2 Cách tiến hành 117

10.4.3 Tính hoạt độ enzyme 119

KẾT LUẬN 120

TÀI LIỆU THAM KHẢO 121

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cơ chế tác động phân giải của tổ hợp enzyme cellulase 6

Hình 2.2 Cấu trúc nấm sợi Asp.niger 12

Hình 2.3 Khuẩn lạc của Asp Niger trên môi trường nuôi cấy 13

Hình 3.1 Sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất enzyme cellulase từ Asp.niger 20

Hình 3.2 Sơ đồ quá trình cô đặc 27

Hình 5.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị làm sạch dạng sàng lắc 49

Hình 5.2 Thiết bị làm sạch dạng lắc kiểu PSC30 50

Hình 5.3 Thiết bị băm cắt rơm 51

Hình 5.4 Thiết bị nghiền bi FL600 52

Hình 5.5 Thiết bị tách trấu HA-25B 52

Hình 5.6 Thiết bị cân băng định lượng DEL/DEM 53

Hình 5.7 Thiết bị trộn nguyên liệu chăn nuôi Sumo 5,5 Kw 54

Hình 5.8 Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang 56

Hình 5.9 Thiết bị làm nguội 57

Hình 5.10 Thiết bị trộn 2 vít nghiêng VSH-A 58

Hình 5.11 Thiết bị cấy giống 58

Hình 5.12 Thiết bị thanh trùng khay 60

Hình 5.13 Thiết bị định lượng Acrison Model 270 60

Hình 5.4 Thiết bị nghiền bi FL600 62

Hình 5.16 Thiết bị trích ly hoạt động liên tục dạng roto 63

Hình 5.17 Thiết bị cô đặc tuần hoàn ngoài 2 cấp SJN2 64

Hình 5.18 Chai HDPE 1000ml 65

Hình 5.19 Máy chiết rót đóng chai tự động 3 trong 1 66

Hình 5.20 Thiết bị nhân giống 67

Hình 5.21 Bunke chứa 70

Hình 5.22 Thùng chứa 73

Hình 5.23 Gàu tải 77

Hình 5.24 Bơm công nghiệp Pentax CM32/160C 82

Hình 5.25 Bơm dân dụng Ebara CMA 0,5M 82

Hình 6.1 Sơ đồ tổ chức nhà máy 86

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các thành phần hóa học chính trong cây rơm 17

Bảng 3.1 Thành phần môi trường thạch Czapek 23

Bảng 4.1 Các ngày nghỉ lễ, nghĩ tết theo quy định của nhà nước 28

Bảng 4.2 Kế hoạch sản xuất theo tháng 28

Bảng 4.3 Tỷ lệ hao hụt vận chuyển qua các công đoạn 29

Bảng 4.4 Thành phần các nguyên liệu chính 39

Bảng 4.5 Thành phần các chất vi lượng 39

Bảng 4.6 Bảng tính cân bằng vật chất 46

Bảng 4.7 Nhu cầu nguyên liệu để nhân giống cấp I 47

Bảng 4.8 Nhu cầu nguyên liệu để nhân giống cấp II 47

Bảng 4.9 Lượng nước cần dùng cho quá trình sản xuất 48

Bảng 5.1 Bảng tổng kết các thiết bị chính 83

Bảng 5.2 Bảng tổng kết bunke và thùng chứa 85

Bảng 5.3 Bảng tổng kết thiết bị vận chuyển 85

Bảng 6.1 Kế hoạch làm việc của nhân viên năm 2017 86

Bảng 6.2 Nhân lực lao động hành chính 87

Bảng 6.3 Nhân lực lao động trực tiếp 87

Bảng 7.1 Bảng tổng kết các hạng mục công trình trong nhà máy 94

Bảng 8.1 Bảng tổng kết lượng hơi dùng trong nhà máy 108

MỞ ĐẦU

Enzyme được biết đến từ những năm giữa thế kỷ XIX và phát triển mạnh từ những năm 1960 Hiện nay nhờ sự tiến bộ của công nghệ gen đã tạo những bước phát triển mạnh mẽ hơn cho công nghệ enzyme, không còn mang tính thủ công mà đã trở nên hiện đại với nhiều loại enzyme kỹ thuật cao Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau [21], trong đó enzyme cellulase là một trong những enzyme được sản xuất nhiều với nhiều ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp

Enzyme cellulase là hệ enzyme bao gồm các loại enzyme: C1, Cx, β-glucosidase,

có khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzyme cellulase được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, trích ly các chất từ thực vật, phân hủy các phế liệu giàu cellulose…

Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn enzyme cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường Việt Nam là nước nông nghiệp đang trên

đà phát triển Vì vậy lượng phế phẩm nông nghiệp rất dồi dào và đa dạng là thách thức lớn với môi trường nhưng cũng là nguồn nguyên liệu giàu cellulose cung cấp cho phát triển công nghiệp sản xuất enzyme cellulase

