Nghiên cứu thăm dò một số hoạt tính sinh học của cây hoàng tinh đỏ mã số mhn 2019 02 (polygonatum kingianum coll et hemsl)

Về nghiên cứu phát triển, hiện nay các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm có chứa một hoạt chất từ cây thuốc tinh chất dược liệu do các chế phẩm này có giá trị

Nguyễn Thị Thu Hiền

NGHIÊN CỨU THĂM DÒ MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CỦA CÂY HOÀNG TINH ĐỎ

(Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.)

HÀ NỘI- NĂM 2020

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng nghiên cứu 3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1 Tình hình nghiên cứu về cây dược liệu trong và ngoài nước 4

2 Bệnh viêm khớp 10

3 Điều trị viêm khớp bằng đông y 13

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Điều chế cao chiết tổng số của thân rễ P kingianum 18

2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của tế bào đại thực bào 19

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH 20

2.2.4 Phương pháp xác định tác dụng chống viêm cấp 20

2.2.5 Phương pháp xác định mức độ giảm đau 23

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 25

2.2.7 Phương pháp xác định khả năng gây độc tế bào 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Kết quả tạo cao chiết của cây Hoàng tinh đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.) 28

3.2 Đánh giá một số hoạt tính sinh học của cao chiết tổng số 29

3.2.1 Tác dụng chống viêm cấp của Cao hoàng tinh đỏ 29

3.2.2 Tác dụng giảm đau 33

3.2.3 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn 38

tinh đỏ 46

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

prostaglandin H2; PGI2: prostaglandin I2; TXA2: thromboxan A2; NF-jB: hệ

Bảng 3.2 Mức độ ức chế viêm của cao hoàng tinh đỏ

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát mức độ kháng khuẩn và kháng nấm của các loại cao chiết từ cây hoàng tinh đỏ

Bảng 3.4 Nồng độ cao chiết gây giảm khả năng sống sót 50% tế bào sau 24,

48, 72 giờ xử lý

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của cao chiết hoàng tinh đỏ đến sự ức chế sản sinh NO

và tỷ lệ sống của các tế bào đại thực bào RAW 264.7

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Việt Nam nằm trong khu vực khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, được thiên nhiên ưu đãi nên có thảm thực vật phong phú và đa dạng, với khoảng hơn 14.000 loài thực vật bậc cao Trong đó, có khoảng gần 4.000 loài được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền1 Nước ta có nền y học cổ truyền hết sức đa dạng và đặc sắc, với bề dày hàng nghìn năm lịch sử, nền y học dân tộc cũng không ngừng phát triển qua các thời kỳ đó Nhiều bài thuốc,

vị thuốc có tác dụng tốt trên lâm sàng nhưng chưa được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý và độc tính Nghiên cứu để khai thác,

kế thừa, ứng dụng và phát triển nguồn thực vật làm thuốc đã, đang và sẽ là vấn đề có ý nghĩa khoa học, kinh tế và xã hội rất lớn ở nước ta

Thực vật là kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên và rất nhiều các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra, được nghiên cứu để phục vụ trong y học Các hợp chất thiên nhiên giữ vai trò chính trong việc phát triển các dược phẩm mới Giá trị của nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học không chỉ ở công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, mà còn vì chúng

có thể dùng làm các nguyên mẫu hoặc các cấu trúc dẫn đường cho sự phát triển và phát hiện nhiều dược phẩm mới Nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học là con đường ngắn và hiệu quả nhất để tìm kiếm các hoạt chất từ nguồn tài nguyên tái tạo này

Cây Hoàng tinh đỏ còn gọi là cây Hoàng tinh lá vòng, Củ cơm nếp có

khoa học Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl., họ Hoàng tinh

(Convallariaceae) Đây là cây thảo sống nhiều năm ở những nơi ẩm mát,

1

Võ Văn Chi (1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, NXB Y học

nhiều mùn của vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai (Sa Pa), Yên Bái, Sơn La (Bắc Yên), Cao Bằng, Nghệ An Cây này đang bị đe dọa tuyệt chủng nên được đưa vào Sách đỏ Việt Nam năm 1996 và 20072

Thân rễ cây Hoàng tinh đỏ được sử dụng để làm thuốc Trong thân rễ chứa manose, polyscharid và các kingianosid A, B, C, D có tác dụng hạ đường huyết, chống viêm và tăng cường miễn dịch3

Trong đông y, Hoàng tinh đỏ được xem là vị thuốc quý, thường có mặt trong các đơn thuốc bổ Tuệ Tĩnh (Nam Dược thần hiệu) đã dùng riêng vị Hoàng tinh chế để chữa chứng hư tổn, suy nhược Hải Thượng Lãn Ông (vệ sinh quyết yếu) dùng Hoàng tinh, phối hợp với Thương truật, Địa cốt bì, lá Trắc bá, Thiên môn để ngâm rượu uống cho mạnh gân cốt, làm đen tóc

Nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu làm sáng tỏ hoạt tính sinh học, đặc biệt là các hoạt tính kháng viêm, giảm đau, kháng khuẩn, gây độc tế

bào của cây hoàng tinh đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.) nhằm

nâng cao giá trị sử dụng và khai thác hợp lý, an toàn và có hiệu quả nguồn hoạt chất quý từ cây thuốc dân gian này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Chiết xuất và tạo được cao chiết từ cây hoàng tinh đỏ (Polygonatum

kingianum Coll Et Hemsl.) và đánh giá được hoạt tính kháng khuẩn, gây độc

tế bào, chống oxy hóa và ức chế sản sinh NO của các cao chiết

3 Nội dung nghiên cứu

1 Chiết xuất tạo các cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn của cây

Hoàng tinh đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.);

2 Đánh giá một số hoạt tính sinh học của các cao chiết tổng và cao

chiết phân đoạn

2.1 Hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn;

2.2 Hoạt tính chống oxy hóa;

2.3 Hoạt tính độc tế bào;

2.4 Hoạt tính ức chế sản sinh NO là nguyên nhân gây phản ứng viêm

4 Đối tƣợng nghiên cứu

Cây Hoàng tinh đỏ (Polygonatum kingianum Coll Et Hemsl.)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tình hình nghiên cứu về cây dược liệu trong và ngoài nước

Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến Dược điển các nước khu vực châu Á như Việt Nam, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản đều có các chuyên luận về dược liệu Một số chuyên luận dược liệu cũng đã được đưa vào Dược điển Mĩ, châu Âu Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu tại cộng đồng Vì vậy, tổ chức Y tế thế giới đã nhấn mạnh việc đảm bảo chất lượng của các thuốc này phải dựa trên các kĩ thuật phân tích hiện đại, với việc

sử dụng các chất chuẩn đối chiếu phù hợp

Trên thế giới, đã phát hiện được 265.000 loài thực vật Trong đó có 150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước ASEAN Trong số này có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc Các loài thực vật có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học Cho tới nay, đã có 0,5%, nghĩa là 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh

Thuốc từ dược liệu được sử dụng không chỉ các nước Á Đông mà còn được tiêu thụ một lượng khá lớn ở các nước Phương Tây Ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì một phần tư số thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ dược liệu Tại Mỹ năm 1980 giá trị số thuốc đó lên tới 8 tỉ đô la, tại thị trường Châu Âu lượngthuốc đông dược tiêu thụ cũng lên tới 2,3 tỉ đô la Nhiều biệt dược đông dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước phát triển

Về sử dụng thuốc, ở khu vực Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với

Ấn Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất Tại Trung Quốc, đông

dược chiếm khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm 2003 ước đạt 20 tỉ

đô la Tại Nhật Bản, đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và sử dụng rộng rãi, với doanh số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc, có tới 90% số lượng cây thuốc trên thế giới được tìm thấy ở đây Theo số liệu năm 1995, có 40% dân số Indonesia sử dụng đông dược, trong đó có 70% sinh sống ở vùng nông thôn Các nước Đông Nam Á khác đều có tỉ lệ sử dụng đông dược đáng kể trong cộng đồng và hệ thống y

tế

Hóa học các hợp chất thiên nhiên trong phát triển thuốc đã trải qua thời

kỳ vàng son vào những năm 1940 đến những năm 1960 Ngày nay, với những

kỹ thuật sàng lọc hoạt tính sinh học mới, hiện đại, với tốc độ nhanh, lượng mẫu nhỏ, việc phát hiện các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học mới là rất có triển vọng Sau khi phát hiện ra các hoạt chất có hoạt tính mới thì việc nghiên cứu chuyển hóa chúng thành các dẫn xuất bằng nhiều con đường trong

đó có hóa tổ hợp để thử hoạt tính sinh học vẫn là một lĩnh vực hấp dẫn

Về nghiên cứu phát triển, hiện nay các công ty đa quốc gia đang có xu hướng phát triển các dược phẩm có chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công thức cổ truyền, kinh điển Ở Trung Quốc giai đoạn 1979 -

1990 có 42 chế phẩm thuốc mới từ cây thuốc được đưa ra thị trường, trong đó

có 11 chế phẩm chữa bệnh tim mạch, 5 chế phẩm chữa ung thư, 6 chế phẩm chữa tiêu hóa Cho đến nay đã có trên 4.000 bằng sáng chế về thuốc đông dược của Trung Quốc được đăng kí, với 40 dạng bào chế khác nhau, được sản xuất ở 684 nhà máy chuyên về đông dược Từ năm 1990 đến nay là giai đoạn

phát triển rất mạnh đối với lĩnh vực sản xuất thuốc từ dược liệu với hàng trăm chế phẩm mới ra đời Nhật Bản là nước dẫn đầu thế giới về nghiên cứu các hợp chất có tác dụng sinh học từ cây thuốc, chiếm 60% bằng phát minh trên thế giới về lĩnh vực này trong 5 năm (1990 - 1995) Trong giai đoạn 2000-

2005 các công ty dược phẩm đa quốc gia đã có 23 thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên được phép đưa ra thị trường để điều trị bệnh ung thư, bệnh thần kinh, bệnh nhiễm trùng, bệnh tim mạch, các bệnh liên quan đến hệ miễn dịch, chống viêm…Điển hình là các thuốc Bivalirudin (MDCO, 2000), Ozogamicin (Wyeth – Ayerst, 2000), Pimecrolimus (Novatis, 2001), Nitisinone (Swedish Orphan, 2002), Ziconotide (Elan, 2004), Exenatide (Eli Lilly, 2005), Micafungin (Fujisawa, 2005) Ở Việt Nam, một số thuốc đang được nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I, II, III như thuốc viêm lợi Dentonin, thuốc trị lỵ và hương hàn Geranin, thuốc hỗ trợ và điều trị ung thư Panacrin, thuốc điều hòa miễn dịch Angala,…

Về pháp chế dược và đăng kí thuốc, theo báo cáo của WHO năm

2011, tốc độ xây dựng và ban hành qui chế quản lí thuốc từ dược liệu phát triển khá nhanh trong khoảng thời gian từ năm 1986 đến 2007 Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ là do xu hướng của các nước phương Tây nhằm tăng cường tự điều trị, và do lo lắng về tác dụng bất lợi của chế phẩm hóa dược và sự nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường Với sự phát triển của các kĩ thuật phân tích hiện đại, nhiều hoạt chất được tách chiết từ dược liệu, nghiên cứu xác định cấu trúc và tác dụng dược lí Kết hợp với công nghệ bào chế, các nhà sản xuất đã cho ra đời những dạng thuốc thuận tiện cho người sử dụng như viên nén, viên nang, cốm thuốc, trong đó nguyên liệu đầu vào là tinh chất hoặc cao dược liệu chuẩn hóa có hàm lượng hoạt chất chính xác Điển hình trong nhóm này là các chế phẩm viên nén, viên nang cao Bạch

quả (Ginkgo biloba), chứa các hoạt chất ginkgo flavnol glycosides, terpene

lactones, bilobalide, ginkgolide A, ginkgolide B, ginkgolide C; viên tỏi chứa

dịch chiết tỏi có hoạt chất chính là allicin, viên nén cao Cúc gai dài (Cardus

marianus) chứa hoạt chất chính là silymarin Nhiều hoạt chất chiết xuất từ

dược liệu được tinh chế đạt đến độ tinh khiết có thể sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc tiêm Điển hình trong nhóm này là các chế phẩm thuốc tiêm

chứa flavonoid của Ginkgo biloba (biệt dược Tanakan®, Pháp; thuốc tiêm chứa paclitaxel phân lập từ cây Taxus Brevifolia (biệt dược Taxol ®, Mĩ); thuốc tiêm chứa vinblastin phân lập từ cây Vinca rosea (biệt dược Velbe ®,

