Khảo sát sự thay đổi giá trị xét nghiệm định lượng methotrexate ở trẻ em bệnh bạch cầu cấp dòng lympho trong điều trị với phác đồ methotrexate liều cao

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------NGUYỄN THỊ THẢO TRANG KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI GIÁ TRỊ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG METHOTREXATE Ở TRẺ EM BỆNH BẠCH CẦU

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -NGUYỄN THỊ THẢO TRANG

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI GIÁ TRỊ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG METHOTREXATE Ở TRẺ EM BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO TRONG ĐIỀU TRỊ VỚI PHÁC ĐỒ METHOTREXATE LIỀU CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

- -NGUYỄN THỊ THẢO TRANG

KHẢO SÁT SỰ THAY ĐỔI GIÁ TRỊ XÉT NGHIỆM ĐỊNH LƯỢNG METHOTREXATE Ở TRẺ EM BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG LYMPHO TRONG ĐIỀU TRỊ VỚI PHÁC ĐỒ METHOTREXATE LIỀU CAO

Ngành: Kỹ Thuật Xét Nghiệm Y Học

Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS HUỲNH NGHĨA

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong luận văn này là được ghi nhận, nhập liệu

và phân tích một cách trung thực Luận văn này không có bất kì số liệu, vănbản, tài liệu đã được Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh hay trường đạihọc khác chấp nhận để cấp văn bằng đại học, sau đại học Luận văn không có

số liệu, văn bản, tài liệu đã được công bố trừ khi đã được công khai thừa nhận

Ngày tháng năm 2018

Ký tên học viên

Nguyễn Thị Thảo Trang

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Y VĂN 4

Tổng quan về bạch cầu cấp dòng lympho 4

1.1.1 Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho 5

1.1.2 Phân nhóm nguy cơ của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em theo phác đồ FRALLE-2000 10

1.1.3 Phác đồ điều trị bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em (FRALLE 2000) 11

Tổng quan về Methotrexate 17

1.2.1 Lịch sử 17

1.2.2 Cơ chế tác động 17

1.2.3 Liều dùng 19

1.2.4 Độc tính của Methotrexate liều cao 20

Kỹ thuật định lượng methotrexate 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

Thiết kế nghiên cứu 24

2.1.1 Thiết kế nghiên cứu 24

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 24

2.1.3 Thời gian 24

Cỡ mẫu 24

2.2.1 Dân số mục tiêu và dân số chọn mẫu 24

2.2.2 Cỡ mẫu 24

Tiêu chuẩn chọn mẫu 24

2.3.1 Tiêu chuẩn đưa vào 24

Yêu cầu về mẫu, xử lý và thực hiện xét nghiệm 24

2.4.1 Yêu cầu về mẫu 24

2.4.2 Xét nghiệm định lượng MTX 25

Phương pháp và bộ công cụ thu thập số liệu 27

2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu 27

2.5.2 Công cụ thu thập số liệu 28

Định nghĩa các biến số nghiên cứu 28

2.6.1 Biến định tính 28

2.6.2 Biến định lượng 28

Phương pháp xử lý số liệu 28

Vấn đề y đức 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

Đặc điểm dịch tễ và bệnh học của mẫu nghiên cứu 30

3.1.1 Tuổi của đối tượng tham gia nghiên cứu 30

3.1.2 Giới tính của đối tượng tham gia nghiên cứu 30

3.1.3 Nhóm bệnh và phân nhóm nguy cơ 31

3.1.4 Phân nhóm nguy cơ theo tiêu chuẩn phác đồ FRALLE 2000 32

3.1.5 Giai đoạn điều trị có MTX liều cao trong phân nhóm nguy cơ 33

3.2.1 Sự biến thiên nồng độ MTX trong máu sau điều trị MTX liều cao

tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ trong giai đoạn

củng cố 33

3.2.2 Sự biến thiên nồng độ MTX trong máu sau điều trị MTX liều cao tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ trong giai đoạn trung gian 34

3.2.3 Sự biến thiên nồng độ MTX trong máu sau điều trị MTX liều cao tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ trong cả hai giai đoạn trung gian và củng cố 36

3.2.4 Sự thay đổi các thông số máu và lâm sàng sau điều trị MTX liều cao 37

Mối liên quan giữa sự thay đổi nồng độ MTX tại thời điểm khảo sát với các yếu tố tuổi, giới và phân nhóm nguy cơ 40