Nguồn enzyme cellulase từ vi sinh vật tận dụng được những phế liệu gây ô nhiễm giải quyết vấn đề môi trường vừa có nguồn nguyên liệu rẻ tiền cung cấp cho các ngành sản xuất khác

Từ cơ sở thực tiễn như trên tôi thực hiện đề tài: “Thiết kế nhà máy sản xuất enzyme

cellulase bằng phương pháp lên men bề mặt với năng suất 1000 tấn sản phẩm/năm”

CHƯƠNG 1: LẬP LUẬN KINH TẾ - KỸ THUẬT

1.1 Sự cần thiết phải đầu tư

Từ khi xuất hiện các khu công nghiệp thực phẩm, các nhà máy sản xuất bia, nhiên liệu sinh học, nhà máy sản xuất cồn, sản xuất giấy, thức ăn chăn nuôi hay sự phát triển mạnh mẽ của nền nông nghiệp tại khu vực các tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi, Đà Nẵng

và ở các tỉnh khác thuộc miền Trung – Tây Nguyên, nhận thấy một nhu cầu về nguồn enzyme cho các quá trình sản xuất của các nhà máy, xí nghiệp trong những năm gần đây

có sự tăng lên rất rõ rệt Đáng kể đến là enzyme cellulase đang được sử dụng nhiều trong ngành chế biến thực phẩm, sản xuất nhiên liệu sinh học, sản xuất giấy, sản xuất thức ăn chăn nuôi và xử lý phế thải nông nghiệp

Theo báo cáo của SBC Scientific hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau Enzyme cellulase sử dụng trên thị trường được nhập khẩu từ nước ngoài ở dạng lỏng hoặc dạng bột với giá thành dao động từ 5-30 USD/kg

Qua tìm hiểu về vị trí địa lý, khí hậu, hệ thống giao thông vận tải và các điều kiện khác, tôi quyết định chọn địa điểm xây dựng nhà máy sản xuất enzyme cellulase tại khu kinh tế mở Chu Lai, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam

1.2 Đặc điểm tự nhiên và vị trí xây dựng

Quảng Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, có 2 mùa rõ rệt là mùa khô và mùa mưa, ít chịu ảnh hưởng của gió đông lạnh miền Bắc Nhiệt độ trung bình đạt 25,40C Lượng mưa trung bình hằng năm đạt 2000 – 2500mm tập trung vào các tháng 9-10-11 Độ ẩm trung bình trong không khí đạt 84% Hướng gió chủ yếu là hướng Đông Nam [22]

Địa điểm xây dựng nhà máy nằm trên mặt bằng giải tỏa của khu kinh tế mở Chu Lai và nằm sát Quốc lộ 1A, với mặt bằng khá bằng phẳng nên rất thuận lợi

1.3 Giao thông vận tải

Nhà máy nằm trong khu kinh tế mở Chu Lai được quy hoạch giao thông nằm gần Quốc lộ 1A, tuyến đường huyết mạch đi qua các vùng sản xuất lúa chính của tỉnh để thuận lợi cho thu mua vận chuyển nguyên liệu

Nhà máy còn đặt gần trục đường sắt Bắc Nam đi qua ga Núi Thành (huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam), sân bay Chu Lai, cảng Kỳ Hà- cảng lớn của khu vực miền Trung nên thuận lợi để xuất sản phẩm ra nước ngoài

1.4 Vùng nguyên liệu

Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi là những địa phương sản xuất lúa gạo trọng điểm của khu vực miền Trung Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn thành phố Đà Nẵng [23] và nghị quyết về quy hoạch sử dụng đất tại Quảng Nam, Quảng Ngãi đến năm 2020 của văn phòng chính phủ [24] tổng diện tích đất trồng lúa tại

3 địa phương từ 98277 ha đến 98897 ha, với lượng rơm rạ ước tính gần 2 triệu tấn rơm rạ/năm đây là nguồn cung cấp rơm rạ cho hoạt động sản xuất tại nhà máy

1.5 Hợp tác hóa

Nhà máy sản xuất enzyme đặt trong khu kinh tế mở Chu Lai nên quá trình hợp tác hóa được tiến hành chặt chẽ, do đó việc sử dụng các công trình chung như: điện, nước, giao thông, được tiến hành thuận lợi và giảm chi phí cho đầu tư xây dựng

1.6 Nguồn cung cấp nhiên liệu

Nhiên liệu sử dụng là dầu FO và trấu, than cung cấp từ thành phố chủ yếu để đốt

lò hơi cho nhà máy

1.7 Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lý nước thải

Nguồn cung cấp nước cho nhà máy là nguồn nước từ nhà máy cấp thoát nước của khu công nghiệp