Pháp)… Do sự phức tạp về cấu trúc hóa học nhiều chất trong nhóm này cho đến nay vẫn chưa tổng hợp được

Hiện nay, nguồn tài nguyên cây cỏ và tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc là cơ sở quan trọng để sàng lọc và tìm ra thuốc mới Hướng nghiên cứu này đang rất được coi trọng ở các nước có nền y học tiên tiến như Mĩ, Pháp, Nhật Bản, Trung Quốc Ứng dụng công nghệ thông tin trong việc thiết kế các phân tử thuốc mới, cũng như trong nghiên cứu mối tương quan cấu trúc – hoạt tính đang ngày càng phát triển Mặc dù đa số các công ty dược lớn trên thế giới trong thời gian vừa qua chưa đầu tư tích cực lắm cho việc nghiên cứu hóa các các hợp chất thiên nhiên Song, lĩnh vực này vẫn được đẩy mạnh trong các thập niên vừa qua và chắc chắn sẽ phát triển mạnh trong thời gian tới Đặc biệt, trong những năm gần đây đã có những thay đổi đáng kể trong việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên

Nhìn chung, cho đến nay có 6 cách tiếp cận khi thu thập mẫu nghiên cứu Đó là: chọn địa điểm một cách ngẫu nhiên, dựa vào phân loại học, dựa vào y học dân tộc, dựa vào hóa thực vật, dựa vào cơ sở thông tin dữ liệu và dựa vào sự cầu may Gần đây, cách tiếp cận dựa vào hóa thực vật và cơ sở

thông tin đã có những thay đổi do sự phát triển mạnh mẽ của hai lĩnh vực này

Ví dụ khi cần thu thập các mẫu có một hoạt tính nào đó thì cơ sở dữ liệu có thể cho ta:

Danh sách của những cây có hoạt tính này theo kinh nghiệm của y học dân tộc;

Danh sách các cây đã có số liệu về hoạt tính này qua phép thử in vitro,

in vivo hoặc trên người;

Danh sách các nguồn hợp chất thiên nhiên có hoạt tính này hoặc có hoạt tính của một trong các phép thử trên

Trường hợp danh sách này quá dài thì người ta kết hợp với các yếu tố khác như: Mẫu dễ kiểm tra hay khó kiểm, sự độc đáo về mặt thực vật hoặc hóa thực vật, tính đặc hữu để lựa chọn một danh sách ngắn hơn Quan trọng là phải thu tất cả các bộ phận của cây Một trong những con đường để tìm kiếm nhanh các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học là dựa vào Thực vật dân tộc học (Ethnobotany) với tạp chí dẫn đầu là Journal of Ethno pharmacology

Việt Nam cũng có một số mặt hàng đông dược xuất khẩu có uy tín ở thị trường nước ngoài như hoa hòe, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu hồi, quế, tràm Nhu cầu sử dụng đông dược ở nước ta cũng rất lớn Theo đánh giá của Viện Dược liệu năm 1995, nhu cầu dược liệu toàn quốc khoảng 30.000 tấn, cung cấp cho 145 bệnh viện y học cổ truyền, 242 khoa y học cổ truyền trong bệnh viên đa khoa và khoảng 30.000 lương y đang hành nghề, ngoài ra còn cần khoảng 20.000 tấn cho nhu cầu xuất khẩu Nhiều chế phẩm đông dược đã được nghiên cứu tại các viện nghiên cứu và chuyển giao kĩ thuật cho các xí nghiệp sản xuất trong nước, như thuốc viêm gan Haina, thuốc hạ cholesterol máu và hạ huyết áp Ruventat, thuốc chống đái tháo đường Morantin, thuốc nhỏ mũi Ngũ sắc, thuốc hòa tan sỏi thận Somatan, Sotinin,

thuốc tăng tuần hoàn máu Angelin, thuốc viêm gan Phyllantin

Cây hoàng tinh đỏ còn gọi là cây Riềng rừng - Globba pendula Roxb (G calophylla Ridl., G panicoides Miq.) thuộc họ Gừng – Zingiberaceae là loại cây thân thảo, cao 30 - 40cm; bẹ nhẵn, có lông ở mép, phân bố trên khắp các vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu Á, chủ yếu ở Trung Quốc,Việt Nam, Lào Malaysia, Indonesia Ở nước ta, cây mọc trong rừng thường xanh từ thấp tới độ cao 1000m Đặc điểm cây có lá tròn ở gốc,

mà gốc phiến men theo cuống lá, hơi có gợn ở mặt dưới, nhẵn ở trên, dài tới 12cm, rộng 3cm Chuỳ hoa dài 5 - 10cm; nhánh ngắn mang hoa và truyền thể trắng nhọn, ở nách lá bắc; hoa màu vàng nghệ; lá đài, cánh hoa đính thành ống đài; nhị lép, to, vàng, môi lõm ở đầu; bao phấn có 2 cánh; bầu tròn, không nhómng, có hoa tháng 7 - 8 Quả mọng trắng, to 5 - 6mm; hạt có áo hạt Thân

rễ cây đã được sử dụng trong y học cổ truyền Trung Quốc như một loại thuốc

bổ và phương thuốc để điều trị các bệnh phổi, đau dạ dày, tiểu đường, tăng lipid máu, các hội chứng chuyển hóa liên quan và bệnh hắc lào Ở Việt Nam, cây là một loại thảo dược quý trong điều trị bệnh lao, ho ra máu, đau thắt ngực, bệnh mạch vành, đái tháo đường, hạ huyết áp, rối loạn hệ thần kinh tự chủ, đau lưng, đau khớp và viêm khớp trong đó có thoái hóa khớp Các cuộc điều tra hóa thực vật trước đây đối với thân rễ của loài cây này đã báo cáo về việc phân lập được saponin steroid, flavonoid, ancaloit, phenolics, dẫn xuất fructose và phytosterol Tuy nhiên, rất ít nghiên cứu sinh học về cây này đã được công bố Cho đến nay, chỉ có hai báo cáo về tác dụng chống đái tháo

