Nghiên cứu quy trình thủy phân cua lột scylla sp bằng công nghệ enzyme làm nguyên liệu thực phẩm chức năng

Với mục đích xây dựng quy trình thuỷ phân cua bùn lột bằng công nghệ enzyme và kiểm soát chất lượng sản phẩm bột đạm thủy phân để tạo ra các sản phẩm phục vụ đời sống của con người, chún

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SỸ

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SỸ

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THỦY PHÂN CUA LỘT SCYLLA

SP BẰNG CÔNG NGHỆ ENZYME LÀM NGUYÊN LIỆU

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HỌC VIÊN THỰC HIỆN : VĂN THƯ VŨ

Hà Nội, 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 8.42.02.018

Đề tài:

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THỦY PHÂN CUA LỘT SCYLLA SP

BẰNG CÔNG NGHỆ ENZYME LÀM NGUYÊN LIỆU

THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

HỌC VIÊN THỰC HIỆN: VĂN THƯ VŨ

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ TẤT THÀNH

Hà Nội, 2020

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc rõ ràng và được phép công bố

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020

Học viên thực hiện

Văn Thư Vũ

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Tất Thành đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện và trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn thạc sỹ tại Trung tâm nghiên cứu và phát triển các sản phẩm thiên nhiên - Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên

Luận văn thạc sỹ của tôi được thực hiện trong nội dung của đề tài

“Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym để sản xuất một số sản phẩm thực phẩm chức năng từ cua bùn lột”

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè đã động viên khích lệ trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020

Học viên

Văn Thư Vũ

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG 1

DANH MỤC CÁC HÌNH 2

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Phân loại, đặc tính sinh học, phân bố của cua bùn Scylla sp 3

1.1.2 Thực trạng nuôi cua trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.2.1 Tình hình phát triển nuôi cua bùn lột trên thế giới 4

1.1.2.2 Thực trạng nuôi cua bùn lột tại Việt Nam 5

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng của cua bùn lột 8

1.1.3.1 Thành phần và hàm lượng protein và các amino acid 9

1.1.3.2 Thành phần và hàm lượng các khoáng chất 10

1.1.4 Thực trạng sử dụng cua bùn lột 11

1.2 Công nghệ enzyme trong chế biến 12

1.2.1 Các khái niệm cơ bản 12

1.2.2 Tiêu chí chọn enzyme trong công nghiệp thực phẩm 14

1.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme 16

1.2.4 Enzyme protease 17

1.2.5 Tình hình ứng dụng của enzyme trong chế biến 20

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Vật liệu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Xác định độ ẩm và tro hóa của cua bùn lột 25

2.2.2 Phương pháp xác định các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng 27

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng và thành phần lipid 27

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 29

2.2.4.1 Xác định hàm lượng protein tổng số theo Kjeldahl 29

2.2.4.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan theo Bradford 31

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng peptide tổng OPA 32

2.2.6 Phương pháp phân tích hàm lượng amino acid 33

2.2.7 Phương pháp xác định các vitamin theo phương pháp HPLC 34

2.2.8 Phương pháp thủy phân theo công nghệ enzyme 35

2.3 Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm và tối ưu hoá quy trình công nghệ theo mô hình bậc 2 của Box 37

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ 42

3.1 Nghiên cứu quy trình và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân cua bùn lột 42

3.1.1 Nghiên cứu lựa chọn enzyme phục vụ quá trình thủy phân 42

3.1.2 Đánh giá các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân: pH, nhiệt độ, thời gian thuỷ phân 43

3.1.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH 44

3.1.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 44

3.1.2.3 Khảo sát tỷ lệ nước bổ sung vào nguyên liệu 45

3.1.2.4 Khảo sát tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) 46

3.3.2.5 Khảo sát thời gian thủy phân 46

3.2 Sử dụng thuật toán mô hình hóa thực nghiệm, xác định các yếu tố tối ưu của quá trình thủy phân 47

3.3 Chỉ tiêu chất lượng chính của bột Cua bùn lột thủy phân 54

3.3.1 Chỉ tiêu cảm quan, giá trị hàm ẩm và tro của bột cua bùn lột thủy phân 55

3.3.2 Hàm lượng peptide và các amino acid 56

3.3.2.1 Hàm lượng peptide trong bột cua bùn lột thủy phân 56

3.3.2.2 Hàm lượng amino acid trong bột cua bùn lột thủy phân 57

3.3.3 Hàm lượng lipid 58

3.3.4 Các chỉ tiêu về vi sinh vật và kim loại nặng của bột cua bùn lột thủy phân 58

3.3.4.1 Các chỉ tiêu vi sinh vật 58

3.3.4.2 Các chỉ tiêu kim loại nặng 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cua bùn lột (Nguyên Phương Lan và cs,

2019) 24

Bảng 2.2 Mật độ quang OD tại các nồng độ L-glutathione 33

Bảng 3.1 Hàm lượng khoáng của mai mềm cua trước và sau khi thủy phân 43

Bảng 3.2 Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng 47

Bảng 3.3 Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm 48

Bảng 3.4 Các điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân cua bùn lột 51

Bảng 3.5 Chỉ tiêu cảm quan của bột cua bùn lột thủy phân 55

Bảng 3.6 Kết quả hàm ẩm của mẫu bột cua bùn lột thủy phân 55

Bảng 3.7 Hàm lượng tro của bột cua bùn lột thủy phân 56

Bảng 3.8 Hàm lượng peptide trong bột cua bùn lột thủy phân 56

Bảng 3.9 Hàm lượng amino acid trong mẫu bột cua bùn lột thủy phân 57

Bảng 3.10 Hàm lượng lipid của bột cua bùn lột thủy phân 58

Bảng 3.11 Kết quả phân tích các chỉ tiêu vi sinh trong cua bùn lột 58

Bảng 3.12 Kết quả chỉ tiêu kim loại nặng có trong cua bùn lột 59

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cua Scylla sp 3

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn Brad ford 32

Hình 3.1 Lượng peptide hòa tan thu được từ mẫu thủy phân cua bùn lột (µg) 42 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 44

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng protein 45

Hình 3.4 Tối ưu hóa tỷ lệ nước và nguyên liệu 45

Hình 3.5 So sánh sự thủy phân enzyme với tỷ lệ E/S khác nhau 46

Hình 3.6 Hàm lượng protein thu được sau thời gian khác nhau 47

Hình 3.7 Các mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tương tác đôi lên hàm mục tiêu Y1 50

Hình 3.8 Các mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tương tác đôi lên hàm mục tiêu Y2 50

Hình 3.9 Quy trình thủy phân cua bùn lột bằng enzymen liệu/mẻ 52

Hình 3.10: Bột cua bùn lột thủy phân 55

MỞ ĐẦU

Cua bùn lột có hàm lượng dinh dưỡng rất cao, cao hơn cua vỏ cứng ở cùng khối lượng vì ở thời kì này cơ thể cua tích lũy rất nhiều chất dinh dưỡng, quá trình chuyển hóa trong cơ thể chúng rất nhanh và liên tục để nuôi sống và bảo vệ chúng khỏi tác động bên ngoài sau khi mất đi lớp vỏ cứng cáp để tự bảo

vệ Cua bùn lột là nguồn thực phẩm cung cấp protein, chất khoáng như canxi, phospho, vitamin và các acid thiết yếu rất tốt như axit folic - một hợp chất rất tốt cho thời kì đầu mang thai

Tuy nhiên, từ hàng thập kỷ qua cho đến nay, sản phẩm cua bùn lột chỉ được sử dụng như một thực phẩm “ăn liền”, nghĩa là chỉ dừng ở việc sơ chế, đóng gói, bảo quản cấp đông rồi tiêu thụ nội địa hoặc xuất khẩu để làm nguyên liệu cho các nhà hàng chế biến ra hàng loạt các món ăn nguyên con như cua bùn lột chiên bơ, cua bùn lột chiên xù, cua bùn lột ram me, cua bùn lột bọc dừa, cua bùn lột xào chua ngọt Do tính đặc thù trong thu hoạch và sơ chế, cua bùn lột bị rụng chân-càng thường chiếm trên 30% tổng số cua bùn lột được thu hoạch, dẫn đến thất thu khá lớn cho người nuôi vì cua bùn lột mất chân-càng bị giảm giá xuống ½, mặc dù chất lượng và sự tươi ngon của chúng hầu như không bị mất

đi so với cua nguyên vẹn Nghề nuôi cua bùn lột cũng mang lại thu nhập cao hơn nuôi cua thịt và các loài giáp xác khác Tuy nhiên các sản phẩm từ cua bùn lột đến nay chủ yếu là bán nguyên con hoặc các món ăn đặc sản trong các nhà hàng

Bên cạnh đó, trong những năm gần đây cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, nhiều loại enzyme đã được sinh tổng hợp ở quy

mô công nghiệp và được thương mại hóa Xu thế ứng dụng các chế phẩm enzyme trong sản xuất và chế biến ở nước ta đã phát triển nhanh chóng, mang lại hiệu quả kinh tế với những ưu điểm như tốc độ phản ứng nhanh, có tính chuyên hóa cao, điều kiện phản ứng đơn giản, không cần loại bỏ hóa chất dư thừa sau phản ứng ra khỏi sản phẩm cuối cùng và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất Việc áp dụng công nghệ enzyme trong chế biến sản phẩm từ cua bùn lột

cũng được quan tâm nghiên cứu nhằm tạo ra các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao trong đó có các sản phẩm thực phẩm chức năng

Với mục đích xây dựng quy trình thuỷ phân cua bùn lột bằng công nghệ enzyme và kiểm soát chất lượng sản phẩm bột đạm thủy phân để tạo ra các sản

phẩm phục vụ đời sống của con người, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu

quy trình thủy phân cua lột Scylla sp bằng công nghệ enzyme làm nguyên

liệu thực phẩm chức năng.”