Nước thải được chuyển vào hệ thống xử lý của nhà máy trước khi chuyển vào hệ thống xử lý nước thải của khu công nghiệp

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về enzyme cellulase

2.1.1 Khái niệm về enzyme

Enzyme là một chất xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác [2, trang 5]

Đặc tính sinh học của enzyme [9]:

- Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật

- Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống

- Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa

- Enzyme có thể tham gia xúc tác cho các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học

- Enzyme có thể được thực hiện một phản ứng

- Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít

- Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng

2.1.2 Định nghĩa enzyme cellulase

Cellulase là một loại homopolyme của β- D- glucose Các gốc được nối với nhau qua liên kết β- D- 1,4 – glucose Nó được sản xuất nhờ các vi khuẩn cộng sinh trong dạ

cỏ của động vật nhai lại Ngoài động vật nhai lại không còn động vật nào khác sản xuất được enzyme này [2, trang 160]

2.1.3 Tính chất và cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

2.1.3.1 Phân loại enzyme cellulase

Enzyme tham gia phân hủy cellulose được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu:

• 1,4 β-D glucan cellobiohydrolase Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Enzyme này còn có một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, exoglucanase, exocellulase, cellobiosidase và avicellase [8, trang 379] Enzyme này có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

• 1,4 D glucan 4 glucanohydrolase Enzyme này tham gia phân giải liên kết

β-1,4 glucoside trong cellulose, lignin và β-D glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose và glucose Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh [8, trang 379]

Enzyme này còn có các tên gọi khác như: endoglucanase, endo 1,4 glucanase và C-cellulase

• β-D glucoside glucohydrolase Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose tạo thành glucose Chúng không có khả năng phân giải cellulose nguyên thủy Trong các tài liệu khoa học chúng còn có tên là cellobiase và β-glucosidase [8, trang 379]

2.1.3.2 Tính chất của enzyme cellulase [8, trang 380]

Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm:

• Cellobiohydrolase bao gồm hai loại là Cbh I và Cbh II:

- Cbh I có trọng lượng phân tử khoảng 65kD, điểm đẳng điện là 4,4 (PI = 4,4) Loại enzyme này tác động cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh nhưng lại không tác động đến cellulose biến tính như CMC hay hydroxyethylcellulose,

cellohexaose β- nitrophenul, β- glucoside hay β-glucan Cbh I chứa khoảng 496 amino

acid

- Cbh II có trọng lượng phân tử là 53kD, PI = 5,0 Chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan và cả cellulose không hòa tan, cũng không có tác động lên CMC Cbh II chứa khoảng 471 amino acid

• Endoglucanase được chia thành hai loại là Egl I và Egl II: Egl I chứa 459 amino acid, trọng lượng phân tử 48,212 kD Egl II chứa 418 amino acid, trọng lượng phân tử

là 42,2 kD Các enzyme này hoạt động ở nhiệt độ khá cao

• β- glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động ở

pH rất rộng (pH 4,4 – 8,4), trọng lượng phân tử 50 -98 kD; PI = 8,4 và có thể hoạt động

ở nhiệt độ cao

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ

40 – 60 0C, pH nằm trong khoảng từ 4 -7

Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose

Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulase, trong khi các ion như Mn2+, Ag+, Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 – 15 phút ở 800C

2.1.3.3 Cơ chế hoạt động của enzyme cellulase

Cellulase là enzyme xúc tác cho quá trình chuyển hóa cellulose thành các sản phẩm hòa tan

Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; glucanohydrolase) Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiêu trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và Hydroxyethyl Cellulose (HEC) Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động đến cellulose kết tinh

1,4-β-D-glucan-4-Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β- D- glucan cellobiohydrolase) Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết β-1,4-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 1 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside) Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

β-glucosidase (cellubiase; β-D-glucoside glucohydrolase) không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose Cellodextrin tạo thành D-glucose

Hình 2.1 Cơ chế tác động phân giải của tổ hợp enzyme cellulase [25]

2.1.4 Ứng dụng của enzyme cellucase

2.1.4.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm [26]

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng

độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực vật Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung là chất lượng thực phẩm được tăng lên

Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển

Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hóa

Trong sản xuất agar – agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chất lượng agar- agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu được chế phẩm có cellulase hoạt độ cao

2.1.4.2 Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy [26]

Trong công đoạn nghiền bột giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trước khi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ là tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin

Trong công nghệ tái chế giấy, các loại giấy thải cần được tẩy mực trước khi sản xuất các loại giấy in, giấy viết Endoglucanase và hemicellulase đã được dùng để tẩy trắng mực in trên giấy

2.1.4.3 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm [26]

Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và đồ uống không cồn dựa trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền, ở giai đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase để tăng hiệu suất trích ly dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và giảm bớt một số công đoạn

Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia Trong dịch lên men có chứa một lượng β– glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và gây đục cho bia