đường của tổng saponin và hoạt tính kháng khuẩn của một số hợp chất từ P

kingianum Vì vậy, các nghiên cứu bổ sung về hoạt tính sinh học của các hợp

chất từ cây này cần được tiến hành để khám phá công dụng của cây trong y

học dân gian Trong y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ của P kingianum

được xử lý bằng cách hấp trong nước nóng và phơi khô trước khi sử dụng để

tăng tác dụng và chống ngứa

2 Bệnh viêm khớp

Viêm khớp là thuật ngữ dùng chung để mô tả tình trạng viêm của một hoặc nhiều khớp xương Viêm khớp có thể làm cho sụn khớp bị vỡ, gây đau, sưng khiến người bệnh gặp khó khăn khi di chuyển Hiện nay, có khoảng 100 loại viêm khớp Trong đó, có 4 loại viêm khớp thường gặp là: viêm xương khớp, viêm khớp dạng thấp , bệnh gout và viêm đa khớp

Viêm xương khớp là bệnh về khớp, chủ yếu ảnh hưởng đến sụn Khi mắc viêm xương khớp, lớp trên của sụn bị vỡ và mòn đi, khiến cho xương dưới sụn cọ xát vào nhau gây đau, sưng, mất khả năng cử động khớp

Viêm khớp dạng thấp là tình trạng rối loạn viêm mạn tính đặc hiệu ảnh hưởng tới khớp Điều này gây tổn thương tới niêm mạc khớp, màng hoạt dịch, đầu xương dưới sụn Bên cạnh đó, bệnh còn ảnh hưởng tới các bộ phận khác như: da, mắt, tim, phổi…

Bệnh gout cũng là một dạng viêm khớp Bệnh xảy ra do có sự rối loạn chuyển hóa trong cơ thể dẫn đến tăng nồng độ axit uric trong máu Tình trạng này thường gặp ở nam giới trung niên hoặc phụ nữ ở độ tuổi mãn kinh

Viêm đa khớp là tình trạng có nhiều hơn 3 khớp khác nhau trên cơ thể

có triệu chứng đau, sưng, cứng khớp gây khó khăn khi cử động Các loại viêm

đa khớp bao gồm: viêm khớp do vảy nến, viêm đa khớp dạng thấp, viêm khớp

do virus Alphavirus gây ra

Có nhiều nguyên nhân gây viêm khớp, phổ biến là:

Tuổi tác: Tuổi tác là nguyên nhân hàng đầu gây ra tình trạng viêm

khớp, tuổi càng cao thì nguy cơ mắc bệnh càng tăng Bởi quá trình lão hóa khiến khớp bị khô do thiếu dịch khớp nên sụn giòn và dễ gãy hơn

Yếu tố di truyền: Một số bệnh xương khớp có yếu tố di truyền như:

viêm đa khớp, viêm khớp dạng thấp… Do đó, nếu người thân có tiền sử viêm khớp thì bạn cũng có nguy cơ cao mắc bệnh hơn so với người bình thường Theo các chuyên gia y tế, gen của những người này thường nhạy cảm với những yếu tố thay đổi của môi trường và dễ bị tổn thương hơn

Béo phì: Cân nặng càng nhiều thì sức ép của trọng lượng cơ thể dồn lên

hệ xương khớp càng lớn Lúc này, khớp háng, cột sống và khớp đầu gối sẽ chịu áp lực nhiều nhất Do đó, người béo phì có nguy cơ mắc bệnh viêm khớp cao hơn bình thường

Nghề nghiệp: Một số công việc làm tăng nguy cơ mắc bệnh viêm khớp

ở vị trí cổ tay, ngón tay, vai như: công nhân làm theo dây chuyền, nhân viên văn phòng, thợ may… do thường phải lặp đi lặp lại các động tác trong thời gian dài Ngoài ra, những người làm công việc nặng, uốn cong đầu gối hoặc ngồi xổm… cũng có khả năng bị viêm khớp ở mắt cá chân, đầu gối, hông, xương sống và vùng cổ

Hút thuốc lá: Hút thuốc lá là một trong những yếu tố làm tăng nguy cơ

mắc viêm khớp dạng thấp Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra, thuốc lá có thể kích hoạt hệ miễn dịch bất thường ở những người mang gen liên quan đến viêm khớp dạng thấp Không những vậy, thuốc lá còn làm tăng mức độ trầm trọng của bệnh và giảm hiệu quả của một số thuốc trị viêm khớp

Đi giày cao gót: Giày cao gót là một trong những “thủ phạm” làm ảnh

hưởng xấu tới sức khỏe hệ xương khớp Khi đi giày cao gót, trọng lượng cơ thể sẽ dồn hết xuống chân, đặc biệt là khớp gối và gót chân Theo thời gian, chúng sẽ bào mòn và làm tổn thương sụn khớp, gây viêm khớp

Ngoài ra, một số nguyên nhân khác cũng có thể làm các khớp xương dễ

bị viêm như: dinh dưỡng không hợp lý, chấn thương, tai nạn…

Tùy thuộc vào loại viêm khớp, vị trí và tình trạng tiến triển của bệnh, triệu chứng có thể xuất hiện tăng hoặc giảm với những dấu hiệu phổ biến sau:

Đau khớp: Đây được xem là triệu chứng điển hình của viêm khớp, kéo dài

suốt thời gian mắc bệnh Do sụn khớp bị bào mòn, dịch khớp giảm nhiều, khiến hai đầu xương chạm vào nhau gây đau Triệu chứng thường xảy ra khi vận động, nghiêng, xoay người, đi lên cầu thang… Thậm chí, ngay cả khi nghỉ ngơi người bệnh cũng có cảm giác đau kéo theo các vấn đề khác về sức khỏe như: mất ngủ, chán ăn, cơ thể suy nhược…

Sưng tấy: Viêm khớp có thể dẫn đến sưng tấy quanh khớp khiến cho người

bệnh có cảm giác đau khi chạm vào, đặc biệt là buổi tối Tại vị trí khớp bị sưng thường xuất hiện dấu hiệu ửng đỏ, sờ vào thấy ấm, đồng thời người bệnh

có cảm giác đau nhức khó chịu Triệu chứng sưng tấy gây khó khăn khi cử động, thậm chí có thể bị tê