Mục tiêu

- Xây dựng quy trình chế biến cua bùn lột bằng công nghệ enzyme

- Xây dựng bộ tiêu chuẩn và các phương pháp kiểm soát chất lượng bột đạm thủy phân làm nguyên liệu thực phẩm chức năng

Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng quy trình thủy phân cua bùn lột bằng enzyme

- Tối ưu hoá quy trình công nghệ bằng thuật toán quy hoạch thực nghiệm bậc 2

- Nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng của bột cua bùn lột sau thủy phân

- Xây dựng bộ tiêu chuẩn chất lượng bột cua bùn lột thủy phân

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Phân loại, đặc tính sinh học, phân bố của cua bùn Scylla sp

Cua bùn Scylla sp thuộc họ Portunidae, bộ Decapoda, lớp Crustacea, ngành Arthropoda Cua bùn Scylla gồm 4 loài (S paramamosain; S serrata; S

olivacea và S tranquebarica) Thân hình cua dẹt theo hướng lưng bụng, toàn bộ

cơ thể được bao bọc trong lớp vỏ chitin dày Cơ thể cua gồm 2 phần: phần đầu ngực nằm trong giáp đầu ngực, phần bụng nhỏ và gập lại dưới giáp đầu ngực (yếm cua) Thời kỳ phát triển phôi được cua mẹ mang và phát triển ở vùng biển ven bờ, ấu trùng nở ra sống phù du ở đây Cua bột mới nở ra theo thuỷ triều dạt vào vùng nước lợ: những bãi lầy rừng sú vẹt ven bờ biển, cửa sông, nơi có đáy bùn, bùn cát hoặc đất thịt pha cát mịn giầu mùn bã hữu cơ thuộc vùng trung hạ triều, cua sinh trưởng ở đây cho đến lúc thành thục sinh dục lại di cư ra vùng biển gần bờ

Hình 1.1 Hình thái cua Scylla sp

Để sinh trưởng và phát triển cua bùn cũng như tất cả các loài giáp xác khác, khi tích lũy đầy đủ vật chất và năng lượng thì cua trải qua quá trình lột vỏ

để tăng về kích thước Các giai đoạn trong một chu kỳ lột xác của cua bao gồm

3 giai đoạn chính: sau lột vỏ (postmolt), giữa chu kỳ lột vỏ (intermolt), và trước khi lột vỏ (premolt) và từ 3 giai đoạn chính được chia ra thành 10 giai đoạn nhỏ

hơn khác nhau A, B, C1, C2, C3, C4, D1, D2, D3, D4 (Passano, 1960; Heasman, 1980) Chu kỳ lột vỏ của cua thay đổi theo từng thời kỳ phát triển, càng về sau thời gian giữa 2 lần lột vỏ càng kéo dài và chịu tác động tương tác giữa yếu tố nội sinh và ngoại sinh như: nhiệt độ, dinh dưỡng, ánh sáng, giới tính, hormon (Heasman, 1980) Như vậy, cua bùn lột xác được gọi là cua bùn lột

1.1.2 Thực trạng nuôi cua trên thế giới và Việt Nam

1.1.2.1 Tình hình phát triển nuôi cua bùn lột trên thế giới

Ở nhiều nước trên thế giới, các loài cua bùn (Scylla spp.) là một trong

những đối tượng nuôi quan trọng Sản lượng cua nuôi của các nước Châu Á và Châu Phi đạt tới 138.000 tấn với trị giá xấp xỉ 377 triệu đô la Mỹ trong năm

2012 (FAO, 2014)

Theo Keenan (1999), có hai hình thức nuôi cua chủ yếu: (a) nuôi từ cua giống lên cua thịt với kích cỡ thương phẩm khoảng 3 – 4 con/kg; (b) nuôi vỗ béo cua lên cua gạch Cua bùn lột hay còn gọi là cua vỏ mềm (softshell mud crab) đã được thu hoạch từ hai hình thức nuôi trên Tuy nhiên, do nhu cầu thị trường của cua bùn lột tăng lên không ngừng vào cuối những năm 1990 của thế kỷ XX, đồng thời giá trị kinh tế của cua bùn lột gấp 3 lần so với cua thịt và 2 lần so với cua gạch đã thúc đẩy nghề nuôi cua bùn lột phát triển khá nhanh, đặc biệt ở các nước Đông-Nam Châu Á Công trình nghiên cứu “Hệ thống nuôi cua bùn lột” của Alber & Julie (2011) đã đề cập đến 2 loại hình nuôi cua bùn lột khá phổ biến hiện nay là nuôi bằng rổ trên giàn bè nổi ở ao/hồ/đầm với lưới che hoặc không

có lưới che và nuôi bằng rổ trong hệ thống bể nước chảy tuần hoàn có mái che Nhóm nghiên cứu cũng đã đưa ra các phương pháp lọc nhằm bảo đảm các chỉ số môi trường cho hệ thống nuôi tuần hoàn bao gồm: (1) lọc cơ học, có thể sử dụng lưới/màn chắn hoặc túi lọc với kích cỡ mắt lưới nhỏ vừa đủ để loại bỏ các chất thải cứng như phân cua, thức ăn thừa…, sau đó sử dụng hệ thống bơm lọc (skimmer) để loại bỏ các vẩn vụn protein; (2) sau khi lọc cơ học, nước tiếp tục

được lọc sinh học, tại đây với các loại vi khuẩn có lợi như Nitrosomonas hoặc

Nitobacter, NH3 có thể được chuyển đổi NO2 trở thành NO3 ít độc hơn Vì vậy, cung cấp oxy hòa tan trong quá trình lọc sinh học giữ vai trò quan trọng

Công bố của Lwin (2011) đã cho thấy, năm 1997 Thái Lan phát triển nuôi cua bùn lột ở 2 tỉnh Samutphakan and Samut Sakhon theo phương pháp cắt bỏ chân bò và càng Với mật độ cua nuôi 10 – 15 con/m2 và cho cua ăn cá vụn 2-3 ngày/lần, tỷ lệ chết của cua khá cao, tới khoảng 50% đã không tạo ra lợi nhuận cao cho người nuôi Năm 2000-2001, một số cơ sở nuôi cua bùn lột của tỉnh Ranong đã tìm ra phương pháp nuôi cua trong từng rổ riêng biệt, nên tỷ lệ chết

đã giảm xuống 20-30% Đến năm 2009, tỉnh này đã có khoảng 756 trang trại nuôi cua bùn lột hoạt động với 4.458 ha mặt nước và 20.000 lao động Hàng tháng các trang trại ở Ranong đã sản xuất được từ 150 tấn đến 200 tấn cua bùn lột Tuy nhiên, nguồn cua nguyên liệu phải nhập khẩu về từ Myanma đang là một vấn đề đối với nghề nuôi cua bùn lột ở đây Kết quả nghiên cứu của tác giả cũng đã chứng minh rằng, mô hình nuôi kết hợp giữa cua bùn lột với cá rô phi hoặc với rong biển đã mang lại lợi ích đáng kể mà đầu tiên phải kể đến là môi trường nuôi cua được cải thiện một cách rõ ràng và hiệu quả, tiếp đến là đa dạng hóa các sản phẩm thu hoạch Đến nay, các mô hình nuôi cua bùn lột được phát triển chủ yếu từ nghiên cứu này

Theo báo cáo của tổ chức AWF (Aquaculture Without Frontier), Malaysia

là quốc gia thứ hai đã phát triển kỹ thuật nuôi cua bùn lột trên kệ/giá nhiều tầng

và loại kệ/giá này đã được cải tiến để đưa ra một khung mẫu khá chuyên nghiệp nuôi cua bùn lột và đã được sản xuất hàng loạt ở Trung Quốc và Malaysia Năm