3.3.1 Nồng độ trung bình tính theo số lượt tiêm MTX 40

3.3.2 Phân nhóm tuổi 41

3.3.3 Phân nhóm giới tính 42

3.3.4 Phân nhóm nguy cơ 43

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 45

Đặc điểm dịch tễ và bệnh học của mẫu nghiên cứu 45

4.1.1 Tuổi của đối tượng tham gia nghiên cứu 45

4.1.2 Giới tính của đối tượng tham gia nghiên cứu 46

4.1.3 Nhóm bệnh và phân nhóm nguy cơ của bệnh 46

4.1.4 Giai đoạn điều trị 48

Sự biến thiên nồng độ methotrexate trong các giai đoạn điều trị 49

4.2.1 Giai đoạn củng cố 49

4.2.2 Giai đoạn trung gian 49

4.2.3 Sự thay đổi các thông số máu và lâm sàng sau sử dụng MTX liều cao 51

Mối liên quan giữa sự thay đổi nồng độ methotrexate với tuổi, giới và

phân nhóm nguy cơ của bệnh 53

4.3.1 Phân nhóm tuổi 53

4.3.2 Phân nhóm giới tính 54

4.3.3 Phân nhóm nguy cơ 54

Giới hạn của đề tài 56

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

PHỤ LỤC 7

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân loại hình thái tế bào học BCCDL theo FAB 6

Bảng 1.2 Phân nhóm B1 và B2 vào ngày 21 của hóa trị liệu 11

Bảng 1.3 Phân nhóm T1 và T2 vào ngày 21 của hóa trị 11

tr Bảng 3.1 Phân nhóm nguy cơ theo phác đồ FRALLE 2000 32

Bảng 3.2 Phân nhóm nguy cơ theo phác đồ FRALLE 2000 32

Bảng 3.3 Giai đoạn điều trị có MTX liều cao trong phân nhóm nguy cơ 33

Bảng 3.4 Nồng độ MTX (µmol/L) tại các thời điểm 24h, 48h, 72h và 96h 33

Bảng 3.5 Nồng độ MTX (µmol/L) tại các thời điểm 24h, 48h, 72h và 96h 34

Bảng 3.6 Nồng độ MTX (µmol/L) tại các thời điểm 24h, 48h, 72h và 96h 36

Bảng 3.7 Nồng độ trung bình tính theo số lượt tiêm MTX 40

Bảng 3.8 Mối liên quan giữa nhóm tuổi và nồng độ MTX (µmol/L) 41

Bảng 3.9 Mối liên quan giữa giới tính và nồng độ MTX (µmol/L) tại các thời điểm 42

Bảng 3.10 Mối liên quan nồng độ trung bình MTX (µmol/L) với phân dưới nhóm BCCDL 43

Bảng 3.11 Mối liên quan nồng độ trung bình MTX (µmol/L) với phân nhóm nguy cơ trung bình và nguy cơ cao 44

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.2 Tủy đồ về BCCDL 7

Hình 1.1 Tóm tắt quá trình biệt hóa tế bào máu 4

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hóa methotrexate ở tế bào 19

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật hóa phát quang vi hạt (CMIA) 23

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.1 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm A 13

Sơ đồ 1.2 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm B 15

Sơ đồ 1.3 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm T 16

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ nhóm tuổi 30

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ giới tính 31

Biểu đồ 3.3 Phân loại dưới nhóm BCCDL 31

Biểu đồ 3.4 Sự biến thiên nồng độ MTX trong điều trị ở giai đoạn củng cố 34

Biểu đồ 3.5 Sự biến thiên nồng độ MTX trong điều trị ở giai đoạn trung gian 35

Biểu đồ 3.6 Sự biến thiên nồng độ MTX trong điều trị ở cả hai giai đoạn 36

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ truyền hồng cầu lắng sau điều trị 37

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ truyền tiểu cầu đậm đặc sau điều trị MTX 37

Biểu đồ 3.9 Tỷ lệ bạch cầu sau điều trị 38

Biểu đồ 3.10 Tỷ lệ sốt >38 0 C sau điều trị 39

Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ loét miệng sau điều trị 39

CD : Clusters of diferentiation makers (dấu ấn tế bào)DAMPA : 4-deoxy-4-amino-N-10-methylpteroic acid

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho (BCCDL) là một rối loạn ác tính hệ tạomáu do sự chuyển dạng bất thường của tế bào đầu dòng lympho [2], [34].BCCDL là loại ung thư phổ biến nhất ở trẻ em [20], [34] Bệnh có thể gặp ởmọi lứa tuổi, thường gặp nhiều nhất ở trẻ em dưới 15 tuổi, chiếm 26% cáctrường hợp chẩn đoán ung thư và 78% các trường hợp bệnh bạch cầu ở nhómtuổi này [34], [48]

Trong những thập niên gần đây, tỷ lệ sống còn của BCCDL đã cải thiệnđáng kể nhờ những tiến bộ trong hóa trị liệu ở những bệnh nhân này Trong đó,methotrexate là thành phần quan trọng trong điều trị BCCDL ở trẻ em [26] Khikết hợp với acid folic, methotrexate có thể được dùng ở liều cao, từ đó có thểkhắc phục được tình trạng kháng thuốc của tế bào, tăng tỷ lệ thành công vớihoá trị liệu [46] Mặc dù methotrexate liều cao được sử dụng để điều trị BCCDL

ở trẻ em hơn 65 năm qua, nhưng cách tiếp cận tối ưu và liều lượng vẫn đangcòn tranh cãi Nhiều nghiên cứu cho thấy methotrexate liều cao hiệu quả hơnnhiều so với liều thấp nhưng độc tính thần kinh cũng nhiều hơn [11]

