Xác định kiểu hình và kiểu gen của các vi khuẩn đường ruột tiết esbl phân lập được tại bệnh viện bạc liêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN THÀNH TÍN XÁC ĐỊNH KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GEN CỦA CÁC VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT TIẾT ESBL PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠC L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

NGUYỄN THÀNH TÍN

XÁC ĐỊNH KIỂU HÌNH VÀ KIỂU GEN CỦA CÁC VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT TIẾT ESBL PHÂN LẬP ĐƯỢC TẠI BỆNH VIỆN BẠC LIÊU

Ngành: Kỹ thuật xét nghiệm y học

Mã số: 8270601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS NGUYỄN THANH BẢO

TP HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Nguyễn Thanh Bảo,người thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn, tôi đã nhận được rấtnhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, cùng đồng nghiệp, bạn bè vàgia đình

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Bộ môn xét nghiệm,Phòng sinh học phân tử, Ban giám đốc Bệnh viện đa khoa Bạc Liêu, phòng visinh Bệnh viện Bạc Liêu, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làmviệc để hoàn thành luận văn này

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, tất cảnhững số liệu và kết quả trong luận văn này là trung thực và chưa được công

bố bởi người khác

Tác giả luận văn

NGUYỄN THÀNH TÍN

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan i

Mục lục ii

Danh mục từ viết tắt v

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn 3

1.1.1 Vi khuẩn 3

1.1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu thường gặp 3

1.2 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL 5

1.2.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL 5

1.2.2 Đặc điểm phân loại ESBL 7

1.3 Các phương pháp phát hiện về kiểu hình ESBL 10

1.3.1 Phương pháp đĩa đơn 10

1.3.2 Phương pháp đĩa đôi 11

1.3.3 Phương pháp đĩa kết hợp 13

1.3.4 Phương pháp que E test 14

1.3.5 Phương pháp tìm ESBL (Bằng máy tự động vitek2 compact): 15

1.4 Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gene ESBL: 15

1.4.1 Tầm quan trọng của việc phát hiện ESBL: 17

1.4.2 Tình hình phân bố ESBL trên thế giới và Việt Nam: 18

1.4.3 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn đường ruột: 20

1.4.4 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL: 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 22

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 22

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ: 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 22

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: 22

2.2.2 Cỡ mẫu: 22

2.2.3 Biến số: 22

2.2.4 Phân tích và xử lý số liệu: 23

2.3 Số chủng vi khuẩn đường ruột dùng để thực hiện multiplex PCR: 23

2.4 Địa điểm thực hiện và thời gian nghiên cứu: 23

2.5 Một số kỹ thuật vi sinh lâm sàng: 23

2.5.1 Cách lấy bệnh phẩm máu: 23

2.5.2 Cách lấy bệnh phẩm nước tiểu: 24

2.5.3 Cách lấy bệnh phẩm đàm: 24

2.5.4 Cách lấy bệnh phẩm mủ (tổn thương phần mềm): 24

2.6 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 24

2.6.1 Vật liệu: 24

2.6.2 Phương pháp thực hiện: 26

2.7 Đạo đức trong nghiên cứu: 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Xác định tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột theo từng loại bệnh phẩm: 38

3.2 Tỷ lệ vi khuẩn E coli, K pneumoniae và K oxytoca sinh ESBL: 38

3.3 Kết quả khảo sát về kiểu gene qui định ESBL 41

3.3.1 Kết quả thí nghiệm monoplex PCR 41

3.3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của các mồi: 42

3.3.3 Hiệu quả phản ứng multiplex PCR: 44

3.4 Xác định kiểu gene thường gặp của vi khuẩn đường ruột sinh ESBL: 48

3.4.1 Tỷ lệ phân bố kiểu gien sinh men ESBL 48

3.4.2 Tỷ lệ các kiểu tổ hợp gene mã hóa men ESBL: 49

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 51

4.1 Tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột trong từng loại bệnh phẩm: 51

4.2 Tỷ lệ E coli, K pneumoniae và K oxytoca sinh ESBL: 55

4.3 Xác định kiểu gene: 62

4.3.1 Tối ưu hóa quy trình khảo sát kiểu gene: 62

4.3.2 Tỷ lệ các gene sinh ESBL phát hiện được: 63

4.4 Hạn chế của đề tài 67

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 Các quy trình nuôi cấy và phân lập vi khuẩn 2 Quy trình định danh và thử nghiệm kháng sinh đồ bằng máy VITEK2 COMPACT 3 Bảo quản và vận chuyển mẫu 4 Tách chiết dna từ vi khuẩn bằng phương pháp cột 5 Kết quả giải trình tự các sản phẩm nhân bản của các mồi dùng trong nghiên cứu 6 Kết quả điện di của mẫu nghiên cứu danh sách kết quả Multiplex PCR Danh sách đối tượng tham gia nghiên cứu tại bệnh viện đa khoa tỉnh Bạc Liêu

EPEC : Enteropathogenic E coli (Gây bệnh đường ruột)

ETEC : Enterotoxigenic E coli (Gây độc tố ruột)

EIEC : Enteroinvasive E coli (Xâm nhập đường ruột)

EHEC : Enterohemorrhagic E coli (gây xuất huyết ruột)

EAEC : Enteroaggregative E coli (Bám dính đường ruột)

ESBLs : Extended spectrum beta lactamases

MIC : Minimum Inhibitory Concentration

PCR : Polymerase Chain ReactionRNA : Ribonuclic acid

SHV-1 : Sulfhydryl variable type 1SMART : Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trend

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Phân loại theo chức năng: 9

Bảng 1.2: Kết quả kháng sinh đồ 11

Bảng 1.3: Tóm tắt các phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 17

Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu 25

Bảng 3.1: Tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột theo từng loại bệnh phẩm 38

Bảng 3.2: Tỷ lệ E coli, K pneumoniae và K oxytoca sinh ESBL 39

Bảng 3.3: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm máu 39

Bảng 3.4: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm nước tiểu 39

Bảng 3.5: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm đàm 40

Bảng 3.6: Tỷ lệ vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ở bệnh phẩm mủ 40

Bảng 3.7: Tỷ lệ phân bố kiểu gene sinh ESBL 48

Bảng 3.8: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL ở E coli 49

Bảng 3.9: Các kiểu tổ hợp gene mã hóa ESBL ở K pneumoniae 49

Bảng 4.1: Tóm tắt vi khuẩn sinh ESBL của các nghiên cứu 60

Bảng 4.2: So sánh với nghiên cứu của các bệnh viện trong nước và SMART vùng châu Á Thái Bình Dương 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa đôi 12

Hình 1.2: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa kết hợp 13

Hình 1.3: Minh họa xét nghiệm bằng phương pháp E-test 15

Hình 2.1: Minh họa nguyên tắc PCR đơn mồi (monoplex) 31

Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm monoplex PCR 41

Hình 3.2: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi CTX-M-Group-1 và CTX-M-Group-9 42

Hình 3.3: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi TEM và 16S rRNA 42 Hình 3.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi SHV 43