Trong quá trình sản xuất cà phê ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch quả Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫm màu, làm giảm

chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ Khi sử dụng chế phẩm Asp

niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho thấy số

lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ khá cao Trong quá trình

ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46%

2.1.4.4 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi [26]

Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng

sự tiêu hóa hấp thụ thức ăn cho động vật - đặc biệt động vật còn non, do đó sẽ giảm chi phí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho gia súc Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino acid cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi

2.1.4.5 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ [26]

Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phần chính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủy thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồi rượu tăng lên 1,5%

2.1.4.6 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh [26]

Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống con người Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong

xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Enzyme này có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các các sản phẩm giàu năng lượng khác Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất

lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao

2.1.5 Tình hình sản xuất enzyme cellulase

2.1.5.1 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất enzyme cellulase trên thế giới

Enzyme cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei,

Asp.niger và gần đây là từ các chủng vi khuẩn Ở Nhật, cellulase kỹ thuật thu nhận từ T.viride bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt theo quá trình koji như sau: cám mỳ được

xử lý nhiệt, cấy bào tử vào, nuôi ủ vào khay dưới điều kiện (pH, nhiệt độ, độ ẩm…) tối

ưu Sau 3÷5 ngày, môi trường lên men được chiết với nước, dịch chiết được cô đặc và enzyme được tủa bằng alcohol Thậm chí ngày nay, một vài công ty còn sản xuất enzyme

cellulase từ Trichoderma theo quá trình koji Tương tự, có thể áp dụng quá trình này để sản xuất enzyme từ Asp.niger Theo Yamada (1977), khoảng 45 tấn cellulase được sản xuất từ T.viride và Asp.niger vào năm 1976 Việc sản xuất cellulase bằng phương pháp

chìm được mô tả đầu tiên trong các patent của Nhật

Ở Mỹ, phòng thí nghiệm của quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers lần

đầu tiên sử dụng chủng T.viride QM 6 hoang dại để sản xuất enzyme cellulase Sau đó

gây đột biến và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh ra cellulase cao [9]

Ở Pháp hãng Ly Ven sản xuất enzyme cellulase từ T.reesei và từ Asp.niger sử

dụng trong công nghiệp thực phẩm

Ở Canada, hãng Logene sản xuất enzyme cellulase sử dụng trong thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol

Loại chế phẩm được sản xuất ở Liên Xô sử dụng trong chăn nuôi có tên gọi là

“cellolignorin” Đây là sản phẩm nuôi cấy T Lignorum đã sấy khô đến chỉ còn 13% độ

ẩm, chứa 1 ÷ 50 đơn vị cellulase/g Ngoài các endoglucanase và exoglucanase còn có hemicellulase, pectinase và xylanase, pH thích hợp nhất cho chế phẩm này hoạt động từ 4,0 ÷ 4,5

Ở Nhật Bản Hãng Nagaze, Amano, dsiva kasei – zenibon sejkage hằng năm đã sản xuất đến 8000 tấn chế phẩm enzyme các loại để dùng trong nông nghiệp

Enzyme “penxenlase” chứa enzyme cellulase, hemicellulase, protease, và amylase Hoạt tính có các loại 500, 1000 và 1500 đơn vị/ gam, pH thích hợp từ 4,0 ÷ 5,5, nhiệt độ thích hợp là 600C

Chế phẩm cellulase “Onozyka” chứa cellulase và hemicellulase Chế phẩm này

thu được từ các dịch nuôi cấy bề mặt nấm T.viride Các điều kiện thích hợp như pH,

nhiệt độ cũng tương tự Pancellase

Chế phẩm enzyme “Celluzin” thu được từ nuôi cấy chìm nấm Asp.niger Hoạt

tính cellulase khoảng 450000 đơn vị/ gam

Ở Mỹ, chế phẩm “Biozim” được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt nấm

Asp.Oryzae Chế phẩm này chứa 26 loại enzyme khác nhau, trong số này có cellulase,

amylase…

Ở Bugari có loại chế phẩm “Xeaza T” chứa hoạt tín exoglucanase 268 đơn vị/gam

và endoglucanase 92 đơn vị/ gam, pH thích hợp từ 4,0 ÷ 5,5

2.1.5.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất enzyme cellulase tại Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có một chế phẩm enzyme cellulase nào được sản xuất chủ động

từ những nguồn nguyên liệu trong nước Việc sản xuất chỉ mới dừng lại ở việc nghiên cứu nên nhu cầu enzyme chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài

Năm 1999, Nguyễn Đức Lượng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

cellulase từ Astinomyces griseus

Năm 1999, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 để bổ sung vào bể ủ rác thải

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

và đặc điểm cellulase từ chủng Aspergillus niger

Năm 2007, Trần Thạnh Phong và các cộng sự đã nghiên cứu thu nhận enzyme

cellulase của Trichoderma reesei trên môi trường bán rắn [10].