Methotrexate có thể dùng với liều cao hơn liều tối ưu khi có chất đối khángđặc biệt Methotrexate khi dùng liều cao hơn 1000 mg/m2, là một thành phầnphổ biến trong các phác đồ điều trị BCCDL ở trẻ em Hầu hết methotrexateđược truyền trong 24 giờ, sau đó dùng acid folinic sau 36 - 42 giờ và tiếp tụccho đến khi nồng độ methotrexate dưới 0,1-0,05 µmol/L [41] Tuy nhiên, tăngnồng độ methotrexate liên quan với nguy cơ cao tăng độc tính của thuốc Mặc

dù methotrexate liều cao được kiểm soát an toàn cho hầu hết bệnh nhân, nhưng

nó cũng là nguyên nhân gây độc cho cơ thể một cách đáng kể như độc tính trênthận, gan, thần kinh, viêm niêm mạc, ức chế tuỷ Điều này không chỉ gây ratình trạng bệnh tật và thỉnh thoảng gây tử vong, mà còn gây gián đoạn điều trị,dẫn đến giảm hiệu quả điều trị Khi bệnh nhân xảy ra tình trạng chậm đào thải

methotrexate mà không được ghi nhận và xử trí kịp thời, cơ thể sẽ tiếp xúc thờigian dài với nồng độ methotrexate độc hại, có thể dẫn đến tình trạng bệnh tật

và tử vong đáng kể [20] Theo kết quả nghiên cứu của Masahito Tsurusawa vàcộng sự (2015) [45] cho thấy nồng độ methotrexate cao trong máu có liên quanđến độc tính ở thận và sự xuất hiện của một số độc tính khác Một số nghiêncứu khác trước đây cho thấy 70,6% bệnh nhân có nồng độ methotrexate cao ởgiờ 72 sau truyền sẽ phát triển độc tính [24]

Vì vậy việc theo dõi một cách tích cực và can thiệp kịp thời, nhằm thúcđẩy bài tiết methotrexate, ngăn chặn độc tính, bệnh nhân được tiếp tục điều trịvới methotrexate góp phần nâng cao hiệu quả điều trị bệnh Do vậy, để trả lờicho câu hỏi: “Những bệnh nhân được áp dụng phác đồ điều trị với methotrexateliều cao, đặc biệt là trẻ em, nồng độ methotrexate trong máu sẽ thay đổi nhưthế nào sau khi truyền tĩnh mạch methotrexate liều cao 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ,

96 giờ và nồng độ này có liên quan gì đến tuổi, giới hay phân nhóm nguy cơ

không?”, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Khảo sát sự thay đổi giá trị xét

nghiệm định lượng Methotrexate ở trẻ em bạch cầu cấp dòng lympho trong điều trị với phác đồ Methotrexate liều cao”.

CÂU HỎI NGHIÊN CỨU

1 Nồng độ methotrexate trong điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ởtrẻ em với phác đồ có methotrexate liều cao thay đổi như thế nào?

2 Mối liên quan giữa nồng độ methotrexate với tuổi, giới và phân nhómnguy cơ như thế nào?

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Khảo sát sự biến thiên nồng độ methotrexate trong máu tại 24 giờ, 48giờ, 72 giờ và 96 giờ sau dùng methotrexate liều cao

2 Đánh giá mối liên quan giữa nồng độ methotrexate với tuổi, giới vàphân nhóm nguy cơ của bệnh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN Y VĂN

1.

Tổng quan về bạch cầu cấp dòng lympho

Bạch cầu cấp dòng lympho là một bệnh lý ác tính bắt nguồn từ các tế bàođầu dòng lympho Bệnh có đặc điểm tăng sinh rất mạnh nhưng không biệt hóahoặc biệt hóa bất thường của các nguyên bào lympho đưa đến sự tích tụ những

tế bào này trong tủy xương gây ức chế sự tạo máu bình thường và thâm nhiễmcác cơ quan tổ chức ngoài tủy xương [2], [34]

Hình 1.1 Tóm tắt quá trình biệt hóa tế bào máu

(Nguồn: Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia Treatment, 2002 [34] )Triệu chứng thực thể của bạch cầu cấp thể hiện mối liên quan chặt chẽ vớiquá trình giảm sinh của các dòng tế bào máu bình thường do sự tăng sinh vàthâm nhiễm của các tế bào ác tính vào cơ quan cụ thể là hội chứng thiếu máu,

Tiểu cầu

Hồng cầu

Bạch cầuBạch cầu hạt

Mỗi năm có khoảng 2.500 đến 3.000 trường hợp BCCDL mới được chẩnđoán tại Hoa Kỳ với tỷ lệ mới mắc là 2,7- 3,3/100.000 dân [2] Bệnh có thể gặp

ở mọi lứa tuổi, thường gặp nhất ở trẻ em từ 2 đến 5 tuổi [36]