Hình 3.5: Hiệu quả nhân bản của phản ứng multiplex PCR 44

Hình 3.6: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene TEM 45

Hình 3.7: Kết quả tối ưu nồng độ mồi nhân bản gene 16S rRNA 45

Hình 3.8: Kết quả tối ưu nồng độ Mg2+ 46

Hình 3.9: Kết quả tối ưu nồng độ men DNA polymerase 46

Hình 3.10: Kết quả đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex PCR 47

Hình 3.11: Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng multiplex PCR 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhiễm trùng do vi khuẩn Gram âm sinh ESBL vẫn là yếu tố góp phầnquan trọng nhất gây ra đề kháng KS nhóm β-Lactam và gây tử vong cao trêntoàn thế giới Men này được phát hiện đầu tiên ở Tây Âu vào giữa thập niên

80, gia tăng một cách đều đặn do vi khuẩn tiết β-lactamases đặc biệt làESBLs Cũng vì chính men β-lactamases giúp cho vi khuẩn đề kháng tất cảcác KS nhóm penicillins, cephalosporin thế hệ 1, 2, 3, 4 và monobactam

(aztreonam), trừ carbapenem [43], [58] Nhưng hiện nay một số chủng đã

giảm nhạy cảm với KS nhóm carbapenem như imipenem, meropenem hayertapenem, trong khi việc tìm ra kháng sinh mới trên thế giới ngày càng giảm

thì mức độ đề kháng KS ngày càng tăng Trong khi đó E coli và

K pneumoniae là hai loại vi khuẩn đường ruột chiếm đa số trong các trường

hợp bệnh lý như nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn tiết niệu…mà thuốc chínhđược lựa chọn để điều trị cho tác nhân gây bệnh trên là β-lactams

Hiện nay đã có hơn 350 loại men ESBL khác nhau đã được mô tả, Kiểugene thường gặp nhất là TEM (Temoneria), SHV (Sulfhydryl variable),CTX-M (Cefotaxime hydrolyzing capabilities) Sự phân bố các kiểu genecũng khác nhau giữa các quốc gia và các vùng địa lý [19] Theo nghiên cứucủa SMART ở vùng châu Á Thái Bình Dương kiểu gene CTX-M-14,

CTX-M-15 chiếm ưu thế ở các vi khuẩn đường ruột [53] Nhiều nghiên cứu báo cáo vi khuẩn Escherichi coli và Klebsiella pneumoniae là loài sinh

ESBL thường gặp nhất Tuy nhiên những loài vi khuẩn khác trong họ đường

ruột và Pseudomonas cũng có khả năng tiết ra men này Đặc biệt thuốc KS

nhóm β-lactam sẽ không có hiệu quả (trừ Carbapenem) nếu ESBL dương tính

kể cả kháng sinh đồ cho kết quả nhạy cảm Ngoài kháng sinh đồ thường quythì xác định vi khuẩn đường ruột sinh ESBL là cần thiết Tuy nhiên việc xácđịnh kiểu gene giúp hiểu sâu hơn cơ chế kháng thuốc ở mức độ phân tử

Bên cạnh đó, tỷ lệ hiện hành của vi khuẩn sinh ESBL thay đổi trên thếgiới; Nam Phi [55] chiếm 8,8% – 13,1%; Ai Cập [21], [47] chiếm từ

11 – 42,9%; ở Việt Nam tỷ lệ ngày càng gia tăng; Bệnh viện An Bình

TP HCM (2014) [14] chiếm 29,9%, bệnh viện Đại học Y Dược TP HCM(2015) [12] chiếm 57,8%

Truy tìm qua các y văn, tạp chí khoa học, ngày càng có nhiều thông tin

và nhiều nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn sinh ESBL

Việc chọn lựa kháng sinh ban đầu hiện nay là chọn lựa KS phổ rộng đủmạnh, bao phủ phần lớn các tác nhân gây bệnh Sau khi có kết quả kháng sinh

đồ sẽ điều chỉnh cho phù hợp, đảm bảo tính hiệu quả, ít tốn kém và giảm sựphơi nhiễm của kháng sinh

Bệnh viện Bạc Liêu là một bệnh viện tuyến tỉnh, mỗi năm số lượngbệnh nhân nhập viện với tình trạng nhiễm trùng do vi khuẩn tiết ESBL ngàycàng nhiều nhưng ở Bạc Liêu chưa có nghiên cứu nào về vi khuẩn tiết ESBLcũng như các gen có liên quan Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài với các mụctiêu cụ thể như sau:

1 Xác định tỷ lệ các vi khuẩn đường ruột phân lập được theo từng loại

bệnh phẩm thường gặp (máu, đàm, nước tiểu, mủ dịch tổn thương phần mềm)tại phòng vi sinh Bệnh viện Bạc Liêu

2 Xác định tỷ lệ vi khuẩn đường ruột thường gặp Escherichia coli,

Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca tiết ESBL.

3 Xác định kiểu gene thường gặp của các vi khuẩn đường ruột tiết

ESBL

Họ đường ruột có tầm quan trọng trong y học bởi nhiều thành viên cókhả năng gây bệnh ở người, trong đó những thành viên có thể gây dịch.Chúng chiếm tới 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người Chúng có thểgây rất nhiều bệnh khác nhau, hầu như tất cả các cơ quan, các mô của cơ thể.Bất cứ bệnh phẩm lâm sàng nào cũng phân lập được họ vi khuẩn đường ruột.

1.1.2 Các vi khuẩn nghiên cứu thường gặp:

Escherichia coli (E coli) và Klebsiella pneumoniae (K pneumoniae) là

hai vi khuẩn gây bệnh thường gặp tại bệnh viện Chúng là thành viên chính

của họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriacae) gây bệnh nhiễm khuẩn bệnh

viện do có tỷ lệ đề kháng KS rất cao Đặc biệt là hai loài vi khuẩn gắn liền vớilịch sử phát hiện cơ chế sinh ESBL ở vi khuẩn Gram âm với các loại men

TEM, SHV và CTX-M… Điều quan trọng là gene mã hóa ESBL ở các vi

khuẩn này chủ yếu di truyền qua trung gian plasmid [37]

1.1.2.1 Escherichia coli: [9]

Escherichia coli do Theodore Eschrich (1857 – 1919) phát hiện lần đầu

tiên năm 1885 Vi khuẩn này chiếm tỉ lệ rất cao trong số các vi khuẩn hiếu khí( khoảng 80%) ở đại tràng

o EPEC (Enteropathogenic E coli): Gây bệnh đường ruột

o ETEC (Enterotoxigenic E coli): Gây độc tố ruột

o EIEC (Enteroinvasive E coli): Xâm nhập đường ruột

o EHEC (Enterohemorrhagic E coli): gây xuất huyết ruột

o EAEC (Enteroaggregative E coli): Bám dính đường ruột Khả năng gây bệnh: E coli gây nhiều loại bệnh lý khác nhau như

nhiễm khuẩn tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não, nhiễm khuẩnđường mật và nhiễm khuẩn vết thương

Khả năng gây bênh: Gây nhiều bệnh như viêm phổi, viêm xoang, viêmtai giữa, nhiễm khuẩn vết thương.

Chẩn đoán vi sinh vật: Dựa vào nuôi cấy phân lập xác định tính chấtsinh vật hóa học, định type huyết thanh

1.2 Khái quát lịch sử và phân loại ESBL:

1.2.1 Vài nét về lịch sử phát hiện ESBL:

Tình hình vi khuẩn đề kháng với KS nhóm β-lactam được biết đến từ

rất lâu Men β-lactamase được phát hiện từ Escherichia coli trước khi kháng

sinh β-lactam đầu tiên là penicillin được đưa vào sử dụng Vào đầu những

năm 1960, các nhà khoa học đã phát hiện ra men TEM-1, là một enzymtruyền qua plasmid được phân lập trên bệnh nhân tên là Temoneira – một

người Hy lạp – bị nhiễm trùng huyết do E coli và lấy luôn tên bệnh nhân này

đặt là TEM-1 Đến năm 1961 thế hệ penicilline phổ rộng đầu tiên làampicillin được ra đời có tác dụng điều trị với cả trực khuẩn Gram âm và cảcầu khuẩn Gram dương [20], [27]

Năm 1965 cũng ở nơi đây từ E coli người ta phát hiện ra TEM-2 là do

TEM-1 biến đổi một amino acid Nhờ TEM-1 và TEM-2 đã làm cho vi khuẩnGram âm kháng lại penicillin, ampicillin và cephalosporin thế hệ 1 [27]

Cho đến năm 1974 chủng K pneumoniae có gene mã hóa β- lactamases

trên plasmid được phát hiện, men này có nhiều thay đổi về amino acid so vớiTEM-1 và TEM-2 nên đặt tên là SHV-1 (Sulfhyryl variable), như vậy vikhuẩn đã có TEM-1, TEM-2 và SHV-1 nên các penicillin, cephalosporine thế

hệ 1 đã bị kháng lại rất nhiều Đến năm 1980 thì các kháng sinh β- lactam phổrộng như cephalosporin thế hệ 2, thế hệ 3 và monobactam được đưa vào điềutrị các vi khuẩn kháng thuốc [33] Sự ra đời các kháng sinh mới này đặc biệt

là caphalosporin thế hệ 3 đã là thành công lớn của khoa học trong cuộc chiếnđấu dài lâu với vi khuẩn gây bệnh sinh men TEM-1, TEM-2, SHV-1 Nhưngrồi một loại β- lactamases có khả năng phân hủy các cephalosporine thế hệ 2,

3 và monobactam, có nguồn gốc do TEM-1, TEM-2, SHV-1 đột biến thay đổimột số amino acid gọi là ESBLs đã xuất hiện [23]

Năm 1983 ở Đức đã phát hiện chủng K ozaenae sinh β- lactamases

phân hủy cefotaxime được đặt tên là SHV-2, đây là trường hợp sinh ESBLđầu tiên được ghi nhận Năm 1984 đến năm 1987 tại pháp đã phát hiện chủng

K pneumoniae có gene mã hóa ESBL trên plasmid kháng cefotaxime đặt tên

là CTX-1 [26], [56] Cũng vào những năm 1986 ở Nhật Bản Masumato và

năm 1989 ở Đức, Bauerfein phát hiện E coli sinh ESBL kháng cefotaxime

không phải là TEM và SHV nên đặt tên là CTX-M-1 Đáng ngại là CTX-M

có khả năng phân hủy hầu hết cephalosporine thế hệ 3 và cả cephalosporine

thế hệ 4 [29], [45] β-lactamases là loại men do vi khuẩn tiết ra có thể thủyphân các liên kết amin của β-lactam gây mở vòng β-lactam và làm mất tác

dụng diệt khuẩn của kháng sinh họ β-lactam.

β-lactamases được sinh tổng hợp có thể do gene nằm trên nhiễm sắcthể hay plasmid quy định Trong một số chủng vi khuẩn có thể tồn tại cả 2 cơchế này

β-lactamases của vi khuẩn Gram dương (đại diện là tụ cầu) là đại diệncho phần lớn các men nhóm A là do cảm ứng, được hình thành ở màng tế bàocũng như được tiết ra ngoại bào

β-lactamases của vi khuẩn Gram âm phức tạp hơn Hầu hết các vikhuẩn đường ruột có chứa các enzym chủ yếu là do plasmid qui định, đượctạo ra ở mức độ thấp tùy theo loài, lan truyền tính kháng thuốc từ loài nàysang loài khác và lây lan trong cộng đồng

Như vậy, với việc sử dụng các kháng sinh nhóm β-lactam ngày cànglàm gia tăng tỉ lệ kháng thuốc Đến nay các ESBL mới vẫn đang tiếp tục đượcthông báo, điều này cảnh báo một nguy cơ gia tăng vi khuẩn đề kháng KS vàkhông còn KS điều trị trong tương lai gần Tuy nhiên, việc phát hiện sớm các

vi khuẩn sinh ESBL và thông báo còn chưa có sự thống nhất

1.2.2 Đặc điểm phân loại ESBL:

Hiện nay các nghiên cứu trên thế giới đã biết đến trên 200 loại ESBL.Những enzyme được nhiều nhà khoa học phân loại theo các cách khác nhau

và cũng khá phức tạp Tuy vậy, có hai hệ thống phân loại chính được thốngnhất sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới Hệ thống phân loại của Ambler và hệthống phân loại của nhóm tác giả Bush karen, Jacoby và Medeiros A [27]

1.2.2.1 Hệ thống phân loại theo Ambler: [31].

Ambler chia các β-lactamase thành 4 lớp: A, B, C, D, dựa trên cấu trúcenzyme có sự giống nhau về các amino acid Trong đó các lớp A, C, D chỉ có

serin trong cấu trúc ở vị trí khởi động nên gọi là các Serin- β-lactamase, cònlớp B do có Metallo ở vị trí khởi động trong cấu trúc men nên gọi là cácMetallo- β-lactamase, một số β-lactamase lớp A và D được gọi là ESBL

1.2.2.2 Hệ thống phân loại theo Bush- Jacoby- medeiros: [38]

Dựa vào các yếu tố sau:

(1) Khả năng hoạt động của men hay gọi là phổ tác dụng của men đốivới các kháng sinh

(2) Tầm ảnh hưởng của men đối với các chất ức chế β-lactamase(thường dùng là clavulanic acid) ở các mức khác nhau như bị ức chế, giảm ứcchế hay kháng ức chế

(3) Vị trí gene mã hóa ESBL nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid.Loài vi khuẩn sinh ESBL thuộc nhóm thường gặp hay hiếm gặp Hệthống phân loại này chia β-lactamase ra 4 nhóm chính: 1, 2, 3, 4 và trong đónhóm 2 lại được chia thành 8 nhóm phụ: 2a, 2b, 2be, 2br, 2c, 2d, 2e, 2f

Nhóm 2a: Gồm các penicillinase, không bị ức chế bởi clavulanic acid

thường xuất hiện ở những vi khuẩn Gram dương như: S.aureus, Enterobacter

spp

Nhóm 2b: Gồm các men cổ điển như: TEM-1-2, SHV-1, bị ức chế bởi

Clavulanic acid, các type này thường gặp ở E coli, chúng không phân hủy

được các cephalosporins phổ rộng thế hệ 3

Nhóm 2be: Đây là nhóm β- lactamase phổ rộng, không phân hủy

carbapenems, và cả cephamycins ( cefoxitin, cefotetan, cefmetazole…) cácmen này gọi là ESBL, bị ức chế bởi Clavulanic acid, sulbactam và

tazobactam Xuất hiện nhiều ở E coli, K pneumoniae và các vi khuẩn đường

ruột khác

Nhóm 2br: Gồm các men CARB có khả năng phân hủy carbapenem,

thường xuất hiện ở P aeruginosa, Acinetobacter spp.