Năm 2008, Trần Thị Hồng và các cộng sự đã nghiên cứu sử dụng hệ enzyme cellulase tách từ hệ vi sinh vật để phân giải cellulose trong phế thải nông nghiệp [4]

Năm 2010, Trần Thị Thanh Thuần và Nguyễn Đức Lượng đã nghiên cứu enzyme

cellulase và pectinase từ chủng Trichoderma Viride và Aspergillus niger để xử lý nhanh

vỏ cà phê[17]

Năm 2011, Dương Văn Hợp và các cộng sự đã phân lập, tuyển chọn vi khuẩn sinh enzyme thủy phân phức hợp cellulose dùng trong chế biến thức ăn thô xanh và phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại [5]

Năm 2013, Xuân Nam Kiều đã nghiên cứu thu nhận một số nguồn enzyme cellulase từ nấm mốc [7]

Năm 2014, Phạm Thị Kim Thảo và một số cộng sự đã nghiên cứu phân lập nấm

Trichoderma và khảo sát khả năng sinh enzyme, ứng dụng trong xử lý bã thải nấm [12]

2.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cellulase

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân hủy bởi VSV cả trong điều kiện hiếu khí và cả trong điều kiện yếm khí Các loài VSV thay phiên nhau phân hủy cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Tuy nhiên, trong thiên nhiên không có một VSV nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại enzyme có trong phức hệ enzyme cellulase Có loài này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại enzyme này, loại khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác Chính vì thế sự phân giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và thường không triệt để

Số lượng các loài VSV tham gia tổng hợp enzyme có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia quá trình phân giải này

2.2.1 Vi khuẩn:

Trong điều kiện hiếu khí, có rất nhiều vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose nhờ vào hệ enzyme cellulase của chúng Cellulase là một phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào vi khuẩn Ở một số vi khuẩn, enzyme oxy hóa khử và enzyme phân hủy protein cũng tham gia vào quá trình trên Một

số loài vi khuẩn tiêu biểu có khả năng phân hủy cellulose trong điều kiện hiếu khí:

Acetobacter xilinum, Achromabacter, Bacillus subtilis, Celvibrio fulvus, Cytophaga, Cellulomonas biazotea

2.2.2 Xạ khuẩn:

Là nhóm vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ cao phân tử như cellulose, lignin…Có trong bã thực vật để tạo thành các hợp chất trung gian, tổng hợp các chất mùn[1]

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, thậm chí trên những cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất hữu cơ trong tự nhiên Chúng sinh sản ra chất kháng sinh từ acid amin tạo thành trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn quang hợp và các chất hữu cơ Các chất kháng sinh này tiêu diệt vi khuẩn và nấm mốc gây hại

Khả năng phân giải cellulose của xạ khuẩn đã được nghiên cứu nhiều Harmsen (1964) chia xạ khuẩn phân hủy cellulose ra làm ba nhóm A, B, C Nhóm B và C phân hủy cellulose rất mạnh Theo Krasilnikov (1949) thì các loài xạ khuẩn phân giải cellulose có thể xếp hạng theo mức độ phân giải từ mạnh xuống yếu như sau:

+ Loài 1: Act coelicolor, Act sulfureus, Act aureus, Act cellulose

+ Loài 2: Act hydroscopicus, Act griseoflavus, Act ochroleucus, Act loidensis,

Act viridans, Act griseolus

+ Loài 3: Act themofuscus, Act xanthostromus

+ Loài 4: Act flavochromogenes, Act bovis, Act sampsonii

2.2.3 Nấm sợi:

Có nhiều loài nấm sợi có khả năng sinh ra 1 lượng lớn cellulase thuộc giống

Alternaria, Trichoderma, Myrothecium, Aspergillus…Trong đó có 2 giống nấm sợi là Trichoderma và Aspergillus đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất

cellulase

Nấm sợi Aps.niger[1]

Hình 2.2 Cấu trúc nấm sợi Asp.niger [27]

Vị trí phân loại và các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sinh thái

Vị trí phân loại của Asp.niger được xếp như sau:

Sinh giới: Eukaryote

Lớp: Ascomycetes

Bộ: Plectascales

Họ: Aspergillaceae

Giống: Aspergillus

Loài: Aspergillus niger

Khuẩn lạc Asp.niger trên môi trường Czapek với pH = 5,5 có dạng lông nhung,

khi còn non có màu trắng, khi sinh bào tử màu đen, mặt trái của peptri thường có màu vàng nhạt đến vàng sáng

Hình 2.3 Khuẩn lạc của Asp Niger trên môi trường nuôi cấy [28]

Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ty khí sinh có chiều dài 1 ÷ 3 mm, có vách tế bào trơn bóng và trong suốt Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là bọng, có đường kính từ 50 ÷ 75 µm, sinh ra 2 lớp thể bình, lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược, lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào tử đính hình cầu, BT đính có đường kính

