Đặc điểm dịch tễ học phân tử virus coxsackie a6 và a16 gây bệnh tay chân miệng tại miền bắc việt nam

Tổng quan về bệnh tay chân miệng, virus đường ruột gây bệnh tay chân miệng, tình hình nghiên cứu dịch tễ học phân tử của CVA6 và CVA16 gây bệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam; phương pháp nghiên cứu; kết quả và thảo luận.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đặc điểm dịch tễ học phân tử virus

NGUY ỄN THẾ ANH Ngành: Công ngh ệ sinh học

Gi ảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Nguyễn Hòa

PGS.TS Tr ần Liên Hà

HÀ N ỘI, 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Đặc điểm dịch tễ học phân tử virus

NGUY ỄN THẾ ANH Ngành: Công ngh ệ sinh học

Gi ảng viên hướng dẫn: TS Trần Thị Nguyễn Hòa

C ỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Họ và tên tác giả luận văn: Nguyễn Thế Anh

Đề tài luận văn: Đặc điểm dịch tễ học phân tử virus coxsackie A6 và A16

gây bệnh tay chân miệng tại miền Bắc Việt Nam

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã s ố SV: CA180122

Tác giả, Người hướng dẫn khoa học và Hội đồng chấm luận văn xác nhận tác

giả đã sửa chữa, bổ sung luận văn theo biên bản họp Hội đồng ngày 30 tháng

6 năm 2020 với các nội dung sau:

1 Chỉnh sửa lỗi đánh máy, định dạng văn bản

2 Chỉnh sửa các thuật ngữ dùng thống nhất trong luận văn

3 Chỉnh sửa tài liệu tham khảo theo một định dạng chung

4 Chỉnh sửa kết luận gọn gàng, phù hợp với mục tiêu

L ỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng của người học trò, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà, TS Trần Thị Nguyễn Hòa đã hướng dẫn

tận tình, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình học tập

và nghiên cứu để thực hiện đề tài này Sự hướng dẫn tận tình và những kiến thức quý báu của các cô đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn này

Em xin gửi cảm ơn toàn thể các anh chị nhân viên, kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm Virus đường ruột - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện về mọi mặt trong quá trình thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, các chị đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện, và động viên em trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Em xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Viện Đào tạo Sau đại học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, các phòng ban chức năng của Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân trong gia đình

và bạn bè đã luôn ủng hộ em trong suốt quá trình làm đề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2020

Tác giả

Nguy ễn Thế Anh

M ỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đại cương bệnh tay chân miệng 3

1.1.1 Định nghĩa ca bệnh TCM 3

1.1.2 Tác nhân gây bệnh tay chân miệng 4

1.2 Vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng 5

1.2.1 Phân loại 5

1.2.2 Hình thái cấu trúc và vật liệu di truyền 5

1.2.3 Sự nhân lên của virus trong tế bào vật chủ 8

1.2.4 Đặc điểm lý hóa 9

1.2.5 Các giai đoạn lâm sàng 9

1.3 Các đặc điểm dịch tễ 10

1.3.3 Tình hình bệnh tay chân miệng ở Việt Nam 12

1.3.4 Sự lưu hành của các kiểu VRĐR gây bệnh TCM trên thế giới và Việt Nam 12

1.4 Các kỹ thuật chẩn đoán CV-A6 và CV-A16 gây bệnh tay chân miệng 14

1.4.2 Nuôi cấy vi rút 15

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử 15

1.5 Điều trị và phòng bệnh 17

1.5.1 Điều trị 17

1.5.2 Phòng bệnh 17

1.6 Tình hình nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của CV-A6 và CV-A16 gây bệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam 18

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 18

1.6.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.3 Vật liệu 22

2.4 Phương pháp nghiên cứu 24

2.4.1 Thiết kế nghiên cứu: 24

2.4.2 Quy trình nghiên cứu 24

2.4.3 Các chỉ số nghiên cứu 26

2.4.4 Các bước thực hiện xác định týp vi rút và giải trình tự gen vùng VP1

26

2.4.5 Phân tích đặc điểm di truyền vùng gen VP1 của CV-A6, CV-A16 giai đoạn 2017-2018 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Đặc điểm dịch tễ bệnh tay chân miệng tại miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2017-2018 32

3.1.1 Đặc điểm dịch tễ bệnh từ mẫu các ca TCM 32

3.1.2 Sự phân bố của các kiểu VRĐR gây bệnh TCM tại miền Bắc Việt Nam theo thời gian 32

3.1.3 Sự phân bố các kiểu VRĐR theo tỉnh 36

3.1.4 Phân bố bệnh nhân TCM theo nhóm tuổi 39

3.1.5 Phân bố bệnh nhân theo phân độ lâm sàng 41

3.2 Đặc điểm phân tử vùng gen VP1 của một số chủng CV-A6, CV-A16 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017-2018 42

3.2.1 Kết quả giải trình tự gen CV-A6 và CV-A16 42

3.2.2 Đặc điểm di truyền của CV-A6 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2017-2018 43

3.2.3 Đặc điểm di truyền của CV-A16 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2017-2018 47

3.3 Sự biến đổi acid amin vùng VP1 của các CV-A6 và CV-A16 lưu hành tại miền Bắc, giai đoạn 2017-2018 51

3.3.1 Sự biến đổi acid amin của CV-A6 52

3.3.2 Đột biến acid amin của chủng CV-A16 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 57

4.1 Kết luận 57

4.1.1 Đặc điểm dịch tễ học phân tử CV-A6 và CV-A16 gây bệnh tay chân miệng tại miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2017-2018 57

4.1.2 Đặc điểm di truyền vùng gen VP1 của CV-A6 và CV-A16 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, giai đoạn 2017-2018 57

4.2 Hướng phát triển luận văn trong tương lai 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 1: 70

PHỤ LỤC 2 72

PHỤ LỤC 3 78

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxyribose Nucleic

ARN Acid Ribonucleic

RT PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

rRT-PCR Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SHPT Sinh học phân tử

TCM Tay chân miệng

TTYT Trung tâm Y tế

UTR Vùng không dịch mã

VP Viral protein

VRĐR Virus đường ruột

VSDTTƯ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

DANH M ỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Hình ảnh trẻ mắc tay chân miệng do Coxsackie A16 3

Hình 1.2 Cấu trúc chung của các vi rút đường ruột [8] 6

Hình 1.3 Mô hình gen của vi rút đường ruột [1] 7

Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cứu 25

Hình 3.1 Tỷ lệ các týp VRĐR gây bệnh TCM tại miền Bắc Việt Nam, 33

Hình 3.2 Phân bố ca bệnh mắc TCM theo tháng tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017-2018 35

Hình 3.3 Tỷ lệ phân bố ca bệnh tay chân miệng theo tỉnh thành phố, năm 2017-2018 38

Hình 3.4 Phân bố bệnh nhân theo nhóm tuổi 39

Hình 3 5 Phân bố bệnh nhân TCM theo độ lâm sàng tại miền Bắc Việt Nam, 2017-2018 41

Hình 3.6 Hình ảnh sản phẩm điện di của CV-A6 42

Hình 3 7 Cây di truyền phả hệ maximum likelihood (ML) xây dưng trên 1902 trình tự VP1 của CV-A6 trong nghiên cứu này (56 trình tự) và các trình tự thu thập từ GenBank Giá trị bootstrap dưới 70% được ẩn trên cây Nhóm ngoại (outgroup) là trình tự VP1 của CV-A10 (Kowalik) được loại bỏ trên cây để dễ quan sát sự phân nhánh của các genogroup/subgenogroup 44

Hình 3.8 Cây di truyền phả hệ xây dựng trên trình tự VP1 (915 nucleotide) của các chủng CV-A6 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2017-2018 và một số chủng đại diện được trích từ cây di truyền phả hệ trong hình 3.7 46

Hình 3.9 Cây di truyền phả hệ maximum likelihood (ML) xây dưng trên 2377 trình tự VP1 của CV-A16 trong nghiên cứu này (21 trình tự) và các trình tự thu thập từ GenBank Giá trị bootstrap dưới 70% được ẩn trên cây Nhóm ngoại (outgroup) là trình tự VP1 của CV-A10 (Kowalik) được loại bỏ trên cây để dễ quan sát sự phân nhánh của các genogroup/subgenogroup 48

Hình 3 10 Cây di truyền phả hệ xây dựng trên trình tự VP1 (891 nucleotide) của các chủng CV-A16 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam năm 2017-2018 và một số chủng đại diện được trích từ cây di truyền phả hệ trong hình 3.9 50

Hình 3.11 Đột biến acid amin của chủng CV-A6 Các đột biến aa đánh dấu khung màu vàng 54

Hình 3.12 Đột biến acid amin của chủng CV-A16 Các đột biến amino acid đánh dấu khung màu vàng 55

DANH M ỤC BẢNG

Bảng 2 1 Bảng thu thập các loại mẫu TCM năm 2017-2018 22 Bảng 3.1 Sự phân bố các kiểu VRĐR năm 2017-2018 33Bảng 3.2 Sự phân bố số ca trong nghiên cứu/ca dương tính VRĐR theo tỉnh 36

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh tay chân miệng (TCM) là bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, phổ biến và dễ gây thành dịch Bệnh hay gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi Biểu hiện đặc trưng của bệnh là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở niêm mạc miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Nguồn lây chính từ nước bọt, phỏng nước và phân của trẻ nhiễm bệnh Phần lớn các trường hợp bệnh TCM diễn biến tự khỏi, tuy nhiên có thể xuất hiện một số biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện sớm và xử trí kịp thời

Bệnh do một số vi rút đường ruột (VRĐR (enterovirus)) gây ra, trong đó tác nhân VRĐR gây dịch bệnh nổi trội là coxsackievirus A16 (CV-A16), enterovirus type 71 (EV-A71) và gần đây là coxsackievirus A6 (CV-A6) và coxsackievirus A10 (CV-A10) [1, 2] Bệnh do nhiễm virus EV-A71 thường liên quan đến các biến chứng thần kinh, có thể dẫn đến tử vong Tuy nhiên các vụ dịch quy mô lớn

do CV-A6 và CV-A16 vẫn xảy ra hàng năm, số ca bệnh nặng do hai tác nhân này vẫn được ghi nhận