2013, Trung tâm nuôi Thủy sản Sepang, Malaysia đã sử dụng loại kệ/giá được thiết kế mới này để nuôi cua bùn lột, nước chảy tuần hoàn từ hộp ở tầng trên xuống các hộp tầng bên dưới, rồi chảy đến hệ thống làm sạch nước gồm Skimmer và Ôzon, sau đó nước được tái sử dụng Đã có 450.000 hộp nuôi được đưa vào sử dụng để sản xuất cua bùn lột ở Trung tâm này Cua nuôi được kiểm tra 4 tiếng một lần để thu hoạch cua bùn lột và loại bỏ cua chết

1.1.2.2 Thực trạng nuôi cua bùn lột tại Việt Nam

Nuôi cua biển trước đây ở nước ta được thực hiện với nhiều hình thức khác nhau như nuôi cua con thành cua thịt trong các đầm quảng canh, trong mô

hình tôm rừng hay nuôi trong đăng quầng ở các bãi triều; nuôi cua gạch trong ao

và lồng; nuôi cua ốp thành cua chắc trong ao Trong đó nghề nuôi cua bùn lột

(Scylla sp.) được thực hiện từ những năm 1980 ở Long An ngoài ao với diện tích

tối thiểu là 100-200m2, mật độ 10-20 con/m2; cho ăn thức ăn còng và cá tạp, vì thế không chủ động và bất tiện, việc theo dõi sự phát triển và thu hoạch hằng ngày cũng khó khăn do ao nuôi ở ngoài trời Đặc biệt việc tiêu thụ sản phẩm cũng là vấn đề trở ngại do xa thị trường và khi đó người dân vẫn chưa có thói quen sử dụng loại hải sản này (Trần Ngọc Hải, 2006)

Giai đoạn những năm 1990-2000, có rất ít các số liệu nghiên cứu, số liệu thống kê về nuôi cua bùn lột được công bố ở nước ta Tuy nhiên thị trường tiêu thụ nội địa và xuất khẩu cua bùn lột ngày càng phát triển đã thúc đẩy, tạo ra nghề nuôi cua bùn lột quy mô gia đình ở một số huyện như Cần Giuộc (Long An), Cần Giờ (TP Hồ Chí Minh), Minh Hải (Bạc Liêu) … trong thập niên 90 Trong báo cáo về “Nuôi giáp xác kết hợp với lúa vùng ngập mặn ở Việt Nam” năm 1992, tác giả Nguyễn Văn Hùng đã đề cập đến mô hình nuôi cua bùn lột ở huyện Minh Hải Những con cua nhỏ (dưới 100g/con) đã được ngư dân bắt bằng rập trong suốt thời gian chúng di cư (tháng 1 đến tháng 8) từ cửa sông lên thượng nguồn Sau khi đã cắt bỏ càng và chân bò (phương pháp thí càng, thí que), cua được đưa vào nuôi nhốt trong các ao hoặc ruộng lúa với mật độ 1kg/3-5m2 Thức ăn nuôi cua là các loại tôm, cá tạp với lượng cho ăn hàng ngày từ 3-5% khối lượng cơ thể Sau khoảng từ 14-20 ngày nuôi kể từ khi cắt bỏ càng và chân bò cua, ao được bơm cạn để bắt những con cua có “nu” (phần thịt chân cua nhú ra từ chỗ bị cắt) chuyển sang nhốt vào lưới quây/lưới giai có kích thước 1 x

2 x 0,8 m Khi cua bùn lột vỏ trong lưới, ngư dân rất dễ dàng thu hoạch đem bán cho các đầu nậu để xuất khẩu Thu nhập trên diện tích nuôi này đạt từ 900.000 -1.200.000 đồng/tháng Tuy nhiên đến năm 2000, diện tích nuôi cua bùn lột đã bị giảm đi đáng kể do kỹ thuật nuôi không được phát triển và không mang lại hiệu quả kinh tế như một số loại thủy hải sản khác nên bà con đã thay đổi sang các giống có hiệu quả kinh tế cao hơn

Theo kỹ sư Nguyễn Chung, trại cua Ba Son, xã Bình Khánh, huyện Cần Giờ, kỹ thuật nuôi cua bùn lột bằng phương pháp cắt bỏ càng và chân bò của cua được phổ biến và áp dụng ở các vùng nuôi thông qua các phương tiện đại chúng như tivi, đài phát thanh,… và được bà con áp dụng đại trà nhưng càng ngày càng bấp bênh, do sản phẩm cua bùn lột bị cắt càng cắt chân không còn được ưa chuộng, nhiều cơ sở nuôi đã phải đóng cửa hoặc chuyển sang nuôi các loại hải sản khác Năm 2008, trại nuôi cua Ba Son là cơ sở đầu tiên áp dụng kỹ thuật nuôi cua bùn lột nguyên con trong từng hộp nhựa như ở Thái Lan Tác giả cũng cho biết, điểm mấu chốt trong kỹ thuật nuôi cua bùn lột nguyên con trong từng hộp nhựa là:

(1) Môi trường nuôi là điểm đầu tiên phải được bảo đảm như sau: nguồn nước nuôi không bị ô nhiễm với độ muối 5-15‰ ; nhiệt độ 25-28oC ; pH 7-8 Khi độ muối giảm, cần sử dụng muối ăn tạt xuống ao cho đến khi độ mặn tăng lên Khi nhiệt độ trong ao tăng, cần dùng lưới giảm nhiệt (loại lưới giảm 70% nhiệt) để che mặt ao và phun nước trên bề mặt các hộp nuôi

(2) Thức ăn nuôi cua là các loại cá tạp hoặc phế thải của các xí nghiệp chế biến thủy sản như mực, nghêu, ngao, sò lông…nhưng cần tươi và đủ số lượng cho cua ăn 2 lần/ngày vào khoảng 7 giờ sáng và 5 giờ chiều (3) Kiểm tra cua nuôi được thực hiện 3 tiếng/lần để loại bỏ cua chết và thức

ăn thừa làm ô nhiễm môi trường nuôi; cua thường lột nhiều vào ban đêm

và những khi nước kém, do vậy cần chủ động theo dõi thời điểm thu hoạch khi cua bùn lột tránh tình trạng vỏ cua bị cứng sẽ làm giảm giá trị

và giá bán cua

Giá cua bùn lột thành phẩm trên thị trường năm 2018-1019 dao động trong khoảng 250-400 nghìn đồng/kg (đối với cua đạt yêu cầu về cảm quan như đầy đủ 2 mắt, đồng đều kích thước các chân, càng…), giá tùy thuộc vào kích thước của cua và quãng đường vận chuyển đến nơi tiêu thụ Đối với cua bùn lột không đạt yêu cầu về cảm quan thì không thể xuất khẩu hoặc có giá thành rẻ bằng 1/3-1/2 giá cua đạt tiêu chuẩn cùng loại

Trong các kỹ thuật nuôi cua bùn lột truyền thống phải cắt bỏ càng, chân

bò (phương pháp thí càng, thí que) thì cua bùn lột thành phẩm kém về cảm quan (chân nhỏ) nên giá trị thương mại rất thấp Ngoài ra, trong kỹ thuật nuôi cua bùn lột cải tiến (sử dụng thức ăn tổng hợp, nuôi trong các rọ nhựa trong bể hay trên

kệ, giá) có một tỉ lệ lớn khá lớn (30%) cua bùn lột rụng chân, càng nên giá trị thương mại rất thấp Sản phẩm cua này không khác về giá trị dinh dưỡng so với cua đạt tiêu chuẩn nên việc chế biến chúng thành những sản phẩm giá trị gia tăng sẽ tăng giá trị cho người nuôi

1.1.3 Giá trị dinh dưỡng của cua lột

Theo Ramamoorthy (2016), cua lột giàu dinh dưỡng là bởi cơ thể chứa hàm lượng chất khoáng (canxi, kẽm, sắt, photpho…) cao hơn gấp 2 - 3 lần so với cua khi chưa lột vỏ và chứa hàm lượng lớn các acid amin quý như lysine, proline, arginine, histadine, acid glutamic, thionine, leucine, isoleucine, acid aspartic, tyrosine; vì vậy nguồn thực phẩm này có thể cung cấp những vi chất cần thiết cho con người, giúp xương chắc, chống bệnh loãng xương, hồi phục sức khỏe, tăng cường hệ miễn dịch

Loài cua và các động vật giáp xác có phần cơ thể được bao bọc bởi một

bộ xương ngoài bằng chitin Nhờ thấm canxi và vôi hóa nên lớp vỏ của cua rất cứng cáp Trong khi lớp vỏ là cố định còn các động vật giáp xác lớn lên theo thời gian, nên lớp vỏ này phải được thay thế định kỳ trong quá trình sinh trưởng hoặc đơn giản là khi chúng phát triển nhô ra ngoài lớp vỏ Giá trị dinh dưỡng phụ thuộc vào từng thời kỳ sinh trưởng của cua Thông thường thịt động vật giáp xác được đánh giá rất cao về hàm lượng dinh dưỡng dựa trên thành phần các amino acid thiết yếu và protein có trong chúng (Haryati, 2019) Một cách chi tiết hơn, protein có ảnh hưởng quan trọng tới kết cấu thịt trong khi các peptide nhỏ, amino acid và các acid béo thiết yếu có vai trò trong việc tạo mùi cũng như chất lượng dinh dưỡng (De la Cruz-Garcia, 2000; Chen, 2007)

Các nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng của các loài giáp xác nói chung và cua bùn lột nói riêng còn rất ít được công bố Theo một số nghiên cứu, về cơ bản

giá trị dinh dưỡng của cua lột tương đương với cua thịt nhưng có chứa hàm lượng một số khoáng và chất vi lượng cao hơn so với cua thịt Thịt cua bùn lột là nguồn thực phẩm có chất lượng cao, trong 100g cua bùn lột có chứa 17,2 g protein, 0,6g lipit, khoảng 7 g glucid và 0,5 g các nguyên tố vi lượng như canxi, phosphor và sắt Nhóm các vitamin có hàm lượng rất nhỏ như B1 (0,3 ppm), B2 (7,1 ppm), PP (27 ppm) và vitamin A (358 ppm) Do cua bùn lột có thể sử dụng toàn bộ nên việc chế biến các món ăn cũng dễ dàng và tiện lợi hơn, do vậy mà hàm lượng dinh dưỡng được hấp thu gần như toàn bộ trong quá trình tiêu hóa Mặc dù thành phần các amino acid có trong các loại thực phẩm đã được khám phá trong những năm gần đây, tuy nhiên cho đến nay, số liệu của chúng ở các loài giáp xác thì vẫn còn rất ít nghiên cứu được thực hiện Đặc biệt đối với loài cua khi trải qua giai đoạn lột xác, cơ thể chúng trong khoảng thời gian này xảy ra rất nhiều các biến đổi cả về sinh lý cũng như hóa sinh Các nghiên cứu cho thấy thành phần dinh dưỡng trong cua bùn lột chứa rất nhiều canxi, vitamin, kẽm, sắt, protein, lipit, photpho từ đó có giá trị cung cấp canxi và các chất khoáng tốt cho cơ thể, giúp chắc xương, tăng cường miễn dịch, thể lực cho người suy nhược, người già và chống suy dinh dưỡng, còi xương ở trẻ nhỏ (L Imayavimimhiw el al., 2007)

1.1.3.1 Thành phần và hàm lượng protein và các amino acid

Nhóm nghiên cứu của M Vilasoa-Martinez et al., 2007, đã tiến hành phân tích thành phần và hàm lượng protein và các amino acid có trong mai và các

phần thịt khác nhau của loài cua tuyết Chionoecetes opilio trong giai đoạn lột

xác Kết quả cho thấy protein có hàm lượng tương đối cao, lần lượt là 35,5 ± 3,16 và 33,0 ± 13,8g/100g khối lượng khô ở mai và thịt cua Trong số 17 amino acid được nhận dạng, các amino acid có hàm lượng cao nhất gồm arginine, lysine, serine và glutamic acid, đặc biệt là arginine và lysine với hàm lượng lần lượt là 2,35 g/100 g và 2.07 g/100 g khối lượng khô

Trong một nghiên cứu khác được tiến hành trên loài ghẹ xanh Portunus

pelagicus, Wu X., và cộng sự, 2010, đã cho thấy yếu tố giới tính có đóng góp

vai trò ảnh hưởng tới hàm lượng dinh dưỡng của loài ghẹ này Thành phần và hàm lượng các acid béo (% trên tổng acid béo) có trong thịt, gan tụy và bộ phận

sinh dục của cua Portunus pelagicus cũng phụ thuộc vào giới tính của chúng

Phần chính của các dự trữ hữu cơ trong gan tụy được tích lũy chủ yếu trong giai đoạn cuối sau khi lột xác bao gồm lipid, hầu như hoàn toàn ở dạng các acid béo

và glycerol Nhiều lipid dự trữ được biến đổi thành glycogen rồi thành glucose được sử dụng trong việc tạo thành chitin (Wu X 2010)

Kết qủa nghiên cứu loài cua Portunus pelagicus, cua cái có hàm lượng

protein và lipid trong thịt, gan tụy và bộ phận sinh dục cao hơn so với cua đực, tuy nhiên, ngược lại cua đực lại có hàm lượng acid docosahexaenoic (DHA) cao hơn Ngoài ra, thành phần acid béo không no có trong thịt (36-39%) cũng đã được chứng minh là cao hơn so với trong gan tụy (16-18%) và bộ phận sinh dục (16-24%) Các amino acid ở trong các bộ phận khác nhau có hàm lượng khá tương đồng (Wu X., 2010)

1.1.3.2 Thành phần và hàm lượng các khoáng chất

A Mohapatra et al., 2009, trong công bố của mình đã đưa ra kết luận

thành phần các vitamin và khoáng chất trong vỏ cua giai đoạn mới lột xác cao hơn nhiều so với những giai đoạn sau lột Cụ thể, nhóm đã tiến hành phân tích hàm lượng của 10 khoáng chất có trong tế bào và vỏ cua ở các giai đoạn trước

và sau khi lột xác trên đối tượng là loài cua bùn Scylla serrata

Kết quả thu được cho thấy đa số các khoáng chất ở trong lớp vỏ mới hình thành sau khi lột có hàm lượng cao hơn so với những giai đoạn sau khi vỏ đã trở nên cứng hơn, đồng thời có một sự khác biệt không đáng kể về hàm lượng các khoáng chất này khi so sánh giữa con đực và con cái (Davies, 1981; Pourang, 2004; Mohapatra, 2007) Thành phần chính của các khoáng chất dự trữ ở gan tụy bao gồm các phosphate, Ca và Mg Bên cạnh đó, nhóm còn quan sát thấy có

sự chuyển dịch của các nguyên tố như K, Ca, Mn, Cu được hấp thụ ngược trở lại từ lớp vỏ vào tế bào cơ thể cua sau khi diễn ra quá trình lột xác (Haryati, 2019) Hiện tượng này có thể nhằm mục đích đảm bảo nhu cầu dinh dưỡng của

chủ thể đồng thời cung cấp các chất cần thiết cho quá trình hình thành lớp vỏ mới Các nguyên tố độc như chì (Pb) thì cũng có xu hướng giảm đi trong và sau quá trình lột xác (L.Imayavimimhiw el al.,2007)

Ở Việt Nam, các kết quả nghiên cứu thành phần dinh dưỡng của cua bùn

Scylla sp cho đến này chưa được công bố Vì vậy trong nghiên cứu này, lần đâu

tiên chúng tôi phân tích các thành phần dinh dưỡng của cua bùn trong quá trình lột xác như protein, các axit amin, các khoáng chất, vitamin…

1.1.4 Thực trạng sử dụng cua lột

Cua lột là nguồn thực phẩm giàu dinh dưỡng, cung cấp những vi chất cần thiết cho con người, giúp xương chắc, chống bệnh loãng xương, hồi phục sức khỏe, tăng cường hệ miễn dịch… Cua bùn lột có giá trị xuất khẩu cao và hiện đang được tiêu thụ mạnh tại các nước Mỹ, EU, Nhật Bản, Trung Quốc, ASEAN, Canada, Đài Loan, Úc (Nguyễn Chung, 2011) So với thịt cua cứng (cua chưa lột), hàm lượng chất khoáng (canxi, kẽm, sắt, photpho…) cao hơn gấp 2 - 3 lần, chứa hàm lượng lớn các amino acid quý như lysine, proline, arginine, histadine, acid glutamic, thionine, leucine, isoleucine, acid aspartic, tyrosine (Ramamoorthy, 2016)

Các tác giả như Thùy Dung (2019), Tom Fitzmorris (2018) Điệp Vũ (2017), Tommy Werner (2016), …và các tác giả từ trước đó như Ole Mouritsen (2009), Fred Thompson (2010), Tracy Barr (2011) cùng một quan điểm cho

rằng, do giá trị dinh dưỡng cao của cua lột (soft-shell mud crab - Scylla sp.)

cũng như một số loài giáp xác lột vỏ (soft-shell crustaceans) khác, ví dụ cua Địa

Trung Hải shell Mediterranean green crab – Carcinus sp.), cua xanh shell blue crab - Callinectes sp.), cua lông (soft-shell velvet crab – Necora sp.), ghẹ xanh (soft-shell blue crab – Portunus sp) hay tôm hùm (soft-shell lobster -