4 ÷ 5 µm, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì

Đặc tính sinh lý: Asp.niger sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 6 ÷ 80C, tối đa 45 ÷

470C, tối ưu 28 ÷ 320C A.niger là nấm sợi chịu khô cho biết bào tử đính có thể nảy mầm

trong môi trường có thế nước 0,77 ở 370C Asp.niger có thể sinh trưởng ở pH = 2 trong

điều kiện có thế nước cao [8]

Độc tố: Asp.niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng

rãi trong chế biến thực phẩm Các enzyme thủy phân thu nhận được từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột Tuy nhiên, theo thông tin gần đây có 2 trong

số 19 chủng Asp.niger phân lập được sinh ra

Sinh thái: Asp.niger chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới Bào tử đính màu đen

nên không bị ảnh hưởng bởi tia mặt trời và tia UV Asp.niger thường được phân lập từ

các sản phẩm phơi nắng: cá, cây gia vị Các đặc tính và cấu trúc của hệ cellulase từ

Asp.niger, endoglucanase từ Asp.niger có trọng lượng phân tử là 26000 Dalton, hoạt

động ở pH và nhiệt độ tối ưu là 4,0 và 450C Galas và Romanowska (1997), cho biết β

– glucosidase từ Asp.niger có trọng lượng phân tử khoảng 200 kDa, điểm đẳng điện là

4,05 và chứa 33% carbohydrate Enzym này thủy phân cellobiose ở pH và nhiệt độ tối

ưu tương ứng là 4,8 và 650C [8]

Nấm là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose [18] Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp từ enzyme này như vi khuẩn

Với những đặc tính dễ nuôi cấy và sản xuất ra được enzyme cellulase hoạt lực cao so với các chủng vi sinh vật khác, tôi quyết định lựa chọn chủng nấm mốc

Aspergillus niger để sản xuất enzyme cellulase

2.3 Phương pháp sản xuất enzyme cellulase

Trong công nghiệp sản xuất enzyme thương mại trên thế giới, enzyme đang được sản xuất theo 2 phương pháp là phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy chìm

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy chìm

Phương pháp nuôi cấy chìm thường sử dụng môi trường lỏng, chứa nhiều chất dinh dưỡng, có khả năng hòa tan cao và phải đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cả dinh dưỡng cơ bản và dinh dưỡng đặc hiệu Phương pháp nuôi cấy chìm có những ưu điểm như sau:

- Tốn ít diện tích

- Dễ cơ giới, tự động hóa

- Có thể thực hiện liên tục bằng hệ thống nhiều thiết bị lên men nối tiếp nhau, dễ dàng kiểm soát được chất lượng lên men

Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm như:

- Hoạt tính enzyme thu được thấp hơn so với phương pháp nuôi cấy bề mặt

- Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra nhiễm toàn bộ hệ thống trong thời gian rất ngắn

- Chi phí sản xuất lớn

2.3.2 Phương pháp lên men bề mặt

Trong phương pháp lên men bề mặt trên môi trường bán rắn, vi sinh vật sẽ mọc trên bề mặt môi trường (môi trường trước khi nuôi cấy cần được làm ẩm trước)

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất

enzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng [10]

Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: Cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương…Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng Môi trường lỏng ít dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này

– Ưu điểm của phương pháp này [9]:

+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, qui trình công nghệ không phức tạp

+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm vì nuôi cấy bề mặt tạo các điều kiện giống điều kiện tự nhiên thực tế cho nấm mốc phát triển

+ Chế phẩm enzyme sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém

+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

– Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:

+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn

+ Tốn nhiều diện tích cho quá trình nuôi cấy

Phương pháp lên men bán rắn có nhiều ưu việc hơn so với lên men chìm trong sản xuất enzyme cellulase: Môi trường lên men tương đối rẻ tiền, nồng độ enzyme tạo thành ở môi trường rắn cao hơn nhiều so với dịch nuôi cấy thu được ở phương pháp nuôi cấy chìm, canh trường lên men dễ được sấy khô và ít tổn hao hoạt tính enzyme, không cần các thiết bị phức tạp, chủ yếu nuôi cấy trên khay và buồng nuôi cấy giữ ở nhiệt độ, độ ẩm thích hợp, quá trình sản xuất ít tiêu hao năng lượng, Với những ưu điểm nổi trội trong công nghệ sản xuất enzyme, tôi quyết định lựa chọn phương pháp

lên men bề mặt và sử dụng chủng nấm mốc Aspergillus niger để sản xuất enzyme

Những nguồn cellulose có thể là rơm rạ, vỏ sắn, giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi

ngô, cám, mùn cưa, bã củ cải, than bùn…Trichoderma lignorum và Tr.koningi nuôi trên

môi trường có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất Kết quả cũng

tương tự như vậy khi nuôi Myrothecium verrucaria trên môi trường có giấy lọc và lõi

ngô, bã củ cải

Chất cảm ứng của enzym cellulase còn là cellobiosooctacetat, cám mì, lactose

salicyl Đối với Stachybotrit atra nguồn carbon tốt nhất để sinh tổng hợp cellulase là

tinh bột 1% [9]