Cứng khớp: Thông thường, cấu trúc của khớp khỏe mạnh sẽ được hỗ trợ vận

động bởi dây chằng kèm theo sụn, dịch khớp và một số mô Khi bị viêm khớp, cấu trúc khớp chịu tổn thương, người bệnh gặp khó khăn trong vận động Các dây chằng, sụn có thể gặp vấn đề và gây xơ cứng Hiện tượng cứng khớp thường xảy ra vào buổi sau khi ngủ dậy và kéo dài khoảng một giờ

Tiếng kêu từ các khớp: Tại vị trí các khớp bị viêm, mỗi khi co duỗi, xoay

khớp, vận động mạnh sẽ xuất hiện tiếng kêu răng rắc, lạo xạo trong khớp Nguyên nhân là do sụn khớp bị bào mòn, dịch khớp giảm khiến cho hoạt động của khớp không được trơn tru như trước Âm thanh phát ra là do hai đầu xương va vào nhau, tạo thành tiếng kêu

Các cơ bắp yếu dần đi: Các cơ quanh khớp sẽ trở nên yếu dần, đặc biệt là đầu

gối Tình trạng này có thể khiến người bệnh sợ vận động vì đau Theo thời

gian, nếu không có biện pháp can thiệp thì có thể dẫn đến tình trạng teo cơ, hạn chế khả năng vận động, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe

Ngoài các triệu chứng kể trên, tùy vào loại viêm khớp người bệnh còn kèm theo một số dấu hiệu như: Sốt kéo dài, mệt mỏi, ăn không ngon miệng; Phát ban, khó thở, khô mắt và miệng; Đổ mồ hôi trộm

Bệnh viêm khớp gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm, bao gồm:

Mất khả năng vận động: Tình trạng này xảy ra ở những người mắc bệnh viêm

khớp diễn tiến trong một thời gian dài mà không có sự can thiệp hiệu quả Đặc biệt là ở người lớn tuổi, khi bị viêm khớp gối, khớp háng, hông sẽ hạn chế khả năng vận động rõ ràng nhất Càng để lâu, các khớp bị tổn thương càng mất vận động, tình trạng viêm đỏ, sưng, nóng thường xuyên tái phát

Biến dạng khớp: Đây là một trong những biến chứng nguy hiểm của bệnh

viêm khớp Hầu hết những người bị biến dạng khớp đều do mắc bệnh lâu năm, việc điều trị trở nên kém hiệu quả hoặc không thực hiện phương pháp cải thiện nào Hiện tượng này xảy ra khi một bên khớp bị bào mòn nặng, cấu trúc khớp không vững chắc, bị dính và biến dạng

3 Điều trị viêm khớp bằng đông y

Sự khác biệt trong việc sử dụng các loại thuốc đông y với thuốc tây y trong điều trị viêm khớp đó là trong 1 phác đồ điều trị đòi hỏi nhiều thành phần hoạt tính có tác dụng hiệp đồng điều trị thông qua nhiều mục tiêu và con đường tác dụng thuốc, hoặc thông qua tương tác giữa hợp chất Trên thực tế, chiến lược điều trị này đã được chứng minh là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các loại thuốc hóa học tổng hợp Đối với các loại thuốc chống viêm không steroid (Nonsteroidal anti-inflammatory drug- NSAID), cấu trúc hóa học của chúng bao gồm một gốc axit gắn với một nhóm chức chứa vòng thơm

[89], và mục tiêu tác dụng của các loại thuốc này là cyclooxygenase (COX),

là yếu tố cần thiết cho sự chuyển hóa của axit arachidonic (AA) có nguồn gốc

từ màng tế bào để hình thành các prostaglandin gây viêm [90] Do đó, NSAID thể hiện hiệu lực cao trong việc ức chế tổng hợp prostaglandin E2 (PGE2) và sau đó làm giảm đáng kể tình trạng viêm và đau Tuy nhiên, NSAID có thể làm giảm hoạt động của prostacyclin (PGI) bằng cách ức chế COX-2 và sau

đó làm đảo lộn sự cân bằng giữa PGI (prostacyclin) và thromboxane (TX), cũng như ức chế chất trung gian gây viêm PGE2 (, dẫn đến các biến cố tim mạch, là một trong những tác dụng phụ chính của NSAID Ngoài ra, bệnh nhân viêm khớp dạng thấp thường xuyên bị đau và viêm đa khớp mãn tính, có thể phải điều trị lâu dài hoặc thậm chí là kiểm soát cơn đau suốt đời, trong khi đặc tính nổi trội của NSAID là giảm đau cấp tính [91]

Sinomenine (SIN) là một alkaloid có cấu trúc tương tự như morphin nhưng không gây nghiện Điều quan trọng, không giống như các chất ức chế COX, SIN không chỉ ức chế sự hoạt hóa của các tế bào liên quan đến miễn dịch và sự bài tiết các cytokine gây viêm, mà còn hạn chế có chọn lọc sự tổng hợp của prostaglandin E syntha-1 (mPGES-1), một loại enzyme liên quan quá trình tổng hợp PGE2 Nói cách khác, SIN nhắm trực tiếp vào mPGES-1 để ức chế tổng hợp PGE2, nhưng không can thiệp vào sự cân bằng giữa PGI và TX,

do đó tránh được các tác dụng phụ trên tim mạch Hơn nữa, SIN có tác dụng bảo vệ đáng kể đối với xương có thể so sánh với MTX (methotrexate) bằng cách xây dựng lại mối liên kết giữa metalloproteinase (MMPs) và yếu tố ức chế (TIMP), do đó, SIN không chỉ là một loại thuốc chống viêm, mà còn là một loại thuốc huốc chống thấp khớp điều chỉnh bệnh [92] (Hình 20)