Hiện tại, chưa có thuốc đặc hiệu phòng bệnh TCM Do tính chất nghiêm trọng của bệnh TCM do EV-A71, các nghiên cứu về thuốc kháng virus, vaccine được tập trung chính cho EV-A71 Loại vaccine bất hoạt kháng EV-A71 đã được thử nghiệm lâm sàng thành công tại Trung Quốc và được cấp phép Tuy nhiên, vaccine này không có tác dụng bảo vệ chéo với các kiểu VRĐR khác như CV-A6 và CV-A16 Việc phát triển vaccine TCM mới kháng đa tác nhân mới bao gồm cả EV-A71, CV-A16, CV-A6 và có thể các kiểu VRĐR khác đang được kỳ vọng là hướng đi mới đúng đắn trong công tác phòng chống bệnh TCM đặc hiệu Bệnh TCM được phát hiện lần đầu ở khu vực miền Nam Việt Nam kể từ năm 2003 và bùng phát dịch năm 2005 [3] Ở miền Bắc Việt Nam, dịch bệnh được báo cáo từ năm 2008 nhưng ở qui mô nhỏ và rải rác, vi rút gây bệnh chủ yếu bao gồm CV-A16 và EV-A71 Năm 2011-2012, dịch TCM bùng phát trên toàn quốc với số ca mắc hơn 300,000 ca, cao nhất từ trước đến nay và tác nhân chính gây bệnh ngoài EV-A71 và CV-A16, còn có thêm tác nhân mới nổi là CV-A6 Những năm tiếp theo, cùng với EV-A71, CV-A16 và CV-A6 được xác định tác nhân chính gây bệnh TCM tại Việt Nam, chiếm khoảng 80% ca dương tính [4, 5] Tác nhân mới nổi là CV-A6 luôn lưu hành nổi trội hàng năm Tuy nhiên,

so với EV-A71, số nghiên cứu về dịch tễ học phân tử, di truyền tiến hóa của A6 và CV-A16 rất giới hạn tại Việt Nam, đặc biệt ở miền Bắc Việt Nam Cụ thể,

CV-2

nhóm tác giả Anh và cs (năm 2018) có một nghiên cứu về di truyền phả hệ của CV-A6 phân lập từ trẻ nhập viện tại miền Nam giai đoạn 2011-2015 Các nghiên cứu khác tại Việt Nam thường chỉ tập trung và tỷ lệ mắc hàng năm của CV-A6

và CV-A16

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đặc điểm dịch tễ học phân

tử vi rút CV-A6 và CV-A16 gây bệnh tay chân miệng tại miền Bắc Việt Nam”

nhằm tìm hiểu về sự lưu hành gây bệnh và đặc điểm di truyền của virus tại các tỉnh miền Bắc Ngoài ra, chúng tôi còn nghiên cứu sự biến đổi acid amin trên các vùng chức năng của protein capsid VP1, là các vị trí thường được quan tâm trong nghiên cứu phát triển vaccine kháng các VRĐR

Các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Nghiên cứu các đặc điểm dịch tễ của bệnh TCM liên quan đến các VRĐR, bao gồm CV-A6 và CV-A16 tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam, năm

2017 và 2018

2 Xác định đặc điểm di truyền, bao gồm kiểu gen (nhóm gen/phân nhóm gen) củaCV-A6 và CV-A16 lưu hành nổi trội tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017-2018 và mối tương quan dịch tễ học phân tử với các nước trong khu vực và trên thế giới

3 Xác định sự biến đổi acid amin trên vùng VP1 của các chủng CV-A6 và CV-A16

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Đại cương bệnh tay chân miệng

Bệnh tay chân miệng (TCM) là bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, rất phổ biến và dễ gây thành dịch Từ những năm 90 của thế kỷ XX, bệnh đã xuất hiện phổ biến ở nhiều quốc gia trên thế giới và một số nước trong khu vực [1, 6] Bệnh hay gặp ở trẻ em dưới 5 tuổi, lây chủ yếu theo đường tiêu hóa Biểu hiện đặc trưng của bệnh là tổn thương da, niêm mạc dưới dạng phỏng nước ở niêm mạc miệng, lòng bàn tay, lòng bàn chân, mông, gối Phần lớn các trường hợp bệnh TCM diễn biến tự khỏi, tuy nhiên có thể xuất hiện một số biến chứng nguy hiểm như viêm não - màng não, viêm cơ tim, phù phổi cấp dẫn đến tử vong nếu không được phát hiện sớm và xử trí kịp thời Bệnh do một số vi rút đường ruột gây ra, trong đó tác nhân gây dịch bệnh nổi trội là coxsackievirus A16 (CV-A16), Enterovirus type 71 (EV-A71) và gần đây là CV-A6 và CV-A10) [1, 2]

4

Dựa trên các dấu hiệu và triệu chứng lâm sàng, bệnh được chia làm 5 độ lâm sàng theo Quyết định số 2554/QĐ-BYT năm 2011 của Bộ trưởng Bộ Y tế [7] Cụ thể như sau:

- Độ 1: chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da

- Độ 2a: có một trong các dấu hiệu sau:

+ Bệnh sử có giật mình dưới 2 lần/30 phút và không ghi nhận lúc khám Sốt trên 2 ngày, hay sốt trên 39ºC, nôn, lừ đừ, khó ngủ, quấy khóc vô cớ

- Độ 2b: có dấu hiệu thuộc nhóm 1 hoặc nhóm 2:

+ Nhóm 1: Có một trong các biểu hiện sau: Giật mình ghi nhận lúc khám; Bệnh sử có giật mình ≥ 2 lần/30 phút; Bệnh sử có giật mình kèm theo một dấu hiệu sau: Ngủ gà, mạch nhanh (khi trẻ nằm yên, không sốt); Sốt cao ≥ 39ºC không đáp ứng với thuốc hạ sốt

+ Nhóm 2: có một trong các biểu hiện sau: Thất điều: run chi, run người, ngồi không vững, đi loạng choạng; Rung giật nhãn cầu, lác mắt; Yếu chi hoặc liệt chi; Liệt thần kinh sọ: nuốt sặc, thay đổi giọng nói

- Độ 3: có biến chứng nặng về thần kinh, hô hấp, tim mạch, biểu hiện: + Co giật, hôn mê (Glasgow < 10 điểm)

+ Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ) + Mạch nhanh >170 lần/phút hoặc tăng huyết áp

- Độ 4: Biến chứng rất nặng, khó hồi phục: Sốc, phù phổi cấp, tím tái, SpO2

< 92%, ngưng thở, thở nấc

1.1.1.2 Định nghĩa ca bệnh xác định: Là ca bệnh lâm sàng có xét nghiệm

dương tính với vi rút đường ruột gây bệnh tay chân miệng [8]

1.1.2 Tác nhân gây bệnh tay chân miệng

Các tác nhân VRĐR gây bệnh tay chân miệng bao gồm VRĐR typ 71 A71), các virus coxsackie A2, 4, 5, 6, 9, 10, 16 các virus coxsackie B2, 3, 5 , các virus echo 11, 18, 30 Trong đó, tác nhân gây bệnh chủ yếu là EV-A71, CV-A16 và gần đây là CV-A6 EV-A71 có thể gây ra các biến chứng thần kinh nặng

(EV-và dẫn đến tử vong, còn các vi rút đường ruột khác thường ở thể nhẹ [2] tuy nhiên y văn vẫn ghi nhận lẻ tẻ các ca TCM kèm biến chứng nặng liên quan đến các tác nhân VRĐR khác Bệnh do CV-A16 thường ở dạng nhẹ nhưng các vụ dịch TCM do CV-A16 là tác nhân chính đôi khi còn xảy ra với quy mô lớn hơn

là EV-A71 Đặc biệt, tác nhân gây bệnh TCM mới nổi CV-A6 ngày càng được ghi nhận là một trong những tác nhân chính gây các vụ dịch TCM hàng năm ở các nước thuộc Châu Á – Thái Bình Dương Trong khuôn khổ luận văn này,

Dựa vào sự đa dạng di truyền vùng gen VP1, CV-A6 được tùy ý chia thành các lineage (dòng) từ A đến E, lineage E tiếp tục chia thành sub-lineage E1 và E2 [10] hoặc cluster (cụm) từ A đến F [11] Cluster A/linegae E1 chứa phần lớn các chủng lưu hành trên thế giới Gần đây, một hệ thống định danh CV-A6 được đề xuất và công nhận rộng rãi bởi có nhiều điểm tương đồng với hệ thống định danh của EV-A71 Trong đó, các CV-A6 được chia thành các genogroup (nhóm gen) từ

A đến D Genogroup D tiếp tục chia thành các sub-genogroup (dưới nhóm gen) D1 đến D4 [12, 13] Chủng gốc (prototype) của CV-A6 là Gdula (số hiệu trên GenBank: AY421764), phát hiện lưu hành ở Mỹ năm 1949 [6], là chủng duy nhất của nhóm gen A Genogroup D, trong đó sub-genogroup D3 (tương ứng lineage E2) chứa phần lớn các chủng CV-A6 lưu hành trên thế giới

CV-A16 được phân thành hai genotype (kiểu gen) A và B Genotype B lại được phân chia tiếp thành các sub-genogroup (dưới nhóm gen/phân nhóm) B1a, B1b, B1c, B2 và B3 [9], đôi khi gọi chung là kiểu gen Chủng gốc của CV-A16

là G-10, lưu hành ở Nam Phi năm 1951, là thành viên duy nhất của kiểu gen A [6] Kiểu gene B có thể có nguồn gốc từ sự tái tổ hợp gen từ kiểu gen A của CV-A16 với EV-A71 và CV-A4

1.2.2.1 Đặc điểm hình thái cấu trúc

Hạt vi rút đường ruột có hình khối cầu gồm 20 mặt đối xứng với đường kính 30nm, không có vỏ lipid bao ngoài Lớp vỏ protein capsid gồm 60 đơn vị cấu trúc (protomers) hợp thành, mỗi đơn vị được hình thành bởi 4 polypeptid VP1, VP2, VP3, VP4 Trong đó, VP1, VP2 và VP3 nằm trên bề mặt capsid, chứa các

vị trí là thụ thể tế bào (receptor) và vị trí kết hợp kháng nguyên – kháng thể, hầu

6

hết các vị trí này nằm trên VP1 VP4 nằm ở mặt trong vỏ capsid Mỗi protein VP1, VP2 và VP3 đều có chung cấu trúc tám tấm β đối song song hay còn goi là ống β Cứ mỗi một nhóm 4 loại protein cấu trúc VP1-VP4 trên sẽ tạo nên một đơn vị capsid “capsid promoter” Năm “capsid promoter” gộp lại thành một nhóm 5 đơn vị “pentamer” và 12 “pentamer” hình thành nên vỏ capsid của hạt virus [8]

Hình 1.2 C ấu trúc chung của các vi rút đường ruột [8]

7

Hình 1.3 Mô hình gen của vi rút đường ruột [1]

Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, tại đây có 6 cấu trúc mã hóa stem-loop trong đó stem-loop I là stem-loop hình lá tham gia vào quá trình tổng hợp ARN của vi rút còn stem-loop II đến VI gồm các các trình tự tiếp nhận ribosome ở bên trong (internal ribosome entry site – IRES) liên quan đến quá trình dịch mã protein

Vùng không dịch mã 3’-UTRs (gồm khoảng 81nt) chứa 3 cấu trúc mã hóa stem-loop X, Y, Z và đuôi poly A Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các điểm đột biến trong vùng 3′UTR sẽ làm mất ổn định tương tác vòng kissing (kissing stem -loops) giúp duy trì cấu trúc tổng thể vùng 3′UTR [8]

Khung đọc mở mã hóa một polyprotein duy nhất, là tổ hợp của ba polyprotein P1 (dài khoảng 2586 nucleotid), P2 (1,734 nt) và P3 (2,259 nt) Tổ hợp này tiếp tục được chia thành 11 protein gồm 4 protein capsid thuộc P1 là VP1, VP2, VP3, VP4 và 7 protein không cấu trúc gồm P2 có 2A, 2B, 2C và P3

có 3A, 3B, 3C, 3D [32]

Tùy thuộc vào từng kiểu VRĐR mà vùng gen mã hóa VP1 có chiều dài khác nhau, giao động từ 834 đến 951 nucleotide (tương ứng 278 đến 317 acid amin) Vùng gen VP1 của CV-A16 là 891 nucleotide (từ vị trí nucleotid 2446 đến 3336 trên hệ gen) và của CV-A6 là 915 nucleotide (từ vị trí nucleotid 2441 đến 3355) [14], [15] Vùng gen mã hóa protein VP1 được chứng minh là vùng gen quyết định đến tính kháng nguyên và tính độc lực của vi rút Những đột biến trong vùng VP1 dễ dẫn đến thay đổi thành phần acid amin và đặc tính gây bệnh

8

của vi rút, từ đó có thể hình thành biến chủng mới [16] Vì vậy, vùng gen này có ảnh hưởng đáng kể đến sự biến đổi về gen, đặc điểm hình thái và là vùng đại diện thích hợp sử dụng trong nghiên cứu về quá trình phát sinh loài của vi rút

1.2.3 Sự nhân lên của virus trong tế bào vật chủ

Sự sao chép của virus diễn ra ở tế bào chất Virus đường ruột có khả năng nhân lên trong rất nhiều loại tế bào, đặc biệt là tế bào thận khỉ Quá trình nhân lên của virus gồm các giai đoạn sau: (1) hấp phụ, (2) xâm nhập và cởi áo, (3) tổng hợp acid nucleic và protein capsid, và (4) lắp ráp và giải phóng virus Kết thúc các giai đoạn trên, sẽ xảy ra sự hủy hoại tế bào vật chủ Các VRĐR có thể

sử dụng nhiều phương thức nhập bào hay xâm nhập khác nhau, phụ thuộc vào serotype và loại tế bào vật chủ Bước gắn thụ thể (receptor) và/hoặc thay đổi pH trong hệ thống các túi, hạt sẽ dẫn đến hiện tượng cởi áo ở virus, giúp phóng genome của virus khỏi lớp vỏ capsid, đưa genome vào tế bào chất thông qua một cái lỗ trên màng tế bào Mặc dù các VRĐR khác nhau có thể sử dụng các receptor và phương thức xâm nhập khác nhau, các bước sau khi xâm nhập tương đối giống nhau và ổn định

- Giai đoạn hấp phụ: Đầu tiên, virus cố định vào thụ thể (receptor) đặc hiệu trên bề mặt tế bào Ngưỡng vật chủ của VRĐR được xác định bởi chính sự nhận diện đặc hiệu của virus và các receptor có trên bề mặt của tế bào thụ cảm Đối với các VRĐR, tương tác với receptor chưa đủ cho sự xâm nhiễm mà chúng cần một phân tử thứ 2, đồng thụ thể (co-receptor) để hoàn tất việc xâm nhiễm Điều phức tạp ở đây là một vài serotype có thể sử dụng các receptor khác nhau phụ thuộc vào kiểu tế bào và một vài serotype VRĐR khác nhau lại có sự tương tác

bề mặt khác nhau với cùng một loại receptor Các receptor có vai trò quyết định con đường xâm nhập của virus Receptor của CV-A16 là Scavenger receptor class B (SCARB2) và P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), tương tự receptor của EV-A71 CV-A6 không nhận diện bất kỳ receptor nào của cả EV-A71 hay CV-A16 mà nhận diện nhóm KREMEN1 (kringle (KR) containing transmembrane protein 1; KRM1) tuy nhiên sự hiểu biết về receptor của CV-A6 hiện vẫn còn nhiều giới hạn [17, 18]

- Giai đoạn xâm nhập và cởi áo (giai đoạn hủy vỏ capsid): Virus có thể đưa vật liệu di truyền (RNA) của mình vào tế bào chủ thông qua con đường cởi

áo hoặc bám gắn Một loạt thay đổi về mặt hình thái sẽ xảy ra trong quá xâm nhập Gần đây, một mô hình mới đã được đưa ra trong đó một điểm trung tâm, cấu thành bởi đầu N của VP4 và VP1 được hình thành, thông quá đó RNA của virus có thể truyền qua

9

- Giai đoạn tổng hợp acid nucleic và protein capsid (3): RNA được giải phóng sẽ được sử dụng để tổng hợp các hạt virus thế hệ sau Sau khi bỏ vỏ capsid, RNA được tự do trong bào tương Ngay sau đó, sự tổng hợp protein của virus diễn ra tại lưới nội mô (ER) có hạt Sao chép RNA virus diễn ra trên bề mặt túi màng sinh chất kép Sự sao chép RNA virus diễn ra sử dụng các bản sao RNA sợi âm trung gian của hệ gen virus 3Dpol điều chỉnh sự mã hóa của virus bằng cách tương tác với những nhân tố của virus và tế bào thông qua mô-típ cấu trúc bậc hai trong các vùng ko mã hóa (NTRs) của các sợi RNA âm và dương

- Giai đoạn lắp ráp và giải phóng virus (4): Sự hình thành hình thái virus được quyết định bởi các bước lắp ráp trung gian của capsid virus thông qua các tiền chất và vỏ tiền capsid (procapsid) Ở pha cuối cùng, một phân tử RNA sợi đơn dương sẽ được bao bọc trong vỏ capsid tạo hạt tiền virus (provirus) và sự phân cắt cuối cùng tiền chất protein VP0 thành VP2 và VP4 sẽ tạo ra hạt virus hoàn chỉnh Hạt virus hoàn chỉnh sẽ thoát ra khỏi tế bào chủ thông qua con đường phóng thích không phân giải nhờ các túi ngoại bào hoặc ly giải

1.2.4 Đặc điểm lý hóa

Sự tủa: Tỷ trọng nổi trong CsCl (cesium chloride): 1.30–1.34 g/cm3

Tính bền: Tồn tại trong điều kiện acid yếu, duy trì hoạt tính gây nhiễm từ 1 đến 3 giờ ở điều kiện pH đến 3.0 (đặc tính này cho phép virus sao chép trong đường tiêu hóa) Ở ngoài môi trường: tồn tại ở nhiệt độ phòng trong vài ngày, 4oC trong vài tuần, và vài năm tại nhiệt độ đông băng

Sự ổn định về mặt cấu trúc: Trơ với các dung môi hữu cơ (ether và chloroform) Bền với nhiều chất tẩy tại nhiệt độ thường Bền với các chất khử trùng phòng thí nghiệm (ethanol 70%, isopropanol, lysol, hợp chất quaternary ammonium)

Sự bất hoạt: Hóa chất: formaldehyde, glutaraldehyde, acid mạnh, sodium hypochlorite, Clo dư Trong môi trường: nhiệt độ >50oC (không bị bất hoạt nếu

có mặt của MgCl), tia cực tím, sấy khô bề mặt

Các đặc tính lý sinh và hóa sinh của virus sẽ ảnh hưởng đến cơ chế bệnh sinh, sự lây truyền và đặc điểm dịch tễ học cơ bản của các VRĐR Tính ổn định

về mặt cấu trúc trong các điều kiện môi trường khác nhau là nhân tố quan trọng đối với sự lây truyền của virus

Quá trình bệnh lý có thể chia làm 4 giai đoạn:

- Giai đoạn ủ bệnh: Kéo dài từ 3 - 7 ngày kể từ khi nhiễm Trong giai đoạn

này trẻ vẫn bình thường, và thông thường không có dấu hiệu nhiễm bệnh Sau

10

khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên chủ yếu ở các mô lympho liên kết ở hầu họng và ruột Sau đó virus tiếp tục nhân lên ở phía sâu trong cổ họng và ở các hạch bạch huyết trên màng treo ruột Tại các tế bào niêm mạc ruột non thì số lượng virus nhân lên nhiều nhất

- Giai đoạn lây truyền: Khoảng 1 - 2 ngày đến vài ngày trước khi phát

bệnh, bệnh biểu hiện mạnh nhất trong tuần đầu và có thể kéo dài vài tuần sau đó, thậm chí sau khi bệnh nhân hết triệu chứng

- Giai đoạn toàn phát: Có thể kéo dài từ 3 - 10 ngày với các triệu chứng

điển hình của bệnh như: loét miệng, phát ban dạng phỏng nước ở lòng bàn tay, lòng bàn chân, gối, mông; tồn tại trong thời gian ngắn, sốt nhẹ và nôn Ngoài ra trẻ có thể gặp các biến chứng về tim mạch dẫn đến trụy mạch hay hô hấp dẫn đến suy hô hấp

- Giai đoạn lui bệnh: Thường sau giai đoạn toàn phát từ 3 - 5 ngày Trẻ hồi

phục hoàn toàn Nếu có biến chứng, bệnh diễn tiến rất nhanh có thể nặng dẫn đến

tử vong

Cá c đặc điểm dịch tễ

1.3.1 Con đường lây truyền và sự phân bố bệnh

Bệnh TCM chủ yếu lây theo đường tiêu hóa Nguồn lây chính do tiếp xúc trực tiếp từ nước bọt, phỏng nước, phân của người nhiễm bệnh, mang mầm bệnh không có triệu chứng hoặc thức ăn, nước uống, bàn tay của trẻ hoặc người chăm sóc trẻ, các đồ dung, đặc biệt là đồ chơi và vật dụng sinh hoạt hằng ngày như chén, bát, đĩa, thìa, cốc bị nhiễm vi rút từ phân hoặc dịch nốt phỏng Khả năng lây truyền cao nhất diễn ra trong tuần đầu của bệnh

Có rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đặc điểm của bệnh TCM phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lứa tuổi mắc bệnh, thời gian mắc bệnh, vùng miền… Nghiên cứu của Xyeyong Huang và cộng sự về đặc điểm dịch tễ học bệnh TCM tại tỉnh Henan, Trung Quốc từ năm 2008-2013 cho kết quả tỷ lệ mắc cao nhất vào giữa tháng Tư và tháng Năm Sự xuất hiện của TCM ở đây có liên quan mật thiết đến phân bố mùa, tuổi và khu vực Trẻ em dưới năm tuổi là dân số bị ảnh hưởng nhiều nhất, gặp ở trẻ nam nhiều hơn trẻ nữ [19]

Một số yếu tố có thể làm gia tăng sự lây truyền và bùng phát dịch bao gồm: mật độ dân số cao, sống chật chội, điều kiện vệ sinh kém, thiếu nhà vệ sinh, thiếu hoặc không có nước sạch phục vụ sinh hoạt hằng ngày Bệnh thường phổ biến ở những khu vực có điều kiện kinh tế xã hội kém phát triển, đặc biệt những vùng dân cư đông đúc và các vùng nhiệt đới nơi điều kiện vệ sinh kém Bệnh thường xảy ra ở vùng nông thôn hơn so với khu vực thành thị, ảnh hưởng bởi yếu

11

tố về mức độ vệ sinh Sự nhiễm trùng thưởng xảy ra nhất ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ Trẻ nhỏ thường gieo rắc/thải VRĐR và thường là trường hợp đầu hệ (index case) trong các vụ dịch gia đình

Tác giả Bending J.W., Fleming D.M nghiên cứu bệnh TCM trong vụ dịch lớn nhất xảy ra ở Anh và xứ Wales vào cuối năm 1994 kết quả là hầu hết bệnh nhân ở độ tuổi từ 1 đến 4 tuổi và sống ở miền trung hoặc miền nam [20] Nghiên cứu của tác giả Xiao-Fang WANG và cộng sự về đặc điểm dịch tễ học của bệnh tay chân miệng trên đối tượng là trẻ em mầm non năm 2008-2015 tại Trung Quốc cho thấy lứa tuổi trẻ mắc bệnh nhiều nhất là 37-48 tháng, trẻ nam mắc bệnh nhiều hơn trẻ nữ, khu vực thành thị có nguy cơ bùng phát dịch cao hơn nông thôn

và đỉnh điểm của bệnh vào tháng 4 – 7 trong năm [21]

Các ca bệnh nhỏ lẻ và những vụ dịch của bệnh TCM có thể diễn ra quanh năm, ở khắp mọi nơi trên thế giới, tại mọi thời điểm và các quốc gia có điều kiện khí hậu khác nhau Bệnh thường có xu hướng xảy ra và lan rộng vào mùa xuân –

hè – thu Ở các vùng nhiệt đới ôn hòa, nhiễm trùng VRĐR xảy ra khá thường xuyên vào mùa hè và thu nhưng không có một kiểu hình/khuôn mẫu/mô hình mùa cụ thẻ ở vùng nhiệt đới Tuy nhiên, cũng giống như các bệnh khác do VRĐR gây ra, bệnh TCM thường diễn ra vào mùa hè ở vùng ôn đới và vào mùa mưa ở các nước nhiệt đới Ở Việt Nam, bệnh TCM có xu hướng tăng vào các tháng mưa ở các tỉnh miền Nam hoặc tăng vào các tháng hè thu ở miền Bắc Điều này được cho là do có sự liên quan về khí hậu đặc biệt là yếu tố độ ẩm và nhiệt

độ

Một nghiên cứu ở Miền Bắc Thái Lan về sự phân bố theo thời gian và các điểm nóng của bệnh TCM từ 2003-2012 của nhóm tác giả Ratchaphon Samphutthanon, kết quả chỉ ra rằng căn bệnh này có thể xảy ra bất cứ lúc nào trong năm, nhưng dường như lên đến đỉnh điểm vào mùa mưa và lạnh Sự phân

bố của các ổ dịch thường là tập trung thành cụm Khi được phân tách theo mùa,

có một mối tương quan với hướng gió mùa tây nam cùng thời điểm [22] Phân tích của Onozuka D, Hashizume M về ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm đến tỷ lệ mắc bệnh tay, chân và miệng ở Nhật Bản cho thấy số trường hợp mắc bệnh TCM hàng tuần tăng 11,2% (95% CI: 3,2 19.8) cho mỗi mức tăng nhiệt độ trung bình 1°C và tăng 4,7% (95% CI: 2,4 trong độ ẩm tương đối Đáng chú ý, ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm lớn nhất ở trẻ em dưới 10 tuổi [23]

1.3.2 Tình hình b ệnh tay chân miệng trên thế giới

Bệnh TCM được mô tả lần đầu tại Toroto-Canada năm 1957 [24] Từ khi được ghi nhận trong y văn, bệnh TCM đã gây ra nhiều vụ dịch ở các nước khu

12

vực Tây Thái Bình Dương trong thập niên đầu tiên của thế kỷ 21 [1] Trong hơn

1 thập kỷ vừa qua các vụ dịch TCM được báo cáo ở nhiều nước, đặc biệt là khu vực Châu Á, Thái Bình Dương như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Brunei, Singapore, Australia… và Việt Nam [1]

Theo cập nhật gần nhất về tình hình bệnh TCM khu vực Tây Thái Bình Dương từ nguồn số liệu của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) ngày 14/8/2018, tại Trung Quốc, chỉ trong tháng 7/2018 có tổng cộng 377.629 trường hợp mắc bệnh và 4 ca tử vong đã được báo cáo ở Trung Quốc, đây là mức tăng 27% so với cùng kỳ năm 2017, nâng tổng số ca bệnh TCM của Trung Quốc từ đầu năm lên >1.000.000 ca, tại Nhật Bản đã có tổng số 69.041 trường hợp, Singapore có 26252 trường hợp được báo cáo kể từ đầu năm 2018 [25]

Tại các nước khác ngoài khu vực Tây Thái Bình Dương, bệnh TCM cũng được ghi nhận Tại Tây Ban Nha, năm 2015 một đợt bùng phát TCM với 99 ca mắc ghi nhận xảy ra tại một trung tâm giữ trẻ và 74 ca xảy ra tại cộng đồng ở thành phố Irun [26], năm 2016 một vụ dịch EV-A71 liên quan đến các trường hợp thần kinh nghiêm trọng đã được báo cáo ở Catalonia và lan rộng ra các khu vực khác của Tây Ban Nha [27] Cùng năm 2016, Pháp cũng báo cáo 59 trường hợp bệnh nhi nặng liên quan đến EV -A71 và EV-D68 [28]

1.3.3 Tình hình bệnh tay chân miệng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, dịch bệnh TCM lần đầu tiên được báo cáo tại miền Nam Việt Nam năm 2003 [3] Bệnh TCM thực sự được xem xét là mối đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng tại Việt Nam khi dịch bệnh bùng phát khắp nước vào năm 2011-2012 với tỷ lệ ca bệnh nặng và tử vong cao [29, 30] và chính thức được đưa vào hệ thống báo cáo thường quy theo quy định tại Thông tư số 48/2010/TT-BYT, ngày 31/12/2010 của Bộ trưởng Bộ Y tế

Theo một báo cáo tổng kết giám sát, điều tra phòng chống dịch TCM năm 2018 của viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, số trường hợp mắc bệnh TCM tại Việt Nam được giám sát trên 63 tỉnh/thành phố, với 53.259 mắc; 25.845 nhập viện; 6 tử vong tại 5 tỉnh thành phố khu vực phía Nam Số mắc ghi nhận chủ yếu khu vực phía Nam (77%); miền Bắc (11,2%); 99,5% trẻ dưới 10 tuổi; từ 1-5 (79%); dưới 1 tuổi 17% [31]

1.3.4 Sự lưu hành của các kiểu VRĐR gây bệnh TCM trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu đã cho thấy sự phân bố các nhóm và dưới nhóm gen của vi rút này rất đa dạng, có thể khác nhau giữa các vùng và các vụ dịch EV-A71, CV-A16, và CV-A6 là ba tác nhân VRĐR chính gây bệnh TCM Các trường hợp

13

nhiễm EV-A71 có thể liên quan đến triệu chứng tổn thương thần kinh nghiêm trọng như bại liệt giống polio, viêm não/viêm màng não và biến chứng tim phổi gây tử vong Tuy nhiên, các vụ dịch TCM quy mô lớn do CV-A16 và CV-A6 xảy

ra hàng năm trên khắp thế giới và vẫn có ghi nhận về các ca bệnh nặng Ngoài ra,

sự chớm nổi của các kiểu VRĐR khác như CV-A10, CV-A4 và virus echo như E11 và E30 gây dịch TCM, trong đấy có những ca có biểu hiện thần kinh nghiêm trọng cũng được báo cáo một cách lẻ tẻ [30, 32-35]

EV-A71 lần đầu tiên được phân lập ở California-Mỹ năm 1969 (chủng gốc BrCr), là tác nhân gây bệnh được quan tâm tại châu Á-Thái Bình Dương và trên thế giới vì khả năng đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng Các vụ dịch TCM lớn có báo cáo về ca tử vong do suy tim phổi và EV-A71 là căn nguyên chính được ghi nhận xảy ra tại Sarawalk -Malaysia năm 1997, Đài Loan năm

1998 Sau đấy, nhiễm EV-A71 là nguyên nhân gây nên hàng ngàn cái chết cho trẻ nhỏ trên thế giới, đặc biệt tại khu vực châu Á-Thái Bình Dương bao gồm Malaysia, Đài Loan, Việt Nam, Campuchia và Trung Quốc, đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng [36, 37]

Năm 2008, tại Singapore, Yan Wu và các cộng sự nghiên cứu trên 51 mẫu lâm sàng phát hiện VRĐR trong 34 mẫu (66,7%), với 11 mẫu (21,6%) dương tính với EV-A71 Các VRĐR khác không phải EV-A71 (bao gồm coxsackievirus A4, A6, A10 và A16) Phân tích phát sinh loài của 10 chủng EV-A71 lưu hành thuộc về hai nhóm con B5 (80%) và C2 (20%) [38] Nghiên cứu của Jing Wang và cộng sự về đặc điểm dịch tễ học của bệnh TCM tại Sơn Đông, Trung Quốc từ 2009- 2016 thấy CV-A16 đã chiếm ưu thế và gây ra khoảng 30% trường hợp nặng [39]

CV-A6 là tác nhân gây bệnh mới nổi gần đây, virus thay đổi kiểu gen và đột ngột có kiểu hình gây bệnh và gây dịch rộng khắp tại Phần Lan năm 2008 Rất nhanh sau đấy, dịch TCM do CV-A6 nhanh chóng lan rộng khắp các nước trên thế giới Trong vòng một thập niên trở trở lại đây, cùng với EV-A71 và CV-A16, CV-A6 trở thành một trong ba tác nhân chính gây bệnh TCM, sự lưu hành của ba kiểu VRĐR này chiếm đến 80% - 90% tổng số các VRĐR được phát hiện [40-43]

Ngoài EV-A71, CV-A16, CV-A6, các tác nhân VRĐR khác, gồm các virus coxsackie nhóm A và B, các virus echo và các VRĐR mới xác định, chiếm khoảng 10%-20% số ca TCM dương tính với VRĐR còn lại [43, 44] Nghiên cứu

về kiểu gen của các EV gây ra bệnh TCM tại Thượng Hải, Trung Quốc năm 2012-2013 của tác giả Menghua Xu và cộng sự kết quả tổng cộng có 13 kiểu gen

14

Enterovirus đã được xác định Các kiểu gen thường gặp nhất là CV-A6 (31,9%), EV-A71 (30,6%), CV-A16 (8,8%) và CV-A10 (7,5%) Mặc dầu vậy, kiểu gene của các VRĐR thay đổi liên tục và sự xuất hiện các biến thể mới của các virus đôi khi có khả năng gây nên các vụ dịch TCM, thậm chí đi kèm với các ca bệnh nặng có biểu hiện tổn thương thần kinh Điển hình là sự xuất hiện biến thể mới của CV-A10 đã giúp virus này lưu hành nổi trội và gây dịch tại Phần Lan (2008), Pháp (năm 2010) và Trung Quốc (2010) hoặc sự lưu hành gây dịch TCM lẻ tẻ của CV-A2 và CV-A5 tại Hàn Quốc (2009), E-11 tại Thái Lan (2005), E-19 tại Trung Quốc (2003) và E-30 tại Úc và Trung Quốc , và ghi nhận về ca bệnh nặng tại Trung Quốc do nhiễm chủng E-11 có nguồn gốc tái tổ hợp gen [33, 44-50]

Gần đây, các nghiên cứu dịch tễ học phân tử về căn nguyên VRĐR gây dịch bệnh TCM ở Việt Nam cũng bắt đầu được tiến hành Nghiên cứu bài bản đầu tiên

do Phan Văn Tú và cộng sự thực hiện năm 2005 trong vụ dịch TCM tại thành phố Hồ Chí Minh, EV-A71 chiếm 42.1% và trong tổng số ca mắc EV-A71 có 29% ca có tổn thương thần kinh và 1.7% ca tử vong Phân tích di truyền phả hệ vùng VP1 trên các chủng EV-A71 đã phát hiện sự đồng lưu hành của 3 subgenogroup EV-A71 là C1, C4 và C5, C5 chiếm nổi trội [3] Một nghiên cứu

về tay chân miệng thực hiện năm 2011-2012, tác nhân là EV-A71 (42,1%) và (52,1%) là CV-A16 Trong số những bệnh nhân bị nhiễm EV-A71, 29,3% trường hợp nặng và 3 trường hợp tử vong Phân tích phát sinh của 23 phân lập EV-A71,

vi rút thuộc 3 dưới nhóm là C1, C4, C5

Nghiên cứu các vi rút đường ruột gây bệnh TCM ở miền Bắc Việt Nam, 2015-2016 của Trần Thị Nguyễn Hòa và cộng sự kết quả xác định vi rút EV-A71 chiếm tỷ lệ 31,2% và 29,3%; vi rút CV- A6 chiếm 58,7% và 33,6%; CV-A16 chiếm 4,3% và 18,1%; vi rút CV-A10 chiếm 0,7% và 10% theo trình tự năm 2015-2016 Các vi rút đường ruột khác ở mức độ tản phát bao gồm CV-A4, CV-A5, CV-A8, CV-A14, echo 6 và Polio Sabin 3 chiếm tỷ lệ 3,5%; CV-A1, CV-A2, CV-A4, CV-A5 và CV-A8, coxsackievius B; echo 5, echo11, echo 18, Enterovirus týp 96; vẫn còn 11% và 4% các vi rút đường ruột không xác định được týp vi rút, kiểu gen vi rút EV-71 là C4 và B5 [51]

Các k ỹ thuật chẩn đoán CV-A6 và CV-A16 gây bệnh tay chân miệng 1.4.1 Các loại mẫu dùng cho chẩn đoán

Để chẩn đoán VRĐR, loại mẫu lựa chọn phụ thuộc vào hệ thống cơ quan liên quan và phương pháp chẩn đoán sẵn có (cổ điển hay phân tử), thường là phân, dịch ngoáy họng hoặc trực tràng, máu và dịch não tủy (CSF) Mẫu phân

15

thường cho kết quả phát hiện VRĐR cao nhất vì nó chứa nồng động virus cao Tuy nhiên, sự phát hiện các VRĐR trong phân hay dịch ngoáy họng có thể xác định nhầm tác nhân gây bệnh bởi vì sự sản sinh của virus không gây triệu chứng Nói chung, sự liên quan của VRĐR và bệnh cần phải phân lập virus từ các tổn thương mô bệnh hay dịch lỏng

Đối với bệnh TCM, bệnh phẩm chẩn đoán bao gồm mẫu phân, mẫu ngoáy trực tràng, dịch ngoáy họng, dịch nốt phòng…

1.4.2 Nuôi cấy vi rút

Tiêu chuẩn vàng để xác định nhiễm VRĐR là phân lập được vi rút Nuôi cấy vi rút là kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có trong mẫu bệnh phẩm) lên dòng tế bào nuôi thích hợp nhằm tăng sinh phát triển, từ đó có thể xác định được vi rút Tuy nhiên nuôi cấy vi rút không được áp dụng rộng rãi cho chẩn đoán do đòi hỏi cao

về cơ sở vật chất và hóa chất, môi trường sử dụng [1] Để xác định týp VRĐR, phương pháp phân lập vi rút trên tế bào thường kết hợp phương pháp trung hòa

vi lượng với các kháng huyết thanh đặc hiệu týp và phải mất khoảng 28 ngày mới

có kết quả [52]

Hiện nay phân lập vi rút chủ yếu là dùng để lưu giữ chủng vi rút, không áp dụng cho chẩn đoán bệnh TCM

1.4.3 Phương pháp sinh học phân tử

Các kỹ thuật sinh học phân tử có đặc điểm nổi trội là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh chỉ sau 1 đến 3 ngày kể từ ngày nhận mẫu

- RT-PCR: PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kĩ thuật được sử

dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã góp phần rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bước tiến vô cùng quan trọng trong các kĩ thuật phòng thí nghiệm.Phản ứng dựa trên nguyên tắc tổng hợp liên tục các chuỗi nucleotide từ một khuôn mẫu có sẵn, dưới sự hoạt động của enzyme Polymerase.Hiện nay, có rất nhiều kĩ thuật PCR khác nhau, phụ thuộc vào mục đích của người làm thí nghiệm cũng như đặc điểm của chuỗi nucleotide cần nhân lên

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu ARN theo nguyên lý của PCR, bao gồm hai giai đoạn:

- Giai đoạn thứ nhất Phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợi ADN bổ sung (cADN)

- Giai đoạn thứ hai: giai đoạn thực hiện phản ứng PCR

16

Kỹ thuật RT-PCR để chẩn đoán mẫu có vật liệu di truyền là ARN Xét nghiệm này áp dụng cho các bệnh phẩm dịch não tủy, các chất dịch cơ thể khác như phân, dịch tiết đường hô hấp và máu [1]

- Multiplex RT-PCR: Ngày nay, người ta đã cải tiến phương pháp PCR qua 2 giai đoạn này thành chỉ còn một lần chạy PCR duy nhất Phương pháp này được gọi là phương pháp Multiplex RT-PCR, nó không những giữ nguyên các ưu điểm của phương pháp RT-PCR truyền thống như nhanh, đặc hiệu, nhạy

RT-và cho kết quả chính xác, mà còn giúp giảm giá thành khi thực hiện phản ứng, đơn giản hoá các bước kỹ thuật, nhờ đó có thể áp dụng rộng rãi hơn trong việc chẩn đoán và nghiên cứu Multiplex RT-PCR đã được phát triển để xác định EVs; EV-A71 và CV-A6; CV-A16 và CV-A10, phương pháp này hiện đang được sử dụng tại phòng thí nghiệm Vi rút Đường ruột – viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương [51]

- Realtime RT-PCR (rRT-PCR): là kỹ thuật nhân bản gen đích trong ống

nghiệm thành hàng tỷ bản sao, kết quả khuếch đại AND đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, không phải làm tiếp các bước của giai đoạn sau PCR nên hệ thống rRT-PCR giúp chẩn đoán phát hiện nhanh chóng và cụ thể một

số bệnh truyền nhiễm Hệ thống rRT-PCR có thể làm giảm nguy cơ nhiễm chéo khi so sánh với RT-PCR thông thường, đặc biệt là hệ thống Nested PCR (kỹ thuật Nested RT-PCR phải thực hiện 2 vòng, tăng nguy cơ nhiễm chéo dẫn đến dương tính giả) [1]

- K ỹ thuật PCR bán tổ và giải trình tự gen (semi-nested PCR/

Sequencing): Năm 2008, kỹ thuật PCR bán tổ và giải trình tự gen (snPCR/Seq) được dùng để xác định các týp VRĐR từ các mẫu dịch nổi tế bào và phải mất ít nhất 2 tuần mới có kết quả [53] Năm 2009, kỹ thuật sinh học phân tử bán tổ xác định các týp VRĐR từ các mẫu lâm sàng [52] Tuy nhiên kỹ thuật này phải giải trình gen nên rất tốn kém và phải có máy Sequencer

Giải trình tự gen: Từ những năm 1977 một số phương pháp giải trình tự gen

đã được phát minh như: Phương pháp giải trình tự gen theo phương pháp hóa học (Alan Maxam và Walter Gilbert), phương pháp giải trình tự gen bằng enzyme hay phương pháp Dideoxy (Frederick Sanger) Cả hai phương pháp này đã đánh dấu bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển của sinh học hiện đại Ngày nay, rất nhiều máy giải trình tự gen tự động đều dựa trên nguyên tắc chính là phương pháp giải trình tự gen của Sanger

- Gi ải trình tự gene thế hệ mới (next generation sequencing – NGS);

như tên gọi của nó, “thế hệ tiếp theo” là để phân biệt với phương pháp giải trình

17

tự thế hệ đầu tiên do Frederick Sanger phát minh vào năm 1977 Phương pháp giải trình tự gen thế hệ mới tuy hoạt động dựa trên nguyên lý tổng hợp tương tự như giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger nhưng tăng hiệu năng và giảm giá thành so với các kỹ thuật trước đây Các kỹ thuật NGS vẫn tiếp tục đổi mới, tăng lưu lượng xử lý lên hàng trăm đến ngàn lần, cho phép đọc trình tự có thể dài bằng cả hệ gen Hiện tại NGS không chỉ bó hẹp trong các nghiên cứu cơ bản mà còn được áp dụng rộng rãi kể cả trong chẩn đoán và xét nghiệm thường ngày

Điều trị và phòng bệnh

1.5.1 Điều trị

Cho đến nay bệnh TCM vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, chỉ điều trị

hỗ trợ Thuốc kháng virus có nhân tố gắn capsid hiện như pirodavir và vapendavir cho thấy có hoạt tính chống lại EV-A71 Tuy nhiên các thử nghiệm lâm sàng của hai loại này vẫn còn hạn chế Các chất ức chế virus đặc hiệu khác cũng đã được phát hiện nhưng các nghiên cứu lâm sàng vẫn đang bị trở ngại vì

sự giới hạn trong hoạt tính kháng virus, tính khả dụng sinh học kém, tính kinh tế…

Hầu hết các trường hợp bệnh thường nhẹ và sẽ tự động hồi phục Tuy nhiên chăm sóc hỗ trợ chuyên sâu có thể cần cho các bệnh nhân biến chứng nặng, liên quan đến tim, gan và hệ thống thần kinh trung ương

Khử trùng nơi bị nhiễm bệnh như dụng cụ, đồ chơi của trẻ, nhà cửa, khu

vệ sinh…

Tránh các tiếp xúc gần với người bệnh như hôn, vuốt ve, dùng chung dụng cụ

Nâng cao thể trạng, chế độ nghỉ ngơi, dinh dưỡng hợp lý

Tuyên truyền tới từng hộ gia đình, đặc biệt là bà mẹ, người chăm sóc trẻ tại các hộ gia đình có trẻ dưới 5 tuổi, giáo viên các trường học, nhà trẻ, mẫu giáo, nhóm trẻ gia đình, lãnh đạo chính quyền, đoàn thể tại địa phương về bệnh tay chân miệng và các biện pháp phòng chống bằng nhiều hình thức như họp tổ dân

Thường xuyên lau sạch các bề mặt, dụng cụ tiếp xúc hàng ngày như đồ chơi, dụng cụ học tập, tay nắm cửa, tay vịn cầu thang, mặt bàn/ghế, sàn nhà bằng

xà phòng hoặc các chất tẩy rửa thông thường

1.5.3 Biện pháp phòng bệnh đặc hiệu

Hiện nay chưa có vaccine phòng bệnh đặc hiệu cho bệnh TCM Một vài vaccine EV-A71 đã được phát triển bao gồm vaccine bán đơn vị, vaccine hạt tương tự virus (virus-like particles, VLPs), vaccine DNA, vaccine sống giảm độc lực và vaccine bất hoạt… Pha thử nghiệm lâm sàng (pha III) một loại vaccine bất hoạt chống nhóm gene C4 của EV-A71 thực hiện gần đây trên 30.000 trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ tại Trung Quốc chỉ ra những hứa hẹn về hiệu lực của vaccine chống lại EV-A71 Tuy nhiên, các phản ứng phụ như sốt cao, nổi ban ban đỏ, đau và cứng tại chỗ tiêm đôi lúc xảy ra Tính ổn định, tính sạch và giá thành sản xuất vẫn là thách thức quan trọng trong tương lại đối với các vaccine này Thêm vào đó, các vắc xin này không có hiệu lực kháng lại các kiểu VRĐR khác, bao gồm CV-A16 và CV-A6 Vì sự lưu hành nổi trội của CV-A16 và CV-A6, vắc xin đa giá kháng lại hai loại serotype này cũng đang được cân nhắc đưa vào phát triển và sản xuất

Tình hình nghiên c ứu về dịch tễ học phân tử của CV-A6 và CV-A16 gây b ệnh tay chân miệng trên thế giới và Việt Nam

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về dịch tễ học phân tử của VRĐR gây bệnh TCM đã chỉ

ra được cùng với EV-A71, CV-A16 và CV-A6 là tác nhân VRĐR chính gây bệnh/dịch bệnh TCM

Dịch TCM do CV-A16 được ghi nhận lần đầu tiên tại Toronto vào năm

1957 [24] Trong một thời gian dài ba, bốn thập niên sau đó, CV-A16 được xem là tác nhân chính gây bệnh TCM, cao hơn cả EV-A17 Các đợt bùng phát TCM trên diện rộng do nhiễm CV-A16 đã được ghi nhận ở Anh, Wales

19

(1994), Đài Loan (1999-2006), Ấn Độ (2009), Bắc Kinh-Trung Quốc (2007)

và năm 2011 - 2013 Sự đa dạng hàng năm của CV-A16 được thể hiện trong các nghiên cứu ba năm được thực hiện tại Bắc Kinh và Quảng Châu, Trung Quốc khi tỷ lệ lưu hành CV-A16 hàng năm dao động từ 21% đến 75% Trong một nghiên cứu 7 năm khác được thực hiện tại Singapore, tỷ lệ phát hiện CV-A16 hàng năm là từ 5,5% đến 76% và kiểu huyết thanh chiếm ưu thế vào năm

2002 (76%), 2004 (66,8%) và 2007 (64,9%) [9, 54]

CV-A6 phân lập lần đầu tiên ở New York - Mỹ năm 1949 (chủng Gdula) Nhưng CV-A6 gần như bị "quên lãng" vì được xếp vào kiểu virus gây bệnh rất nhẹ hoặc không triệu chứng Nhưng virus thay đổi kiểu gen và đột ngột có kiểu hình gây bệnh TCM và gây dịch rộng khắp tại Phần Lan năm 2008 Rất nhanh sau đấy, dịch TCM do CV-A6 nhanh chóng lan rộng khắp các nước trên thế giới Trong vòng một thập niên trở trở lại đây, cùng với EV-A71 và CV-A16, CV-A6 trở thành một trong ba tác nhân chính gây bệnh TCM, sự lưu hành của

ba kiểu VRĐR này chiếm đến 80% - 90% tổng số các VRĐR được phát hiện [26, 40-42] Thậm chí, trong một số giai đoạn nhất định, CV-A6 còn vượt qua EV-A71 và CV-A16, trỏe thành tác nhân gây bệnh chính của vụ dịch TCM Nghiên cứu về kiểu gen của các EV gây ra bệnh TCM tại Thượng Hải, Trung Quốc năm 2012-2013 của tác giả Menghua Xu và cộng sự kết quả tổng cộng

có 13 kiểu gen Enterovirus đã được xác định Các kiểu gen thường gặp nhất là CV-A6 (31,9%), EV-A71 (30,6%), CV-A16 (8,8%) và CV-A10 (7,5%)

Những nghiên cứu trên mô hình chuột đã cho thấy CV-A6 bao gồm cả những chủng gây tử vong và không gây tử vong [21] Điều thú vị là một số đột biến thay thế ở các vị trí của VP1 như A5T, V30A, S137N, I242V ở các chủng thu thập giai đoạn 2010-2012 đều thuộc nhóm không gây tử vong Tuy nhiên những chủng CV-A6 mang các đột biến này thu thập vào giai đoạn 2013-2015 và 2016-2017 lại gây tử vong Do vậy, CV-A6 có thể có độc tính cao hơn và liên quan đến các ca bệnh từ nhẹ tới nặng ở Guangxi năm 2013 và cần những nghiên cứu sâu hơn để tìm hiểu mối liên quan giữa 4 đột biến thay thế này với độc tính vủa virut Hiện tượng cũng được tìm thấy ở Vietnam, CV-A6 trở thành tác nhân gây bệnh phổ biến ở Việt Nam từ năm 2011, 4 đột biến thay thế A5T, V30A, S137N, I242V cũng đã được phát hiện ở các chủng lưu hành tại Việt Nam từ năm 2011-2015 [55]

VP1 là thành phần miễn dịch quan trọng của capsid CV-A16 trong tất cả bốn loại protein capsid (VP1, VP2, VP3 và VP4) [56] Gần đây, sáu vùng được bảo tồn trong protein VP1 đã được xác định bởi Shi và cộng sự, có thể

20

dùng cho việc sản xuất các kháng thể trung hòa chống lại sự xâm nhập của CVA16, các vị trí acid amin (aa) là: aa 94-108 (Vùng 1), aa 109-123 (Vùng 2), aa 163-177 (Vùng 3), aa 187-201 (Vùng 4), aa 211-225 (Vùng 5) và a 271-

285 (Vùng 6) Nghiên cứu các chủng CV-A16 tại Nam Kinh, Trung Quốc của Wei Yong và cộng sự cho kết quả vùng kháng nguyên 4 là trình tự được bảo tồn nhất trong tất cả các kiểu gen CVA16 không có sự thay thế acid amin Đối với Vùng 2 và Vùng 5, so với chủng G-10 nguyên mẫu, năm đột biến được tìm thấy trong tất cả các kiểu gen khác ở các vị trí M119L, A213E, P215L, S217A và A220L [57] Tuy nhiên, chưa thấy công bố nào chỉ ra mối liên quan giữa các đột biến ảnh hưởng đến độc tính hay làm xuất hiện biến chủng mới của CV-A16

Bệnh TCM do nhiễm CV-A16 và CV-A6 thường nhẹ thì các trường hợp nhiễm EV-A71 có thể liên quan đến triệu chứng tổn thương thần kinh nghiêm trọng Chính vì vậy, các nghiên cứu thường tập trung về đặc tính vi rút học, dịch tễ học, bệnh học và kiểm soát vi rút EV-A71 Tuy nhiên, có thể thấy, trên thực tế, các vụ dịch TCM quy mô lớn do CV-A16 và CV-A6 xảy ra hàng năm trên khắp thế giới, các ca bệnh nặng vẫn xảy ra trong các mùa dịch, gánh nặng bệnh tật cho xã hội là rõ ràng Mặc dầu vậy, các nghiên cứu tương tự dành cho CV-A16 hay CV-A16 vẫn còn nhiều hạn chế, còn nhiều câu hỏi về đặc điểm phân tử, di truyền tiến hóa của các virus chưa có hoặc chưa đầy đủ câu trả lời

Vì thế cần nhiều hơn nữa các nghiên cứu về đặc điểm gây bệnh, đặc điểm dịch

tễ học phân tử như sự đa dạng kiểu gene, đặc điểm di truyền tiến hóa, xác định vùng gene chức năng quan trọng quyết định tính khánh nguyên, tính độc của CV-A6 và CV-A6 gây bệnh TCM Các kết quả nghiên cứu này sẽ là cơ sở khoa học cho việc đề xuất các chiến lược phòng và chống bệnh TCM toàn diện hơn bao gồm cả việc phát triển vaccine đa giá kháng CV-A6 và CV-A16 bên cạnh EV-A71

Một số nghiên cứu xác định kiểu (serotype) VRĐR gây bệnh/dịch bệnh TCM tại Việt Nam đã ghi nhận một tỉ lệ không nhỏ các căn nguyên VRĐR khác không phải là EV-A71 Tại vụ dịch TCM đầu tiên bùng phát ở Hồ Chí Minh năm

2005, CV-A16 là tác nhân nổi trội nhất, chiếm 52.1% trong tổng số mẫu VRĐR phân lập được [3]

Nghiên cứu căn nguyên VRĐR gây dịch bệnh TCM ở miền Bắc giai đoạn

từ 2008 đến đầu 2018 cho thấy CV-A6 đóng vai trò là tác nhân nổi trội thứ 2 (sau EV-A71) và chiếm 27% trong tổng số các mẫu dương tính, xếp thứ 3 là CV-A16,

21

chiếm 21% Sự lưu hành của CV-A16 hàng năm rất biến đổi, có những năm không xuất hiện hoặc xuất hiện với tỷ lệ thấp nhưng có những năm được phát hiện với tỷ lệ cao, lên đến 54.7% CV-A6 lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam vào năm 2011, hàng năm đều lưu hành nổi trội, chiếm từ 22% đến 53% tổng số mẫu dương tính và đôi khi là tác nhân chính gây dịch bệnh TCM trong năm Cùng với các kiểu VRĐR không phải là EV-A71 như coxsackie A4, coxsackie A13, E-6 và Sabin polio 2 (PV2), CV-A6 và CV-A16 liên quan đến 21% ca bệnh nặng [5]

Một nghiên cứu về bệnh TCM tại khu vực phía Nam giai đoạn 2011-2014 cho thấy một tỉ lệ không nhỏ (15%-20%) các ca TCM có độ lâm sàng IIb trở lên liên quan đến nhiễm CV-A6, CV-A16 và các VRĐR khác ngoài EV-A71 (non-EV-A71 EV serotype [58]

Một nghiên cứu công bố gần đây nhất, cũng thực hiện với bệnh nhân TCM nhập viện ở miền nam Việt Nam giai đoạn 2011-2015, của nhóm nghiên cứu thuộc Đại học Oxford - Hồ Chí Minh và bệnh viện các bệnh truyền nhiễm -

Hồ Chí Minh, nhấn mạnh CV-A6 là tác nhân gây bệnh TCM nổi trội tại miền Nam giai đoạn này, các virus thuộc lineage E2 (hay cluster A) Đây là nghiên cứu về đặc điểm di truyền của CV-A6 đầu tiên và duy nhất tính đến thời điểm hiện tại ở Việt Nam [55]

Như vậy, tại Việt Nam, CV-A16 và CV-A6 đóng vai trò quan trọng gây bệnh/dịch bệnh TCM tại Việt Nam Nhưng so với các nghiên cứu về EV-A71 [29, 59-63], các nghiên cứu bài bản về đặc điểm bệnh học, dịch tễ học phân tử, di truyền tiến hóa của các virus CV-A16 và CV-A6 lưu hành gây bệnh TCM tại Việt Nam, đặc biệt là khu vực phía Bắc vẫn còn rất hạn chế, gần như chỉ giới hạn trong một số ít nghiên cứu mô tả về tỷ lệ lưu hành của các kiểu VRĐR theo năm như đã đề cập ở trên

22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các ca bệnh được chẩn đoán mắc bệnh tay chân miệng theo định nghĩa ca bệnh, hướng dẫn của Bộ Y tế, được thu thập tại 28 tỉnh thành phía Bắc Việt Nam

2.2 Th ời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian thu thập mẫu nghiên cứu: 1/2017 – 12/2018

- Địa điểm thực hiện xét nghiệm: PTN vi rút đường ruột – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương

2.3 V ật liệu

- Phi ếu điều tra các ca bệnh mắc bệnh tay chân miệng: 719 phiếu điều

tra dịch tễ học ca bệnh của các bệnh nhân nghi nhiễm TCM năm 2017-2018

- M ẫu bệnh phẩm lâm sàng: mẫu bệnh phẩm của 719 ca nghi mắc bệnh

TCM đã được thu thập và gửi đến PTN VRĐR Một số ca sẽ có từ 2 mẫu bệnh phẩm trở lên Số lượng các mẫu bệnh được thể hiện trong bảng dưới đây

Bảng 2.1 Bảng thu thập các loại mẫu TCM năm 2017-2018

- Mẫu bệnh phẩm giải trình tự vùng VP1: trong nghiên cứu này, chúng

tôi lựa chọn được 56 mẫu CV-A6 và 21 mẫu cho CV-A16

- Kít ch ẩn đoán vi rút:

+ Kit tách chiết RNA: Qiagen viral RNA mini Kit (Catalog 52906);

+ GoScript RT system (100), (Promega,Catalog A5001);

+ GoTaq® Green Master Mix (Promega, 201443)

- Sinh phẩm giải trình tự gen:

+ Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR-Sequencing: Kit PCR Purification: QiaGen – Cat No 28104;

23

+ Sinh phẩm PCR – sequencing: BigDye® Terminator v3.1, ABI, 4336917;

+ Sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide: Kit Dye

Ex 2.0 Spin, QiaGen – Cat No 63204;

+ Hidi Formamide, ABI, 4311320;

+ Sinh phẩm dùng cho máy Sequencer ABI 3100:

POP 7 (7 ml), ABI, 4352759;

Buffer 10X with EDTA (25ml), ABI, 402824

- Sinh ph ẩm điện di:

AGAROSE 500G, Promega, V3125;

TBE x 10 (1L), Promega, V4251;

SYBR ADN GEL STAIN 10,000x, Invitrogen;

ADN LADER 100 (300 ul), Promega, G8291

- B ộ mồi sử dụng trong phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện CV-A6 và CV-A16:

2 CV-A6_3194R TTA ATT CTC ATR TAC ACY CG

3 CV-A16_2895F AGT AYA TGT ATG TCC CRC

210bp [64]

4 CV-A16_3105R TAA TCY AGG TCA YTT GCT TG

- Bộ mồi sử dụng để giải trình tự vùng VP1:

1 CV-A6_2351F AYA TYA TAG CTC TTG GAG CRG C

CV-A6

2 CV-A6_3050R GGR TAR CCA TCA TAA AAC CA

3 CV-A6_2825F ART TCA CYT TYG TRT CCA

4 CV-A6_3401R CAC TCT RAA GTT ACC YAC ATA GAT

5 CV-A16_2302F ATG GTA YCA AAC YAA CTA TG

CV-A16

6 CV-A16_3105R TAA TCY AGG TCA YTT GCT TG

7 CV-A16_2895F AGT AYA TGT ATG TCC CRC G

8 CV-A16_3462R GAR GAR ACT AAC ARG TCY CT

Chú ý: nucleotide ambiguity codes Y = C/T, R=A/G

(Bộ mồi được nhóm nghiên cứu thuộc PTN VRĐR- Viện VSDTTW kết hợp với Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) thiết kế và đánh giá)

24

- Hệ thống máy PCR

- Máy Sequencer ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ)

- Tủ an toàn sinh học, máy ly tâm siêu tốc, tủ lạnh và tủ âm sâu

- Một số vật tư và trang thiết bị khác sử dụng cho kỹ thuật sinh học phân tử

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Hồi cứu kết hợp phân tích

2.4.2 Quy trình nghiên cứu

Phân tích các yếu tố dịch tễ học bệnh TCM từ các phiếu điều tra dịch tễ ca bệnh: 719 phiếu điều tra của các trường hợp nghi mắc bệnh TCM tại miền Bắc Việt Nam giai đoạn 2017-2018 Thông tin về ca bệnh được ghi nhận qua trung tâm kiểm soát bệnh truyền nhiễm Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương và các phiếu điều tra lưu trữ tại PTN VRĐR – viện vệ sinh dịch tễ Trung ương theo mẫu của

Bộ Y tế

719 trường hợp được chẩn đoán lâm sàng mắc bệnh TCM tại miền Bắc năm 2017-2018 được lấy mẫu bệnh phẩm theo quyết định số 581/QĐ-BYT ngày 24/2/2012 Mẫu được lấy bởi hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm và được vận chuyển tới phòng thí nghiệm VRĐR tiến hành xét nghiệm chẩn đoán tác nhân gây bệnh

Để xác định được đặc điểm kiểu gen VP1 của CV-A6 và CV-A16 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, một số mẫu dương tính CV-A6, CV-A16 được lựa chọn ngẫu nhiên có hệ thống, đảm bảo đại diện về thời gian (tháng khởi phát bệnh hoặc tháng thu thập mẫu) và không gian (tỉnh thu thập mẫu), để khuếch đại vùng gen VP1 bằng phương pháp PCR Kết quả, có 56 mẫu CV-A6 và 21 mẫu CV-A16 đáp ứng đủ điều kiện về nồng độ ADN và độ đặc hiệu (thể hiện ở độ sáng,

rõ của băng điện di, không có băng phụ) cho giải trình tự gen Kết quả giải trình

tự sau đó được so sánh với các chủng EV đại diện (chủng lưu hành ở Việt Nam

và trên thế giới đã được công bố trong ngân hàng gen thế giới)

25

Hình 2 1 Sơ đồ nghiên cứu

26

2.4.3 Các chỉ số nghiên cứu

miệng tại miền Bắc Việt Nam

- Phân bố bệnh nhân về: tuổi, khu vực, thời gian xuất hiện bệnh trong năm

- Tỷ lệ bệnh nhân theo phân độ lâm sàng

- Phân bố các trường hợp xác định bệnh tay chân miệng theo tác nhân gây bệnh

- Mối liên quan giữa tác nhân gây bệnh và độ lâm sàng

2.4.3.2 Xác định tác nhân gây bệnh từ mẫu lâm sàng:

Các tác nhân vi rút đường ruột chung, EV-71, A6, A16 và

CV-A10

2.4.3.3 Phân tích vùng gen VP1 của CV-A6, CV-A16:

Cây phát sinh loài, sự tương đồng hay khác biệt về trình tự nucleotide, sự

biến đổi về amino acid trên VP1…

sung 10ml dung dịch PBS 1X, 5-10 hạt thuỷ tinh, 1ml chloroform Vặn chặt nắp ống, dán parafilm kín nắp ống

Lắc ống bằng máy lắc (800 vòng/phút) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 4000 vòng/phút trong 20 phút ở 4oC Hút 1ml dịch nổi chia vào ống tube 1,5

ml và bảo quản ở -70oC

bảo quản trong ống môi trường VTM Lắc ống bằng máy lắc (800 vòng/phút) trong 20 phút ở nhiệt độ phòng Chia 1ml dịch vào ống tube 1,5 ml và bảo quản ở -70 oC

2.4.4.2 Tách chiết ARN vi rút

Sử dụng sinh phẩm Quiagen virak ARN mini kit, catalog 52906, gồm các bước:

- Cho 560 µl AVL có chứa 5,6µl carrier ARN vào ống có thể tích 1,5 ml

- Cho 140 µl mẫu vào ống đã có chứa hỗn hợp AVL và carrier ARN, trộn đều

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút

- Thêm 560 μl cồn (96–100%) vào hỗn hợp trên, trộn đều

- Chuyển hỗn hợp lên cột lọc, ly tâm 8000v/1 phút, chuyển cột sang ống hứng

* Đọc kết quả: (với các mẫu chứng âm, dương, IC đạt)

- Dương tính EV/EV-A71 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 37,5 [65, 66];

- Dương tính CV-A6 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 35 [67];

- Dương tính CV-A16 khi tín hiệu vượt ngưỡng có Ct < 38 [68]

* mỗi phản ứng cho CV-A6, CV-A16 cho loại mồi tương ứng

- Sự xuất hiện các sản phẩm PCR ở các vị trí không đặc hiệu hoặc không có

sự hiện diện của sản phẩm PCR cho kết quả âm tính

- Sản phẩm PCR đặc hiệu: CV-A6: 1050bp; CV-A16: 1160bp

2.4.5.2 Giải trình tự nucleotide

Nguyên tắc của phản ứng dựa trên nguyên tắc của phương pháp Sanger có

sử dụng các dideoxynucleotide Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một chất huỳnh quang có màu khác nhau Sự xuất hiện của các dideoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí cacbon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp ADN bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng ADN sợi đơn) tạo ra những đoạn ADN có độ dài khác nhau Những đoạn ADN này được điện di qua mao quản từ nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser

Bước 1 Tinh sạch sản phẩm PCR:

Kit tinh sạch (Qiagen Purification kit Qiaquick 250 Cat.No 28104; Chú ý: Thêm cồn tuyệt đối (96-100%) vào đệm PE trước khi sử dụng)

- Trộn 5 thể tích đệm PB vào 1 thể tích sản phẩm PCR đã có (vd: 500 µl đệm PB và 100 µl sản phẩm PCR) Đặt cột Qiaquick vào tube thu 2ml

- Dùng pipet cho sản phẩm đã trộn vào cột Qiaquick, ly tâm 13.000vòng/30-60giây

- Loại bỏ nước ở tube thu, đặt lại cột Qiaquick vào tube

- Chuyển cột Qiaquick sang tube sạch 1.5ml

- Cho 30ul đệm EB hoặc nước tinh sạch vào chính giữa màng lọc của cột Qiaquick để tách lấy ADN, ủ tại nhiệt độ phòng trong 1 phút, ly tâm 13.000 vòng/60giây ADN tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC

Bước 2 Tổng hợp sản phẩm PCR để giải trình tự gen (phản ứng cycle sequencing)

Phản ứng PCR giải trình tự được thực hiện với bộ sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) Big Dye Terminator pha loãng theo tỷ lệ 1:3 với dung dịch đệm Big Dye buffer Các đoạn mồi xuôi

và ngược được pha loãng từ nồng độ 10 µM xuống nống độ 3,2 µM

Thành phần của phản ứng PCR cho kỹ thuật sequencing

Thành ph ần của phản ứng Th ể tích cho một mồi

Big Dye Terminator (1:3) 2 µl

5x Sequencing Buffer 1 µl

** mỗi phản ứng cho CV-A6, CV-A16 cho loại mồi tương ứng

Sinh phẩm được trộn trong từng tube 0.2ul riêng biệt, đánh mã số, vortex đều sau đó ly tâm nhẹ trước khi cho vào máy

Chu trình nhiệt phản ứng PCR giải trình tự:

30

M ục đích: loại bỏ các Bigdye terminators còn dư và các thành phần dư

khác trong dung dịch đệm (buffers) trước khi tiến hành điện di mao quản nhằm thu được tín hiệu tốt hơn trên máy giải trình tự tự động

Phương pháp: Sản phẩm PCR giải trình tự gen được tinh sạch bằng bộ

kít Dye Ex 2.0 Spin để loại bỏ các thành phần thừa như sau:

- Ly tâm cột Dye Ex ở 3000 vòng/phút trong 3 phút

- Chuyển cột sang eppendoft 1.5ml

- Ghi tên mẫu Nhỏ mẫu lên gel bed

- Ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 3 phút Loại bỏ cột

- Thu mẫu: dung dịch thu được sau khi ly tâm cột

- Thực hiện điện di trên máy giải trình tự ABI 3100-AvantTM Genetic Analyser (Applied Biosystem, Mỹ) với gel POP-7

Chuyển toàn bộ dung dịch sản phẩm ADN của phản ứng PCR giải trình tự gen vào từng giếng tương ứng trên đĩa chạy mẫu (sample plate)

Đặt đĩa vào máy giải trình tự ABI 3100

Khởi động phần mềm ABI PRISM® Gene Scan® Analysis phiên bản 3.7

Hiệu chỉnh các thông số theo phần mềm trên và cài đặt các thông số cho phân tích kết quả giải trình tự Chọn chương trình phân tích giải trình tự ADN với gel POP-7 cho độ chính xác 98.5% đoạn ADN có độ dài khoảng 650 bp Máy giải trình tự gen có 4 mao quản với mỗi mao quản có độ dài là 50cm, mỗi lần chạy đọc được 4 giếng theo chiều dọc của đĩa từ A đến H và mất 2 giờ 30 phút cho mỗi lần chạy Trình tự nucleotide được phân tích theo các thông số của phần mềm đi kèm theo máy

Bước 5 Thu nhận và xử lý các chuỗi trình tự

Sử dụng các phần mềm tin-sinh học trong nghiên cứu, bao gồm các chương trình Larsergene ADN Star - Seqman; Larsergene ADN Star - MeAlign

và Mega 7.0 để thu nhận, xử lý, phân tích các chuỗi nucleotide, acid amin của chủng thu được và so sánh trình tự nucleotide, acid amin với chủng chuẩn, xây dựng cây phát sinh loài

Ghép các trình tự xác định bởi các mồi khác nhau thành một trình tự hợp nhất và đọc trình tự bằng phần mềm Larsergene ADN Star – Seqman

Bước 6 Phân tích di truyền gen VP1