Nghiên cứu triển khai phương pháp pcr phát hiện enterobacter sakazakii trong sữa công thức và các sản phẩm dinh dưỡng dành cho trẻ dưới 12 tháng tuổi

DANH MỤC CÁC BẢNGBảng 3.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi trên chủng chứng dương và các chủng chứng âm 43 Bảng 3.2 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp PCR so v

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DƯỚI 12 THÁNG TUỔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG

TP Hồ Chí Minh – Năm 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

DƯỚI 12 THÁNG TUỔI

Chuyên ngành: Y tế Công cộng

Mã số : 60720301

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y TẾ CÔNG CỘNG

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Đặng Văn Chính

TP Hồ Chí Minh – Năm 2017

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan số liệu trong luận văn này là được ghi nhận, nhập liệu vàphân tích một cách trung thực Luận văn này không có bất kì số liệu, văn bản,tài liệu đã được Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh hay trường đại học khácchấp nhận để cấp văn bằng đại học, sau đại học Luận văn cũng không có sốliệu, văn bản, tài liệu đã được công bố trừ khi đã được công khai thừa nhận

Học viên

Đặng Thùy Linh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

DÀN Ý NGHIÊN CỨU 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Y VĂN 5

1.1 Sơ lược về Enterobacter sakazakii 5

1.1.1 Lịch sử phát hiện 5

1.1.2.1 Đặc điểm chung 6

1.1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học 7

1.1.3 Cơ chế gây bệnh 7

1.2 Tình hình nhiễm E sakazakii 8

1.2.1 Thế giới 8

1.2.2 Việt Nam 10

1.3 Phương pháp phát hiện E sakazakii trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi 10

1.3.1 Phương pháp nuôi cấy 10

1.3.2 Phương pháp phát hiện nhanh E.sakazakii 10

1.4 Sơ lược về phương pháp PCR 16

1.4.1 PCR là gì? 16

1.4.2 Nguyên tắc của phương pháp PCR 16

1.4.3 Vai trò của mồi (primer) 17

1.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 18

1.4.5 Các nguyên tắc ứng dụng phương pháp PCR để xét nghiệm vi sinh trong thực phẩm 19

1.4.6 Một số ứng dụng của PCR trong y học 20

1.5 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp 23

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Thiết kế nghiên cứu 25

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 25

2.2.1 Thời gian 25

2.2.2 Địa điểm 25

2.3 Đối tượng nghiên cứu 25

2.3.1 Số lượng mẫu dùng để khảo sát các thông số theo ISO 16140: 2003 và NordVal 2009 26

2.3.2 Phương pháp chọn mẫu 26

2.3.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu 27

2.4 Phương pháp phát hiện E sakazakii bằng kỹ thuật nuôi cấy 27

2.4.1.Nguyên tắc 27

2.4.2 Tiến hành thử nghiệm 27

2.4.2.1 Chuẩn bị mẫu thử 28

2.4.2.2 Tiền tăng sinh 28

2.4.2.3 Tăng sinh chọn lọc 28

2.4.2.4 Phân lập E sakazakii giả định 28

2.4.2.5 Ðịnh danh 29

2.4.2.6 Xác định tính chất sinh vật hoá học 31

2.4.2.7 Diễn giải kết quả những thử nghiệm định danh 33

2.5 Phương pháp PCR phát hiện E sakazakii 34

2.5.1 Hóa chất 34

2.5.2 Thiết bị 35

2.5.3 Cách tiến hành 37

2.5.3.1 Tách chiết DNA vi khuẩn bằng phương pháp đun sôi 37

2.5.3.2 Phản ứng nhân bản gen bằng PCR 37

2.5.4 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR 38

2.5.4.1 So sánh phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 38

2.5.4.2 Khảo sát LOD50 38

2.6 Phương pháp xử lý và phân tích số liệu 42

2.7 Cách hạn chế sai số 42

2.8 Y Đức 42

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43

3.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi và các thông số phản ứng PCR 43

3.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp 44

3.3 Xác định giá trị của phương pháp PCR phát hiện E sakazakii và so sánh với phương pháp nuôi cấy truyền thống (ISO 16140: 2003) 45

3.3.1 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện 50 (LOD50) của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống 45

3.3.2 Kết quả khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 50

3.4 Khảo sát xác định thời gian tăng sinh tối thiểu cần thiết cho việc phát hiện vi khuẩn E sakazakii 59

3.5 Áp dụng phương pháp PCR để phát hiện E sakazakii trong một số sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi bán tại thành phố Hồ Chí Minh 60

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 64

4.1 Kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi 65

4.2 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi 66

4.3 Xác định giá trị của phương pháp PCR phát hiện E sakazakii và so sánh với phương pháp nuôi cấy truyền thống (ISO 16140: 2003) 66

4.3.1 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện 50 (LOD50) của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống 66

4.3.2 Kết quả khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy 66

KẾT LUẬN 69

ĐỀ XUẤT 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO i

PHỤ LỤC I: TÓM TẮT SƠ ĐỒ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY TRUYỀNTHỐNG viiPHỤ LỤC II: TÓM TẮT SƠ ĐỒ PHƯƠNG PHÁP PCR viiiPHỤ LỤC III: MÔI TRƯỜNG THUỐC THỬ ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADH Arginine DeHydrogenase Môi trường canh thang

L-Arginine dehydrolaseATTC American type culture colection Bộ chủng chuẩn nuôi cấy từ

MỹAUC Area under the curve Diện tích dưới đường cong

AC Accuracy Độ chính xác

BHI Brain Heart Infusion broth Môi trường canh thang

BPW Buffered peptone water Môi trường canh thang

FISH Fluorescence in situ hybridization Lai tạo huỳnh quang tại chỗ

FN False negatives Tỷ lệ âm tính giả

FP False positives Tỷ lệ dương tính giả

HIV Human Immunodeficiency Virus Vi rút gây suy giảm miễn

dịch ở ngườiISO International Organization For

Standardization

Tổ chức tiêu chuẩn hoá QuốcTế

Tiếng Anh Tiếng Việt

KL Khuẩn lạc

LDC Lysine Decarboxylase Môi trường canh thang

L-Lysine decarboxylaseLOD Limits Of Detection Giới hạn phát hiện

ODC Ornithine Decarboxylase Môi trường canh thang

L-Ornithine decarboxylase

ompA Outer membrane protein A Protein màng ngoài tế bào vi

khuẩnPCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng khuếch đại genPNA Peptide nucleic acid

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

ROC Receiver Operating Characteristic

TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam

TSA Tryptone Soya Agar Môi trường thạch tryptone từ

đậu nànhWHO World Health Organization Tổ Chức Y Tế Thế Giới

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của cặp mồi trên chủng

chứng dương và các chủng chứng âm

43

Bảng 3.2 Kết quả xác định giới hạn phát hiện của phương pháp

PCR so với phương pháp nuôi cấy trong phát hiện

E sakazakii

46

Bảng 3.3 Kết quả phân tích mẫu bằng 2 phương pháp PCR và

nuôi cấy phát hiện E sakazakii

51

Bảng 3.4 Tổng hợp kết quả so sánh thử nghiệm của phương

pháp nuôi cấy so với phương pháp PCR để phát hiện

E sakazakii trên mẫu

56

Bảng 3.5 Kết quả phát hiện E sakazakii bằng kỹ thuật PCR

theo thời gian nuôi cấy trên mẫu sản phẩm dinhdưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi

59

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát 20 mẫu sữa công thức dạng bột cho

trẻ dưới 12 tháng tuổi

61

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Vi khuẩn E sakazakii trực khuẩn gram âm 7

Hình 1.3 Môi trường DFI vi khuẩn E sakazakii màu xanh 11

Hình 1.4 Phát hiện C sakazakii 274 phát huỳnh quang 13

Hình 1.5 Hình tế bào C sakazakii trên kính hiển vi điện tử 15

Hình 2.1 Khuẩn lạc E sakazakii trên môi trường ESIA 29

Hình 2.2 Khuẩn lạc E sakazakii trên môi trường TSA 30

Hình 2.3 Vi khuẩn E sakazakii thử nghiệm oxidase âm tính 31

Hình 2.4 Thử nghiệm các tính chất sinh vật hóa học của

E sakazakii

34

Hình 3.1 Hình điện di kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi với

chủng chứng dương và các chủng chứng âm

44

Hình 3.2 Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ bắt cặp của mồi 45

Hình 3.3 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 1.1 đến 1.10 47

Hình 3.4 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 2.1 đến 2.10 47

Hình 3.5 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 3.1 đến 3.10 48

Hình Nội dung Trang Hình 3.6 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 4.1 đến 4.10 48

Hình 3.7 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 5.1 đến 5.10 49

Hình 3.8 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 6.1 đến 6.10 49

Hình 3.9 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 1 đến 10 53

Hình 3.10 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 11 đến 20 53

Hình 3.11 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 21 đến 30 54

Hình 3.12 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 31 đến 40 54

Hình 3.13 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 41 đến 50 55

Hình 3.14 Kết quả điện di 10 mẫu từ mẫu 51 đến 60 55

Hình 3.15 Đường cong ROC và diện tích dưới đường cong 58

Hình 3.16 Hình điện di khảo sát thời gian tăng sinh phát hiện

ĐẶT VẤN ĐỀ

Enterobacter sakazakii là vi khuẩn Gram âm, sống kỵ khí tùy nghi và thường

gây bệnh cơ hội Đặc biệt, vi khuẩn này có liên quan đến nhiễm trùng ở trẻ sơ

sinh và trẻ em như: viêm ruột hoại tử và viêm màng não [38] Ngoài ra, E.

sakazakii còn gây ra nhiễm trùng cơ hội có thể nguy hiểm cho những người

suy giảm miễn dịch, chẳng hạn như những người mắc một căn bệnh tiềm ẩn

nghiêm trọng [39] Mặc dù, tỷ lệ mắc các bệnh nhiễm trùng do E sakazakii ở

trẻ sơ sinh thấp 14% [39], nhưng tỷ lệ tử vong lại cao (40% - 80%) và nhữngtrẻ bị nhiễm bệnh đã qua khỏi thường bị biến chứng thần kinh nặng [40]

E sakazakii đã được phân lập không chỉ từ thực phẩm có độ ẩm thấp như sữa

bột trẻ sơ sinh, bột sữa, bột và thực phẩm ăn dặm [16] mà còn từ rau quảtươi, sò đông lạnh, và các sản phẩm thực phẩm khác và thức ăn chế biến sẵn,

thực phẩm khô, gia vị, trứng và thịt [26] Tuy nhiên, các vụ dịch do E.

sakazakii gây ra đã được báo cáo ở châu Âu và Mỹ thường liên quan đến sữa

công thức cho trẻ [7, 59]

Sữa và sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột là nguồn dinh dưỡng thiếtyếu cho trẻ để cung cấp dưỡng chất cũng như tăng cường sự phát triển của trẻ.Sữa không an toàn có thể gây ngộ độc hoặc nhiễm bệnh cho trẻ do có thểchứa các độc tố vi sinh vật, độc tố hóa học hoặc chứa các vi sinh vật gâybệnh, cho nên việc sử dụng sữa an toàn đang là vấn đề cần được quan tâmhàng đầu đối với trẻ

Để đảm bảo an toàn và giảm nguy cơ gây bệnh cho trẻ đến 12 tháng tuổi khi

sử dụng sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột, quy chuẩn kỹ thuật quốc

gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm (QCVN 8-3:2012/BYT) quy định vi khuẩn E sakazakii không cho phép có mặt trong 10g sản phẩm [1].

Hiện nay, số liệu về tình hình nhiễm E sakazakii trong các mẫu thực phẩm

nói chung và mẫu sữa bột nói riêng tại nước ta vẫn chưa có những công bốchính thức Tuy nhiên, nhu cầu sử dụng sữa và sản phẩm dinh dưỡng công

thức dạng bột cho trẻ em là rất lớn Vì thế, việc kiểm soát E sakazaki trong

các sản phẩm này là một yêu cầu cần thiết

Hiện nay, phương pháp nuôi cấy truyền thống theo TCVN 7850:2008(ISO/TS 22964:2006) đang được các phòng thí nghiệm sử dụng cho việc phát

hiện vi khuẩn E sakazakii trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột

cho trẻ đến 12 tháng tuổi Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này thờigian xét nghiệm chậm (5 -7 ngày) Việc áp dụng phương pháp sinh học phân

tử như Polymerase Chain Reaction (PCR) nhằm rút ngắn thời gian xét nghiệm

vi khuẩn E sakazakii, phương pháp này được thực hiện ngay sau giai đoạn

tiền tăng sinh mẫu Một số nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện phương pháp

này [49] Tuy nhiên, việc áp dụng phương pháp PCR cho phát hiện E.

sakazakii nhằm đáp ứng kịp thời khi cần giám sát số lượng mẫu lớn hoặc ngộ

độc do vi khuẩn này gây ra vẫn chưa được áp dụng rộng rãi tại Việt Nam Do

đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu triển khai phư ng ph p PCR

ph t hiện Enterobacter sakazakii trong sản phẩm dinh dưỡng công thức

dạng bột dành cho trẻ đến 12 th ng tuổi”.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu tổng qu t

Nghiên cứu triển khai phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn E sakazakii

trong sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi

Mục tiêu cụ thể

1 Nghiên cứu triển khai phương pháp PCR phát hiện E sakazakii: kiểm tra

tính đặc hiệu của mồi và các thông số phản ứng PCR

2 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp PCR: giới hạn phát hiện 50(LOD50), độ chính xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âmtính giả So sánh phương pháp PCR với phương pháp nuôi cấy truyền thống

3 Khảo sát thời gian nuôi cấy tăng sinh thích hợp cho phát hiện E sakazakii.

Áp dụng phương pháp PCR để phát hiện E sakazakii trong một số sản phẩm

dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi bán tại thành phố HồChí Minh

Nhiệt độ bắt cặp

phương pháp PCR

Xác định giá trị sử dụng phương pháp PCR

LOD50

So sánh với phương pháp nuôi cấy

Độ nhạy (Se)

Độ đặc

(FP)

Âm giả (FN)

Chính xác (AC)

Khảo sát chọn thời gian tăng sinh

Áp dụng phương pháp PCR kiểm tra mẫu sữa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Y VĂN

1.1 S lược về Enterobacter sakazakii

1.1.1 Lịch sử ph t hiện

E.sakazakii đã được gọi là Enterobacter cloacae sinh ―sắc tố màu vàng‖ Đến

năm 1980, vi khuẩn này đã được đổi tên là E sakazakii [18].

Năm 1958 tại bệnh viện Osterhills của nước Anh ghi nhận hai trường hợp

viêm màng não đầu tiên ở trẻ sơ sinh do vi khuẩn E sakazakii [60] Năm

1965 vi khuẩn E sakazakii gây viêm màng não xuất hiện tại Bệnh viện

Odense Đan Mạch Năm 1987, Muytjens và cộng sự [48] nghiên cứu tỷ lệnhiễm 35 sản phẩm sữa công thức dạng bột khác nhau, tác giả đã tìm thấy vi

khuẩn E sakazakii và Enterobacteriaceae trong mẫu sữa được sản xuất từ 13

Quốc gia khác nhau Nghiên cứu này đã đánh dấu về mối liên quan giữa vi

khuẩn E sakazakii và sữa công thức dạng bột cho trẻ sơ sinh Vào năm 2001,

một thảm cảnh đã diễn ra tại khu chăm sóc đặc biệt cho trẻ sơ sinh ở bangTennessee (Mỹ), hàng chục bé đã bị viêm màng não Nguyên nhân được phát

hiện do một lô sữa bột dành cho trẻ bị nhiễm vi khuẩn E sakazakii [14].

Từ năm 2007 E sakazakii được gọi với tên mới Cronobacter sakazakii [51].

Một nghiên cứu phân tích về lai ADN-ADN và kiểu hình, kiểu gen đã xếp vi

khuẩn này vào chi mới Cronobacter [27, 30] Cho đến nay, chi này có 10 loài khác nhau: C sakazakii, C malonaticus, C turicensis, C muytjensii, C.

dublinesis, C condiment, C universalis, C pulveris, C helveticus, C zurichensis Ba trong số 10 loài trên C sakazakii, C malonaticus và C.turicensis có liên quan đến nhiễm trùng sơ sinh [15, 33].

1.1.2 Đặc điểm

1.1.2.1 Đặc điểm chung

E sakazakii thuộc họ Enterobacteriaceae là trực khuẩn hình que, gram âm, có

kích thước chiều dài là 3 micromet và chiều rộng là 1 micromet, kỵ khí tùynghi, không có sự hình thành bào tử, có sắc tố vàng, chịu được áp suất thẩm

thấu cao, di động E sakazakii thuộc loại vi khuẩn ưa nhiệt ôn hòa, có thể

phát triển ở nhiệt độ 6-45o

C, nhiệt độ phát triển tối ưu là 37- 430C [28]

Vi khuẩn E sakazakii có thể tồn tại lâu dài trong sản phẩm công thức dạng

bột sau 2,5 năm [53]

Hình 1.1 Vi khuẩn E sakazakii

(nguồn: Đánh giá mối nguy về vi sinh vật số 6 của WHO/FAO năm 2004)

Hình 1.2 Vi khuẩn E sakazakii trực khuẩn gram âm

1.1.2.2 Đặc điểm sinh vật hóa học

Vi khuẩn E sakazakii tạo sắc tố màu vàng trên môi trường thạch tryptone

soya ở 250C, không có men oxidase, L-Lysine decarboxylase (-), L-Ornithinedecarboxylase và L-Arginine dihydrolase (+) sinh acid từ lên men các loạiđường như: L-rhamnose, D-sucrose, D-melibiose, amygdaline, không lên menđường D-sorbitol

1.1.3 C chế gây bệnh

Vi khuẩn E sakazakii gây bệnh cơ hội xâm lấn như: nhiễm khuẩn huyết, viêm

màng não và viêm ruột hoại tử ở trẻ sơ sinh, trẻ sinh non, thiếu cân, trẻ suygiảm miễn dịch, trẻ có mẹ dương tính với HIV Nhiễm trùng bệnh viện do

E sakazakii gây ra nặng nhất là viêm màng não, chiếm gần 50% các bệnh

nhiễm trùng bệnh viện, đặc biệt ở các đơn vị chăm sóc đặc biệt của khoa nhi.Nguyên nhân chủ yếu do những trẻ này được truyền bằng sữa công thức Cáctriệu chứng trong giai đoạn tiến triển của viêm màng não: viêm võng mạc, áp

xe não, hình thành u nang, chứng tràn dịch màng phổi, thần kinh chậm phát

triển và nhồi máu Bệnh nhân hồi phục để lại di chứng chậm phát triển về thểchất và tinh thần [17].

E sakazakii có thể sinh ra các bao nang, nhờ đó có thể tấn công vào cơ thể tế

bào vật chủ mà vẫn tránh được hiện tượng đại thực bào trong ruột Hơn thế

nữa, bao nang này giúp bảo vệ E sakazakii, tạo điều kiện thuận lợi cho nó tồn

tại trong môi trường khô Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ (nhất là đối với trẻ

sơ sinh) vi khuẩn sẽ gắn vào bề mặt màng plastics và lớp silicon, và cứ như

thế phát triển tạo lớp màng biofilm bao bọc E sakazakii có lớp protein ngoài màng của tế bào được mã hóa bằng gen (ompA) khi vi khuẩn này xâm nhập

vào ruột qua niệm mạc ruột vào máu gắn với đại thực bào của vật chủ đi quahàng rào máu não, gây tổn thương nghiêm trọng ở não người [45, 59] Thời

kỳ ủ bệnh của vi khuẩn E sakazakii gây viêm não ở trẻ sơ sinh thường 3-4 ngày, các dấu hiệu và triệu chứng của giai đoạn đầu nhiễm vi khuẩn E.

sakazakii như: biếng ăn, khó chịu, vàng da, thân nhiệt không ổn định [11].

1.2 Tình hình nhiễm E sakazakii

1.2.1 Thế giới

Ủy ban Quốc tế về Vi sinh vật định nghĩa vi khuẩn E sakazakii "Nguy hiểm

nghiêm trọng cho một nhóm dân số, với các di chứng lâu dài, có khả năng tạothành một mối đe dọa cho cuộc sống" [24] Do mức độ nghiêm trọng và bệnh

lý liên quan đến E sakazakii nên đã đưa E sakazakii vào danh sách của các

vi khuẩn gây bệnh phổ biến nhất như Listeria monocytogenes, Clostridium

botulinum và Cryptosporidium parvum [29] Trẻ sơ sinh và những trẻ sinh

non được chăm sóc đặc biệt và cho ăn bằng sữa công thức dạng bột là nhóm

dân số bị ảnh hưởng nhiều nhất Năm 2002 cơ quan Thực phẩm và Dược

phẩm Mỹ (FDA) đã có thông báo liên quan đến nhiễm khuẩn E sakazakii ở

trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa bột dinh dưỡng, nghiên cứu này xác định 5/22

(22,7%) mẫu sữa thành phẩm bị nhiễm E sakazakii và 2/69 mẫu nguyên liệu thô nhiễm E sakazakii [19] Một cuộc khảo sát và kiểm tra sữa bột trẻ sơ

sinh được thực hiện ở một số quốc gia khác nhau đã cho thấy 14% mẫu sữa bị

nhiễm E sakazakii và 20 mẫu đã được thu hồi trên tổng số141 mẫu [48].

Tổng Cục Kiểm tra Chất lượng và Kiểm dịch Trung Quốc đã công bố danhsách 852 loại thực phẩm, đồ uống và mỹ phẩm bị cấm bán ra thị trường do có

chứa vi khuẩn E sakazakii trong đó có cả rượu, thịt cá đông lạnh, nước và

bánh quy của Mỹ, Nhật, Tây Ban Nha và sữa bột Đài Loan [16] Năm 2004,

tác giả Iversen C, Forsythe S đã khảo sát vi khuẩn E sakazakii trên mẫu sữa công thức và các mẫu thực phẩm khô khác Kết quả phát hiện vi khuẩn E.

sakazakii trong 2/2 mẫu sữa bột công thức, 5/49 mẫu thực phẩm khô cho trẻ

nhỏ và 3/72 mẫu bột sữa [26] Năm 2010, hai trẻ sơ sinh được phát hiện

nhiễm vi khuẩn E sakazakii ở bệnh viện Mexico [31] Năm 2016, một nghiên

cứu ở Iran khảo sát 125 mẫu sữa bột cho trẻ sơ sinh có 9 mẫu phát hiện có

nhiễm vi khuẩn E sakazakii chiếm 7,2% [32].

Ngoài ra, vi khuẩn E sakazakii còn được phân lập từ các nguồn bệnh phẩm

lâm sàng như: dịch não tủy, máu, tủy xương, đờm, nước tiểu, mô ruột thừaviêm, ruột, đường hô hấp, mắt, tai, vết thương và phân [22, 44] Nghiên cứu ở

bệnh viện Uijeongbu St Mary's Hàn Quốc [35] phân lập được bốn chủng E.

sakazakii từ 1.146 mẫu phân của bệnh nhân (2/392 mẫu phân của trẻ dưới một

tuổi và 2/31 mẫu phân của nhóm tuổi từ 61-70 tuổi) Một nghiên cứu

Friedemann trên 100 trẻ sơ sinh nhiễm Cronobacter spp từ năm 2000 đến

năm 2008 ghi nhận tỷ lệ tử vong 42% do viêm màng não ở trẻ sơ sinh [21].Baumgartner và cộng sự, năm 2009 đã thu thập hai trăm sáu mươi tám mẫu

thực phẩm ăn liền từ các cửa hàng bán lẻ, kết quả cho thấy sự hiện diện của E.

sakazakii trong 14/23 (60,9%) mẫu rau mầm và rau salad tươi, 7/26 (26,9%)

mẫu gia vị và thảo dược khô và 3/42 (7,1%) mẫu bánh kẹo [12]

Năm 2010 và 2012, một nghiên cứu về tỷ lệ nhiễm C sakazakii trong 705

mẫu thực phẩm trẻ sơ sinh và sữa trẻ sơ sinh được khảo sát ở 12 thành phố

phía Tây, Trung Quốc phát hiện có 119 mẫu (16,9%) nhiễm C sakazakii [41] Năm 2014 Mozrova' và cộng sự [46], phân lập được 20 chủng Cronobacter

spp từ 291 mẫu thực phẩm và 52 chủng đã được phân lập từ các mẫu bụi thuthập từ nhà ở, nhà hàng, quán bar và khách sạn Vào tháng 7 năm 2006, tạiBệnh viện Bacteraemia ở Ấn Độ, một trẻ sơ sinh hai tháng phát hiện nhiễm

trùng máu do vi khuẩn E sakazakii [52] Phần lớn các ca nhiễm E sakazakii

xảy ra ở các bệnh viện, ở các đơn vị chăm sóc đặc biệt cho trẻ sơ sinh Sữacông thức dạng bột sau khi pha chế trẻ chưa sử dụng hết ngay thường được để

ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài, đó cũng là yếu tố thuận lợi cho vi khuẩn

E sakazakii phát triển.

1.2.2 Việt Nam

Sữa nhiễm vi khuẩn E sakazakii hiện nay ở Việt Nam chưa có trường hợp

nào được công bố Tuy nhiên hiện nay các sản phẩm sữa bột nhập khẩu cầnđược giám sát chỉ tiêu này chặt chẽ theo quy chuẩn của Bộ Y tế (QCVN 8-3:2012/BYT)

1.3 Phư ng ph p ph t hiện E sakazakii trong sản phẩm dinh dưỡng

công thức dạng bột cho trẻ đến 12 th ng tuổi

1.3.1 Phư ng ph p nuôi cấy

Phương pháp phát hiện E sakazakii bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống

gồm có: TCVN 7850:2008 (ISO/TS 22964:2006) và phương pháp của FDA

Nguyên tắc chung của các phương pháp này được dựa trên việc E.sakazaki

được nuôi cấy môi trường tiền tăng sinh và tăng sinh chọn lọc, phân lập trênthạch chọn lọc, thực hiện các thử nghiệm sinh vật hóa học để khẳng định

1.3.2 Phư ng ph p ph t hiện nhanh E.sakazakii

Hiện nay, một số phương pháp nhanh đã được nghiên cứu, phát triển và ứng

dụng nhằm phát hiện nhanh E.sakazakii Phương pháp Pathatrix (Matrix

Microscience Ltd., Newmarket, Anh Quốc) dựa trên việc sử dụng các hạt từtính tích điện dương hút lipopolysaccharide điện tích âm trên bề mặt vi khuẩn

E.sakazakii Trong kỹ thuật này mẫu sữa bột được đồng nhất trong môi

trường Buffer pepton water (BPW) một phút, ủ ở 420

C/6h Sau đó chuyển túi

qua hệ thống vi khuẩn được giữ lại rửa và trải trên môi trường thạch DIF ủ

380C/18h Tất cả các thử nghiệm được thực hiện 3 lần Kỹ thuật này phát hiệnnhanh trong vòng 24h với mức từ 1-5 CFU/500g sữa bột [47]

Hình 1.3 Môi trường DFI vi khuẩn E sakazakii màu xanh

(nguồn: Nghiên cứu của tác giả Mullane và cộng sự)FISH là một phương pháp lai tạo huỳnh quang tại chỗ thường được sử dụng

để xác định vi khuẩn hiện diện trong mẫu Phương pháp này dựa trên sự kếthợp đầu dò axit nucleic với các vùng gen đặc biệt DNA hoặc RNA mục tiêu,rRNA của vi khuẩn được xem là gen mục tiêu thích hợp nhất cho kỹ thuậtFISH [10] giúp phân biệt các tế bào vi khuẩn có thể tồn tại Năm 2009, tác giảAlmeida C và cộng sự [9] đã ứng dụng phương pháp mới lai tạo huỳnh quangtại chỗ (FISH) dùng đầu dò axit nucleic peptide (PNA) để phát hiện vi khuẩn

Cronobacter trong sữa dạng bột cho trẻ sơ sinh FISH sử dụng đầu dò

SakPNA971 đã được chứng minh là một phương pháp nhạy để phát

hiện Cronobacter ngay cả khi nồng độ vi khuẩn mục tiêu thấp Khi sử dụng phương pháp này để kiểm tra với một số loài Enterobacteriaceae cho thấy độ

đặc hiệu và độ nhạy của phương pháp là 100% Giới hạn phát hiện

Cronobacter nhỏ hơn 1 CFU trong 10g sữa bột sau khi 8 giờ tăng sinh, ngay

cả ở một nền mẫu có chứa nhiều vi khuẩn gây nhiễm khác nhau Ngoài ra,phương pháp FISH được dựa trên việc sử dụng các đầu dò DNA

oligonucleotide thông thường cũng đã được phát triển, VIT-E sakazakii

(Vermicon AG, Munich, Đức) được phát triển dựa trên công nghệ này Tuynhiên, gần đây một chất tổng hợp DNA tương tự phát triển, axit nucleicpeptit đã cho thấy hiệu quả lai được cải thiện so với các đầu dò DNA, làm cho

quy trình FISH trở nên dễ dàng và hiệu quả hơn [58].

Hình 1.4 ph t hiện C sakazakii 274 ph t huỳnh quang bằng đầu dò

SakPNA 971 với mức nhiễm từ 1 đến 3 CFU trong 100ml sữa bột.

(nguồn: Nghiên cứu của tác giả Almeida C và cộng sự)Mỗi vi sinh vật có trình tự gen mã hóa khác nhau, các protein phản ánh sựkhác biệt về gen Hiện nay, phương pháp quang phổ khối lượng, một phươngpháp được nghiên cứu dựa trên nguyên tắc xác định protein, được áp dụng để

phát hiện vi khuẩn nhiễm trong thực phẩm như: Campylobacter, Clostridia,

Cronobacter, Salmonella và Listeria [8, 54]. Phổ khối lượng bao gồm ba đơnvị: một nguồn ion để tạo ra ion và chuyển ion đã phân tích vào giai đoạn khí,máy phân tích khối lượng để tách các ion theo tỷ lệ khối lượng để tính và mộtmáy dò để theo dõi ion [23, 37] Trong thực tế, các mẫu vi khuẩn trước tiênphải qua giai đoạn chiết xuất protein, tiếp xúc trong hỗn hợp Axit α-cyano-4-hydroxycinnamic và phân tích theo khối lượng quang phổ (Freiwald và Sauer,2009) [20] Phần lớn các protein vi khuẩn này được phát hiện từ ribosome

Hơn thế nữa, năm 2016 tác giả Shukla và cộng sự [57] áp dụng kỹ thuật phân

tích miễn dịch dựa trên hạt nano từ tính để phát hiện C.sakazakii Giới hạn

phát hiện của phương pháp ở mức 2 CFU/10g mẫu sữa sau 6h tăng sinh Quytrình thử nghiệm của kỹ thuật này gồm ba bước quan trọng: (1) nồng độ

miễn dịch và phân tách được vi khuẩn C sakazakii hiện diện trong mẫu sữa cho trẻ sơ sinh, (2) các phân tử miễn dịch phản ứng với C sakazakii đã

phân tách được gắn các phân tử nano miễn dịch từ, (3) phát tín hiệu huỳnhquang từ SRB (Sulforhodamine B) sau khi phân tách các phân tử miễndịch Trong bước đầu tiên của thử nghiệm, mẫu sữa được gây nhiễm vi

khuẩn C sakazakii và dùng các phân tử nano miễn dịch để phân tách Sau

đó vi khuẩn C sakazakii gắn với các phân tử liposomes miễn dịch, cho một

phức hợp nặng hơn Các phức hợp một lần nữa đi qua từ trường để loại bỏcác phân tử miễn dịch Đối với các phức hợp, OG (n-Octyl-β-D-glucopyranoside) được thêm như một chất tẩy để làm sạch các phân tử miễndịch, phát ra các tín hiệu huỳnh quang, được đo ở bước sóng kích thích là

550 nm và bước sóng phát xạ 585 nm, được chụp lại ở hình 1.5

Hình 1.5 Hình tế bào C sakazakii trên kính hiển vi điện tử:

(a) tế bào đơn của vi khuẩn C sakazakii; (b) phân tử nano magnetic; (c, d) tế bào C sakazakii bị kết dính với nhiều phân tử nano magnetic

(nguồn: Nghiên cứu của tác giả Shruti shukla và cộng sự)

1.4 S lược về phư ng ph p PCR.

1.4.1 PCR là gì?

PCR là thử nghiệm nhân bản một đoạn DNA trong ống nghiệm dựa vào cácchu kỳ nhiệt Thử nghiệm được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứadung dịch phản ứng (gọi là PCR mix) có thể tích vào khoảng từ 10 µl đến50µl với các thành phần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt,thường được gọi là Taq polymerase, có hoạt tính tối đa ở 720

C và bền vớinhiệt độ; (2) 4 loại desoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP và dCTP); (3)DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bản trong ống phản ứng; (4) cácđoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạn oligonucleotide có chiều dàikhoảng 20-30 nucleotide có trình tự bổ sung một cách đặc hiệu với trình tựcủa hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản; (5) ion Mg++ trong muối MgCl2 ởnồng độ thích hợp Khi ống nghiệm phản ứng này được cho vào buồng ủ theochu kỳ nhiệt của máy luân nhiệt (thermal cycler), chương trình nhiệt độ trongmáy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt của máy thay đổi theo chu kỳ,nhờ vậy mà phản ứng nhân bản DNA sẽ xảy ra [6]

1.4.2 Nguyên tắc của phư ng ph p PCR

Về mặt nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ (1)Đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 940C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro củamạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch

đơn; giai đoạn nhiệt độ này được gọi là giai đoạn biến tính, (2) kế đó nhiệt độ

sẽ được hạ đến 550

C - 650C là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắtcặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn nhiệt độ này được gọi

là giai đoạn bắt cặp, (3) Cuối cùng, nhiệt độ được đưa lên 720C là nhiệt độ

thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu

3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho

sự tổng hợp nên mạch bổ sung Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNAđích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp

lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230

đến

240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [6]

Hình 1.6 Nguyên tắc của phản ứng PCR ( nguồn: Internet)

1.4.3 Vai trò của mồi (primer)

Mồi là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 20-30 bases có trình tự bổsung với hai đầu của đoạn DNA mà người làm thí nghiệm muốn nhân bản.Mồi giữ vai trò quyết định để polymerase tổng hợp được sợi bổ sung vì để cóthể trượt được trên sợi khuôn tổng hợp sợi bổ sung, polymerase phải nhậndiện được nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp được với một nucleotide ở sợikhuôn Nếu không có mồi hay nucleotide ở đầu 3’của mồi không bắt cặpđược với một nucleotide trên sợi khuôn thì polymerase không nhận diện đượcđầu 3’ của mồi, không thể trượt được trên sợi khuôn để tổng hợp được sợi bổsung Do vậy có thể nói mồi đóng vai trò quyết định tính đặc hiệu của PCR đểnhân bản một đoạn DNA đặc hiệu nào đó.Ví dụ: Muốn chẩn đoán lao bằngPCR thì phải thiết kế cho được cặp mồi chỉ bắt cặp được một đoạn DNA đặc

hiệu chỉ có trên bộ gen DNA của vi khuẩn lao mà không có trên các vi khuẩnkhác và cả DNA từ cơ thể vật chủ [6].

1.4.4 C c yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.

DNA dùng làm khuôn: phản ứng PCR không cần DNA có độ tinh sạch cao

để làm khuôn, vẫn có thể cho kết quả với khuôn là DNA không đươc bảoquản tốt hoặc đã bị phân hủy từng phần Tuy nhiên, kết quả của phản ứng sẽtốt nhất với khuôn là DNA có độ tinh sạch cao Ngoài ra, cần hạn chế nồng độDNA dùng làm khuôn trong phản ứng, ở nồng độ cao thường dẫn đến sự nhânbản sao không chuyên biệt

DNA polymerase: enzym sử dụng trong phản ứng PCR cần có tính bền nhiệt.

Enzyme được sử dụng phổ biến hiện nay là Taq DNA polymerase có nguồn gốc từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus.

Mồi và nhiệt độ bắt cặp của mồi: mồi là yếu tố quyết định tính đặc hiệu của

phản ứng PCR Do đó, cặp mồi được thiết kế cần phải thỏa mãn các yêu cầusau:(i) Đặc trưng cho đoạn DNA cần nhân bản sao, không trùng với các trình

tự lập lại trên gen:(ii) Trình tự nucleotide bên trong mồi không cho phép có sựbắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, cũng như không có sự tự bắt cặp bêntrong bản thân mồi:(iii) Thành phần GC/AT trong mồi phải cân bằngnhau:(iv) Nhiệt độ bắt cặp (Tm) giữa 2 mồi không quá chênh lệch

Các thành phần khác:

dNTP: là hỗn hợp của dATP, dGTP, dCTP và dTTP Nồng độ dNTP được sử

dụng tùy thuộc vào điều kiện phản ứng, tuy nhiên nồng độ cao của dNTP sẽdẫn đến hiện tượng nhân bản sao không chuyên biệt

Dung dịch đệm: Dung dịch đệm là phản ứng PCR thường đi kèm với Taq

DNA polymerase, tạo sự ổn định cho hoạt động enzyme

Ion Mg 2+ : là một trong những thành phần quan trọng ảnh hưởng tới kết quả

phản ứng PCR Ở một nồng độ tối ưu, Mg2+ có ảnh hưởng tới hoạt tính củaDNA polymerase, làm tăng khả năng bắt cặp của mồi vào bản mẫu

Số lượng chu kỳ phản ứng: sau một số chu kỳ nhất định, các thành phần

trong phản ứng có thể bị phân hủy, bị cạn kiệt, các sản phẩm phụ hình thành

ức chế phản ứng và các bản sao vừa được tổng hợp ở nồng độ cao có thể tựbắt cặp với nhau: Các hiện tương này dẫn đến hệ quả là hiệu quả nhân bản sao

bị giảm ở những chu kỳ càng về sau của phản ứng PCR Thông thường, phảnứng PCR không được thực hiện quá 40 chu kỳ

Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng: để đảm bảo tính ổn định về nhiệt độ giữa

các lần khảo sát nên sử dụng cùng một loại thiết bị và dụng cụ Đồng thời, đểtránh các trương hợp ngoại nhiễm, cần sử dụng tất cả các dụng cụ mới chophản ứng PCR [4]

1.4.5 C c nguyên tắc ứng dụng phư ng ph p PCR để xét nghiệm vi sinh trong thực phẩm.

Như vậy, phản ứng PCR thực chất là một phản ứng sinh hóa cho phép nhân sốlương bản sao của một đoạn DNA hoặc gen mục tiêu lên một số lượng đủ lớn

để có thể được dùng làm nguyên liệu cho việc phân tích, thao tác DNA gen,hoặc để phát hiện sự hiện diện của DNA gen này trong tế bào, trong mẫu vật.Viêc ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện, xét nghiệm vi khuẩn gâybệnh, gây ngộ đôc thực phẩm dựa trên nguyên tắc sau đây:

Vi khuẩn cần xét nghiệm phải có một hoặc vài gen đặc trưng mà không có ở

vi sinh vật khác Gen này được chọn làm gen đại diện cho vi khuẩn cần xétnghiệm và làm gen mục tiêu để nhân bản sao bằng phương pháp PCR

Một mẫu thực phẩm bị nhiễm vi khuẩn cần xét nghiệm sẽ chứa bộ gen của vikhuẩn này, trên đó có sự hiện diện của gen đặc trưng nêu trên của vi khuẩn.Phương pháp PCR giúp phát hiện được hiện diện của gen này trong mẫu thựcphẩm, qua đó kết luận có sự hiện diện của vi khuẩn xét nghiệm trong mẫu.Thông thường, mật độ hiện diện của vi khuẩn cần xét nghiệm trong thựcphẩm là thấp Mặt khác, các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm về vi sinhvật thường không cho phép vi sinh vật hiện diện hoặc chỉ cho phép hiện diệnvới mật độ rất thấp trong một đơn vị khối lượng thực phẩm (1g hoặc 25g)

Mật độ hiện diện ban đầu của vi sinh vật cần xét nghiệm quá thấp nên quytrình xét nghiệm sự hiện diện của vi sinh vật luôn luôn cần có bước tăng sinh

để làm tăng mật độ của vi sinh vật xét nghiệm trước khi thực hiện phươngpháp PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tích bằng phương pháp điện di gelagarose và nhuộm bằng ethidium bromide Nếu có sự xuất hiện của vạchDNA có kích thước đặc trưng thì phản ứng PCR được gọi là dương tính haymẫu thực phẩm có chứa vi khuẩn cần xét nghiệm Nếu không có sự xuất hiệncủa vạch DNA có kích thước đặt trưng này hoặc chỉ có sự xuất hiện các vạchDNA có kích thước khác thì phả ứng PCR là âm tính, tức là mẫu thực phẩmkhông chứa vi khuẩn cần xét nghiệm Phương pháp PCR cho phép phát hiệnnhanh, nhạy, chuyên biệt sự hiện diện của DNA, gen mục tiêu [4]

1.4.6 Một số ứng dụng của PCR trong y học.

PCR được ứng dụng rất rộng rãi trong y học: trong chẩn đoán bệnh ung thư(tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APC trong ung thư đạitràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trong bệnh bạchcầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gen Rb-105trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu về

hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…Trong

vi sinh học, PCR là một phương tiện hữu dụng để phát hiện các tác nhân visinh vật gây bệnh trong các trường hợp: Tác nhân không thể nuôi cấy thườngquy: như các virus (viêm gan B, viêm gan C, Dengue, HIV, …), các vi khuẩn

(Chlamydia, Legionella, Mycoplasma, Treponema pallidum…).Tác nhân nuôi cấy thường quy cho kết quả chậm: Mycobacterium tuberculosis.Tác

nhân nuôi cấy thất bại vì có mặt rất ít trong bệnh phẩm, đã bị điều trị khángsinh trước đó (ví dụ: Lao thất bại nuôi cấy, viêm màng não mủ mất đầu…).Phát hiện định danh về huyết thống, dấu vân tay, định typ mô học, pháp y [3]

Hiện nay, kỹ thuật PCR còn được áp dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh

các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm như: Escherichia coli, Salmonella spp.,

Shigella spp, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Pseudomonas aeruginosa [4].

Ngoài ra, để phát hiện nhanh các vi sinh vật gây bệnh, kỹ thuật real-time PCR

đã được phát triển dựa trên trình tự 16s rRNA hoặc gen OmpA [36] Kỹ thuật

real-time PCR cũng được phát triển bằng cách sử dụng mẫu dò TaqMan và

SYBR Green để phát hiện Cronobacter spp trong dịch nuôi tăng sinh ở môi

trường mLST và BHI [43, 55] Tác giả Xian- Quan Cai và cộng sự [62] đã sửdụng kỹ thuật Real-time PCR kết hợp với độ nóng chảy cao của gen mục tiêu

(OmpA) để phát hiện nhanh Cronobacter spp bằng cách sử dụng cặp mồi:

C trong 5 phút, rồi tăng nhiệt độ từ 600Cđến 950C với nhiệt độ thay đổi sẽ làm cho độ nóng chảy của gen mục tiêuthay đổi được ghi nhận lại phân tích bằng phần mềm HRM 2.0.1 ghi nhậnđược hình ảnh

Hình 1.7 Chủng Cronobacter spp và chủng chứng âm kh c

(nguồn: Nghiên cứu của tác giả Xian – Quan Cai và cộng sự)

Nhóm tác giả đã sử dụng chủng chuẩn Cronobacter spp và chủng chứng âm

để kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi Trong hình 1.4 cho thấy cặp mồi này

phát hiện đặc hiệu với vi khuẩn Cornobacter spp Giới hạn của phương pháp

được phát hiện trực tiếp trên mẫu sữa ở mức 102

CFU/ml

Ngoài ra, năm 2016, tác giả Yingli Chen và cộng sự [63] sử dụng kỹ thuật

khuếch đại mồi đơn đẳng nhiệt huỳnh quang để phát hiện vi khuẩn E.

sakazakii trong sữa cho trẻ sơ sinh Kỹ thuật này sử dụng hỗn hợp mồi với

đầu 3’ DNA và đầu 5’ RNA, giới hạn phát hiện của phương pháp ở mức 81CFU/ml

Tuy nhiên, việc ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử mới như

Realtime- PCR và hạt từ để phát hiện vi khuẩn E sakazakii chưa được áp

dụng nhiều do không phù hợp với điều kiện hiện tại của nhiều phòng thínghiệm Vì thế, kỹ thuật PCR được nhiều phòng thí nghiệm ưu tiên triển khai,

công sự đã nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR [61], sử dụng Gen gyrB mã hóa

tiểu đơn vị B để xác định Cronobacter spp cho sản phẩm DNA khuếch đại

438 bp gồm 38 chủng Cronobacter spp và 34 chủng loại vi khuẩn khác.

Với điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm chúng tôi chọn kỹ thuật PCR,

trình tự gen ompA 469 bp theo tác giả Mohan Nair và Venkitanarayanan năm

2006 Vi khuẩn E sakazakii có lớp protein ngoài màng của tế bào được mã hóa bằng gen (ompA), trình tự gen này đặc trưng cho vi khuẩn E sakazakii để phát hiện nhanh E sakazakii.

1.5 X c định gi trị sử dụng của phư ng ph p

Hiện nay, việc đánh giá giá trị sử dụng của một phương pháp thường dựa vàomột số thông số theo ISO 16140: 2003 [25] và NordVal 2009 [50] gồm có:Giới hạn phát hiện (LOD50), độ chính xác (AC), độ nhạy (Se), độ đặc hiệu(Sp), tỷ lệ âm tính giả (FN), tỷ lệ dương tính giả (FP)

Giới hạn phát hiện (LOD 50 ): là nồng độ nhỏ nhất của vi sinh vật mà ở đó có

khoảng 50% số mẫu cho kết quả dương tính và 50% số mẫu cho kết quả âmtính

Độ chính x c tư ng đối (AC): Là thông số kỹ thuật biểu thị khả năng cho

kết quả chính xác của phương pháp mới so với phương pháp nuôi cấy truyềnthống, được trình bày bằng phần trăm số mẫu mà kết quả là tương đồng nhaugiữa 2 phương pháp trong tổng số mẫu phân tích

Độ đặc hiệu tư ng đối (SP): Là thông số kỹ thuật biểu thị khả năng phát

hiện vi khuẩn mục tiêu với các dòng khác và không phát hiện các dòng vikhuẩn không là mục tiêu Trên thực tế độ đặc hiệu tương đối được đánh giábằng phần trăm số mẫu cho kết quả âm tính bởi 2 phương pháp so với tổng sốmẫu cho kết quả âm tính bởi phương pháp nuôi cấy

Độ nhạy tư ng đối (SE): Là thông số kỹ thuật biểu thị khả năng phát hiện vi

khuẩn mục tiêu trong mẫu của phương pháp mới Độ nhạy được biểu hiệnbằng phần trăm số mẫu mẫu cho kết quả dương tính bởi 2 phương pháp so với

Tỷ lệ dư ng tính giả (FP): Là trường hợp phương pháp mới cho kết quả

dương tính trong khi phương pháp nuôi cấy cho kết quả âm tính Tỷ lệ dươngtính giả được biểu hiện bằng phần trăm số mẫu cho kết quả dương tính bởiphương pháp mới trong tổng số mẫu cho kết quả âm tính bởi phương phápnuôi cấy truyền thống

Tỷ lệ âm tính giả (FN): Là trường hợp phương pháp mới cho kết quả âm tính

trong khi phương pháp nuôi cấy cho kết quả dương tính Tỷ lệ âm tính giảđược biểu hiện bằng phần trăm số mẫu cho kết quả âm tính bởi phương phápmới trong tổng số mẫu cho kết quả dương tính bởi phương pháp nuôi cấytruyền thống

Điều kiện đánh giá các thông số kỹ thuật như sau [2] :

Giới hạn phát hiện (LOD50) < 10, độ chính xác tương đối (AC) ≥ 90%, độ đặchiệu tương đối (SP) ≥ 90%, độ nhạy tương đối (SE) ≥ 90%, tỷ lệ dương tínhgiả (FP)  10%, tỷ lệ âm tính giả (FN)  10%

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Thiết kế nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm

Đánh giá giá trị sử dụng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn E sakazakii.

Sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống phát hiện E sakazakii theo

TCVN 7850:2008 (ISO/TS 22964:2006) để tham chiếu so sánh

Sử dụng các tiêu chí đánh giá giá trị sử dụng phương pháp PCR theo ISO

16140: 2003 [25] và NordVal 2009 [50] trong phát hiện E sakazakii.

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Phương pháp PCR phát hiện E sakazakii trong mẫu sản phẩm dinh dưỡng

công thức dạng bột dành cho trẻ đến 12 tháng tuổi

Chủng chứng dư ng:

Nguồn chủng từ Viện Y tế Công cộng Thành phố Hồ Chí Minh

Enterobacter sakazakii ATCC 4869

Chủng chứng âm:

Nguồn chủng từ Viện Y tế Công cộng Thành phố Hồ Chí Minh

Salmonella paratyphy A ATCC 9150

Shigella sonnei ATCC 9290

Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853

Proteus vulgaris ATCC 17258

Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802

Klebsiella pneumoniae ATCC 27489

E sakazakii):

Khảo s t LOD 50 : khảo sát 6 mức nhiễm: mỗi mức gây nhiễm 10 mẫu thực

hiện bằng hai phương pháp PCR và nuôi cấy truyền thống

Sau khi có kết quả LOD50 tiếp tục khảo sát các thông số còn lại

Khảo sát các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR phát hiện E sakazakii

(so với phương pháp nuôi cấy truyền thống): bao gồm 60 mẫu sữa trong đó có

30 mẫu gây nhiễm và 30 không gây nhiễm với chủng E sakazakii có nồng độ

10 lần LOD50

2.3.2 Phư ng ph p chọn mẫu

Chọn mẫu: sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ dưới 12 thángtuổi ( bao gồm: từ 0 đến 6 tháng tuổi, 0 đến 12 tháng tuổi, 6 đến 12 thángtuổi) Chọn ngẫu nhiên 20 mẫu thuộc nhóm sữa trên của các công ty sản xuấtsữa trong nước hoặc nhập khẩu hiện bán tại thị trường Thành phố Hồ ChíMinh

2.3.3 Tiêu chuẩn chọn mẫu

Tiêu chuẩn chọn vào:

- Chọn mẫu là sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 thángtuổi có nhãn hiệu rõ ràng, còn hạn sử dụng, bảo quản nơi thoáng mát

Tiêu chuẩn loại ra:

- Những mẫu là sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12tháng tuổi bị móp méo, biến dạng

2.4 Phư ng ph p ph t hiện E sakazakii bằng kỹ thuật nuôi cấy truyền

thống

TCVN 7850:2008 (ISO/TS 22964:2006)

Sơ đồ tóm tắt phương pháp nuôi cấy truyền thống phát hiện E sakazakii trong

sản phẩm dinh dưỡng công thức dạng bột cho trẻ đến 12 tháng tuổi (xem phụlục I)

- Cấy ria và xác định các khuẩn lạc điển hình: Từ dịch nuôi cấy tăng sinhchọn lọc ở trên, cấy ria sang môi trường thạch tạo màu (Chromogenic agar)

và ủ ở 44 ± 1oC /24±2giờ

- Định danh bằng thử nghiệm sinh vật hóa học: Chọn các khuẩn lạc điển hìnhtrên môi trường thạch tạo màu Những khuẩn lạc điển hình, tạo sắc tố vàngtrên môi trường thạch tryptone soya được xác định những tính chất sinh vậthóa học

2.4.2 Tiến hành thử nghiệm

Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị, môi trường và thuốc thử (xem phụ lục III)