(soft-Homarus sp.)…nên việc sử dụng chúng theo cách tươi sống để chế biến các

món ăn với nhiều công thức nấu khác nhau là rất phổ biến trong các nhà hàng hoặc các gia đình ở hầu hết các nước trên thế giới Tất cả các món ăn được chế biến từ cua lột hay nhóm giáp xác lột vỏ đều rất nổi tiếng mà bản chất của chúng

không khác nhau nhiều giữa các quốc gia như chiên giòn, chấy gia vị, ram/xốt,

áp chảo, nướng… sự khác nhau chỉ là gia vị trong các công thức Song, chưa có bất cứ một công trình nghiên cứu nào công bố về sử dụng cua lột hoặc giáp xác lột vỏ trong chế biến các sản phẩm chức năng

Cho đến nay việc khai thác sản phẩm từ cua lột hầu hết mới chỉ dừng ở mức độ đánh bắt, chăn nuôi và cung cấp dưới dạng thực phẩm tươi sống hoặc đông lạnh, chưa có thành phẩm chế biến thành thuốc hoặc dạng tiêu thụ khác Bên cạnh đó, việc chăn nuôi loài này đòi hỏi sử dụng nhiều lao động nên giá thành sản phẩm vẫn còn tương đối cao

Dựa vào các yếu tố trên, có thể thấy đây là một lĩnh vực rất hứa hẹn để tiến hành nghiên cứu, phát triển các sản phẩm khác nhau từ cua lột cung cấp cho thị trường để cải thiện sức khỏe người dân, giúp phòng chống các bệnh suy dinh dưỡng, chống loãng xương…

1.2 Công nghệ enzyme trong chế biến

1.2.1 Các khái niệm cơ bản

Định nghĩa

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hoà tan trong nước

và trong dung dịch muối loãng Enzyme có phân từ lượng lớn từ 20.000 – 1.000.000 dalton nên không qua được màng bán thấm Enzyme có tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học Enzyme có cường lực xúc tác lớn, ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản ứng có enzyme xúc tác xảy ra với tốc độ nhanh gấp 108 - 1011 lần so với phản ứng không có chất xúc tác Bên cạnh đó, enzyme có tính đặc hiệu cao và tác dụng trong điều kiện êm dịu, nhiệt độ thích hợp để enzyme hoạt động 30-50oC, pH trung tính và áp suất thường (Trần Ngọc Hải, 2006)

Cơ chế của quá trình thuỷ phân bằng enzyme

Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương NH) trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác

(CO-có sự tham gia của nước trong phản ứng

Cơ sở lý thuyết về tác dụng của enzyme thủy phân vào liên kết nhị dương

Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại Trong trung tâm hoạt động của chúng có chứa gốc amino acid đặc hiệu Đối với hydrolase thường chứa hai nhóm chức Ví dụ: + Vòng imidazol của histidin + Nhóm hydroxyl (một số amino acid: serine, threonine) Sự tương tác giữa hai nhóm đặc hiệu (-OH, - imidazol) đã hình thành tâm ái nhân Xung quanh trung tâm hoạt động của hydrolase còn chứa nhiều các amino acid, vai trò của serine có chứa nhóm – OH

có tác động rất lớn làm thay đổi trung tâm hoạt động theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme Do cấu trúc bậc 3 của phân tử protein-enzyme mà nhóm hydroxyl của serine và vòng imidazol của histidin sắp xếp gần nhau, tạo ra liên kết hydroxyl giữa gốc – OH của serine với nitơ bậc 3 của histidin Nhờ quá trình đó mà nhóm hydroxyl xuất hiện tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của cơ chất

Sự thủy phân của enzyme càng dễ dàng khi sự khuyết điện tử trong liên kết nhị dương càng lớn, vì sự gắn tâm ái nhân của enzyme vào liên kết nhị dương càng mạnh mẽ Sự khuyết điện tử có thể được tăng lên khi tăng tổng điện tích dương của hai nguyên tử tạo thành liên kết hóa học hoặc chỉ tăng điện tích của một trong hai khi cơ chất tương tác với enzyme Nếu trong hai phân tử cơ chất có nhiều liên kết giống nhau thì liên kết nào nhị dương hơn cả sẽ bị phân ly thủy phân trước bởi enzyme (với điều kiện không có án ngữ không gian và đặc hiệu lập thể của từng liên kết)

Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase lên cơ chất bị thủy phân cũng tuân theo cơ chế chung sau:

E + S → ES → P + E Trong đó: E là enzyme, S là cơ chất, ES là phức hợp enzyme và cơ chất, P sản phẩm tạo thành

1.2.2 Tiêu chí chọn enzyme trong công nghiệp thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm các chế phẩm enzyme được sử dụng với với nhiều mục đích và tác động ở nhiều mức độ khác nhau Người ta có thể sử dụng tác động của enzyme để điều chỉnh những khiếm khuyết tự nhiên của nguyên liệu Enzyme có thể tham gia cải thiện hoặc tiêu chuẩn hoá các quá trình chuyển hoá, từ đó cho phép nhận các sản phẩm mới hay sản phẩm có chất lượng cao hơn Đặc biệt enzyme cũng có thể can thiệp vào quá trình chế biến

và đóng vai trò công cụ công nghệ Nhờ tác dụng của enzyme chúng ta có thể nhận được các sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối cùng khác nhau (Trần Ngọc Hải, 2006)

Độ hoạt động của enzyme

Điều đầu tiên khi lựa chọn một enzyme để thực hiện phản ứng là độ hoạt động của enzyme Tuỳ vào bản chất của cơ chất mà chọn loại enzyme có độ hoạt động phù hợp để đảm bảo hiệu quả của quá trình phản ứng và giá thành sản phẩm Ngoài ra cần xét đến các yếu tố tác động đến hoạt độ enzyme trong quá trình phản ứng như:

- pH của môi trường phản ứng phải tương ứng với pH tối ưu của enzym

- Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ của enzym phải được tính đến khi lựa chọn enzym Mối liên quan giữa nhiệt độ và hoạt lực enzym được đặt ra phức tạp hơn

- Nếu thời gian tác dụng của enzym nhanh, chất xúc tác sẽ phản ứng tối đa với khả năng xúc tác của mình, sau đó phải nhanh chóng bị vô hoạt Nếu thời gian tác dụng lâu nên sử dụng enzym có độ bền hoạt lực cao

- Không được bỏ qua sự có mặt của cá chất hoạt hóa hay kìm hãm enzym trong môi trường phản ứng

tính xúc tác có thể thay đổi qua biến đổi của các vi môi trường Nên kiểm tra lại tính đặc hiệu của enzym trong các môi trường phản ứng gần giống với môi trường thực tế sử dụng về thành phần và tính chất hóa học

Hơn nữa không nên bỏ qua các hoạt tính phụ của các chế phẩm enzym, vì các hoạt tính phụ này có thể không mong muốn hay ngược lại rất có giá trị

Trong thực tế không có chiến lược lựa chọn chung Giải pháp duy nhất là tiến hành các pháp thử so sánh nhiều enzym trong các điều kiện thực của quy trình công nghệ (Đặng Thị Thu, 2004)

Điều kiện ứng dụng enzyme

Một khi một hay nhiều chất xúc tác đáp ứng được các tiêu chuẩn của phản ứng, thì cần lựa chọn dựa trên tính chất và số lượng của chế phẩm enzym Nếu việc bổ sung enzym làm thay đổi lớn tới công nghệ sản xuất cần phải xây dựng các nhà máy lớn thì việc cung cấp enzym thường xuyên và ổn định đóng vai trò quan trọng

Giá các enzym tác động rất ít tới giá của sản phẩm Do đó tốt hơn nên lấy tỷ lệ giữa giá/chất lượng là tiêu chuẩn cần xem xét trong việc lựa chọn nhà cung cấp

Các enzym được phép sử dụng

Sử dụng các chế phẩm enzym phải tuân theo một luật chung Các chế phẩm enzym chỉ được sử dụng khi đã được các chuyên gia xét nghiệm và cho phép (Đặng Thị Thu, 2004)

Danh sách các chế phẩm enzyme được phép không dừng lại mà luôn đươc

bổ sung Liên quan tới các chế phẩm enzym dùng trong sản xuất thức ăn và nước uống cho người, luật quan trọng nhất ra đời 05/09/1989 được ban hành tại Cộng hòa Pháp (JORF,1.10.89) ngoài ra còn có các luật khác như:

- Luật 20/06/1985 (JORF, 13.07.85) cho phép sử dụng lactase để thủy phân lactose

- Luật 21/12/1988 (JORF, 7.01.89) đưa ra một danh sách các chế phẩm enzym protease thực vật, động vật và vi sinh vật cho phép được sử dụng

để thủy phân protein dùng làm thức ăn đặc biệt cho người

- Luật 24/3/1993 (JORF, 27.03.93) cho phép sử dụng β-cyclodextrin và cho phép sử dụng cyclodextrin - glycozyl – transferase của Bacillus maceran

và của Bacillus circulans

- Một số luật 15/6/1993 (JORF, 10.07.93); luật 27/8/1993 (JORF, 4.09.93); 1/2/1994 (JORF, 25.02.94) và 18/8/1994 (JORF, 11.09.94) vừa mới ban hành bổ sung cho luật 5/9/1989 cho phép sử dụng một loạt enzym mới

1.2.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Mỗi một enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ tối ưu nhất định Khi nhiệt độ lệch sang hai bên nhiệt độ tối ưu hoạt động của enzyme giảm và tốc

độ phản ứng sẽ giảm theo Sự tăng nhiệt độ làm cho làm cho động năng của enzyme và cơ chất tăng, chúng chuyển động nhanh hơn, va chạm nhiều hơn Các phức chất emzyme-cơ chất hình thành nhiều hơn, phản ứng xảy ra nhanh hơn Tuy nhiên nếu nhiệt độ quá cao, enzyme bị biến tính Khi cấu hình vị trí xúc tác không còn phù hợp với cơ chất, enzyme mất hoạt tính xúc tác Khi nhiệt độ hạ thấp hơn nhiệt độ tối ưu, cơ chất và phân tử enzyme chuyển động chậm Tần số va chạm giữa chúng thấp> ít phức hợp enzyme-cơ chất hình thành và tốc độ phản ứng giảm

Ảnh hưởng của pH

Mỗi một enzyme hoạt động tối ưu tại một giới hạn pH thích hợp, chẳng hạn pepsin hoạt động tối ưu ở pH 2, trypsin hoạt động tối ưu ở pH 8.5 Khi pH lệch sang hai bên phía pH tối thích, hoạt tính của enzyme giảm xuống

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Tốc độ phản ứng của phần lớn các phản ứng biến đổi theo nồng độ của cơ chất và nồng độ enzyme Khi tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng tăng chỉ khi nồng độ cơ chất tương đối thấp Khi nồng độ cơ chất lớn tốc độ phản ứng ít

phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và có khuynh hướng đạt cực đại do nồng độ enzyme có mặt quyết định

Ở nồng độ cơ chất thấp, nhiều phân tử enzyme có trung tâm hoạt động chưa liên kết với cơ chất Nên việc tăng hạn chế cơ chất là tăng tốc độ phản ứng Tuy nhiên, ở nồng độ cơ chất cao, hầu hết các trung tâm phản ứng đã liên kết với cơ chất làm cho số phân tử enzyme trở thành yếu tố giới hạn Khi số phân tử

ezyme tăng tốc độ phản ứng cực đại tăng lên tương ứng

1.2.4 Enzyme protease

Đặc điểm enzyme protease

Protease là các enzyme phân huỷ protein và làm xúc tác việc phân cắt các liên kết peptit trong các protein Protein là các chuỗi polyme của các amino acid với công thức chung của R-CHNH2-COOH, trong đó các liên kết peptit được hình thành bởi sự liên kết cộng hóa trị của các nguyên tử nitơ của nhóm amino với các nguyên tử cacbon của nhóm carboxyl trước đó với việc giải phóng nước (Adler -Nissen, 1993)

Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptit trong phân tử protein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid Ngoài

ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển amino acid

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật đến thực vật, động vật Protease vi sinh vật có những đặc điểm rất khác biệt so với của động thực vật bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Phân loại protease

Protease được phân loại theo phản ứng xúc tác của chúng thành endopeptidases và exopeptidases Endopeptidases hoạt động trên chuỗi polypeptide ở các liên kết peptide đặc biệt dễ bị phá vỡ, trong khi các exopeptide thủy phân giải phóng một amino acid đơn lẻ mỗi lần từ đầu N hoặc

đầu C (Adler-Nissen, 1993) Endopeptidases là serine proteases (EC 3.4.21), cysteine proteases (EC 3.4.22), aspartic proteases (EC 3.4.23), và metalloproteases (EC 3.4.24) Serine, cysteine và aspartic protease có chứa serine, cysteine và aspartic acid, trong khi metalloprotease chứa một nguyên tử kim loại cần thiết, thường là kẽm (Zn), tại các vị trí hoạt động (Adler-Nissen, 1993) Mặt khác, Exopeptidases được chia thành ba nhóm chính: aminopeptidases, carboxypeptidases, và omegapeptidases Aminopeptidases tạo

ra một amino acid đơn, di- hoặc tripeptide, bằng cách tấn công đầu N của chuỗi polypeptit Carboxypeptides, trái lại, hoạt động ở đầu C của polypeptide và giải phóng amino acid đơn hoặc dipeptide (Rao và cộng sự, 1998)

Nguồn enzyme protease

Nguồn thực vật

Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya); Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant) Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt trong chế biến Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica), enzyme được

sử dụng thuỷ phân protein tự nhiên

Nguồn vi sinh vật

Vi khuẩn, nấm và vi rút là các nguồn protease tuyệt vời Protease của

vi khuẩn chiếm khoảng 40% lượng protein trên toàn cầu Protease của vi khuẩn hoat động ở môi trường pH kiềm và ổn định tới 60oC, cho phép sử dụng chúng trong sản xuất chất tẩy rửa Protease của nấm cũng có vùng pH rộng (4-11) nhưng tỉ lệ phản ứng và khả năng chịu nhiệt kém hơn so với

enzyme từ vi khuẩn

Cơ chế xúc tác của protease trong quá trình thủy phân

Quá trình thủy phân protein thường xảy ra theo một trình tự nhất định Lúc đầu, enzyme proteinase (endopeptidase) phân cắt các liên kết peptide của phân tử protein từ giữa chuỗi polypeptide và cho các sản phẩm thủy phân có phân tử lượng trung bình (albumoza, peptit và polypeptit) Tiếp đó các enzyme peptidase (exopeptidase) phân cắt các amino acid từ hai đầu của chuỗi polypeptit cho sản phẩm thủy phân là các peptit mạch ngắn và các amino acid Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein thành các amino axit hòa tan

Quá trình thủy phân protein đến amino acid là một quá trình rất phức tạp Enzyme protease phân cắt phân tử protein thành những phân tử nhỏ hơn Cơ chế hoạt động thủy phân protein của enzyme protease được Boyce (1986) mô tả theo sơ đồ sau:

Endopeptidase (proteinase)

Protein  Albumoza  pepton  polypeptit  peptit

Exopeptidase (peptidase)

Peptit  peptit và amino acid

Một số ứng dụng của enzyme protease

Protease có ứng dụng lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm Trong sản xuất sữa, enzyme làm đông tụ sữa (rennin của động vật, chất đông tụ lấy từ vi khuẩn, engineered chymosin được sử dụng trong sản xuất phomat) Chymosin

có nhiều lợi thế hơn rennin động vật nhờ vào khả năng hoạt động đặc hiệu và

tính sẵn có của nó Các vi sinh vật GRAS tạo ra protease là Mucor michei,

Bacillus subtilis và Endothia parasitica Protease được sử dụng trong làm bánh

để điều chỉnh các protein gluten không tan ở lúa mì, việc này quyết định đặc tính của bột Việc xử lí bột bằng enzyme cải tiến sản xuất bằng tay và máy móc, giúp tiết kiệm thời gian và tăng khối lượng ổ bánh mì Enzyme từ vi khuẩn

Aspergillus oryzae được sử dụng trong sản xuất bánh mì Tuy nhiên, protease

có thể tạo ra vị đắng, điều này làm hạn chế việc sử dụng chúng trong ngành công nghiệp thực phẩm, vị đắng này liên quan đến số lượng các amino acid kị nước khi thủy phân Sự kết hợp của endoprotease và aminopeptidase có thể làm giảm vị đắng

Protease có một số ứng dụng trong sản xuất dược phẩm như hỗ trợ tiêu hóa, trong sản xuất thực phẩm chức năng như tổng hợp aspartame và trong sữa công thức cho trẻ sơ sinh

1.2.5 Tình hình ứng dụng của enzyme trong chế biến

Thời gian qua, nhiều chế phẩm enzyme đã được ứng dụng trong nghiên cứu chế biến các đối tượng thủy sản nhằm phục vụ đời sống dân sinh, các công trình đáng chú ý có thể thấy :