Các nguồn carbon khác (glucose, cellobiose, acetat, citrat, oxalat, xuccinat và những sản phẩm trung gian của vòng Krebs) có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp cellulase Song, trong môi trường với nồng độ glucose rất ít tác dụng kích thích vi sinh vật phát triển tạo thành enzyme Glycerin chỉ có tác dụng kích thích vi sinh vật sinh trưởng phát triển, không cảm ứng tổng hợp enzyme

2.4.2 Nguồn Nitơ

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các sinh vật cellulase là muối nitrat Đối với các giống của bộ nấm bông nguồn nitơ tốt nhất lại là (NH4)2HPO4 Nói chung các muối amon ít tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng môi trong các muối này làm cho môi trường acid hóa Điều này không những ức chế trong quá trình sinh tổng hợp enzyme mà còn có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành [10]

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lý của từng chủng giống Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật nhưng với cao ngô khả năng sinh tổng hợp C1 – và C2 – cellulase cao hơn so với cao nấm men

2.4.3 Nguồn khoáng chất

Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu…) có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn: 0,11 ÷ 22 mg/l, Fe: 2 ÷ 10 mg/l, Mn: 3,4 ÷ 27,2 mg/l [10]

2.4.4 Chất kích thích sinh trưởng

Biotin và tiamin trong môi trưởng dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme này

2.4.5 Một số lưu ý trong quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase

- Nhiều nhà nghiên cứu cho biết cellulose là nguồn cơ chất thích hợp nhất đối với

sự tổng hợp cellulase Rõ ràng đây là sự tổng hợp mang tính chất cảm ứng mà cellulose

là “chất cảm ứng” Do đó nồng độ của nó trong môi trường nuôi sẽ ảnh hưởng lớn đến năng suất của quá trình nuôi cấy [10]:

- Một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cellulase như glucose, succinat, citrat, các sản phẩm trung gian của chu trình Kreb…

- Cao nấm men, cao bắp, pepton có thể là chất tăng sinh tổng hợp cellulase ở một

số chủng vi sinh vật Một số acid amin như: aspartic, valin… tăng cường tổng hợp cellulase

- Nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự tổng hợp cellulase như: Fe, Mn, Zn, Co …

pH thích hợp cho tổng hợp đa số nấm tích tụ cellulase là 4,6 Nhiệt độ enzyme chịu được

90 ÷ 1000C trong vài phút như cellulase của Tricoderma viride, khi nâng 1000C/ 5 phút hoạt tính vẫn giữ được 96%

2.5 Giới thiệu về nguyên liệu rơm rạ khô

2.5.2 Lượng cung cấp và giá cả

Một năm nước ta có thể thu được 2-3 vụ rơm rạ Rơm rạ được thu mua tại Quảng Ngãi, Quảng Nam, Đà Nẵng với ước tính lượng rơm rạ có thể lên đến 2 triệu tấn/ năm

Theo tin tức trên thị trường [29], giá thu mua rơm rạ khoảng 100.000 đồng/ tấn

và có thể dao động qua các năm

Rơm rạ sau khi thu hoạch lúa được phơi khô đạt độ ẩm 10 – 12% sẽ được bó thành từng bó hoặc thành từng cuộn chuyển về dự trữ trong kho

CHƯƠNG 3: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN CÔNG NGHỆ 3.1 Chọn dây chuyền công nghệ

Sau khi tìm hiểu tài liệu về nghiên cứu, sản xuất enzyme cellulase [20] trong phòng thí nghiệm, tôi quyết định lựa chọn phương pháp lên men bề mặt sử dụng chủng

nấm mốc Aspergillus niger để sản xuất enzyme cellulase từ nguyên liệu rơm rạ khô với

dây chuyền công nghệ như sau:

3.2 Sơ đồ dây chuyền công nghệ

Hình 3.1 Sơ đồ dây chuyền công nghệ sản xuất enzyme cellulase từ Asp.niger

Nhân giống

sản xuất

Khay

Tiệt trùng khay

Định lượng

Băm cắt, định lượng

Phối trộn (W=60%) Làm sạch

Thanh trùng (t0=1400C, T=50÷60 phút)

Làm nguội (t0=320C) Cấy giống

Phân phối vào khay nuôi Nuôi cấy (t0=29÷300C; T=42 giờ)