BCCDL được phân loại dựa trên hình thái tế bào học, dấu ấn miễn dịch,sinh học phân tử Trong đó bạch cầu cấp dòng lympho B (BCCDL-B) chiếmkhoảng 85% trong BCCDL ở trẻ em, bạch cầu cấp dòng lympho T (BCCDL-T) chiếm 10% đến 15% BCCDL ở trẻ em [4]

1.1.1 Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Chẩn đoán xác định BCCDL khi có sự hiện diện của tế bào lymphoblastchiếm hơn 20% tổng số tế bào có nhân trong tủy với Sudan đen âm tính [18].Chẩn đoán xác định dòng lympho dựa trên hình thái học, hóa học tế bào,dấu ấn miễn dịch tế bào và sinh học phân tử

1.1.1.1 Huyết đồ

Huyết đồ giảm 3 dòng tế bào máu thường gặp ở bệnh nhân BCCDL mớichẩn đoán Mức độ nặng hay nhẹ phản ánh mức độ thay thế các tế bào tủy bìnhthường bởi các tế bào lymphoblast

 Số lượng bạch cầu có thể thấp, bình thường hay tăng cao Khoảng 50%bệnh nhân có bạch cầu tăng cao hơn 10 x109/L phản ánh khả năng tăng sinhcủa các tế bào lymphoblast Tuy nhiên khoảng 5% trẻ bệnh BCCDL có số lượngbạch cầu dưới 2 x109/L và thường không phát hiện được lymphoblast trongmáu ngoại biên Bạch cầu tăng cao (>100 x109/L) xảy ra ở 10 - 15% bệnh nhân.Giảm bạch cầu hạt nặng (<0,5 x109/L) gặp ở 40% các bệnh nhân gây nguy cơnhiễm trùng cao [7]

 Thiếu máu đẳng sắc, đẳng bào biểu hiện ở 2/3 trẻ em BCCDL với nồng

độ hemoglobin thường dưới 8 g/dL, phản ánh sự tiến triển của suy tủy [2]

 Giảm tiểu cầu (trung bình khoảng 50 x 109/L) là triệu chứng thường gặplúc chẩn đoán [2]

1.1.1.2 Hình thái học tủy đồ

Hình thái học là sự phân tích về hình thái các tế bào trên tiêu bản tủy đãnhuộm Wright-Giemsa Phân loại BCCDL theo hình thái học dựa trên hệ thốngFrench-American-British (FAB) bao gồm 3 phụ nhóm: L1, L2 và L3 Bảng 1.1

mô tả phân loại hình thái tế bào học BCCDL theo FAB [2], [39] Đặc điểm hìnhthái theo FAB chỉ giúp chẩn đoán 70% các trường hợp BCCDL [2] Tủy đồkhoảng 10% bệnh nhân BCCDL không có tế bào non trong máu ngoại biên nên

tế bào tủy tốt hơn Số lượng tế bào tủy có thể tăng, bình thường hoặc giảm.Tăng sinh rất nhiều lymphoblast và có hiện tượng lấn át các dòng tế bào tủy[1]

Bảng 1.1 Phân loại hình thái tế bào học BCCDL theo FAB

Tế bào lớn, đa dạng, không bào

Hình dạng nhân Đều, có dạng chẽ

hoặc lõm

Không đều, có dạng chẽ hoặc lõm

Đều, có hình oval đến tròn

Hạt nhân Khó phân biệt

hoặc không thấy

Một hoặc nhiều, lớn, rõ ràng

Một hoặc nhiều, lớn, rõ ràng

Hình 1.2 Tủy đồ về BCCDL

(Nguồn: Ajay Vora, 2015 [7])

(A) Lymphoblasts điển hình với tế bào chất ít, hình dạng hạt nhân thường xuyên và

hạt nhân không rõ ràng (B) BCCDL với các tế bào blast lớn cho thấy hạt nhân nổi bật, lượng tế bào chất trung bình và nhiều tế bào blast nhỏ hơn (C) BCCDL với các

hạt tế bào chất Hạt Fuchsia có mặt trong bào tương của nhiều tế bào blast, các hạt như vậy có thể dẫn đến chẩn đoán sai bệnh bạch cầu cấp dòng tủy; Tuy nhiên, các

hạt này âm tính đối với peroxidase và sudan đen (D) BCCDL- B Các tế bào blast

trong kiểu hình này được đặc trưng bởi tế bào chất bắt màu kiềm mạnh và chứa không bào trong tế bào chất (Hình A đến D, nhuộm Wright-Giemsa, độ phóng đại 1000X).

1.1.1.3 Hóa học tế bào

Hóa học tế bào giúp chẩn đoán phân biệt giữa BCCDL và BCCDT và cácdòng của BCCDL thêm chính xác:

 Phương pháp nhuộm Periodic acid – Schiff (PAS) dương tính hơn 70%trường hợp BCCDL [2].

 Thuốc thử acid phosphatase dương tính khoảng 70% các trường hợpBCCDL-T [2]

 Phương pháp nhuộm soudan đen, ASD-chloroacetate esterase âm tínhvới BCCDL [2]

1.1.1.4 Dấu ấn miễn dịch tế bào

Tính chính xác của chẩn đoán sẽ tăng thêm nhờ sự kết hợp với phươngpháp dấu ấn miễn dịch tế bào Phương pháp này sử dụng các kháng thể đơndòng nhằm xác định các kháng nguyên trên bề mặt tế bào gọi là dấu ấn tế bào(CD makers – clusters of differentiation makers) bằng phương pháp Flowcytometry

Hơn 20 năm qua việc phân loại BCCDL đã được cải tiến nhiều hơn giúpphân loại BCCDL thành hai dòng B và T với nhiều phụ nhóm Bao gồm cáckháng thể cho ít nhất một dấu ấn có độ nhạy cao: CD19 cho dòng lympho B,CD7 cho dòng lympho T và các kháng thể cho một dấu ấn đặc hiệu cao:cyCD79a cho dòng lympho B, cyCD3 cho dòng lympho T Phương pháp nàygiúp xác định chẩn đoán 99% các trường hợp [2], [14], [16]

1.1.1.5 Sinh học phân tử

Trong bạch cầu cấp, các bất thường liên quan đến bất thường nhiễm sắcthể (NST) được xác định bằng NST đồ và kỹ thuật Fluorescent insituhybridization (FISH) Nhiều sự thay đổi số lượng NST có ý nghĩa tiên lượng

và quan trọng cho việc điều trị

 Thể đa bội trên 50 NST trong mỗi tế bào ung thư xảy ra ở khoảng 25%bệnh nhân BCCDL ở trẻ em, thường gặp nhất ở trẻ nhỏ, đặc biệt là bệnh nhân

 Thể thiểu bội dưới 44 NST chiếm 1-2% BCCDL ở trẻ em và thuộcnhóm tiên lượng xấu [19].

 Khoảng 75% trẻ BCCDL có chuyển đoạn NST như t(12;21), t(9;22),t(1;19),… các chuyển đoạn này làm hoạt hóa protein kinase bởi gen ung thư vàhoạt hóa các yếu tố phiên mã Chuyển đoạn NST philadelphia t(9;22)(q34;q11)với tổ hợp gen BCR/ABL xảy ra ở 3-6% trẻ em BCCDL Những bất thườngNST này có ý nghĩa nhiều trong vấn đề tiên lượng và điều trị Ví dụ như bệnhnhân có NST Philadelphia thường có tiên lượng rất xấu với thời gian sốngkhông bệnh là 30%

 Chuyển đoạn t(12;21)(p13;q22) là chuyển vị thường gặp nhất, tạonên tổ hợp gen TEL/AML1 chiếm khoảng 20% đến 25% trẻ BCCDL có nguy

cơ chuẩn [33] Trẻ em bệnh BCCDL mang tổ hợp gen TEL/AML1 có tiên lượngtốt với thời gian sống lâu dài khoảng 95% [31]

 Chuyển đoạn t(1;19)(q23;p13.3) là chuyển vị thường gặp trongBCCDL-B, tạo tổ hợp gen TCF3/PBX1 Chuyển vị này được xác định bằng các

kỹ thuật di truyền tế bào như kỹ thuật FISH và RT-PCR, giúp nó trở thành dấu

ấn tiên lượng lý tưởng trong thực hành lâm sàng Ở nhóm bệnh trẻ em, cácnghiên cứu cho thấy TCF3/PBX1 như là một dấu ấn tiên lượng xấu nhưng hầuhết các nghiên cứu gần đây từ các phác đồ hóa trị liệu phối hợp mạnh hơn đãcho kết quả cải thiện đáng kể tiên lượng với tỷ lệ sống còn toàn bộ trên 80%[21], [30]

 Trẻ em BCCDL có chuyển đoạn t(9;22) tạo tổ hợp gen BCR/ABLgặp trong khoảng từ 3% đến 5% BCCDL-B ở trẻ em [8] Những trẻ có chuyểnđoạn t(9;22) tạo tổ hợp gen BCR/ABL và chuyển đoạn t(4;11) với tái sắp xếpgen MLL thì có tiên lượng xấu hơn trẻ có chuyển đoạn khác Tuy nhiên, một

số bệnh nhân có BCR/ABL(+) với tuổi từ 1 đến 9 và số lượng bạch cầu thấpthì có kết quả đối với điều trị tốt hơn [4]

1.1.2 Phân nhóm nguy cơ của bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em theo phác đồ FRALLE-2000

1.1.2.1 Nhóm A: nguy cơ chuẩn

Bao gồm các trẻ em BCCDLB, từ 1-10 tuổi và bạch cầu < 50x109/L và

có đủ các yếu tố sau:

 Không có xâm lấn hệ thần kinh trung ương

 Không có hiện diện t(9;22), t(4;11), t(1;19) hoặc bộ NST < 44

 Không có hiện diện BCR/ABL hay MLL/AF4

 Không hiện diện sự tái sắp xếp gen MLL phác hiện bằng kỹ thuậtSouthern blot hay FISH cho trường hợp CD10(-)

1.1.2.2 Nhóm B: nguy cơ cao

Bao gồm các trẻ em BCCDLB de novo và có một trong những tiêu chuẩn

sau:

 Tuổi > 10

 Có xâm lấn hệ thần kinh trung ương

 Bạch cầu > 50 x109/L

 Có hiện diện t(9;22), t(4;11) hoặc bộ NST < 44

 Có hiện diện BCR/ABL hay MLL/AF4

 Hiện diện sự tái sắp xếp gen MLL phác hiện bằng kỹ thuật Southernblot hay FISH cho trường hợp CD10(-)

 Phân nhóm B1 và B2 vào ngày 21 đợt điều trị tấn công dựa vào sự nhạycảm với corticoid vào ngày 8 và nhạy cảm hóa trị vào ngày 21:

 Nhạy cảm với corticoid: khi số lượng tế bào blast trong máu ngoại biênvào ngày 8 của hóa trị < 1 x109/L

 Kháng với corticoid: khi số lượng tế bào balst máu ngoại biên vào ngày

 Nhạy cảm với hóa trị: khi số lượng tế bào blast trong tủy vào ngày 21của hóa trị < 5%, được gọi là “tủy M1”.

 Kháng với hóa trị: khi số lượng tế bào blast trong tủy ngày 21 trên 5%

 Tủy M2: khi có 6-25% tế bào blast trong tủy

 Tủy M3: khi có > 25% tế bào blast trong tủy

Bảng 1.2 Phân nhóm B1 và B2 vào ngày 21 của hóa trị liệu

tr

1.1.2.3 Nhóm T: nguy cơ cao

 Bao gồm các trẻ em BCCDL-T de novo và tuổi từ 1 đến 20

 Phân nhóm T1 và T2 vào ngày 21 của điều trị tấn công dựa vào sự nhạycảm với corticoid vào ngày 8 và nhạy cảm hóa trị vào ngày 21

Bảng 1.3 Phân nhóm T1 và T2 vào ngày 21 của hóa trị

Nhạy cảm Corticoid ngày 8 Kháng Corticoid ngày 8 Nhạy cảm hóa trị ngày 21 Kháng hóa trị ngày 21 MRD ngày 35 < 10 -2 MRD ngày 35 > 10-2

8

1.1.3 Phác đồ điều trị bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em (FRALLE 2000)

Việc điều trị được đưa ra dựa trên các đặc điểm lâm sàng, phân loại Điềutrị nhắm trúng đích đặc tính sinh học của từng nhóm riêng biệt Có nhiều phác

đồ hoá trị liệu được đưa ra, dựa trên các nghiên cứu lâm sàng đều cho hiệu quả

đối với BCCDL ở trẻ em Mọi phác đồ đều tuân theo quy tắc điều trị chung:điều trị nên bắt đầu càng sớm càng tốt, điều trị dựa trên kiểu hình bệnh, yếu tốtiên lượng và bao gồm các giai đoạn nối tiếp nhau: tấn công, củng cố, phòngngừa độc tính thần kinh trung ương, duy trì trong vòng 2 đến 3 năm.

1.1.3.1 Phác đồ điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em (FRALLE 2000-A)

Nhóm A có phân nhóm A1, A2, A3 ở ngày 21 dựa vào sự đánh giá tế bàoblast trong tủy vào ngày thứ 21 (bất kể nhạy cảm với corticoid vào ngày thứ 8hay không): nhóm A1 blast < 5%, nhóm A2: blast 6-20%, nhóm A3: blast

>20% Bệnh nhân có MRD dương tính vào ngày 35-42 sẽ được chuyển sangnhóm A3 bất kể lúc đầu thuộc nhóm nào Theo phác đồ FRALLE 2000 chỉ cónhóm A3 mới sử dụng methotrexate liều cao trong điều trị Những giai đoạntiêm MTX liều cao là:

 Giai đoạn củng cố: vào ngày thứ nhất (N1) của đợt 2 COPADM2000

 Giai đoạn trung gian: N1, N15 và N29

Sơ đồ 1.1 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm A

Nguồn: [2]

1.1.3.2 Phác đồ điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em (FRALLE 2000-B)

Phác đồ FRALLE 2000 nhóm B1 điều trị bệnh BCCDL ở trẻ em cho thấynhững giai đoạn tiêm Methotrexate liều cao là:

 Giai đoạn củng cố: N29, N43

 Giai đoạn trung gian: N1, N29

Phác đồ FRALLE 2000 nhóm B2 điều trị bệnh BCCDL ở trẻ em cho thấynhững giai đoạn tiêm methotrexate liều cao là:

 Giai đoạn củng cố: N1 của đợt 2 COPADM2000

 Giai đoạn trung gian: N1, N15, N29 của đợt 2 COPADM2000

 Vào ngày thứ 43 đối với trẻ < 4 tuổi

1.1.3.3 Phác đồ điều trị bệnh bạch cầu cấp dòng lympho ở trẻ em (FRALLE 2000-T)

Phác đồ FRALLE 2000 nhóm T1 điều trị bệnh BCCDL ở trẻ em cho thấynhững giai đoạn tiêm Methotrexate liều cao là:

 Giai đoạn củng cố: N29, N43

 Giai đoạn trung gian: N1, N15, N29

 Vào ngày thứ 43 đối với trẻ < 4 tuổi

Phác đồ FRALLE 2000 nhóm T2 điều trị bệnh BCCDL ở trẻ em cho thấynhững giai đoạn tiêm Methotrexate liều cao là:

 Giai đoạn củng cố: N1 của đợt 2 COPADM2000

 Giai đoạn trung gian: N1, N15, N29 của đợt 2 COPADM2000

 Vào ngày thứ 43 đối với trẻ < 4 tuổi

Sơ đồ 1.2 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm B

(Nguồn: [2])

Sơ đồ 1.3 Phác đồ tổng quát FRALLE 2000 nhóm T

(Nguồn: [2])

Tổng quan về Methotrexate

Methotrexate (MTX), trước đây gọi là amethopterin, là một chất hoátrị và là chất ức chế hệ miễn dịch Nó được sử dụng để điều trị ung thư, cácbệnh tự miễn, thai ngoài tử cung và phá thai Các loại ung thư được sử dụngbao gồm ung thư vú, bệnh bạch cầu, ung thư phổi, u lymphoma, Các loại bệnh

tự miễn được sử dụng bao gồm bệnh vẩy nến, viêm khớp dạng thấp và bệnhCrohn

1.2.1 Lịch sử

Năm 1947, một nhóm nhà nghiên cứu do Sidney Farber dẫn đầu đã tìmthấy aminopterin, một chất hóa học tương tự axit folic, có thể làm thuyên giảmbệnh BCCDL ở trẻ em Vào năm 1950, methotrexate (sau đó được gọi làamethopterin) đã được đề xuất để điều trị bệnh bạch cầu [28].Năm 1951, JaneC.W đã chứng minh việc sử dụng methotrexate trong các khối u rắn cho thấy

sự thuyên giảm trong ung thư vú Các nghiên cứu trên động vật được công bốnăm 1956 cho thấy chỉ số điều trị của methotrexate tốt hơn so với aminopterin

1.2.2 Cơ chế tác động

Methotrexate là một chất chống chuyển hóa gây trở ngại cho sự trao đổichất của axit folic Sau khi nhập vào tế bào, MTX là polyglutamate liên kết vớidihydrofolate reductase (DHFR) với ái lực gấp 1000 lần folate và cạnh tranh

ức chế chuyển đổi dihydrofolate thành tetrahydrofolate [17], [37].Tetrahydrofolate rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp thymidin và purin,cần thiết để tổng hợp DNA Phong tỏa của tổng hợp tetrahydrofolate bằng MTXlàm ức chế khả năng tế bào phân chia và sản xuất protein Methotrexate là thànhphần cần thiết để điều trị cho bệnh BCCDL và hoạt động chống lại nhiều loạiung thư, điều này giải thích cho sự hiện diện của nó trên danh sách các loạithuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế Thế giới

Methotrexate là một chất chống chuyển hoá, ngăn ngừa quá trình chuyểnhoá của axit folic MTX đi vào tế bào thông qua quá trình trung gian hấp thuchủ động ở hầu hết tế bào u bởi quá trình làm giảm acid folic Quá trình vậnchuyển thứ hai liên quan đến protein gắn folate ở màng (FBP: Folate bindingprotein) có ái lực với MTX thấp hơn, có thể góp phần cho sự hấp thu các chấtchống folate khác Thứ ba, vận chuyển pH thấp có thể cũng tham gia cho sựhấp thu MTX, đặc biệt xảy ra ở ruột, nhưng nó có vai trò trong sự hấp thu củacác khối u hay không thì chưa chắc chắn Sau khi đi vào tế bào, bằng cách thaythế 4 amino của nó, MTX ức chế một cách hiệu quả enzym DHFR, là chất thaythế dihydrofolate (FH2) dạng oxy hoá thành tetrahydrofolate (FH4) dạng hoạtđộng Ức chế DHFR dẫn đến giảm nhanh chóng các enzym FH4 trong nội bàocần cho quá trình tổng hợp thymidin và purin Kết quả cuối cùng, sự tổng hợpDNA bị gián đoạn và chu trình sao chép tế bào dừng lại MTX được giữ lạitrong nội bào như là một kết quả của quá trình enzym hoá, được gắn thêm 6phân tử glutamate bằng liên kết peptide với gốc carboxyl của nó Sự tạo thànhpolyglutamate này giúp xác định rõ sự nhạy cảm của tế bào bạch cầu cấp vớiMTX MTX polyglutamte hoá làm kéo dài thêm sự ức chế tế bào cũng như hiệuquả ức chế DHFR và làm tăng hiệu quả ức chế lên các enzym phụ thuộc folatekhác như enzym tổng hợp thymidin, enzym tổng hợp purin Các tế bào chuyểnđổi thuốc qua dạng polyglutamate như myeloblast, lymphoblast trong bạch cầucấp sẽ tăng sự ảnh hưởng của thuốc lên nó hơn so với các tiền tế bào dòng tuỷ,với khả năng polyglutamate hoá có giới hạn Sự tích luỹ polyglutamate này liênquan đến tăng độc tính và đáp ứng điều trị ở bệnh BCCDL ở trẻ em.