1.3 Các phương pháp phát hiện về kiểu hình ESBL:

Tần suất của các vi khuẩn đường ruột sinh ESBL ngày càng tăng đòihỏi những phương pháp phát hiện ESBL phải ngày càng chính xác Trongnhững năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu về phương pháp pháthiện vi khuẩn sinh ESBL

1.3.1 Phương pháp đĩa đơn: [17]

Nguyên tắc: Phương pháp đĩa đơn hay còn gọi là phương pháp sàng

lọc phát hiện khả năng tiết ESBL dựa trên đường kính vô khuẩn, hoặc giá trịnồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cephalosporines thế hệ 3, aztreonam đốivới vi khuẩn thử nghiệm

Phương pháp thực hiện:

Thực hiện kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán hay phương pháptìm MIC trên các loại kháng sinh cefpodoxime, ceftazidime, aztreonam,cefotaxime và ceftriaxone Xác định đường kính vô khuẩn hoặc giá trị MIC

Phương pháp này chỉ mang tính sàng lọc tức là tiên đoán khả năng cao

là vi khuẩn có tiết ESBL, nếu kết quả dương tính cần phải xác định lại bằngphương pháp đĩa kết hợp

1.3.2 Phương pháp đĩa đôi: [17]

Nguyên tắc:

Phương pháp đĩa đôi phát hiện ESBL được Jarlier mô tả đầu tiên vàonăm 1988 Phương pháp này dựa trên nguyên tắc clavulanic acid và các ứcchế β-lactamse khác (sulbactam, tazobactam) sẽ ức chế enzyme ESBL nênlàm giảm mức độ đề kháng của cephalospin thế hệ 3, sẽ được mở rộng ra khiđặt gần một đĩa kháng sinh có chứa clavulanic acid hoặc ức chế β-lactamseskhác

Phương pháp thực hiện:

Thực hiện kháng sinh đồ khuếch tán các đĩa kháng sinh cephalospin thế

hệ 3 (ceftazidime, cefotaxime, ceftriaxone), cefpodoxime, cefuroxime hayaztreonam đặt cách đĩa β-lactam / ức chế β-lactamse (amoxicillin /

Hình 1.1: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa đôi

Phát hiện ESBL bằng phương pháp đĩa đôi cho thấy hình cổ chaichampagne (AMC: amoxicillin/clavulanic acid, CAZ: ceftazidime, CTX:cefotaxime)

Kiểu ESBL mà vi khuẩn tiết ra: Đối với vi khuẩn tiết men ESBL kiểuCTX-M, kết quả dương tính chỉ thực hiện trên đĩa kháng sinh cefotaximehoặc cefodoxime

1.3.3 Phương pháp đĩa kết hợp: [17]

Nguyên tắc:

Phương pháp đĩa kết hợp do Jacoby và Hans mô tả đầu tiên vào năm

1999 Phương pháp dựa trên nguyên tắc phát hiện tính hiệp lực của đĩa khángsinh kết hợp cephalosporin thế hệ 3 với ức chế β-lactamase so với đĩa khángsinh cephalosporin thế hệ 3 đơn thuần

Phương pháp thực hiện:

Thực hiện kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán đồng thời hai cặp đĩakháng sinh: (i) Ceftazidime và Ceftazidime/ clavulanic acid; cefotaxime vàcefotaxime /clavulanic acid phải bắt buộc trên cùng một đĩa thạch làm khángsinh đồ cho ít nhất từng cặp

Hình 1.2: Minh họa xét nghiệm khuếch tán đĩa kết hợp Kết quả: Đo đường kính vòng vô khuẩn Tính hiệu số đường kính

vòng vô khuẩn của từng cặp đĩa kháng sinh Biện luận kết quả như sau:

o ESBL (+) khi đường kính vô khuẩn ≥ 5mm giữaCeftazidime/ clavulanic acid và Ceftazidime, hoặcCefotaxime /clavulanic và cefotaxime

o Một số vi khuẩn tiết β-lactamase AmpC không phải ESBL, nhưng cũnglàm gia tăng đường kính vòng vô khuẩn khi có sự hiện diện của clavulanicacid, và gây dương tính giả.

1.3.4 Phương pháp que E test: [17]

Que E-test phát hiện ESBL có cấu tạo một đầu là cephalosporin thế hệ

3 và đầu đối diện là cephalosporin thế hệ 3 phối hợp với clavulanic acid

Thực hiện thử nghiệm phát hiện ESBL theo phương pháp giống nhưphương pháp kháng sinh đồ tìm MIC với que E-test Các que E-test được sửdụng để làm xét nghiệm là cefotaxime/cefotaxime + clavulanic acid(CT/CTL), ceftazidime/ceftazidime + clavulanic acid (TZ/TZL) Đọc kết quảMIC và biện luận bằng cách so sánh MIC của các kháng sinh của từng cặptrên que E-test ESBL (+) khi đầu que có chứa clavulanic acid có MIC giảmtrên hoặc 8 lần so với đầu que không có chứa clavulanic acid

so với giếng không có clavulanic acid, thì có sự hiện diện của ESBL Với mộtnghiên cứu của Senders và các cộng sự cho thấy rằng độ đặc hiệu và độ nhạycảm của hệ thống máy tự động Vitek2 tìm ESBL đạt tới 99% [22] Mà ưu thếcủa hệ thống vitek2 compact là phân tích tự động và phân loại men β-lactamase từ các vi khuẩn gram âm dựa vào kiểu nhạy với nhiều loại khángsinh β-lactam khác nhau [24].

Mỗi phương pháp thì có ưu điểm khác nhau, tuy nhiên chưa có phươngpháp nào phát hiện chính xác 100% các chủng sinh men ESBL

1.4 Phương pháp sinh học phân tử phát hiện kiểu gene ESBL:

Nguồn gốc gene làm cho vi khuẩn sản xuất được ESBL là TEM, SHV,CTX-M và OXA Ngoài ra còn có một số gene khác như PER-1, PER-2 vàVEB-1 Trong tất cả các gene này, chúng tôi chỉ đề cập đến kỹ thuật PCR vàgiải trình tự phát hiện TEM, SHV và CTX-M vì đây là các gene phổ biến trêncác vi khuẩn đường ruột; còn các gene khác thì trên các vi khuẩn Gram âm

không lên men đường (bao gồm P aeruginosa, A baumanii…) và cũng

không phải là nguồn gốc đề kháng chính yếu các kháng sinh họ β-lactam trên

các vi khuẩn này TEM1 và SHV1 là gene chịu trách nhiệm giúp vi khuẩn tiếtđược β-lactamases cổ điển phá hủy được các penicillin và các cephalosporinthế hệ 1 Tuy nhiên TEM và SHV bị đột biến và tạo được các biến thể giúp vikhuẩn tiết ESBL Chính vì vậy để có thể xác định các biến thể TEM và SHVthì phải giải trình tự gene TEM và SHV Các đột biến làm thay đổi các aminoacid trên các codon ở gene TEM hay SHV mà dựa vào đó chúng ta có thể xácđịnh các biến thể của chúng và xác định biến thể nào giúp vi khuẩn biểu hiệnkiểu hình ESBL, β-lactamases cổ điển

Sử dụng phương pháp monoplex PCR và phương pháp multiplex PCR(Polymerase Chain Reaction) dựa trên đoạn mồi đặc hiệu từ ngân hàng gene

để tìm ESBL

Nguyên tắc: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân bản một đoạn DNA

đích từ vi sinh vật cần phát hiện

Thực hiện: Tách chiết DNA của vi khuẩn theo phương pháp cột; đỗ gel

agarose 4%; sử dụng mồi xuôi và mồi ngược đặc hiệu cho các gene TEM,SHV, CTX-M; thành phần PCR mix cho tổng thể tích phản ứng là 25µL; Chutrình nhiệt cho phản ứng PCR:15 phút ở 950C; 30 chu kỳ lặp lại gồm 20 giây

ở 950C, 40 giây ở 580C và 40 giây ở 720C; và giai đoạn cuối cùng 6 phút ở

720C

Kết quả: Phát hiện các sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel

agarose 4% với chất nhuộm Ecodye và thang phân tử 100 bp (Solgent)

Những kỹ thuật hiện đại này rất quan trọng để xác định sự hiện diện, sựphân loại, cũng như định danh các ESBL, phương pháp này thường tốn kém

về tài chính và nhân sự

Đĩa kết hợp

Dùng đĩa cephalosporin thế hệ 3 đơn thuần và cókết hợp với clavulanic acid Tăng đường kínhvòng vô khuẩn ≥ 5mm ở đĩa kết hợp là có ESBL

E test (que ESBL)

Que có hai đầu: Một đầu có chứa Ceftazidime vàđầu kia chứa Ceftazidime/clavulanic acid Giảmgiá trị MIC của đầu kết hợp ≥ 8 lần so với đầuchứa là có ESBL

Phương Pháp tự động

(vitek)

Đo MIC và so sánh tốc độ mọc của vi khuẩn khi

có Ceftazidime đơn thuần và khi kết hợp vớiCeftazidime có chứa clavulanic acid

Phương pháp phân tử Xác định chuổi nucleotid mục tiêu để xác định

biến thể của TEM và SHV

1.4.1 Tầm quan trọng của việc phát hiện ESBL:

Với những phương pháp được lựa chọn để phát hiện vi khuẩn sinhESBL là điều quan trọng Có hay không có sự hiện diện của chủng sinh ESBLcho phép người bác sĩ lâm sàng nhận định mức độ nặng nhẹ của tình trạngnhiễm trùng mà chọn lựa kháng sinh cho phù hợp

Hầu hết các ESBL có hoạt tính phá hủy tất cả các penicillin G,

ampicillin, amoxicillin, aztreonam, và các cephalosporin thế hệ 1,2,3 [53].

Các ESBL còn có khả năng lây lan cao giữa các vi khuẩn cùng loài hay khácloài vì nguồn gốc gen là đột biến trên TEM-1 và SHV-1 chịu trách nhiệmgiúp vi khuẩn sinh ra β-lactamse cổ điển nằm trên Plasmid Hiện nay vi khuẩn

tiết ESBL thường được ghi nhận với tỉ lệ cao là E coli và K pneumoniae

[54], chính vì vậy các nhà lâm sàng vất vả và đối phó với thất bại điều trị

cephalosporin thế hệ 3 hay 4 trên các nhiễm trùng bệnh viện do trực khuẩn

gram âm.

Nhiều số liệu cho thấy, điều trị bằng kháng sinh cephalosporin phổrộng cho những bệnh nhân bị nhiễm vi khuẩn sinh ESBL có nguy cơ thất bạicao hơn so với những bệnh nhân nhiễm vi khuẩn không sinh ESBL TheoCLSI, thì cho dù kết quả kháng sinh đồ nhạy, đều nên được xem là đề kháng

với tất cả các kháng sinh thuộc nhóm β-lactam (trừ Carbapenem) [25] Về

mặt vi sinh, nên thận trọng xem xét và tầm soát ESBL ở những tác nhân cóbiểu hiện gia tăng MIC với oxyimino-cephalosporin, nhất là khi MIC chưa đạtđến kháng thuốc thực sự

1.4.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn sinh ESBL trên thế giới và Việt Nam:

1.4.2.1 Tình hình nhiễm vi khuẩn sinh ESBL trên thế giới:

Mặc dù tỉ lệ phát hiện được vi khuẩn sinh ESBL ở một số nơi vẫn cònthấp, nhưng hiện tượng này lan rộng trong rất nhiều chủng vi khuẩn đườngruột Xuất hiện đầu tiên ở Châu Âu, nơi phát minh ra kháng sinh phổ rộng vàđược sử dụng rộng rãi, sau đó xuất hiện ở Hoa Kỳ, Châu Á Các ESBL đượcsinh ra từ vi khuẩn đường ruột có thể thay đổi tùy theo từng quốc gia, từng

khu vực, và tùy theo từng viện nghiên cứu [50].

Các ESBL ở vi khuẩn đường ruột được báo cáo lần đầu tiên tại Đứcnăm 1983 và chúng lan truyền nhanh chóng ở châu Âu vào giữa thập kỷ 80.Cuối thập kỷ này, chúng đã xuất hiện ở Hoa Kỳ, và kể từ đó trở đi các ESBLlưu hành tại nhiều bệnh viện trên khắp thế giới

17,5%, và sau cùng là Enterobacter cloacae chiếm 9,5% [42] Trong các vi

khuẩn đường ruột tiết ESBL qui định bởi các gen lần lượt là: SHV chiếm

10%, CTX-M chiếm 90% đối với E coli, CTX-M chiếm 100% đối với K pneumoniae, SHV chiếm 50%, CTX-M chiếm 50% đối với Enterobacter

cloacae [42].

Theo nghiên cứu ở Iran năm 2016: Trong đó E coli chiếm cao nhất là 71.3%, kế tiếp là Enterobacter spp chiếm 27% sau cùng là Klebsiella spp

chiếm tỉ lệ thấp nhất là 1,2% [47] Trong các vi khuẩn đường ruột tiết ESBL,

phổ biến nhất là K pneumoniae có gen CTX-M chiếm 66,6%, tiếp theo là E coli có gen CTX-M chiếm 46,1%, sau cùng là Enterobacter cloacae có gen

CTX-M chiếm 41,5% [47]

Nghiên cứu ở Châu Mỹ LaTinh năm 2017, cho thấy loài K pneumoniae chiếm tỷ lệ 36,3%, tiếp theo là E coli chiếm tỷ lệ 25,4% và K.

oxytoca chiếm 16,4% [52].