Cô đặc

Nước

Khoáng chất

Chế phẩm enzyme Giống

Aspergillus niger

3.3 Thuyết minh dây chuyền công nghệ

3.3.1 Nguyên liệu

3.3.1.1 Nguyên liệu rơm rạ khô

a) Phân loại, làm sạch

- Mục đích:

Phân loại nhằm lựa chọn rơm đạt yêu cầu về kích thước và chất lượng Làm sạch

cơ học giúp loại bỏ tạp chất như cỏ dại, rác, đất cát ra khỏi rơm đảm bảo thành phần dinh dưỡng cho môi trường nuôi cấy

- Tiến hành:

Rơm khô được dự trữ trong kho khi cần cho sản xuất được đưa vào máy nghiền băm cắt sợi rơm thành những mảnh nhỏ có kích thước khoảng 4-5 mm Dưới máy nghiền

có sàng phân loại rơm theo kích thước:

+ Nếu kích thước lớn hơn yêu cầu thì đưa trở lại máy tiếp tục nghiền

+ Nếu kích thước đạt yêu cầu thì đưa vào phối trộn

- Thiết bị: Sử dụng thiết bị băm cắt rơm

3.3.1.2 Nguyên liệu trấu

3.3.1.3 Nguyên liệu ngô

Khoáng chất được định lượng rồi đổ vào thiết bị phối trộn

- Thiết bị: Sử dụng thiết bị cân và định lượng dạng băng tải

- Thiết bị: Thiết bị tiệt trùng môi trường tiệt trùng dạng nằm ngang

3.3.4 Làm nguội

- Mục đích:

Làm nguội môi trường dinh dưỡng đến nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích hợp về mặt nhiệt độ cho vi sinh vật phát triển Đây cũng là giai đoạn kiểm tra và loại bỏ những thành phần quá nhão hoặc quá khô so với yêu cầu

3.3.5.2 Nhân giống sản xuất

Quá trình nhân giống sản xuất cũng được thực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nuôi cấy

- Thiết bị: Sử dụng các khay để nhân giống sản xuất

- Cách tiến hành:

Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được vít tải chuyển lên bunke trung gian Từ bunke này canh trường qua cân định lượng và được đưa vào khay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy và tiến hành nuôi

Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường Đây là môi trường bán rắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi trường Độ

ẩm 60 ÷ 65% Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là

42 giờ

Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:

Giai đoạn 1:

Thường kéo dài từ 10 ÷ 14 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy Trong giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc

+ Enzyme mới bắt đầu hình thành

+ Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt Tuyệt đối không được để nhiệt độ cao hơn 300C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm của môi trường giảm dần

+ Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 40 ÷ 450C

+ Các loại enzyme được hình thành, trong đó cellulase hình thành nhiều nhất + Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần Do đó trong giai đoạn này cần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 29 ÷ 300C

3.3.8 Thu nhận canh trường sau nuôi cấy

thiết bị đóng chai

- Thiết bị: Lựa chọn thiết bị cô đặc chân không 2 mức tuần hoàn ngoài

Hình 3.2 Sơ đồ quá trình cô đặc

Việc đóng chai sản phẩm sẽ được thực hiện bởi thiết bị đóng chai

- Thiết bị: Dây chuyền rửa chai, chiết rót và đóng nắp tự động 3 trong 1

CHƯƠNG 4: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT

4.1 Lập kế hoạch sản xuất

Kế hoạch sản xuất nhà máy năm 2017:

- Nhà máy làm việc cả tuần liên tục, ngày nghỉ lễ và tết có công nhân trực ca nên dây chuyền hoạt động liên tục

- Nghỉ bảo dưỡng: Nhà máy nghỉ bào dưỡng máy móc 2 tuần vào tháng 11 Bảng 4.1 Các ngày nghỉ lễ, nghỉ tết theo quy định của nhà nước

Tháng Ngày lễ Ngày nghỉ Số ngày nghỉ

1 Tết dương lịch

Tết âm lịch

1/1 28/1, 25/1 ÷ 31/1

1

1

Số ca làm việc trên ngày: 3 ca/ngày

Số giờ làm việc của mỗi ca: mỗi ca công nhân làm việc trong 8 giờ

Bảng 4.2 Kế hoạch sản xuất theo tháng

Tháng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tổng số Ngày 23 28 31 28 30 30 31 31 29 31 16 31 329

4.2 Thông số ban đầu

- Năng suất nhà máy: 1000 tấn enzyme cellulase/năm

Thời gian sản xuất 1 mẻ là 48 giờ Nhà máy sản xuất liên tục, theo kiểu gối đầu nên mỗi ngày đều xử lý nguyên liệu, lên men, thu nhận và tinh chế sản phẩm nên năng suất của nhà máy có thể được tính theo ngày

- Năng suất theo ngày: 1000000/329 = 3039,514 (kg/ngày)

- Thành phần môi trường dinh dưỡng: