Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệ identifiler từ quần thể người hoa ở các tỉnh phía nam

Tình hình nghiên cứu khảo sát tần suất các alen của các gen sử dụng trong giám định ADN đối với người Hoa .... Tóm tắt kết quả nghiên cứu:- Đã thu được mẫu máu từ 200 người dân tộc Khmer

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng ở trong bất

kỳ công trình nào khác

TÁC GIẢ

TRẦN TÖ QUYÊN

DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

Stt Họ và tên, học hàm

học vị

Tổ chức công tác Nội dung công việc tham gia

1 BS Trần Tú Quyên(Chủ nhiệm đề tài)

Phân việnKHHS

Thuyết minh, tổng quan báocáo, phân tích xử lý số liệu,báo cáo tổng kết

2 ThS Đỗ Minh Trí

(Thƣ ký đề tài)

Phân việnKHHS

Phân tích mẫu, xử lý số liệu,thuyết minh, tổng quan báo cáo

3 BS Cao Xuân Trung Phân viện

KHHS Thu, phân tích mẫu

4 TS Lê Thị Thu Thủy Viện KHHS Xử lý số liệu, tổng hợp số liệu

5 ThS Trịnh Tuấn Toàn Viện KHHS Xử lý số liệu, tổng hợp số liệu

6 CN Vũ Việt Hoài

Thanh

Phân việnKHHS Phân tích mẫu, xử lý số liệu

7 ThS Nguyễn Danh

Lâm

Phân việnKHHS Phân tích mẫu, xử lý số liệu

8 CN Châu Thị Lệ Phân viện

KHHS Phân tích mẫu, xử lý số liệu

9 CN Huỳnh Thanh Phân viện

KHHS Thu, phân tích mẫu

10 BS Đoàn Công Viên

TT Y tế Dựphòng-Sở Y

Tế TP HCM

Thu, phân tích mẫu

MỤC LỤC

Trang TRANG BÌA

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Cơ sở khoa học và sự ra đời của giám định gen: 5

1.1.1 Khái niệm về gen: 5

1.1.1.1 Các quan niệm cổ điển về gen……… 5

1.1.1.2 Các khái niệm hiện đại về gen 5

1.1.1.3 Khái niệm về giám định gen 6

1.1.2 Sự ra đời của giám định gen: 6

1.1.2.1 Sự ra đời của sinh học phân tử: 6

1.1.2.1 Cấu trúc và chức năng của phân tử ADN: 7

1.1.2.3 Sự ra đời của giám định gen:… 9

1.1.3 Di truyền quần thể:……… … 10

1.1.3.1 Tính đa dạng di truyền: 10

1.1.3.2 Định luật Hardy-Weinberg: 11

1.1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến Định luật Hardy-Weinberg: 12

1.1.4 Giám định ADN:…… 13

1.1.4.1 Các gen sử dụng trong giám định: 13

1.1.4.2 Các tiêu chuẩn cho gen STR dùng trong giám định ADN 17

1.1.4.3 Cơ sở lý thuyết để tính tần suất và vai trò của cơ sở dữ liệu tần suất các alen 19

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen

của các gen sử dụng trong giám định ADN 21

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước: 25

1.2.3 Tình hình nghiên cứu khảo sát tần suất các alen của các gen sử dụng trong giám định ADN đối với người Hoa 27

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 28

2.1.1 Thiết kế nghiên cứu: 28

2.1.2 Dân số mục tiêu và dân số chọn mẫu: 28

2.1.3 Cõ mẫu và cơ sở chọn mẫu: 28

2.1.4 Tiêu chuẩn chọn mẫu: 29

2.1.5 Phương pháp thu thập mẫu: 30

2.1.6 Công cụ thu thập số liệu: 30

2.1.7 Kiểm soát sai lệch: 30

2.1.8 Vấn đề y đức: 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 31

2.2.1 Phân tích mẫu theo qui trình: 31

2.2.2 Tách chiết ADN… ……… ……… …… ….34

2.2.3 Định lượng ADN… …… ……… ……… 36

2.2.4 Nhân bội ADN… ……… ……… .37

2.2.5 Điện di sản phẩm PCR và phân tích kết quả:.… ……… 40

2.3 Xử lý số liệu thống kê 43

2.3.1 Cơ sở lý thuyết 43

2.3.2 Phương pháp xử lý thống kê 43

2.3.3 Các bước tính toán thống kê và kiểm định: 45

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

3.1 Phân tích kiểu gen của 200 mẫu máu người Hoa 46

3.1.1 Kết quả thu, bảo quản mẫu, tách chiết và định lượng ADN 46

3.1.2 Kết quả thực hiện phản ứng PCR, điện di và phân tích kiểu gen 49

3.2 Kết quả xử lý số liệu thống kê 53

3.2.1 Kết quả quan sát các alen ở từng gen, tính toán tần số và các chỉ số …….53

3.2.2 Kết quả tính tần suất alen của 15 locus gen người Hoa: 62

3.2.3 Đánh giá sự phù hợp với định luật Hardy - Weinberg 66

Chương 4: BÀN LUẬN … ……… 67

KẾT LUẬN … … ……….78

KIẾN NGHỊ … … ……….79 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC:

BẢNG CÂU HỎI THU MẪU LÀM DANH BẢN ADN

DANH SÁCH 200 CÁ THỂ NGƯỜI HOA

BẢNG KIỂU GEN PHÂN TÍCH TỪ 200 MẪU MÁU NGƯỜI HOA

BẢNG TẦN SUẤT CÁC ALEN CỦA 15 GEN HỆ DENTIFILER NGƯỜI HOA

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

tắt

Viết đầy đủ tiếng nước

2 ADN Acid Deoxyribo Nucleotide

3 ARN Acid Ribonucleotide Axít Ribonucleotit

9 ID Identifiler Hệ 16 locus gen STR do hãng

ABI nghiên cứu và phát triển

12 PBS Phosphate-Buffered Saline Dung dịch đệm sử dụng trong

nghiên cứu sinh học

13 PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

12 STR Short Tandem Repeat Trình tự các đoạn lặp ngắn

14 VNTP Variable Number of

Tandem Repeat

Trình tự các đoạn lặp trungbình

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Tần số của các kiểu kết hôn và tần số các kiểu gen ở thế hệ sau theo

định luật Hardy-Weinberg 12

Bảng 1.2 Các locus gen hệ Identifiler 23

Bảng 2.1 Hóa chất và thiết bị cho tách chiết ADN 35

Bảng 2.2 Hóa chất và thiết bị cho định lượng ADN 36

Bảng 2.3 Hóa chất và thiết bị cho nhân bội ADN 38

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 39

Bảng 2.5 Hóa chất và thiết bị điện di 42

Bảng 3.1 Nồng độ ADN tách chiết từ 200 mẫu máu người Hoa 46

Bảng 3.2 Số lượng alen quan sát được ở gen D8S1179 52

Bảng 3.3 Số lượng alen quan sát được của gen D21S11 54

Bảng 3.4 Số lượng alen quan sát được của gen D7S820 55

Bảng 3.5 Số lượng alen quan sát được của gen CSF1PO 55

Bảng 3.6 Số lượng alen quan sát được của gen D3S1358 56

Bảng 3.7 Số lượng alen quan sát được của gen TH01 57

Bảng 3.8 Số lượng alen quan sát được của gen D13S317 58

Bảng 3.9 Số lượng alen quan sát được của gen D16S539 59

Bảng 3.10 Số lượng alen quan sát được của gen D2S1338 60

Bảng 3.11 Số lượng alen quan sát được của gen D19S433 62

Bảng 3.12 Số lượng alen quan sát được của gen vWA 62

Bảng 3.13 Số lượng alen quan sát được của gen TPOX 63

Bảng 3.14 Số lượng alen quan sát được của gen D18S51 65

Bảng 3.15 Số lượng alen quan sát được của gen D5S818 66

Bảng 3.16 Số lượng alen quan sát được của gen FGA 67

Bảng 3.2.2 Tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler người Hoa 68

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu tạo ADN trong nhân tế bào……… ……… 8

Hình 1.2 Sơ đồ các gen hệ Identifiler Biosystems 25

Hình 1.3 Bộ kit Identifiler của hãng Applied 26

Hình 2.1 Danh bản ADN được thiết kế để thu mẫu 32

Hình 2.2 Thẻ FTA dùng để thu mẫu máu 33

Hình 2.3 Hình ảnh sơ đồ qui trình giám định ADN 33

Hình 2.4: Sơ đồ minh họa phương pháp tách chiết ADN 36

Hình 2.5 Hình ảnh chu kỳ ngưỡng và tín hiệu huỳnh quang trên máy Real Time PCR định lượng ADN 37

Hình 2.6 Hình ảnh máy PCR 9700 nhân bội gen 39

Hình 2.7 Hình ảnh sơ đồ phản ứng nhân gen (PCR) 40

Hình 2.8 Hình ảnh máy điện di ABI 3130 41

Hình 3.1 Hình ảnh điện di điển hình trên máy điện di 3130 48

Hình 3.2 Hình ảnh kiểu gen hệ Identifiler của người Hoa (HOA112) 49

Hình 3.3 Hình ảnh kiểu gen hệ Identifiler của người Hoa (HOA113) 50

Hình 3.4 Hình ảnh kiểu gen hệ Identifiler của người Hoa (HOA116) 51

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

Tên đề tài: Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen

hệ Identifiler trong quần thể người Hoa ở các tỉnh phía Nam

Mã số đề tài: BH-2015-C54-10

Chủ nhiệm đề tài: Trung tá Trần Tú Quyên

Đơn vị chủ trì đề tài: Phân viện Khoa học hình sự

Thời gian thực hiện đề tài:

3 Tính mới và sáng tạo:

Lần đầu tiên tại Việt Nam, 200 mẫu máu của 200 cá thể người Khmerđược thu thập, xác định kiểu gen, đưa ra bảng tần suất các alen của 15 locustheo hệ Identifiler

4 Tóm tắt kết quả nghiên cứu:

- Đã thu được mẫu máu từ 200 người dân tộc Khmer ở các tỉnh phíaTây Nam Bộ và phân tích theo quy trình giám định ADN của Viện Khoa họchình sự và thu được bảng kiểu gen đầy đủ theo hệ Identifiler của từng các thể

- Đưa ra bảng dữ liệu tần suất đầy đủ các alen của 15 locus gen hệIdentifiler của người dân tộc Khmer Bảng dữ liệu tần suất này đã được kiểmđịnh và cho thấy 200 mẫu khảo sát (mẫu thực nghiệm) phù hợp với quần thể

lý thuyết

5 Tên sản phẩm:

- Bản báo cáo khoa học về dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen hệIdentifiler từ quần thể người dân tộc Khmer ứng dụng trong giám định gen (ADN)các vụ án liên quan đến người dân tộc Khmer

- Bảng tần suất các alen của 15 locus gen hệ Identifiler người dân tộcKhmer

6 Các sản phẩm khoa học:

- Tên bài báo: Tần suất alen của các locus STR hệ Identifiler của quần

thể người Tày và người Khmer Nam Bộ.

- Đăng trên Tạp chí Khoa học tự nhiên và Công nghệ - Đại học Quốcgia Hà Nội, Tập 31, Số 4S (2015), Trang 437-444

7 Kết quả tham gia đào tạo sau đại học:

1 Lê Thanh Cừ Khảo sát và xây dựng cơ sở

dữ liệu tần suất các alen của

15 locus gen hệ Identifiler

từ quần thể người dân tộc

Thạcsỹ

- Chủ nhiệm đềtài tham giahướng dẫn

- Kết quả bảo

giám định ADN

8 Hiệu quả, phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng

áp dụng.

- Hiệu quả, khả năng áp dụng kết quả nghiên cứu:

+ Kết quả của đề tài được sử dụng để tính tần suất truy nguyên đồngnhất cá thể, xác định quan hệ huyết thống cha - mẹ - con cho người dân tộcKhmer

+ Tại Việt Nam không chỉ Viện Khoa học hình sự thực hiện giám địnhADN mà còn có nhiều tổ chức khác cũng triển khai lĩnh vực giám định, xétnghiệm ADN phục vụ tố tụng cũng như các yêu cầu ngoài tố tụng Vì vậy, kếtquả của đề tài có thể được áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực giám định ADNtruy nguyên cá thể, xác định huyết thống, áp dụng cho các cơ quan tố tụng,các phòng thí nghiệm giám định ADN người

- Phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Kết quả của đề tài được chuyển giao dưới dạng đào tạo, hướng dẫn sửdụng tại các tổ chức giám định ADN, các cơ quan tố tụng:

+ Đề xuất bổ sung bảng tần suất các alen của dân tộc Khmer tại ViệtNam vào Quy trình giám định ADN (đã được ban hành kèm theo Thông tư số46/2013/TT-BCA ngày 05/11/2013 của Bộ trưởng Bộ Công an) để ứng dụngtại Viện Khoa học hình sự, các Phân Viện Khoa học hình sự và các phòng Kỹthuật hình sự tại các tỉnh có triển khai giám định ADN trong việc tính xác suấttruy nguyên cá thể, xác định quan hệ huyết thống trong các vụ án hình sự, dân

sự và các yêu cầu cá nhân khác

+ Interpol và cảnh sát các nước có giám định ADN: khi được yêu cầu,Viện Khoa học hình sự sẽ cung cấp bảng tần suất các alen để giám định ADNđối với tội phạm là người Khmer đang sinh sống, làm việc ở các nước sở tại

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN - Axit Deoxyribo Nucleic

ARN - Axít ribonucleic


VNTR - Variable Number of Tamden Repeat - Các trình tự l p ng n

STR - Short Tamden Repeat - Các trình tự l p ng n

ID - Identifiler/Identify definition

PCR - Polymerase Chain Reaction - Ph n ứng chu i tr ng hợp

T - Tên riêng của m t vật mang thu m u máu d ng th trong khoa h c hìnhsự

bp - Base pair

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế kỷ 21 với sự phát triển vượt bậc của khoa học công nghệ, đã vàđang tạo nên hệ thống công cụ hiện đại trợ giúp các nghiên cứu liên quan đếnmọi bí ẩn của con người Công nghệ gen (ADN) chính là một thành công tolớn trong hệ thống nghiên cứu ấy Trong lĩnh vực khoa học hình sự, giámđịnh gen (ADN) mở ra một phương pháp truy nguyên cá biệt chính xác vàhiệu quả, giúp các nhà điều tra tìm ra thủ phạm trong các vụ án thông qua việcphân tích các dấu vết, mẫu vật có nguồn gốc từ cơ thể người như: máu, lôngtóc, tinh trùng, mô tế bào, xương, răng…Mặt khác, thông qua giám định ADN

từ các mẫu vật, có thể xác định các mối quan hệ huyết thống cha - mẹ - con,

họ hàng, xác định tung tích nạn nhân trong các vụ thảm họa, xác định hài cốt,làm thẻ ADN cá nhân

Giám định gen là ứng dụng kỹ thuật, công nghệ hiện đại của sinh họcphân tử nhằm phân tích các đặc điểm của dấu vết mẫu vật hay cá thể ngườidựa trên nền tảng của giám định sinh học Giám định gen phân tích các đặcđiểm của dấu vết, mẫu vật và cá thể người ở mức độ phân tử Trong giámđịnh gen, phân tử cần nghiên cứu, phân tích chính là ADN (Axit DeoxyriboNucleic), một thành phần quan trọng trong cấu tạo của nhiễm sắc thể (NST),ADN là vật liệu mang thông tin di truyền đóng vai trò quyết định trong việc ditruyền các đặc điểm từ thế hệ này đến thế hệ khác của cơ thể sống [5]

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định cá thể người: nhậnbiết qua vân tay, tiếng nói, nhận biết các yếu tố di truyền như: xác định cácnhóm kháng nguyên hồng cầu (nhóm máu), xác định một số yếu tố proteintrong huyết thanh, xác định một số enzym, nhưng khả năng phân biệt cònthấp Phải đến những năm cuối thế kỷ 20, đặc biệt là thập kỷ 80, 90 các nhàkhoa học hình sự mới ứng dụng công nghệ gen (DNA- Technology) vào trongxác định tội phạm Năm 1984 Alec Jeffreys và các cộng sựở trường đại học

máu người đã phát hiện ra trình tự của các bazơnitơđược lặp lại một số lần vớichiều dài đoạn lặp từ 10- 15 bp (base pair), các đoạn lặp này được gọi là tiểu

vệ tinh (minisattelite) Đây chính là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triểncủa Khoa học hình sự thế giới nói chung và Sinh học pháp lý nói riêng Cáctiểu vệ tinh được phát hiện thấy trong mọi tế bào vàở những vị trí khác nhautrong hệgen người Điều đáng chú ý là số lần lặp lại các đoạn lặp này ở các cáthể khác nhau thì khác nhau Alec Jeffreys coi đây làđặc điểm rất quan trọng

để phân biệt sự khác nhau giữa các cá thể (truy nguyên cá thể) Giám định

gen cho mục đích Tư pháp ra đời từđây [14] Giám định gen ra đời không

chỉ khắc phục được những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học màcòn giải quyết được những vụ án bế tắc trước đây- những vụ án mà ADN làbằng chứng duy nhất

Vấn đề đặt ra là độ tin cậycủa phân tích ADN như thế nào? Trong giámđịnh ADN, để xác định (truy nguyên) một cá thể đòi hỏi bắt buộc phải tínhxác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể có cấu trúc di truyền trùng lặpvới ADN của mẫu vật cần giám định hay không Để tính toán được xác suấtnày thì phải có dữ liệu tần suất của từng alen [5, 9], với xác suất tính đượccàng lớn thì độ tin cậy trong giám định càng cao

Tần suất alen là tỉ lệ xuất hiện của một alen nào đó trong quần thể ở mộtlocus gen trên nhiễm sắc thể(alen là những trạng thái biểu hiện khác nhau củamột locus gen chiếm một vị trí xác địnhtrên nhiễm sắc thể), các gen nằm trêncác nhiễm sắc thể khác nhau từ cặp số 1 đến cặp số 23 Các nhà nghiên cứuthường sử dụng những gen khác nhau trên những nhiễm sắc thể (NST) khácnhau để bảo đảm tính phân ly độc lập và tính đa hình cao, mỗi gen có nhiềualen khác nhau Do vậy sẽ có rất nhiều đặc điểm khác nhau được phân tích.Theo lý thuyết di truyền học, mỗi một quần thể khác nhau có những đặcđiểm di truyền đặc trưng, thể hiện bằng sự phân bố tần suất alen trong mỗiquần thể là khác nhau và không thể áp dụng cơ sở dữ liệu của quần thể này

một hoặc nhiều gen ở một quần thể người nhất định thông qua việc thu thậpmẫu của những người cùng trong quần thể người đóở nhiều vùng địa lý khácnhau vàkhông có quan hệ họ hàng huyết thống Số lượng các mẫu cần phântích phải đủ lớn để bảo đảm được độ tin cậy, có nghĩa là kết quả phân tíchthống kê tần số alen và kiểu gen phải phù hợp giữa mẫu nghiên cứu và quầnthể lý thuyết [15] Tần suất này có giá trị để xác định độ tin cậy trong truynguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống.

Hiện nay, Phân viện khoa học hình sự tại thành phố Hồ Chí Minh cũngnhư lực lượng kỹ thuật hình sự cả nướcđang sử dụng bộ kit Identifiler củahãng AppliedBiosystem trong giám định ADN(Kit Identifiler gồm 15 gen trênNST thường và một gen trên NST giới tính) Do đó, các nghiên cứu đượcthực hiện đều tiến hànhkhảo sát các alen của 15 gen trên NST thường

Việt Nam có 54 dân tộc, trong đó dân tộc Kinh chiếm tỉ lệ lớn nhất (gần90%) [1] và đã có cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen người Việt(Kinh) [11]; cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 gen người dân tộc H'mông.Còn lại một số các dân tộc khác cũng đang được tiến hành nghiên cứu khảo sátnhư: các dân tộc Tây nguyên, dân tộc Khmer ở Sóc Trăng [15], tuy nhiên chưa cómột nghiên cứu nào khảo sát về người Hoa

Người Hoaở Việt Nam cư trú tại 63 tỉnh, thành phố Theo Tổng điều tradân số và nhàở năm 2009 (dữ liệu mới nhất 2016 chưa được công bố), ngườiHoa ở Việt Nam có dân số 823.071 người, cư trú tập trung tại Thành phố HồChí Minh, và rải rác ở các tỉnh phía Nam [1] Những địa bàn nàyđều là nhữngđiểm nóng về tình hình an ninh và trật tự an toàn xã hội Việc mở rộng quan

hệ quốc tế và hội nhập kinh tế quốc tế hướng đất nước vào thời kỳ phát triển,tăng trưởng và bền vững, bên cạnh đó việc giữ gìn ổn định an ninh trật tựcũng là một trọng trách nặng nề cho các lực lượng thực thi pháp luật Bởi bêncạnh những thành tựu đạt được lại có muôn vàn khó khăn mà đất nước phảiđối mặt như diễn biến phức tạp của tình hình khu vực và quốc tế, tội phạm đa

sắc tộc, tội phạm công nghệ cao, trong đó người Hoa là một trong những vấn

đề cần được quan tâm

Hàng năm số lượng các vụ việc liên quan đến người Hoa được trưng cầugiám định ADN tại Phân viện Khoa học hình sự có chiều hướng gia tăng.Cụthể: năm 2013 có 47 vụ, năm 2014 có 56 vụ và năm 2015 có 69 vụ

Việc tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất

các alen của 15 gen hệ Identifiler từ quần thể người Hoa ở các tỉnh phía Nam” là một yêu cầu cấp thiếtđể đảm bảo tính chính xác và khách quan trong

kết luận giám định ADN những vụviệc có liên quan đến người Hoa

Luận văn thạc sỹ y học này là một nhánh nghiên cứu của Đề tài khoahọc cấp Bộ mà tôi cùng nhóm nghiên cứu đã tiến hành từ tháng 12 năm 2015đến tháng 6/2017 Dữ liệu của đề tài là cơ sở vững chắc để phân tích, đánh giá

và kết luận giám định, có ý nghĩa cao kể cả về khoa học và thực tiễn

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát

Khảo sát và xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus genhệIdentifiler từ quần thể người Hoa ở các tỉnh phía Nam

Mục tiêu cụ thể

1 Phân tích ADN của 15 locus gen theo hệ Identifiler từ 200 cá thể ngườiHoa tại các tỉnh phía Nam và tính tần suất các alen của 15 gen này

2 Xây dựng bảng cơ sở dữ liệu tần suất các alen của 15 locus gen(ADN) hệ Identifiler từ quần thể người Hoa phục vụ cho công tác giám địnhADN

3 Xác định tính đa hình và các alen hiếm trong 15 locus gen (ADN) hệIdentifiler từ quần thể người Hoa

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Cơ sở khoa học và sự ra đời củagiám định ADN

1.1.1 Khái niệm về gen

1.1.1.1 Các quan niệm cổ điển về gen

G Mendel (1965) là người đầu tiên đưa ra định nghĩa về gen Gen lànhân tố (factor) xác định một trong hai tình trạng tương phản Như vậy, genđược coi là một đơn vị di truyền tách biệt

T.H Mocgan (1911-1926) là người đầu tiên cụ thể hoá khái niệm vềgen: Gen là đơn vị di truyền nằm trên nhiễm sắc thể (NST) không thể chianhỏ hơn và đồng thời có vai trò sau:

- Đơn vị chức năng: Các phần của gen nếu có tồn tại thì không thể hoạtđộng chức năng

- Đơn vị tái tổ hợp: trao đổi chéo chỉ xảy ra giữa các gen mà không xảy

ra bên trong một gen Vì gen không bị chia nhỏ bởi trao đổi chất nên nó đượcxem là đơn vị cấu trúc cơ sở

- Đơn vị đột biến: Gen bị biến đổi như một đơn vị hoàn chỉnh chứkhông có các thành phần nhỏ hơn trong nó bị biến đổi

Các quan niệm cổ điển này có các hạn chế nhất định và đã được cáccông trình nghiên cứu sau này làm sáng tỏ

1.1.1.2 Các khái niệm hiện đại về gen

Khi gen được nghiên cứu chi tiết hơn thì các thuật ngữ liên quan đếnlĩnh vực di truyền học cũng được sử dụng rộng rãi Khái niệm gen được hoànthiện dần Cho đến nay, định nghĩa về gen là dựa trên giả thuyết “một gen-một polypeptid”; gen là một đơn vị của ADN mã hoá một polypeptid hoặcmột phân tử ARN cấu trúc Gen bao gồm các vùng nằm trước và sau vùng mã

Các gen nằm trên các NST và nơi một gen cụ thể định vị trên NSTngười ta gọi là locus của gen đó Ở các sinh vật lưỡng bội, các NST sắp xếpthành các cặp tương đồng Trên cặp NST tương đồng, tại các vị trí tương ứngtồn tại các trạng thái khác nhau của một gen gọi là các alen (allele) Mỗi cáthể đều nhận được 2 alen: một alen từ bố và một alen từ mẹ Nếu 2 alen củamột locus gen có trình tự hoàn toàn giống nhau gọi là đồng hợp tử, còn kháckhác nhau gọi là dị hợp tử [5, 16].

1.1.1.3 Khái niệm về giám định gen

Giám định gen là nghiên cứu, phân tích ADN từ các dấu vết, vật chứng

có nguồn gốc từ cơ thể người ở góc độ phân tử Thông qua phân tích ADN đểxác định truy nguyên, nhận dạng cá thể trong các vụ án hình sự, tìm tung tíchnạn nhân, người mất tích trong các vụ cháy, vụ tai nạn, thảm họa…hoặc xácđịnh quan hệ huyết thống [26, 27]

1.1.2 Sự ra đời của giám định gen

1.1.2.1 Sự ra đời của sinh học phân tử

Thuyết tiến hoá của Darwin và Wallace cho thấy thế giới sống khôngbất biến Thông qua sự chọn lọc tự nhiên từ thế hệ này sang thế hệ khác, ởmỗi thế hệ có thể xuất hiện các biến đổi để phù hợp với điều kiện ngoại cảnh.Thuyết tiến hoá và thuyết tế bào trở thành cơ sở của ngành sinh hoá vànghành di truyền học Năm 1865, nhà bác học người Áo Gregor Medel đãcông bố công trình nghiên cứu và các định luật di truyền, song bản chất ditruyền vẫn còn chưa giải thích được

Mãi đến năm 1944 các nhà khoa học đã chứng minh được rằng bảnchất di truyền của sinh vật là do axit nucleic (bao gồm axit Deoxyribonucleic

- ADN và Axit Ribonucleic - ARN) quyết định, nhờ các công trình nghiêncứu của Oswald Avery, Colin Macleod và Maclyn Macarty Những phân tử

ADN, ARN đóng vai trò quyết định đến các đặc tính di truyền và hoạt độngkhác nhau của cơ thể [2].

Năm 1953, hai nhà khoa học James D Watson (Mỹ) và Francis H.C

Crick (Anh) đã công bố mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép phân tử ADN.Đây

là mốc chính thức đánh dấu sự ra đời của Sinh học phân tử.Từ khi ra đời

đến nay, nhờ có các kỹ thuật và thiết bị hiện đại (kính hiển vi điện tử, máynhân gen - kỹ thuật PCR, máy giải trình tự gen, chương trình tin - sinh học…)tạo đà cho các công nghệ ADN, công nghệ enzyme - protein, công nghệ tếbào động vật, thực vật, công nghệ vi sinh phát triển, đạt được những thành tựu

to lớn trong các nghiên cứu nói chung và sinh học phân tử nói riêng, góp phầnvào sự phát triển tri thức nhân loại Hiện nay, sinh học phân tử bao gồm cácphân ngành cơ bản sau: Nghiên cứu chẩn đoán và giám định, nghiên cứu phânloại và quan hệ loài, nghiên cứu phả hệ và lịch sử tiến hoá [3]

1.1.2.2 Cấu trúc và chức năng của phân tử ADN

Năm 1953, hai nhà khoa học James D Watson (Mỹ) và Francis H.CCrick (Anh) đã công bố mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép phân tử ADN Từ

đó, các nhà khoa học đã chứng minh được bản chất di truyền nằm trên cấutrúc nhiễm sắc thể.Nhiễm sắc thể nằm trong nhân tế bào.Nhiễm sắc thể đượccấu trúc từ phân tử ADN kết hợp với các protein kiềm (histon).ADN là chấttrùng phân (polymer) sinh học, có trọng lượng phân tử lớn, gồm nhiều đơnphân (monomer) nối với nhau thành các mạch (chuỗi) dài Phân tử ADN làmột chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗinucleotide Mỗi nucleotide gồm nhóm phosphate, đường deoxyribose và mộttrong bốn base Adenine, Cytosine, Guanine và Thymine ( được viết tắt bằngbốn chữ cái A, C, G, T) Hai mạch đơn kết hợp với nhau nhờ các liên kếthydro hình thành giữa các base bổ sung nằm trên hai mạch, base Adenine (A)liên kết với base Thymine (T) bằng hai liên kết hydro (A=T), base Cytosine(C) liên kết với base Guanine (G) bằng ba liên kết hydro (C=G) Mỗi mạch

đơn là một trình tự có định hướng với một đầu là đầu 5 phosphat tự do và mộtđầu là 3 hydroxyl tự do (hướng quy ước là 5'  3') Hướng của hai mạch đơntrong chuỗi xoắn kép ngược nhau và là hai mạch đối song song Những đặcđiểm quan trọng nhất trong mô hình cấu trúc ADN là tính đặc thù trong việckết cặp base và sự phân cực ngược chiều của hai sợi đơn 5'  3', 3'  5') bởi

vì chúng có tầm quan trọng đặc biệt với nhiều hoạt động chức năng của ADNnhư tự sao chép, phiên mã và dịch mã [12]

Hình 1.1.Cấu tạo ADN trong nhân tế bàoNói cách khác, ADN chính là một đại phân tử sinh học, thành phần cấutạo không thể thiếu của các hệ thống sống và là vật liệu di truyền có các đặctính thiết yếu sau đây:

- Đặc tính thông tin sinh học: mang thông tin cần thiết để xác định cấutrúc các protein đặc thù của loài và điều khiển các hoạt động sinh trưởng,phân chia và biệt hoá tế bào

- Đặc tính tái bản: khả năng tự sao chép chính xác để thông tin ditruyền của thế hệ sau giống như các thế hệ trước.

- Đặc tính biến đổi: khả năng bị biến đổi từ nhiều quá trình khác nhau(sai sót trong tái bản, đột biến, tái tổ hợp, sự vận động nội tại của các gentrong hệ gen).Chính sự biến đổi đa dạng này là nền tảng của sự tiến hoá

1.1.2.3 Sự ra đời của giám định gen

Năm 1956, hai nhà khoa học Joe Him Tjio và Albert Levan đã xác địnhchính xác ở người, trong nhân tế bào thể (tế bào lưỡng bội) có 46 nhiễm sắcthể được xếp thành 23 cặp đồng dạng: 22 cặp nhiễm sắc thể thường và mộtcặp nhiễm sắc thể giới tính Riêng tế bào trứng và tinh trùng chỉ có 23 nhiễmsắc thể (tế bào đơn bội) Thế hệ con cái nhận từ mẹ 23 nhiễm sắc thể thôngqua tế bào trứng và 23 nhiễm sắc thể từ cha thông qua tế bào tinh trùng Sựkết hợp giữa trứng và tinh trùng đã duy trì được số lượng nhiễm sắc thể trong

tế bào thường là 46 Bộ nhiễm sắc thể được bảo tồn và truyền từ thế hệ nàysang thế hệ khác và mang tính đặc trưng cho người [28]

Vào những năm cuối thế kỉ XX, các nhà khoa học hình sự đã ứng dụngcông nghệ gen (DNA-Technology) vào việc xác định tội phạm Đây là bướcngoặt trong lịch sử phát triển của Khoa học hình sự và giám định gen cho mụcđích tư pháp ra đời Tính ưu việt của giám định gen là truy nguyên được cáthể người, xác định quan hệ huyết thống, xác định hài cốt [14]

Tháng 10 năm 1990, tại Mỹ, Dự án hệ gen người (Human GenomeProject-HGP) chính thức được bắt đầu Đến ngày 12 tháng 02 năm 2001,HGP và Celera đã công bố trình tự đầy đủ của hệ gen người - một sự kiệntrọng đại trong sự phát triển của sinh học phân tử nói chung và trong việcnghiên cứu gen người nói riêng Theo công bố này, số lượng gen trong bộ genngười có khoảng 35.000 gen, trong đó có hàng chục gen được nghiên cứu ứngdụng để xác định huyết thống và truy nguyên cá thể [18]

Cũng như ADN ở sinh vật nhân chuẩn khác, ADN nhân ở người gồmnhững trình tự mã hoá (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hoá(các intron) Gen có cả exon và intron gọi là gen phân mảnh Tuỳ mức độ hiệndiện của chúng trong nhân, các trình tự ADN được chia làm 3 loại:

- Các trình tự duy nhất: là các gen mã hoá cho các protein có trình tựđặc trưng cho từng gen

- Các trình tự có số lần lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% bộgen người, chúng có kích thước từ 100-1000kb, đa dạng hơn các trình tự lặplại nhiều lần Các trình tự này không tập trung mà phân tán trên toàn bộ gen.Chúng có thể là các trình tự không mã hoá với chức năng chưa rõ hoặc là cáctrình tự đã mã hoá (các gen mã hoá cho ADN riboxom, ARN vận chuyển…)

- Các trình tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10-15% bộ gen, đó là nhữngtrình tự ADN ngắn (10-200kb), không mã hoá, thường tập trung ở nhữngvùng chuyên biệt trên NST (vùng tâm động, vùng đầu NST)

1.1.3 Di truyền quần thể

“Quần thể là tập hợp các cá thể của cùng một loài, sống trong mộtkhoảng không gian xác định, vào một thời điểm nhất định, có khả năng sinhsản và tạo thành thế hệ mới hữu thụ” [42] Di truyền học quần thể nghiên cứu

sự phân bố của các alen trong quần thể cũng như sự duy trì và thay đổi tầnsuất của các alen và kiểu gen qua các thế hệ

Di truyền học quần thể không những liên quan đến những yếu tố ditruyền như đột biến, sinh sản mà còn liên quan đến những yếu tố xã hội vàmôi trường như sự chọn lọc, tình trạng di dân

1.1.3.1 Tính đa dạng di truyền trong quần thể người

Thế giới với hơn 7 tỷ dân gồm nhiều chủng tộc khác nhau, nhiều quầnthể dân cư khác nhau Tất cả đều mang bộ nhiễm sắc thể gồm 46 NST và sự

phân bố của các gen trên NST như nhau, nhưng bản chất của các alen và tần

số của các alen tại mỗi vị trí của gen trên NST là khác nhau giữa các quần thể

Sự phân ly độc lập và chọn lọc tự nhiên tạo nên sự khác biệt di truyềnrất lớn giữa các quần thể

1.1.3.2 Định luật Hardy - Weinberg

Năm 1908, nhà toán học Geoffrey Hardy (Anh) và bác sĩ WilhelmWeinberg (Đức) đã đồng thời nghiên cứu ra việc đánh giá tần số của các kiểugen từ tần số của các alen bằng một công thức toán học đơn giản khi quần thể

đó thoả mãn một số điều kiện nhất định Định luật Hardy-Weinberg ra đời,đây chính là nền tảng cho di truyền học quần thể

Nội dung định luật Hardy-Weinberg như sau: “Trong một quần thể có

số lượng lớn, giao phối tự do và ngẫu nhiên ở vào thế cân bằng, không cóchọn lọc và cũng không có đột biến, thì tần số tương đối của các alen ở mỗigen có khuynh hướng duy trì không đổi từ thế hệ này sang thế hệ khác” [42].Định luật Hardy-Weinberg gồm 2 tính chất quan trọng:

(1) Giả sử gọi p là tần số của alen A, q là tần số của alen a và các alenkết hợp với nhau một cách ngẫu nhiên trong quần thể thì tần số của các kiểugen AA, Aa, aa được thể hiện qua đẳng thức:

p2 + 2pq + q2 = 1(2) Tần số của các kiểu gen sẽ không đổi qua các thế hệ miễn là tần sốcủa các alen không đổi

Nghĩa là: nếu tần số của các kiểu gen AA, Aa và aa phân bố trong quầnthể theo tỷ lệ p2:2pq:q2 thì tần số này ở các thế hệ sau cũng sẽ là p2:2pq:q2.Trạng thái này được gọi là trạng thái cân bằng của quần thể

Nếu một gen có tới 3 alen (p, q và r) thì sự phân bố tần số của các alen

sẽ tuân theo công thức: (p + q + r)2 = 1

Nói chung với n alen (p1, p2 ,p3 pn) thì công thức sẽ là:

(p1 + p2 + p3 + pn)2 = 1Bảng 1.1: Tần số của các kiểu kết hôn và tần số các kiểu gen ở thế hệ sau theo

- Điều kiện nghiệm đúng cho định luật Hardy - Weinberg:

+ Quần thể phải đủ lớn, kết hôn xảy ra ngẫu nhiên trong quần thể

+ Tần số của các alen được duy trì không đổi qua các thế hệ nghĩa là:

* Không xảy ra đột biến làm xuất hiện các alen mới

*Tác động của chọn lọc xem như là đồng đều với mọi cá thể

*Không có tình trạng nhập cư đáng kể từ những quần thể có vốn

- Các yếu tố ảnh hưởng:

+ Tình trạng kết hôn đồng huyết dẫn tới việc kết hôn không thể diễn ramột cách ngẫu nhiên ở một số chủng tộc người (thói quen, luật lệ…) làm ảnhhưởng đến sự đột biến gen

+Sự di dân cũng sẽ làm ảnh hưởng đến tác động của chọn lọc, đột biếndẫn đến thay đổi các điều kiện cần và đủ của định luật Hardy-Weinberg, mặc

dù yếu tố này xảy ra chậm

+ Sự phiêu bạt di truyền (genetic drift): Sự phiêu bạt di truyền dẫn đến

sự thay đổi ngẫu nhiên tần số của các alen trong một quần thể nhỏ, ban đầu cóthể chỉ ở một cá thể Những yếu tố ngẫu nhiên không liên quan đến tình trạngmang gen đột biến có thể làm gia tăng khả năng sống, khả năng sinh sản củangười mang đột biến và làm gia tăng tần số alen đột biến này trong quần thể

đó qua các thế hệ Với một quần thể lớn thì các yếu tố đó không ảnh hưởngnhiều đến tần số của các alen trong quần thể

Trường hợp một nhóm cá thể tách ra khỏi quần thể lớn tạo ra một quầnthể mới, sự phiêu bạt di truyền làm cho tần số của các alen trong quần thể mớinày khác biệt ít nhiều so với tần số alen ở quần thể gốc Trải qua vài thế hệ sựkhác biệt về tần số alen sẽ trở nên đáng kể Nếu một trong số các cá thể trongnhóm cá thể tách ra đó mang một alen hiếm thì về càng sau tần số của alennày sẽ càng cao hơn trong quần thể mới so với quần thể cũ

+ Dòng chảy của gen (gene flow): Là sự phát tán chậm chạp của gentrong quá trình sống làm thay đổi dần tần số của các alen Các gen của quầnthể nhập cư với những đặc trưng riêng của nó dần dần được đưa vào vốn gencủa quần thể tiếp nhận và làm thay đổi tần số của các alen trong quần thể này

1.1.4 Giám định ADN

1.1.4.1 Các gen được sử dụng trong giám định

Trong giám định thường sử dụng là các gen nằm ở vùng không mã hoá(intron) của ADN Kỹ thuật phân tích gen có đoạn lặp trung bình (VariableNumber of Tandem Repeat - VNTR) nhưng nhữngkỹ thuật này chỉ áp dụngvới từng gen riêng lẻ (single locus) và phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật củangười giám định nên dễ xảy ra sai sót Từ năm 1990 đến nay các nhà khoahọc hình sự sử dụng các kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (ShortTandem Repeat - STR) vì chúng khá bền vững, có khả năng phân tích đồngthời nhiều gen, ít phụ thuộc vào thao tác kỹ thuật của người giám định [32].Các cấu trúc VNTR hay STR đều mang tính đa hình cao, được di truyền qua,được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cho cá thể.

Tính đa hình của các gen này được thể hiện ở hai dạng: đa hình về trình

tự các nucleotid và đa hình về chiều dài [16]

- Đa hình về trình tự: các gốc nucleotid ngẫu nhiên trong đoạn ADNkhông theo một trình tự nào

Cỏ thể thứ hai: GATAGATAGATA GATA12 đoạn lặp GATAXuất phỏt từ thực tế của giỏm định ADN và cựng với sự tiến bộ của kỹthuật, ngày nay cỏc nhà khoa học hỡnh sự đang ỏp dụng kỹ thuật phõn tớchcỏc gen cú trỡnh tự siờu ngắn Mini STR (Mini Short Tandem Repeat) Vềthực chất của Mini STR vẫn là những đoạn STR nhưng khi phõn tớch, mồi(primer) được thiết kế với mục đớch sao chộp đoạn STR ngắn hơn những đoạnSTR thụng thường nhằm thu được sản phẩm từ những đoạn STR của mẫu ớtnhiều đó bị biến tớnh hoặc phõn huỷ phần nào, tức những mẫu cú hàm lượngADN ớt Đõy là sự cải tiến của cỏc nhà khoa học, bởi lẽ dấu vết hỡnh sự núichung, đặc biệt là dấu vết sinh học núi riờng khụng phải lỳc nào cũng tồn tại ởdạng nguyờn vẹn cho nờn cần phải cú những biện phỏp kỹ thuật để hạn chế sựbiến tớnh của dấu vết đồng thời khai thỏc triệt để khả năng của dấu vết [26].

Để phõn tớch Mini STR cỏc hóng sản xuất trờn thế giới cũng chế tạo ranhững bộ KIT tương tự như những bộ KIT phõn tớch thụng thường khỏc,chẳng hạn như bộ KIT Minifiler.Cỏc tập đoàn nghiờn cứu khoa học trờn thếgiới đó sản xuất cỏc bộ KIT phõn tớch tổ hợp cỏc gen cú trỡnh tự lặp lại ngắnbao gồm: KIT 2 gen (TPOX/CSF1PO), KIT 3 gen (THO1/F13A1/FES), KIT

9 gen (D3S1358/FGA/vWA/ ) [18]

Ngày nay các nhà Sinh học phân tử và Khoa học hình sự trên thế giới đãcho ra đời và ứng dụng những bộ Kít phân tích tới 16, 24 hoặc 27 gen Việcphân tích ít hay nhiều gen phụ thuộc vào đặc điểm quần thể, dân số của mỗiquốc gia Nếu chỉ phân tích từ 2 đến 3 gen thì độ tin cậy khoảng 85 % - 90%

Số l-ợng gen đ-ợc phân tích càng nhiều thì độ tin cậy càng cao Theo tập đoànPerkin-Elmer (Mỹ) khi phân tích tổ hợp 9 gen hệ Profiler Plus, khả năng trùnghợp về một kiểu gen là vô cùng nhỏ, vì tần suất xuất hiện của một kiểu gen làkhoảng 1/72 tỷ [17] Hiện nay, lực lượng kỹ thuật hỡnh sự cả nước đangsửdụng hệ Identifiler để xây dựng cơ sở dữ liệu tần suất các gen (database)

Qua giám định cho thấy khả năng trùng hợp của một kiểu gen trong quần thểng-ời Việt cũng vô cùng nhỏ.

Ví dụ:

Trong vụ ỏn “Hiếp dõm trẻ em”, xảy ra ngày 29 thỏng 7 năm 2016 tại

ấp Vịnh, xó An Cơ, huyện Chõu Thành, tỉnh Tõy Ninh, giám định gen theo hệIdentifiler cho thấy kiểu gen của tinh trùng có trên quần lót nạn nhân trùnghoàn toàn với kiểu gen của đối t-ợng và tần suất của kiểu gen này trong quầnthể ng-ời Việt là 1/70 tỷ (trong khi đó dân số Việt nam hiện nay chỉ khoảng

90 triệu); do vậy đã truy nguyên đ-ợc đối t-ợng gây án

Trong một vụ ỏn “Giết người”, xảy rangày 27 thỏng 02 năm 2017 tại tổ

05, ấp Tõn Lợi, xó Tõn Qưới, huyện Bỡnh Tõn, tỉnh Vĩnh Long, phân tích gen

đã khẳng định đ-ợc máu trên con dao chính là máu của nạn nhân vì kiểu genphân tích từ dấu vết máu trên dao trùng với kiểu gen của nạn nhân với tần suấttrong quần thể ng-ời Việt là 1/7869898tỷ

Theo cỏc nhà khoa học hỡnh sự khi phõn tớch bằng bộ KIT Identifiler thỡ

độ tin cậy trung bỡnh đạt được là khoảng: 1/ 4,62 x 1019, cú nghĩa là trong số4,62 x 1019 người thỡ mới cú một người ngẫu nhiờn nào đú trựng với kiểu gentrờn [10, 27]

Bộ KIT Sefiler cú 12 locus gen, độ tin cậy trung bỡnh là khoảng: 1/6,47 x 1015 gồm cỏc locus:

D2S1338 D3S1358 D8S1179 TH01 D16S539 SE33D18S51 D19S433 D21S11 FGA VWA Amelogenin

Bộ KIT ProfilerPlus cú 10 locus gen, độ tin cậy trung bỡnh là khoảng1/1,48 x 1011 gồm cỏc locus:

D3S1385 D5S818 D7S820 D8S1179 D13S317D18S51 FGA D21S11 VWA Amelogenin

Bộ KIT Cofiler có 7 locusgen, độ tin cậy trung bình là khoảng: 1/ 3,15

x 107 gồm các locus gen:

D3S1385 CSF1PO D7S820 D16S539TH01 TPOX Amelogenin

Trong vòng gần 30 năm qua, giám định gen đã có những đóng gópđáng kể giúp cho các nhà điều tra hình sự và những người làm công tác xét xửtrong việc truy tìm tội phạm, xét xử đúng người, đúng tội và minh oan chongười vô tội Giá trị chứng cứ của ADN ngày càng được coi trọng trong hệthống pháp luật, đặc biệt ở các nước phát triển Ở Mỹ hiện có hơn 100 phònggiám định gen hình sự của nhà nước và hàng chục phòng thí nghiệm của tưnhân Hàng năm họ đã giám định hàng trăm ngàn mẫu ADN [20] Ở hầu hếtcác nước châu Âu và châu Á đều có giám định ADN ở các mức độ phát triểnkhác nhau Riêng ở Trung Quốc ngành công an đã triển khai giám định ADNxuống tận cấp quận, huyện [22, 24] Trên thế giới số lượng phòng giám địnhADN ngày càng tăng

Ở Việt Nam, tại Viện Khoa học hình sự, phòng giám định ADN đượctriển khai từ năm 1999 với trang thiết bị hiện đại và đội ngũ giám định viênđược đào tạo chuyên sâu Trong quá trình phát triển trình độ năng lực cán bộngày càng được nâng cao, trang thiết bị được bổ sung và nâng cấp, đáp ứng

và phục vụ hữu hiệu cho công tác đấu tranh phòng chống tội phạm của lựclượng Công an và công tác xét xử của ngành Tư pháp

1.1.4.2 Tiêu chuẩn các gen sử dụng trong giám định ADN

Hiện nay, các gen sử dụng trong giám định ADN chủ yếu là các locusgen STR (Short Tandem Repeats) Phương pháp giám định gen có đủ độ tincậy bởi các locus gen STR có tính đa alen (tính đa hình) rất cao, mỗi alen chỉxuất hiện trong quần thể với tần số rất thấp [28, 29] Locus gen STR ngắn nên

có thể đồng thời phân tích được ba hoặc nhiều gen STR hơn trong cùng một

thời điểm Việc phân tích đa hệ rất có giá trị vì chúng có kết quả phân biệt lớn

và thành công ngay cả một số trường hợp mẫu chất lượng kém như mẫu lẫnhoặc đã bị phân hủy phần nào [8, 13]

Một gen STR được sử dụng cho mục đích nhận dạng và xác định cá thểphải đảm bảo các thông số sau:

- Có tính bền vững cao (tần suất đột biến thấp)

- Locus gen STR phải có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao Điều nàygiúp các nhà phân tích chỉ sử dụng một số locus gen tối thiểu đã đạt được sựphân biệt cá thể một cách tốt nhất

- Các locus gen STR ngắn hơn, trung bình chỉ từ 100 - 400 bp so với cácđoạn đa hình ngẫu nhiên khác Các đoạn ADN ngắn có độ bền vững cao, ít bịđứt gãy dưới tác động của điều kiện ngoại cảnh Do vậy, khi tiến hành nhân bộigen (PCR) sẽ thu được hiệu quả tốt hơn các đoạn ADN dài

- Các locus chứa đoạn STR phải đảm bảo yếu tố di truyền độc lập, dovậy nên lựa chọn tổ hợp các locus nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau là rấtquan trọng Các STR thông thường có rất nhiều alen, độ dài của các alenthông thường khác nhau số đoạn lặp Do vậy, việc sử dụng các STR có chiềudài dưới 400 base để dễ dàng phân tích là một yêu cầu cần thiết trong quátrình lựa chọn

Nhiều đoạn đa hình có trình tự lặp lại chứa các đơn vị lặp lại từ 4nucleotide đã được nghiên cứu và đáp ứng được yêu cầu của quy trình phântích cá thể người Các đoạn này có đặc tính như sau:

- Có tính đa hình và mức độ dị hợp tử cao (>70%)

- Dễ dàng phối hợp thành bộ phức khi thực hiện PCR

- Sản phẩm PCR ổn định

1.1.4.3 Cơ sở lý thuyết để tính tần suất và vai trò của dữ liệu tần suất các alen

Mỗi cá thể người có cấu trúc di truyền riêng không ai giống ai, trừnhững trường hợp sinh ra cùng một trứng [26] Nếu xét rộng trong cả mộtquần thể thì một số đặc điểm di truyền (ADN) ở các cá thể khác nhau vẫn cóthể giống nhau (trùng lặp) Mặt khác mỗi một quần thể người (tộc người)khác nhau cũng có những đặc điểm di truyền đặc trưng thể hiện bằng sự phân

bố tần suất alen trong mỗi quần thể [31] Do vậy, trong giám định ADN cácnhà khoa học ngoài lựa chọn, nghiên cứu những gen có tính đa alen (đa hình)cao thì cần khảo sát tần suất phân bố các alen trong quần thể của từng gen để

sử dụng Quần thể được nghiên cứu khảo sát phải đạt được các yêu cầu trongthống kê, di truyền như: các mẫu dùng trong nghiên cứu phải đảm bảo tínhngẫu nhiên, không có quan hệ huyết thống [30, 38]

Để có được tần suất của mỗi alen, trước hết phải tìm được số lần xuấthiện của mỗi alen trong quần thể nghiên cứu sau đó tính tần suất lý thuyết củaalen đó theo luật di truyền quần thể [36] Kiểm tra sự phù hợp giữa mẫu vớiquần thể cân bằng lý thuyết thông qua đánh giá chênh lệch giữa tần số quansát thực tế với phân bố lý thuyết của các kiểu gen của mỗi gen được nghiêncứu có sai khác nhau hay không?[4, 7] Khi có được tần suất thực tế và tầnsuất lý thuyết của mỗi alen, chúng ta tiến hành kiểm định xem tần suất alen cóđược chấp nhận với mức xác suất đã chọn

Theo báo cáo của Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa Kỳ năm 1996[21] thì việc ước lượng tần số của một alen nào đó có thể không chính xác nếualen đó là alen hiếm, chỉ xuất hiện một vài lần khi khảo sát và có thể khôngđại diện cho cả quần thể Hội đồng nghiên cứu quốc gia Hoa Kỳ khuyến cáorằng mỗi alen nên được tính ít nhất là năm lần để tần suất tính được đáng tincậy Do đó tần số thấp nhất của một alen là 5/2N, trong đó N là số lượng mẫu

khảo sát từ quần thể và 2N là số lượng nhiễm sắc thể Với quy ước như thế, sốlượng mẫu khảo sát sẽ ảnh hưởng tới tần suất của alen tối thiểu như sau:

Bảng 1.2 Tần suất tối thiểu của một alen thay đổi tương ứng với số

lượng mẫu khảo sát

Số lượng mẫu khảo sát (N)

Số lượng nhiễm sắc thể (2N)

Tần suất tối thiểu của alen (5/2N)

Giám định gen (ADN) đòi hỏi cơ sở khoa học vững chắc để tính toánxác suất một người ngẫu nhiên trong quần thể là người có cấu trúc di truyềnđặc trưng trùng lặp với ADN trong các mẫu vật (thu thập trong quá trình điềutra, khảo sát) Nếu không có tần suất alen thì không tính toán được tần suấtxuất hiện của một kiểu gen nào đó trong một quần thể nhất định [4, 36]

Trong trường hợp cần xác định huyết thống, để kết luận một người cóphải là cha đẻ hoặc mẹ đẻ của người con không, phải dựa vào khả năng chonhận của các alen và phải căn cứ vào tần suất alen để tính ra chỉ số quan hệ

huyết thống (Paternity Index - PI) Từ đó tính độ tin cậy đạt được Mặt khác,

đó cũng là cơ sở khoa học để so sánh độ tin cậy trong trường hợp phân tíchđược nhiều gen hoặc ít gen hơn [37, 49]

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về khảo sát tần suất các alen của các gen sử dụng trong giám định ADN

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Từ những năm 1990, các nhà Khoa học hình sự trên thế giới sử dụngcác kỹ thuật phân tích các gen có trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat-STR) cho mục đích giám định ADN hình sự [29]

Ứng dụng các thành tựu của Công nghệ sinh học nói chung và kết quảcủa Dự án hệ gen người (Human Genome Project-HGP) nói riêng, các tậpđoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới đã sản xuất các bộ kit phân tích tổ hợpcác locus có trình tự lặp lại ngắn: kit 2 locus (TPOX/CSF1PO), kit 3 locus(THO1/F13A1/FES), kit 9 locus (hệ Profiler Plus của hãng Perkin-Elmer,Mỹ), kit 15 locus (hệ Identifiler của hãng AB, hệ Power Plex 16 của hãngPromega) [15, 30]

Tổ chức Cảnh sát hình sự quốc tế (Interpol) có hiệp hội giám định ADN

và rất nhiều quốc gia đã có phòng thí nghiệm giám định ADN hình sự

Mỗi phòng thí nghiệm giám định gen (ADN) đều phải đạt những chỉtiêu chất lượng trang thiết bị máy móc cũng như con người và đều phải có cácnghiên cứu, khảo sát và công bố kết quả của mình về tần suất các alen trong

hệ locus gen của từng quần thể người để ứng dụng trong giám định truynguyên cá thể hay xác định quan hệ huyết thống Để đảm bảo tính chính xác,các phòng thí nghiệm giám định gen thường dùng hệ thống phân tích 15 locusgen như hệ Identifiler hoặc hệ Power Plex 16 [48]

Tại Mỹ, cảnh sát liên bang Mỹ đã khảo sát và sử dụng tần suất dữ liệu

Mỹ, 290 người Mỹ gốc Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha, 349 người Mỹ da trắng

và 357 người Mỹ gốc Phi [20, 21].Với chủng tộc người lai Âu - Á (Eurasia),tại mỗi quốc gia khác nhau lại có những khảo sát khác nhau về tần suất cácalen theo hệ Identifiler của cộng đồng người Eurasia tại quốc gia đó: 384người tại Nga, 300 người tại Hy Lạp, 139 người tại Rumani [47, 52]

Cùng với sự phát triển không ngừng của ngành công nghệ sinh học nóichung, các tập đoàn nghiên cứu khoa học trên thế giới tiếp tục phát triển các

bộ kit phân tích mở rộng hơn về số lượng locus và đã có nhiều quốc gianghiên cứu khảo sát tần suất các alen của các locus ở các bộ kit mới để đưavào ứng dụng trong giám định ADN hình sự.Thái lan, Malaixia đã công bốkết quả khảo sát của 15 gen của người Malaixia năm 2006, 2008 [44, 46].Nhật Bảncũng đã công bố kết quả khảo sát của 15 gen hệ Identifiler của ngườiNhật năm 2013 [43]

Từ năm 2012 đến 2015, Trung Quốc công bố bảng tần suất các alen của

9 gen STR các dân tộc phía nam Trung Quốc [22], tần suất các alen của 15gentừ các cá thể người dân tộc Hán ở các vùng miền ở Trung Quốc [45, 50],tần suất, các alen của 15 gen từ các cá thể người Miao, người Yunnan, ngườiIangsu phía Bắc Trung Quốc [25, 34, 35]…Tuy nhiên, 15 gen hệ Identifilervẫn được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi với các công bố gần đây về tần suấtcác alen

Năm 2016, Indonesia đã công bố tần suất các alen của 15 gen hệIdentifiler được khảo sát từ 8 dân tộc của Indonesia [53] Năm 2016, Malaixia

đã công bố các thông tin mới nhất về các alen của 15 gen hệ Identifiler đượckhảo sát từ 341 cá thể người Malaixia [54]

Kit Identifiler là bộ Kit phức hợp nhân đồng thời 16 gen STR, trong đó

có một gen qui định giới tính và 15 gen qui định tính trạng nằm trên NST

thường Các khảo sát về tần suất alen sẽ được tiến hành nghiên cứu trên 15gen này.

Bảng 1.3 Các locus gen hệ Identifiler [37]

Tên locus Vị trí trên NST Trình tự đoạn lặp Các alen

vWA 12p12-pter phức hợp TCTA/TCTG 10 - 25

Đặc điểm của một số locus gen STR hệ Identifiler:

- Locus gen D8S1179 (D8) định vị trên nhiễm sắc thể số 8, dài 128-168cặp bazơ, có 12 alen

- Locus gen D21S11 (D21) định vị trên nhiễm sắc thể số 21, dài

- Locus gen D13S317 (D13) định vị trên nhánh dàinhiễm sắc thể số

13, dài 206-234 cặp bazơ, có 9 alen

- Locus gen D16S539 (D16) định vị trên nhiễm sắc thể số 16, dài

245-269 cặp bazơ, có 7 alen

- Locus gen D2S1338 (D2) định vị trên nhiễm sắc thể số 2

- Locus gen D19S433 (D19) định vị trên nhiễm sắc thể số 19

- Locus gen vWA địnhvị trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 12, dài

Hình 1.2: Sơ đồ các gen hệ Identifiler

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, giám định gen được triển khai từ tháng 4 năm 1999, tạiViện Khoa học hình sự - Bộ Công an Toàn bộ quy trình giám định gen đượcchuyển giao từ Viện Khoa học hình sự bang Victoria - Úc cùng đội ngũ giámđịnh viên được đào tạo cơ bản tại Úc

Năm 2000, đề tài cấp Bộ "Nghiên cứu, khảo sát và xây dựng tần suất

các alen của các gen trong hệ NinePlex II (9 locus gen) trên đối tượng người Kinh" được triển khai và nghiệm thu năm 2002.

Năm 2004, Việt Nam đã thông báo bảng tần suất các alen của các locusgen hệ Nineplex II trên đối tượng người Kinh cho Interpol, đây là một cộtmốc đánh dấu sự phối hợp toàn cầu trong đấu tranh phòng chống tội phạmdựa vào lĩnh vực giám định ADN [38]

Năm 2006, Viện Khoa học hình sự đưa vào triển khai hệ Identifilertrong giám định ADN Với phương pháp tách chiết ADN bằng chelex [19],công tác giám định đạt hiệu quả cao hơn so với bộ kit 9 locus gen Nineplex II.

Năm 2008, Viện Khoa học hình sự đã triển khai đề tài cấp Bộ "Khảo sát

tần suất các alen theo hệ Identifiler (ID) trên đối tượng người Kinh" Đề tài tiến

hành khảo sát số mẫu là 170 cá thể người Kinh và kết quả đã được triển khai ứngdụng trong công tác giám định ADN

Năm 2014, Viện Khoa học hình sự đã nghiệm thu đề tài cấp Bộ "Khảo sát

tần suất các alen theo hệ Identifiler (ID) trên đối tượng người H'Mông".

Năm 2016, Viện Khoa học hình sự đã nghiệm thu đề tài cấp Bộ "Khảo sát

tần suất các alen theo hệ Identifiler (ID) trên đối tượng người Khmer".

Hình 1.3 Bộ kit Identifiler của hãng Applied BiosystemsCũng như các phòng thí nghiệm giám định ADN khác trên thế giới, để

có cơ sở pháp lý cho việc ứng dụng hệ Identifiler tại Việt Nam thì phải khảosát để có tần suất các alen của các dân tộc khác nhau

Đây là căn cứ khoa học để xây dựng cơ sở pháp lý vững chắc trong việcđưa ra các kết luận giám định về truy nguyên cá thể và xác định huyết thống