1.4.2.2 Tình hình nhiễm vi khuẩn sinh ESBL ở Việt Nam:

Chúng tôi vẫn chưa thấy công trình nào báo cáo chính thức thời điểmđầu tiên phát hiện ra vi khuẩn sinh ESBL tại Việt Nam Tuy nhiên, đã có một

số công trình nghiên cứu về các vi khuẩn đường ruột sinh ESBL như sau:

Nghiên cứu mô tả cắt ngang tại Bệnh viện trung ương Huế về tình hìnhtrực khuẩn Gram âm sinh ESBL, số lượng vi khuẩn sinh ESBL phân lập nhiều

nhất là E coli chiếm 43,5% và K pneumoniae chiếm 53,6% [11].

Tác giả Hoàng Thị Phương Dung, Nguyễn Thanh Bảo, Võ Chi Mai,Khảo sát tại Bệnh viện Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh thì tỷ lệ vi khuẩn

sinh ESBL là 32,4% Trong đó, tỷ lệ sinh ESBL cao nhất là E coli với 71,2%,

tiếp đến là K pneumoniae với 15,2%, Enterobacter với 6,1% [1].

Khảo sát ở Bệnh viện Chợ Rẫy năm 2010, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột

sinh men ESBL cho từng loại vi khuẩn lần lượt như sau: E coli (53,7%),

Klebsiella spp (35,8%), Enterobacter cloacae (0,06%), Citrobacter spp

(2,4%) [5].

Khảo sát ở Bệnh viện 175 năm 2013, tỉ lệ vi khuẩn đường ruột sinh

ESBL như sau, đối với Klebsiella spp chiếm cao nhất 59,21%, tiếp đến là E coli chiếm 48,89% và Proteus spp chiếm 20% [6].

Một nghiên cứu do Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn lý Hoàng Ngân năm

2013 Khảo sát tần suất các gene của vi khuẩn đường ruột sinh ESBL trong

cộng đồng thành phố Hồ Chí Minh, đối với Escherichia coli có tỷ lệ sinh

ESBL là 45,6%, Klebsiella pneumoniae có tỷ lệ 24,4% và Citrobacter spp có

tỷ lệ 0.6% [10] Trong các vi khuẩn đường ruột tiết ESBL trên thì tần suấtmang gen ESBL là: mang 1 gen CTX-M là 28,3%, TEM là 3,5%, SHV là 1%;mang 2 gen TEM/CTX-M là 33,6%, SHV/CTX-M là 6,2%; mang 3 genSHV/TEM/CTX-M là 2,7%; không mang gene nào cả chiếm tỷ lệ 24,7%

1.4.3 Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn đường ruột:

Kháng sinh nhóm β-lactam được khám phá đầu tiên để điều trị nhiễmtrùng do vi khuẩn Gram âm Mà đặc biệt là nhóm vi khuẩn đường ruột sinhESBL là một vấn đề nan giải trong việc điều trị cũng như kiểm soát nhiễm

khuẩn bệnh viện Hiện nay số loại ESBL mới được phát hiện càng nhiều, mỗi

loại có đặc điểm nhạy cảm với KS khác nhau gây khó khăn rất nhiều trongviệc chọn lựa KS để điều trị Vi khuẩn đường ruột là tác nhân gây bệnh chiếm

đa số, mà vi khuẩn thường gặp nhất là Escherichia coli và Klebsiella

pneumoniae, mức độ kháng thuốc đa dạng và có khuynh hướng gia tăng đề kháng E coli đề kháng cao với ampicillin, cephalosporin thế hệ 2 và 3,

fluoroquinolones và đề kháng thấp với ticarcillin-clavulanate,

piperacillin-tazobactam, cefepime, amikacin và carbapenems K peumoniae có tỉ lệ đề kháng carbapenems cao hơn E coli [15] Ngoài ra vi khuẩn E coli và K pneumoniae

sinh ESBL không những đề kháng cao với nhóm kháng sinh β-lactams, mà còn

đề kháng với nhóm kháng sinh khác như gentamicin chiếm 86,6%, ciprofloxacinchiếm 93,3%, trinmethoprim-sulfamethoxazol chiếm 93,3% [11] Theo nghiêncứu ở bệnh viện Nhi Đồng I, năm 2011, vi khuẩn sinh ESBL còn nhạy cao vớiImipenem 98,9% và Meropenem 100% ở tại thời điểm nghiên cứu [13] Còn vớinghiên cứu ở Bệnh viện An Bình năm 2016, vi khuẩn sinh ESBL đề kháng vớiImipenem 8,3%, Meropenem 13,9% [15]

1.4.4 Phòng ngừa vi khuẩn sinh ESBL:

Nhiều trường hợp lây truyền đơn dòng được báo cáo đầu tiên trongnhiều trận dịch liên quan đến nhiều bệnh viện trong một khu vực Lan truyềntrực tiếp từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác cũng là cơ chế quan trọng, vìvậy cách ly để kiểm soát nhiễm khuẩn, bao gồm sử dụng dụng cụ cách ly khitiếp xúc với bệnh nhân hoặc ngay cả môi trường trong bệnh viện, có thể cách

ly được sự lây lan các vi khuẩn sinh ESBL Thuốc diệt khuẩn vẩn còn đóngvai trò chủ chốt, sau khi tháo găng cần rửa tay ngay với nước diệt khuẩn khônhanh hoặc rửa tay theo qui trình trước khi thăm khám bệnh nhân tiếp theo

Đã có ghi nhận được sự lan truyền giữa các bệnh viện với nhau thông quaviệc chuyển bệnh nhân, nên khi có chuyển bệnh nhân nhiễm vi khuẩn khángthuốc thì bệnh viện nơi nhận bệnh nhân cần phải chú ý về mặt vi sinh vàchống nhiễm khuẩn

CHƯƠNG 2.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn mẫu:

Tất cả các bệnh phẩm thường gặp như: máu, nước tiểu, đàm và mủ dịch(tổn thương phần mềm) đã được đưa đến xét nghiệm tại phòng vi sinh Bệnhviện Đa khoa Tỉnh Bạc Liêu Các loại bệnh phẩm được lấy đúng theo quytrình hướng của phòng Vi sinh Bệnh viện Đa khoa Bạc Liêu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

(1) Các mẫu cấy có nhiễm nấm hay quá tạp nhiễm (2) Bệnh phẩmđược chỉ định hai lần (3) Không lấy các chủng vi khuẩn phân lập từ môitrường giám sát nhiễm khuẩn bệnh viện, được loại trừ khỏi nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu mô tả cắt ngang

- Loại vi khuẩn đường ruột (E coli, K pneumoniae, K oxytoca và các

loại vi khuẩn đường ruột khác)

- ESBL dương hay âm

- Gene TEM, SHV, CTX-M-G-1 và CTX-M-G-9 dương hay âm

2.2.4 Phân tích và xử lý số liệu:

Các số liệu thu thập được nhập vào excel 2010 Xử lý số liệu và phântích bằng phần mềm thống kê SPSS 20.0, Tính tỉ lệ %, mô tả, so sánh

2.3 Số chủng vi khuẩn đường ruột dùng để thực hiện multiplex PCR:

Vì thời gian có hạn và kinh phí tốn kém nhiều, nên chúng tôi chọn cỡ

mẫu thấp nhất khoảng 30 mẫu cho mỗi loại vi khuẩn gồm Escherichia coli và Klebsiella pneumoniae với chủng đối chứng là Escherichia coli ATCC 25922

và Klebsiella pneumoniae ATCC 700603.

2.4 Địa điểm thực hiện và thời gian nghiên cứu:

Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 06 - 2017 đến tháng 03 - 2018.Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại :

Phòng vi sinh Bệnh viện Đa khoa Tỉnh Bạc Liêu Thực hiện cấy phân

lập và định danh xác định các vi khuẩn đường ruột thường gặp E coli, K pneumoniae và K oxytoca sinh ESBL.

Phòng Sinh học phân tử, bộ môn Xét nghiệm, Khoa Điều dưỡng- kỹthuật y học, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Thực hiện xácđịnh các vi khuẩn trên sinh ESBL mang kiểu gen thường gặp như: TEM,SHV, CTX-M-Group-1 và CTX-M-Group-9

2.5 Một số kỹ thuật vi sinh lâm sàng:

2.5.1 Cách lấy bệnh phẩm máu:

Lấy máu tĩnh mạch bằng phương pháp vô trùng, thể tích máu được lấy

để cấy chiếm 1/10 hay tối đa là 1/5 thể tích môi trường cấy máu Thôngthường đối với người lớn, mỗi lần cấy, lấy 5-10 ml máu cho vào chai 50ml

môi trường Trẻ em có thể từ 1-3ml cho chai 30ml môi trường (chi tiết được đính kèm phụ lục 1).

2.5.2 Cách lấy bệnh phẩm nước tiểu:

Lấy nước tiểu giữa dòng là kỹ thuật thông dụng nhất hiện nay Dùnggạc vô trùng thấm nước muối sinh lý lau sạch quanh lỗ tiểu, âm hộ, sau đó laukhô bằng gạc vô trùng Tiểu bỏ phần nước tiểu đầu, lấy phần nước tiểu còn lạicho vào vô trùng có nắp đậy chặt Nước tiểu sau khi lấy xong phải được gửiđến phòng xét nghiệm ngay càng sớm càng tốt Nếu chậm trễ, có thể giữ trong

trùng, miệng rộng, có nắp đậy chặt (chi tiết được đính kèm phụ lục 1).

2.5.4 Cách lấy bệnh phẩm mủ (tổn thương phần mềm):

Lau sạch vùng da lành chung quanh với cồn 70% và lau sạch mủ trênvết thương bằng gạc vô trùng thấm nước muối sinh lý vô trùng Dùng tămbông vô trùng lấy chất dập nát hay mô ngay dưới lớp mủ đã lau sạch, cho vào

lọ vô trùng hay môi trường chuyên chở Stuart-Amie Gửi ngay đến phòng xét

nghiệm để yêu cầu nuôi cấy (chi tiết được đính kèm phụ lục 1).

2.6 Vật liệu và phương pháp thực hiện:

2.6.1 Vật liệu:

2.6.1.1 Hóa chất:

Hóa chất dùng để nuôi cấy vi khuẩn: Gồm môi trường MC

(MacConkey Agar), BA (Blood Agar), môi trường chuyên chở bệnh phẩm(Stuart Amie, Carry Blair), BHI (Brain Heart Infusion), BHI+Glycerol 20%(Công ty TNHH Nam Khoa Biotek) Thẻ định danh vi khuẩn Gram dương (GPtest kit code 21342), vi khuẩn Gram âm (GN test kit code 21341), thẻ khángsinh đồ Gram âm AST67 test kit code 413399 (Hãng bioMerieur)

Hóa chất dùng trong PCR gồm bột agar tinh sạch, Ecodye dùng đểnhuộm gene, TEA (Tris Acetate EDTA), bộ thuốc thử dùng để tách chiếtDNA của vi khuẩn bằng phương pháp cột (Khoa Thương)

Bộ mồi chẩn đoán gene: TEM, SHV, Group-1, Group-9 và 16S rRNA

CTX-M-Bảng 2.1: Trình tự mồi dùng trong nghiên cứu

Gene Mồi Trình tự (5’→3’)

Kích thước Sản phẩm (bp)

Tài liệu tham khảo

2.6.1.2 Thiết bị:

Tủ an toàn sinh học cấp II (Esco Singapore), tủ ủ 370

C (Memmert Đức), bình nến ủ CO2 bằng thủy tinh, máy định danh tự động Vitek2 compact

(Hãng bioMerieux), máy đo độ đục chuẩn của vi khuẩn (Hãng bioMerieux), khay đựng ống nghiệm và thẻ định danh (Hãng bioMerieux), máy điều nhiệt

tự động (Hãng Bio-Rad), máy ly tâm lạnh (Velocity 15µ Dynamica), máy Vortex Genius 3 ( IKA Đức), máy điện di, máy chụp gel, máy đo nồng độ DNA (Hãng Bio-Rad).

2.6.1.3 Vật tư tiêu hao:

Gồm có que cấy định lượng, que cấy phân lập, đèn cồn, tăm bông, lọ vô

khuẩn, nước muối 0.45%, ống nhựa polytyren 12x75mm (Hãng bioMeriux),

dụng cụ phân phối nước muối, pipette 147µl, pipette 280µl, bộ chuẩn máy độđục, eppendorf, đầu tip từ 100- 1000µl, đầu tip từ 50- 200µl, đầu tip từ 10-

100µl, đầu tip từ 0.5- 10µl, đầu tip từ 5- 50µl (Axygen).

2.6.2 Phương pháp thực hiện:

2.6.2.1 Phương pháp cấy phân lập:

Bệnh phẩm máu: Chai cấy máu được ủ trong tủ ấm 370

C và theo dõimỗi ngày trong 7 ngày xem có vi khuẩn mọc hay không trên pha đặc, nếukhông có vi khuẩn mọc thì tráng pha lỏng lên pha đặc Cấy mù được thựchiện trong 2 ngày: là vào ngày thứ 2 và ngày thứ 6 trên thạch BA ủ tủ ấmCO2 hay bình nến trong 24h, vì có một số vi khuẩn dễ bị ly giải sau khi mọc

trên môi trường lỏng như: S pneumoniae Bất cứ lúc nào phát hiện có dấu

hiệu vi khuẩn mọc trên pha đặc hay cấy mù trên BA, tiến hành làm phiến phếtnhuộm Gram và định danh vi khuẩn

Bệnh phẩm nước tiểu: Dùng khuyên cấy định lượng 1µl, lấy đầy một

vòng cấy trải toàn bộ lên bề mặt hộp thạch nuôi cấy (môi trường BA và MC),

ủ BA trong bình nến, MC ủ thường trong tủ ủ 370

C/24 giờ, đọc kết quả bằngcách đếm khúm khuẩn để biết số lượng vi khuẩn trong mầm cấy ban đầu, sau

đó suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống (Colony Forming Unit= CFU) trong1ml nước tiểu Nếu ≤ 10000 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng 10000

- ≤ 100000 CFU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng tiểu ≥ 100000 CFU/mlnước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu, định danh vi khuẩn

Bệnh phẩm đàm: Trước khi cấy phân lập và định danh vi khuẩn phải

đánh giá mẫu đàm có tin cậy hay không, nếu tin cậy thì tiến hành cấy phân lậpngay, còn mẫu đàm không tin cậy thì không tiến hành nuôi cấy mà yêu cầulâm sàng lấy lại mẫu đàm, dựa theo thang điểm Barlett đánh giá mẫu đàm

(đính kèm phần phụ lục 1 ).