Flavonoid là những hợp chất phenol phong phú nhất thể hiện đặc tính chống oxy hóa, chống viêm và điều hòa miễn dịch [93, 94] Nhiều flavonoid

hoạt tính sinh học, chẳng hạn như licochalcone, baicalein và puerarin, có tác

dụng chống viêm mạnh mẽ Do đó, flavonoid là một loại hóa chất tự nhiên

tiềm năng để bào chế ra các loại thuốc chống viêm và chống viêm khớp Ví

dụ, dihydromyricetin, một loại flavonoid được chiết xuất từ cây chè dây

(Ampelopsis) có tác dụng ngăn chặn tín hiệu IjB kinase b (IKK-b) là yếu tố

biệt hóa tế bào T của người Dihydromyricetin liên kết cộng hóa trị với vị trí

gắn kết Cys-46 của IKK-b kinase, điều này cho thấy Cys-46 là một vị trí liên

kết thuốc mới để ức chế IKK-b và những bệnh nhân kháng thuốc với kiểu gen

đột biến IKK-b cuối cùng có thể được điều trị bằng chất ức chế IKK-b mới

này

Hình 1 Cơ chế phân tử của quá trình điều trị viêm khớp bằng

sinomenine cPLA2: men phospholipase A2; PGD2: prostaglandin D2;

PGH2: prostaglandin H2; PGI2: prostaglandin I2; TXA2: thromboxan A2;

NF-jB: hệ số hạt nhân kappa B

Bên cạnh đó, một số nghiên cứu theo hướng đảo ngược sự tiến triển của bệnh viêm khớp bằng cách điều chỉnh một phần sự trao đổi chất của axit béo

và AA Berberine (BBR), một thành phần chính trong Rhizoma Coptidis (Huanglian), cũng được xác nhận là có thể điều trị bệnh viêm khớp bằng cách điều chỉnh các con đường tổng hợp axit béo và cholesterol; tuy nhiên, tác dụng chống viêm khớp của nó phần lớn bị chặn bởi việc bổ sung các chất chuyển hóa trung gian trong hai con đường này [97] Dựa trên những kết quả này, việc điều chỉnh sự trao đổi chất ở cấp độ tế bào và cơ quan là một cơ chế quan trọng mà thuốc đông dược trong điều trị bệnh viêm khớp [98] Vì sự kết hợp của thuốc đông dược thường có thể tạo ra tác dụng tại chỗ hoặc toàn thân trên đường tiêu hóa sau khi uống, hệ vi sinh đường ruột phải phát huy tác dụng trung gian trong quá trình điều trị Thành phần và chức năng của hệ vi khuẩn đường ruột là những chỉ số quan trọng phản ánh tác dụng của thuốc đông y Ví dụ, polysaccharid trong cây hoàng kỳ và tâm sen phân giải thành các axit béo chuỗi ngắn để thực hiện thêm các chức năng chống suy giảm chức năng của khớp và chống viêm Các kỹ thuật giải trình tự gen có thể được

sử dụng để xác nhận và phân tích thêm mối tương quan giữa những thay đổi trong hệ vi khuẩn đường ruột và hiệu quả điều trị viêm khớp của thuốc đông

y Nghiên cứu của Pan và cộng sự về GJK, một công thức thuốc đông ý chứa năm loại thảo mộc có tác dụng làm giảm đáng kể các triệu chứng của bệnh viêm khớp và ngăn chặn sự xói mòn xương ở các mô hình chuột bị viêm khớp Thuốc này cũng ổn định lại sự mất cân bằng trong hệ vi khuẩn đường ruột, có tương quan chặt chẽ với việc cải thiện sản xuất cytokine gây viêm và

cơ chế bảo vệ xương Ví dụ, GSZMD, một công thức thảo dược cổ điển được

sử dụng để điều trị RA, bao gồm chín loại thảo mộc Trung Quốc có chứa 637 hóa chất [101], trong khi phân tích chức năng của GSZMD cho thấy rằng

1327 mục tiêu của 637 hóa chất này có thể liên quan đến nhiều mạng lưới

sinh học làm trung gian cho các hoạt động của thuốc Hiệu quả điều trị của GSZMD có thể là kết quả của việc điều chỉnh con đường tín hiệu Fc epsilon

RI, con đường tín hiệu adipocytokine và chuyển hóa lipid, có liên quan chặt chẽ với giải phóng chất trung gian, bệnh lý viêm, đáp ứng tự miễn do kháng nguyên, chuyển hóa lipid toàn cơ thể, và sự giảm quá trình viêm khớp ở bệnh nhân

Khám phá các loại thuốc đông y mới là cơ sở quan trọng để phát triển các loại thuốc chống viêm khớp nhắm mục tiêu mới Việc sử dụng các mô phỏng tính toán và ghép nối ảo giữa các thành phần hóa học có trong các loại thuốc đông y và các protein đặc hiệu có thể giúp các nhà nghiên cứu tránh được việc lựa chọn thuốc ngẫu nhiên Hơn nữa, tế bào gốc và kỹ thuật in ba chiều (3D) có thể được sử dụng để đạt được các mô hình in vitro tái tạo quá trình tiến triển của bệnh và tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện ra các protein hoặc mục tiêu quan trọng liên quan đến bệnh lý viêm khớp [111,112]

Do đó, việc áp dụng các kỹ thuật điều chế tính toán, bao gồm cả việc ghép nối phân tử, có thể làm tăng tỷ lệ thành công và độ chính xác trong quá trình lựa chọn một loại thuốc nào đó từ cơ sở dữ liệu thành phần TCM, điều này sẽ đóng góp đáng kể vào việc phát hiện ra thuốc [113] Căn nguyên và sinh bệnh học của bệnh viêm khớp rất phức tạp, và có thể liên quan đến các mục tiêu và con đường tín hiệu khác nhau với các tác dụng thuốc dược lý đa dạng Do đó, các chiến lược khai thác các thành phần hiệu quả khác nhau để điều chỉnh các mục tiêu và đường dẫn tín hiệu đó có thể tạo ra kết quả hiệu quả hơn so với một thành phần đơn lẻ Vì mục đích này, một cách tiếp cận có ý nghĩa là chiết xuất các thành phần hiệu quả từ các công thức thuốc đông y để phát triển các loại thuốc mới để điều trị bệnh Ngoài ra, việc xác định các tác nhân đa mục tiêu mới hoạt động trên nhiều lĩnh vực, bao gồm protein, lipid và axit amin, rất có giá trị cho việc khám phá các loại thuốc điều trị bệnh viêm khớp

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cây hoàng tinh đỏ (P kingianum) Thân rễ tươi của P kingianum được

thu hái ở Hà Giang, Việt Nam tháng 9 năm 2017 Tên khoa học được xác định bởi TS Nguyễn Văn Du, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Điều chế cao chiết tổng số của thân rễ P kingianum