Với nhóm cá : Nguyễn Thị Mỹ Hương & CTV (2013) đã sử dụng enzyme

Protamex (hoạt độ 1,5 AU) có nguồn gốc từ vi sinh vật Bacillus để thủy phân đầu cá ngừ vây vàng Sản phẩm thủy phân có hàm lượng protein 80%, lipit 1,3% và tro 7,9% ; bột protein không tan có hàm lượng protein 53,5%, lipit 25,7% và tro 6,4% ; các axit béo có hàm lượng cao trong dầu đầu cá ngừ là axit palmitic (29,75%), axit oleic (16,76%), axit docosahexaenoic (DHA; 14,56%), axit stearic (10,28%), axit béo omega 3, đặc biệt là axit docosahexaenoic (DHA)

và axit eicosapentaenoic (EPA) Các sản này có thể được dùng trong công nghiệp thực phẩm như sản xuất nước mắm công nghiệp, bột dinh dưỡng hoặc bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá Dầu và bột protein không tan có thể được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hoặc sản xuất thức ăn cho nuôi trồng thủy sản Một nghiên cứu khác của Trần Thị Bích Thủy & CTV (2016) cũng đã sử

dụng enzyme Protamex (hoạt độ 1,5 AU) để thủy phân cá trích (Sardinella

gibbosa) thu dịch đạm giàu acid amine Nhóm tác giả đã xác định được chế độ

thủy phân thích hợp đối với protein của cá trích là, nhiệt độ thủy phân 50oC ; tỷ

lệ enzyme/cơ chất 0,5% ; thời gian thủy phân 6 giờ, độ thủy phân đạt 70,87% và hiệu suất thu hồi đạt 60,66% Sản phẩm thủy phân giàu dinh dưỡng với hàm lượng acid amine không thay thế chiếm 64,6% tổng lượng acid amine và có thể được sử dụng sản xuất nước chấm, bột dinh dưỡng hoặc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi

Với nhóm giáp xác : Vũ Ngọc Bội, Lê Hương Thủy & CTV (2015) đã sử

dụng hỗn hợp enzym alcalase 2.4L thuộc nhóm endopeptidase và enzyme bromelain thô (hoạt tính 0,741 UI/g) để thủy phân moi biển (Acetes sp) Kết luận của nhóm tác giả cho thấy, chế độ thủy phân thích hợp đối với moi biển là : nhiệt độ thủy phân 50,010C ; pH 7 ; tỷ lệ nước bổ sung 20% ; tỷ lệ alcalase 0,49

% ; bromelin 13% ; thời gian thủy phân 14,93 giờ Dịch đạm thủy phân thu được

có độ đạm đạt 24,73 gN/l ; giàu axid amine với tỷ lệ Naa/Nts đạt 58,35% và có mùi thơm đặc trưng, vị ngọt ngon, đạt tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm có thể dùng trong lĩnh vực thực phẩm như chế biến bột dinh dưỡng, hạt nêm, súp gia vị Nghiên cứu so sánh sự thủy phân của 2 enzyme enzyme alcalase 750L và emzyme bromelain (hoạt tính 1542,555 UI/g) trên các phụ phẩm sau chế biến của cua xanh (Callinectes sapidus), Sara A.A.Valcareggi & CTV (2017) đã kết luận rằng, enzyme alcalase có cấu trúc tương đồng hơn với cơ chất của cua xanh, cũng như điều kiện thủy phân so với enzyme bromelain Kết quả của nhóm cho thấy, với tỷ lệ emzyme/cơ chất 3%, nhiệt độ 53oC ở cả 2 enzyme ; pH

9, thời gian thủy phân 120 phút ở enzyme alcalase, và pH 6, thời gian thủy phân

60 phút ở enzyme bromelain, thì thành phần thu được như sau : protein tan 4,12% ; khoáng 0,83% ; astaxanthin 20μg/g bã ; hoạt tính chống oxy hóa 88,6% đối với alcalase và tương tự là 1,48% ; 0,58% ; 17,0μg/g bã ; 69,0% đối với bromelain

Với nhóm thân mềm : Sử dụng kết hợp giữa enzyme Protamex 1,5AU và

enzyme Flavourzyme 500LAPU/g , Nguyễn Thị Mỹ Hương & CTV (2013) đã

nghiên cứu thủy phân sò lông (Anadara antiquata) trong hai giai đoạn, kết quả

cho thấy : giai đoạn đầu bằng enzyme protamex, chế độ thủy phân thích hợp đạt được khi tỉ lệ enzyme 0,3% ; nhiệt độ 50oC ; pH tự nhiên ; thời gian 4giờ ; giai đoạnthứ hai bằng enzyme Flavourzyme thì chế độ thủy phân đạt được khi tỉ lệ enzyme 0,2% ; nhiệt độ 50oC ; thời gian 3giờ Sản phẩm thủy phân thu được từ

sò lông có thể được sử dụng sản xuất nước mắm, bột dinh dưỡng hoặc bột nêm,

gia vị Nghiên cứu thủy phân hầu biển (Crassostrea lugubris) bằng enzyme

allzyme FD, Lý Thị Minh Phương (2008) đã xác định được điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân với tỷ lệ enzyme 0,32% ; muối 1,5% ; ethanol 6% ; nước 20% ; nhiệt độ 560C; thời gian 8 giờ Chế phẩm thu được có hàm lượng axit amin cao, có mùi thơm và đạt tiêu chuẩn về vi sinh có nhiều khả năng ứng dụng trong y dược hoặc bổ sung vào thực phẩm làm tăng giá trị dinh dưỡng có tác dụng tốt với sức khỏe người tiêu dùng

Như vậy, có thể thấy rằng xu hướng sử dụng phổ biến các chế phẩm enzyme trong thủy sản là nhóm enzyme proteases

Protease là các chế phẩm enzyme phân huỷ protein và làm xúc tác việc phân cắt các liên kết peptide trong các protein Protein là các chuỗi polyme của các acid amin với công thức chung của R-CHNH2-COOH, trong đó các liên kết peptide được hình thành bởi sự liên kết cộng hóa trị của các nguyên tử nitơ của nhóm amino với các nguyên tử cacbon của nhóm carboxyl trước đó với việc giải phóng nước (Adler -Nissen, 1993)

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật đến thực vật, động vật Protease vi sinh vật có những đặc điểm rất khác biệt so với của động thực vật bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Đồng thời, nhiều tác giả cho rằng các enzyme chitinase đóng vai trò tích cực trong quá trình thủy phân phá vỡ liên kết glycosid trong chitin có ở các loài

giáp xác Các enzyme này thúc đẩy các phản ứng trao đổi chất mà nếu không sẽ

ở trạng thái không hoạt động kéo dài, với tính đặc hiệu, tốc độ và hiệu quả Chitinase là một trong số các enzyme có ứng dụng thực tế hữu ích vì chúng đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chuỗi polysaccharide (Oyeleye, 2018) Chitinase xúc tác phân hủy liên kết β-1 → 4 trong chitin (C8H13O5N)n, một polyme dồi dào chỉ đứng sau xenlulose và là thành phần chính của khung cấu trúc của thành tế bào nấm (Langner, 2016), bộ xương ngoài và lớp lót ruột của côn trùng, và vỏ của các loài giáp xác (Merzendorfer, 2003; Hamed, 201

CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cua bùn Scylla sp., cụ thể là loài Scylla

paramamosain Cua nguyên liệu có trọng lượng 100-120 gram/con, chiều rộng

mai từ 65 – 75 mm được nuôi và thu hoạch theo quy trình sản xuất cua bùn lột

sử dụng thức ăn công nghiệp của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III

Thành phần dinh dưỡng của cua bùn lột nghiên cứu:

Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của cua bùn lột (Nguyên Phương Lan và cs,

Enzyme chitinase có hoạt tính 200 U/g thu từ Aspergillus niger, dạng bột

nâu nhạt, cung cấp bởi công ty Creative Enzyme, Mỹ với điều kiện tối ưu ở pH 3,0-9,0, nhiệt độ từ 40-50oC

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định độ ẩm và tro hóa của cua bùn lột

Xác định độ ẩm

- Định nghĩa: Hàm lượng ẩm của bột là phầm trăm của khối lượng mất đi

sau khi sấy ở 1020C cho đến khi khối lượng bột không thay đổi

- Nguyên tắc: Cân 2-3 gam mẫu, sấy khô mẫu cho đến khối lượng không

đổi ở 1020C ± 2oC trong khoảng 4h Tiếp tục sấy khô cho đến khi nào khối lượng giữa 2 lần sấy không vượt quá 0.5mg

+ Sau khi sấy lấy nắp đậy đĩa lại và chuyển qua bình hút ẩm để làm nguội

và cân ghi khối lượng là (m2)

+ Tiếp tục sấy mẫu (phải mở nắp) trong 1 giờ ở 1020C ± 2oC

+ Thực hiện lại bước thứ 3 và cân lại khối lượng (m2)

+ Lặp lại bước 4 và 5 đến khi nào sự chênh lệch giữa 2 lần cân không quá 0.5mg thì dừng lại

- Tính kết quả:

Hàm lượng ẩm được tính như sau:

Trong đó:

m0: khối lượng nắp và dĩa (g)

m1: khối lượng nắp + dĩa + mẫu (g)

m2: khối lượng nắp + dĩa + mẫu sau khi sấy khô (g)

Xác định hàm lượng tro toàn phần (TCVN 3700 - 90)

- Định nghĩa: Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy

hết các chất hữu cơ Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực phẩm (do đó tro còn được gọi là tro tổng số muối khoáng) Trong trường hợp thực phẩm có lẫn các chất bẩn (đất, cát) muốn có độ tro thật sự phải loại trừ đất cất và những chất không phải là muối khoáng mà lại không nung cháy ở nhiệt độ quy định

- Nguyên lý: Dùng sức nóng 550-600oC nung cháy hoàn toàn các chất hữu

cơ Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro trong thực phẩm

- Cách tiến hành: Cân 5g mẫu chính xác tới 0,0001g vào chén nung bằng

sứ có nắp đã nung đến khối lượng không đổi và xác định khối lượng Đậy nắp chén nung và đốt sơ bộ trên bếp điện Sau khi mẫu đã cháy thành than, chuyển chén nung chứa mẫu sang lò nung ở nhiệt độ 600- 700oC Mẫu được tro hóa tới màu trắng xám hoặc vàng nhẹ, lấy kẹp gắp chén nung đặt trong bình hút ẩm khỏang 40 phút, cần xác định khối lượng chén nung chứa tro của mẫu chính xác tới 0,0001g

- Tính kết quả: hàm lượng tro theo phần trăm (X1) tính bằng công thức:

0 1

1

( - G) x 100 ( - G)

 G

X

G

Trong đó:

G: Trọng lượng của chén tính bằng gam

G1: Trọng lượng của chén và trọng lượng của mẫu thử tính bằng gam

G2: Trọng lượng của chén và trọng lượng tro trắng sau khi đã nung và cân tới trọng lượng không đổi tính bằng gam

2.2.2 Phương pháp xác định các nguyên tố vi lượng, kim loại nặng

Việc xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng được thực hiện bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cùng các bộ phận đi kèm: Thermo Elemental-Model Solaar M6 Dual Zeeman Atomic Absorption Spectrometer đi cùng với hệ tạo hydrua VP 90-hydride generation, đèn catốt rỗng, HCL data Coded

Thực nghiệm: Cân 0,5g mẫu cua bùn lột vào trong bình phá mẫu dung tích 55ml đưa vào đó 5ml acid nitric, đậy nắp lại và vặn chặt Đưa vào lò vi sóng

và chạy với nhiệt độ 2000C trong thời gian 30 phút Sau khi phá mẫu, mẫu được đưa về định mức 50ml bằng nước cất 2 lần Mẫu được pha loãng từ 5 đến 10 lần bằng dung dịch acid nitric 20%

Mẫu sau khi phá bằng lò vi sóng được chuyển vào máy quang phổ hấp thụ nguyên tử và xác định hàm lượng các nguyên tố vi lượng

2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng và thành phần lipid

Phương pháp dựa trên nguyên tắc chiết lipit ra khỏi mẫu bằng dung môi hữu cơ Ete etylic

Tiến hành thử

Cân 2-3 g mẫu (chính xác tới 0,0001g) cho vào ống giấy lọc hình trụ bịt kín một đầu và có kích thước phù hợp với bộ Soxhlet Đầu trên ống giấy lọc chứa mẫu đặt một ít bông đã khử lipit Chiều cao của ống giấy lọc chứa mẫu phải thấp hơn ống hồi lưu ete của bộ cất Soxhlet

Đặt ống giấy chứa mẫu vào phần giữa của bộ Soxhlet, lắp bình cầu khô, sạch và đã được xác định khối lượng ở phía dưới, đổ dietylete ngập ống giấy chứa mẫu và cao hơn ống hồi lưu Bộ Soxhlet được lắp trên máy chưng cách thuỷ Điều chỉnh nhiệt độ máy cách thuỷ sao cho có từ 6 đến 8 lần ete luân chuyển qua mẫu trong 1 giờ

Quá trình chiết lipit kết thúc khi giọt dietylete từ ống hồi lưu chảy xuống không làm loang giấy lọc khi đã bay hết ete Cất thu hồi ete etylic trong bình cầu Đặt bình cầu trong tủ sấy đã duy trì ở nhiệt độ 100-1050C, sấy đến khối lượng không đổi

Để nguội bình 30 phút trong bình hút ẩm, cân bình cầu để xác định hàm lượng lipit có trong mẫu

Tính kết quả

Hàm lượng lipit có trong mẫu tính bằng phần trăm khối lượng (X) theo công thức:

100 _ 0

1

x m

m m

X 

Trong đó

m1: Khối lượng của bình cầu chứa hàm lượng lipit của mẫu, tính bằng g;

m0: Khối lượng bình cầu tính bằng g;

m: Khối lượng mẫu tính bằng g

Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định đồng thời và tính đến số lẻ thứ nhất Sai lệch giá trị của hai lần xác định đồng thời không được vượt quá 0,5%

Metyl hóa: Lấy 10-15mg lipid cho vào ống nghiệm, thêm 0,25-0,3 ml

benzen, thêm tiếp 0,25 ml MeONa/MeOH 1%, lắc kỹ rồi đun ở nhiệt độ 45-500C trong khoảng 15 phút Để nguội rồi thêm tiếp 1 ml HCl 5%, tiếp tục đun nóng hỗn hợp ở 45-500C trong khoảng 15 phút, lấy ra để nguội rồi thêm 2ml n-hexan

và 1ml nước cất, lắc kỹ sau 2’ để phân lớp, hút lấy pha chất lỏng ở trên Quay cất đuổi dung môi dưới áp suất thấp, thêm 0,5 ml CHCl3 rồi sử dụng bản mỏng điều chế tráng sẵn silica gel để lấy nhanh phần acid béo đã được metyl hóa Giải hấp rồi đem phân tích trên hệ máy GC và GC-MS

Các kết quả nhận dạng và tính toán trên máy sắc ký khí: C-R17A

(Shimadzu, Japan), detector FID, cột dẫn mao quản CBP 10 M25-0,25 (ID = 0,22mm/l=25m/slight-polarity.film thickness = 0,25µm) Cột chạy chế độ đẳng nhiệt 2100C, injector: 2400C, khí mang nitơ Tính độ dài mạch cacbon của phân

tử acid béo (ELC – Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on Gas Chromatography) có sử dụng hệ chất chuẩn C16:0 và C18:0

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein

2.2.4.1 Xác định hàm lượng protein tổng số theo Kjeldahl

Chuẩn bị mẫu

Cân từ 1,0 - 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị (chính xác đến 1 mg), chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khô Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác dạng bột hoặc dạng viên, trộn đều Thêm 20 ml acid sulfuric 98 %, xoay nhẹ bình để trộn

và làm ẩm lượng chứa trong bình Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 min Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl Để nguội dịch phân hủy (dịch A) Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng acid dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi

Pha loãng dịch A với 250 ml nước cất và lut từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch acid boric Chưng cất lutathi vào lượng dư acid boric nồng độ 20 g/lít (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ lutathi bằng dung dịch acid chuẩn độ Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám

V là thể tích dung dịch acid chuẩn độ cần để trung hòa lutathi sau

khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);

0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch acid chuẩn độ (acid

clohydric 0,1 M hoặc acid sulfuric 0,05 M);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

w là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần lut khối lượng, xác

định được theo TCVN 10788:2015

Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần lut khối lượng, được tính theo Công thức (3):

XP1 = XN1 x 6,25 (3)

Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần lut khối lượng chất khô, được tính theo Công thức (4):

6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng protein

2.2.4.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan theo Bradford

Nguyên lý

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước lut hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (G250) khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm

có bước lut hấp thu cực đại là 465nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước lut 595nm Độ hấp thụ ở bước lut 595nm có lut hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein

Cách tiến hành

Chuẩn bị thuốc thử Bradford gồm 20mg G250, 50ml ethanol và 100 ml

H3PO4 85% trong 1000 ml Chuẩn bị dung dịch albumin 5 mg/ml

Dựng đường chuẩn Bradford: chuẩn bị 7 ống nghiệm đánh số từ 1 đến 6

và đối chứng (ĐC), cho vào mỗi ống thuốc thử Bradford và dung dịch albumin theo nồng độ từ 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000 (µg/ml)

Sau khoảng 20 phút ủ trong bóng tối, mẫu được đo bằng máy quang phổ ở bước lut 595 nm Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein với mật độ quang OD tại A595 ta tính được hàm lượng protein P có trong mẫu