Mẫu đàm được tiến hành cấy 3 chiều trên môi trường BA ủ trong bìnhnến 370C/24 giờ và môi trường MC ủ thường trong tủ ủ 370C/24 giờ Sau đóquan sát khúm khuẩn mọc, và tiến hành làm phiến phết nhuộm Gram, địnhdanh xác định vi khuẩn

Bệnh phẩm mủ: Sau khi bệnh phẩm được cho vào môi trường chuyên

chở Stuart – Amie, tăng sinh vi khuẩn trong môi trường BHI lỏng, ủ 1giờ/370

C Rồi tiến hành cấy 3 chiều trên môi trường BA ủ trong bình nến

370C/24 giờ, môi trường MC ủ thường trong tủ ủ 370C/24 giờ Sau đó quansát khúm khuẩn mọc, và tiến hành nhuộm Gram, định danh xác định vi khuẩn

2.6.2.2 Phương pháp định danh vi khuẩn bằng máy Vitek2compact:

Nguyên lý định danh vi sinh vật và làm kháng sinh đồ bằng máy tựđộng Vitek®2 compact 30 (Hãng bioMerieur) là theo dõi liên tục sự phát triểncủa vi sinh vật trong các giếng của thẻ (Card) Sự suy giảm ánh sáng khi điqua các giếng, hệ thống quang học sự dụng ánh sáng với các bước sóng thíchhợp để theo dõi trực tiếp vi sinh vật phát triển thông qua cường độ ánh sáng bị

chặn lại khi ánh sáng đi qua các giếng của thẻ Hệ thống máy sử dụng cácbước sóng là 660nm, 568nm, 528nm

Thực hiện định danh vi khuẩn:

Vi khuẩn cần định danh đã được nuôi cấy thuần nhất trên BA sau khi ủ18-24 giờ Tiến hành nhuộm Gram, nếu là cầu trùng Gram dương làmcatalase, catalase dương tính thì sử dụng thẻ định danh tụ cầu, catalase âmtính thì sử dụng thẻ định danh phế cầu, nếu là trực khuẩn Gram âm thì sửdụng thẻ định danh GN test kit code 21341, thẻ kháng sinh AST 67 test kitcode 413399

Chuẩn bị hai ống nước muối vô trùng để pha độ đục chuẩn cho cả vikhuẩn Gram dương và Gram âm là 0.5 – 0.63 McFarland Sau đó được tiếnhành trên hệ thống máy tự động VITEK2 compact của hãng bioMerieux sửdụng thẻ định danh GN 21341 và thẻ kháng sinh AST67 test kit code 413399,phù hợp với hướng dẫn của nhà sản xuất Kết quả cuối cùng được phân tíchbằng phần mềm Advanced Expert System (AES) của hệ thống máy VITEK2compact, thời gian hoàn thành định danh ra chủng vi khuẩn là từ 18 đến 24giờ Quy trình chuẩn bị mẫu thực hiện định danh và làm kháng sinh đồ của

máy tự động VITEK2 (được đính kèm ở phụ lục 2).

2.6.2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng máy tự động Vitek2 compact:

Thông qua quá trình phân tích KSĐ bằng card AST-GN67, hệ thống

máy Vitek®2 compact có khả năng phát hiện các vi khuẩn Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca tiết ESBL.

Thử nghiệm ESBL của máy tự động Vitek2 compact là thử nghiệm xácđịnh các chủng vi khuẩn sinh ESBL này bị ức chế bởi axit clavulanic, sử dụng

3 cặp kháng sinh là cefepime, cefotaxime, và ceftazidime, có và không có axitclavulanic, để xác định kết quả dương tính hay âm tính Phân tích bằng thẻ

kháng sinh AST 67 của hãng bioMériuex chuyên cho vi khuẩn Gram âm với

16 loại kháng sinh, đại diện cho nhiều nhóm kháng sinh khác nhau Sử dụng 6giếng kháng sinh trong thẻ AST 67 test kit code 413399 để phát hiện ESBLlà: Cefepime 1,0µg/ml, Cefotaxime 0,5µg/ml, Ceftazidine 0,5µg/ml,Cefepime + acid clavulanic 10µg/ml, Cefotaxime + acid clavulanic 4µg/ml,Ceftazidine + acid clavulanic 4µg/ml

Phần mềm AES (Advanced Expert System) được sử dụng để phân tíchkết quả, cập nhật theo tiêu chuẩn của CLSI năm 2017 Máy theo dõi liên tục

sự phát triển của vi khuẩn trong từng giếng kháng sinh, nếu như có giảm tỉ lệtăng trưởng ở giếng có chứa các kháng sinh cephalosporins cộng acidclavulanic so với giếng chứa các kháng sinh cephalosporins không có acidclavulanic thì được xem là ESBL dương tính Vì ESBL dương nên máy sẽbiện luận kết quả lại, khi đó nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là S (Susceptible)hay I (Intermediate) đều sẽ chuyển về R (resistant), Ceftazidime, cefotaximehay cefepime là kháng sinh nhóm beta-lactam nên sẽ không điều trị được vớinhững vi khuẩn sinh men ESBL Trên kết quả R có dấu (*) kế bên, đây làđiểm nổi bật của hệ thống máy tự động Vitek®2 compact 30

2.6.2.4 Thực hiện nội kiểm và ngoại kiểm:

Thực hiện nội kiểm: Kèm với mẫu chủng chuẩn K pneumoniae

ATCC 70063 ESBL dương tính và mẫu chủng chuẩn E coli ATCC 25922

ESBL âm tính Một tuần thực hiện một lần hoặc khi có lô thuốc thử mới

Thực hiện ngoại kiểm: Tham gia ngoại kiểm ở trung tâm kiểm chuẩn

xét nghiệm TP Hồ Chí Minh (Địa chỉ: 75A Cao Thắng, Phường 3, Quận 3,

TP HCM) Một năm có đợt, 3 tháng thực hiện một lần gồm có: Nhuộm Gram,Nhuộm Ziehl neelsen, mẫu định danh vi khuẩn và kháng sinh đồ

Sơ đồ tóm tắt quá trình định danh vi khuẩn bằng máy tự động

Vitek®2 compact 30

Nước tiểu

Sau cùng định danh được tên các vi khuẩn trong nghiên cứu và vi khuẩn

đường ruột sinh men ESBL.

Cấy phân lập trên môi trường BA

ủ bình nến , MC ủ 37 0

C/24 giờ

Không có vi khuẩn mọc trên môi trường BA.

Thực hiện định danh vi khuẩn và xác định ESBL bằng

Máy tự động VITEK2 compact.

Chủng ESBL (n=30); cho mỗi loại E coli và K.

pneumoniae thực hiện các kiểu gene thường gặp

TEM, SHV, CTX-M-G1 và CTX-M-G9