Thân rễ tươi của P kingianum được thu hái tại Hà Giang, Việt Nam vào tháng 9 năm 2019 Thân rễ tươi của P kingianum rửa sạch, hấp cách

thủy, sau đó phơi khô Quá trình này được lặp lại 9 lần cho đến khi thân rễ trở nên mềm và có màu đen theo phương pháp chế biến được sử dụng trong y học

cổ truyền Việt Nam Thân rễ đã qua xử lý được cắt lát và sấy khô ở nhiệt độ

400C Bột khô thu được (1,0 kg) được ngâm trong ethanol 95% (mỗi lần 4,5 lít, 3 lần) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Dịch chiết sau đó được lọc và cô đặc dưới áp suất giảm trong thiết bị bay hơi quay để thu được phần còn lại của

dịch chiết ethanol (chất rắn màu nâu) Dịch chiết ethanol của thân rễ P

thử nghiệm các hoạt tính sinh học

2.2.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của tế bào đại thực bào

Tế bào đại thực bào dòng RAW264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 2mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, 10% huyết thanh bào thai bê (fetal bovine serum- FCS) Tế bào được nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 370C, 5% CO2

Tế bào nuôi cấy trong đĩa 96 giếng để đạt mật độ 2x105 tế bào/giếng, loại bỏ môi trường trong đĩa, bổ sung DMEM không có FCS

Cao chiết hoàng tinh đỏ được pha loãng trong PBS để đạt các liều 0,8,

4, 20, 100 g/ml được ủ với tế bào trong 2 giờ trước khi kích thích tế bào sản sinh NO bằng lipopolysaccharide (LPS) với nồng độ g/ml trong 24 giờ Các giếng đối chứng âm là các giếng thay cao chiết bằng dung dịch PBS

NO2 tạo thành được xem là chỉ thị cho việc tạo NO, chất này được xác định bằng cách lấy 100 l dịch ủ chuyển sang đĩa 96 giếng mới sau đó thêm vào 100 mcl Griess reagent, 50 l của dung dịch sulfanilamide 1% trong phosphoric acid 5% (1:1) và 50 l của N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride 1% Hỗn hợp này được ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, hàm lượng nitrit sẽ được đo bằng máy microplate reader ở bước sóng 540

mm Môi trường DMEM không có FBS được sử dụng làm giếng trắng (blank)

Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu được xác định bằng công thức:

% ức chế= 100%- (hàm lượng NO trong các giếng chứa mẫu/hàm lượng NO

trong giếng có LPS)*100

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH

Nguyên lý: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra

các gốc tự do bền trong dung dịch ethanol bão hòa Khi các mẫu thử nghiệm được cho vào hỗn hợp này, nếu mẫu trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do thì

nó sẽ làm giảm độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do đó Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi so màu ở bước sóng 517 nm

Dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol Cao chiết hoàng tinh đỏ được pha trong DMSO 100% sao cho đạt nồng độ là 100, 20, 4 và 0,9

g/ml Hỗn hợp DPPH và mẫu được trộn theo tỷ lệ 1:1 và giữ ở nhiệt độ phòng, không có ánh sáng trong 16 phút rồi đo bằng máy đo UV ở bước sóng

517 nm Mẫu trắng là các giếng chỉ có dung dịch DPPH có nồng độ 1mM trong methanol Khả năng khử gốc tự do DPPH của mẫu cao chiết được tính theo công thức sau: SC% = (ODtrắng – OD mẫu cao chiết thử)/ ODtrắng (%) Quercetin là chất đối chứng Kết quả được báo cáo bằng giá trị EC50 là nồng

độ của dung dịch cao cho khả năng khử gốc tự do DPPH là 50%

2.2.4 Phương pháp xác định tác dụng chống viêm cấp

* Gây phù chân chuột bằng carrageenin

Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành 3 nhóm, mỗi nhóm 10

con Nhóm 1: (Đối chứng âm): không tác động gì Nhóm 2: dùng Voltaren 0,2g/1 chân chuột Nhóm 3: sử dụng Cao hoàng tinh đỏ 0,2g/1 chuột Chuột được dùng thuốc 5 lần trong 3 ngày liên tục Ngày thứ 1, chuột sau khi dùng thuốc thử 1giờ được gây viêm bằng cách tiêm carrageenin 1% (pha trong

nước muối sinh lý) 0,25 ml/chuột vào gan bàn chân sau, bên phải của chuột

Đo thể tích chân chuột (đến khớp cổ chân) bằng dụng cụ chuyên biệt vào các thời điểm: trước khi gây viêm (V0); sau khi gây viêm 1 giờ (V1), 2 giờ

(V2), 4 giờ (V3) và 6 giờ (V4), 24 giờ (V5), 30 giờ (V6) và 48 giờ (V7) Kết quả

đo thể tích được tính theo công thức của Fontaine

+ Độ tăng thể tích chân của từng chuột được tính theo công thức:

Trong đó: Vc %: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở nhóm đối chứng

Vt%: trung bình độ tăng thể tích chân chuột ở nhóm dùng thuốc

Cách đo độ dày chân chuột: một kỹ thuật viên giữ chuột cố định Một

người khác dùng thước đặt vào gan bàn chân chuột chỗ dày nhất, khi 2 mép của thước chạm chân chuột, màn hình điện tử sẽ hiện ra số đo tính theo đơn

vị mm Các thời điểm đo độ dày chân chuột giống như đo thể tích chân chuột

+ Độ tăng độ dày chân của từng chuột được tính theo công thức:

Trong đó: D% là độ tăng độ dày chân chuột

D0 là độ dày chân chuột trước khi gây viêm

Dt là độ dày chân chuột sau khi gây viêm + Tác dụng chống viêm của thuốc được đánh giá bằng khả năng ức chế phản ứng phù (I%)

Trong đó:  : trung bình độ tăng độ dày chân chuột ở nhóm đối chứng

: trung bình độ tăng độ dày chân chuột ở nhóm dùng thuốc

* Gây viêm tai bằng dầu croton

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm 10

con, được bố trí thí nghiệm như sau:

Nhóm 1 (Gây viêm): Gây viêm bằng dung dịch dầu croton (trong aceton) ở tai phải Nhóm 2 (clobetason): Gây viêm + dùng clobetason liều 0,02g/lần 1 lần ở tai phải Nhóm 3 (Hoàng tinh đỏ 1 lần): gây viêm sau 1 giờ dùng cao Hoàng tinh đỏ liều 0,02g/lần ở tai phải 1 lần Nhóm 4 (Hoàng tinh

đỏ 3 lần): gây viêm + dùng Hoàng tinh đỏ liều 0,02g/lần ở tai phải tại thời điểm 2 ngày trước khi gây viêm, 1 lần/ngày và sau gây viêm 1 giờ Ở tất cả các chuột, tai trái không gây mô hình và không dùng thuốc gì

6 giờ sau khi gây viêm, chuột được giết bằng ether, tai chuột được đo lại chiều dày, sau đó cắt ở phần trung tâm với đường kính 7mm bằng dụng cụ sinh thiết để đo cân nặng

Mức độ ức chế viêm ở mỗi nhóm được tính theo công thức (%):

(KL tai phải - KL tai trái của nhóm gây viêm) - (KL tai phải - KL tai trái

của nhóm dùng thuốc)

x100 (KL tai phải - KL tai trái nhóm gây viêm)

Chú thích: KL - Khối lượng

2.2.5 Phương pháp xác định mức độ giảm đau

* Phương pháp mâm nóng” (hot plate)

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm, mỗi nhóm 10 con:

- Nhóm 1 (Đối chứng âm): Không dùng gì vào 2 chân chuột

- Nhóm 3 (Chứng Salonpas): Dùng Salonpas Gel vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Nhóm 4 (Voltaren): Dùng Voltarel vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Nhóm 5 (Lidocain): Dùng lidocain vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Nhóm 6 (Cao Hoàng tinh đỏ): Sử dụng Cao hoàng tinh đỏ vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

Sau thời gian 30 phút kể từ lúc được dùng, chuột được đặt lên mâm nóng (máy Hot plate), luôn duy trì ở nhiệt độ 56oC bằng hệ thống ổn nhiệt Thời gian phản ứng với kích thích nhiệt được tính từ lúc đặt chuột lên mâm nóng đến khi chuột có phản xạ liếm chân sau Loại bỏ những chuột phản ứng quá nhanh (trước 8 giây) hoặc quá chậm (sau 30 giây) So sánh thời gian phản ứng với kích thích nhiệt trước và sau khi bôi thuốc thử và so sánh giữa các nhóm chuột với nhau

* Phương pháp tail - flick (vẫy đuôi): Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm 10 con:

- Nhóm 1 (Đối chứng âm): không dùng gì vào đuôi chuột

- Nhóm 2 (Chứng Salonpas): dùng Salonpas Gel vào đuôi chuột

- Nhóm 3 (Voltarel): dùng Voltarel vào đuôi chuột

- Nhóm 4 (Cao Hoàng tinh đỏ): sử dụng Cao hoàng tinh đỏ vào đuôi chuột

Sau khi dùng thuốc 30 phút, cho chuột vào buồng đo, đợi khoảng 2 phút để chuột ổn định Đưa đuôi chuột tiếp xúc với nguồn bức xạ nhiệt Khoảng cách đo được xác định giống nhau cho mọi chuột là khoảng 2 - 3cm tính từ đầu mút đuôi chuột Khi xuất hiện phản xạ vẫy đuôi, xác định thời gian phản ứng của chuột với nguồn nhiệt

* Phương pháp rê kim

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm, mỗi nhóm 10 con

- Nhóm 1 (Đối chứng âm): không dùng gì vào 2 chân chuột

- Nhóm 2 (Chứng Salonpas): dùng salonpas Gel vào toàn bộ 2 gan bàn chân chuột

- Nhóm 3 (Voltarel): dùng voltarel vào toàn bộ 2 gan bàn chân

chuột

- Nhóm 4 (Cao Hoàng tinh đỏ): sử dụng Cao hoàng tinh đỏ vào toàn

bộ 2 gan bàn chân chuột

Sau khi dùng thuốc 30 phút, Cho toàn bộ 10 chuột của mỗi nhóm vào các buồng đo, đợi khoảng 5 phút trước khi để chuột ổn định Rê kim (cảm ứng) sao cho đầu kim chạm vào giữa gan bàn chân chuột Bấm nút để thực hiện việc đo, đo thời gian phản ứng với đau của chân chuột

 Phương pháp gây phù viêm chân chuột bằng carrageenin

Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 nhóm, mỗi nhóm 10 con

- Nhóm 1 (Đối chứng âm): không gây phù viêm, không dùng gì

- Nhóm 2 (gây viêm bằng cách tiêm 0,2mL dung dịch carrageenin 0,1%): tiêm phù chân chuột, không dùng gì

- Nhóm 3 (Chứng dương Voltaren): tiêm phù chân, dùng Voltaren

- Nhóm 4 (Chứng dương Salonpas Gel): tiêm phù chân, dùng Salonpas

- Nhóm 5 (Hoàng tinh đỏ): tiêm phù chân, dùng Hoàng tinh đỏ Sau khi gây phù viêm 1 giờ 30 phút, chuột được dùng thuốc hoặc tá dược tương ứng với từng nhóm 30 phút sau khi dùng thuốc, chuột được đo ngưỡng đau bằng phương pháp rê kim Đánh giá phản ứng đau của chuột tại thời điểm 30 phút sau khi dùng

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn

Các chủng vi sinh vật thuộc các loài Vibrio cholera, Salmonella Typhi,

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC), Staphylococcus aureus, Salmonella

aeruginosa, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Candida albicans được

cung cấp bởi khoa Công nghệ Sinh học, trường Đại học Mở Hà Nội được nuôi cấy trong môi trường BHI (Brain Heart agar) cho tới khi đạt mật độ 5x105cfu/ml Cấy trải 100 µl canh khuẩn trên đĩa petri chứa môi trường MHA (Mueller Hinton agar) vô trùng, để khô, sau đó đục các lỗ thạch đường kính 4

mm Cho 100 µl dịch cao chiết ở các nồng độ 10, 25, 50, 100, 150, 200µg/ml vào mỗi lỗ thạch, ủ 37°C trong vòng 18-24 giờ, đọc kết quả và đo đường kính vòng kháng khuẩn Đối chứng dương là ampicillin 0,1 mg/ml, đối chứng âm

là ethanol 35%