Hình 1.3 Sơ đồ quá trình chuyển hóa methotrexate ở tế bào

(Nguồn: Howard S C., 2016 [20] )

1.2.3 Liều dùng

MTX được sử dụng với liều từ 12 mg/m2 trong tiêm kênh tuỷ hoặc 20mg/m2 bằng đường uống, tiêm bắp hoặc tiêm mạch duy trì mỗi tuần trong hoátrị liệu BCCDL với liều cao 33000 mg/m2 cho một vài chỉ định khác [47] Liều

500 mg/m2 da hoặc hơn qua tiêm truyền tĩnh mạch được định nghĩa là MTXliều cao và được sử dụng để điều trị một loạt các bệnh ung thư dành cho ngườilớn và trẻ em, bao gồm BCCDL, sarcoma xương và u lympho [5], [43] Mục

đích của liệu pháp MTX liều cao là duy trì nồng độ MTX huyết tương ở mứccao trong thời gian dài (12 giờ - 36 giờ) [23] Nồng độ trong huyết tương củaMTX được theo dõi thường xuyên để kiểm soát nồng độ của thuốc để xác địnhbệnh nhân có nguy cơ độc tính cao và để điều chỉnh giải cứu axit folinic MTXliều cao có thể dẫn đến các độc tính nguy hiểm, không chỉ làm tăng tỷ suấtbệnh, tỷ suất tử vong mà còn làm gián đoạn quá trình điều trị, giảm hiệu quảđiều trị, dự hậu của bệnh Khi bệnh nhân có sự giảm bài tiết MTX, không đượcphát hiện và điều trị một cách kịp thời, sự tích tụ kéo dài nồng độ độc tính củaMTX có thể dẫn đến tỷ suất bệnh, tỷ suất tử vong nghiêm trọng Cần theo dõitích cực, thúc đẩy can thiệp quá trình bài tiết MTX, ngăn chặn độc tính và đồng

ý sử dụng thuốc điều trị sau dùng MTX liều cao [15]

1.2.4 Độc tính của Methotrexate liều cao

Tổn thương thận cấp: mặc dù đã có sự theo dõi sát trong quá trình sử

dụng MTX liều cao, tổn thương thận cấp (AKI: acute kidney injury) vẫn có thểxảy ra khoảng 2-12% bệnh nhân [20] Điều này phụ thuộc vào cơ địa, điều trị

hỗ trợ, liều dùng, cách dùng của MTX liều cao Độc tính thận gây ra bởi MTXliều cao là do tích tụ các phân tử tinh thể trong ống thận, xảy ra khi MTX đivào ống thận và nó chuyển hoá thành chất kết tủa Vì MTX là chất acid, nênthuốc sẽ không kết tủa được ở pH kiềm Vì vậy, kiềm hoá nước tiểu làm tăngkhả năng hoà tan và bài tiết MTX Sự tích tụ tinh thể trong ống thận ban đầuđược thể hiện qua việc creatinin huyết thanh tăng, sau đó quá trình tiến triểndẫn đến hoại tử ống thận và tổn thương thận nặng hơn Vì thể tích đào thải và

độ acid nước tiểu là nguy cơ chính gây tổn thương thận cấp, kiềm hoá trongsuốt quá trình sử dụng MTX liều cao Tương tác thuốc có thể làm giảm sự bàitiết MTX và làm tăng nguy cơ tổn thương thận [35] Các yếu tố đó cạnh tranh

Độc tính ở gan: thường thoáng qua, có thể hồi phục, với tăng men gan

trong 60% trường hợp và tăng billirubin trong 25% trường hợp [6] Tăng mengan này thường không có biểu hiện lâm sàng cũng như cần điều chỉnh liềulượng MTX liều cao về sau Định lượng men gan, billirubin cần được thực hiệntrước khi sử dụng MTX liều cao, để đảm bảo rằng không có viêm gan hay rốiloạn chức năng vì nó có thể tệ hơn sau khi sử dụng MTX Yếu tố nguy cơ làmđộc gan khi sử dụng MTX kéo dài là uống rượu, nhiễm viêm gan siêu vi B, C

Độc tính thần kinh: độc tính lên thần kinh trung ương có thể xảy ra sau

MTX liều cao hoặc xảy ra lúc tiêm kênh tuỷ điều trị Khoảng 11% bệnh nhân

có tổn thương thần kinh trung ương với triệu chứng: đau đầu, chóng mặt, lú lẫn,

co giật có hoặc không có bằng chứng hình ảnh học của xâm lấn não [26] Cơchế giải thích cho tổn thương thần kinh này là do sự tích luỹ dần của adenosin,sản phẩm được tạo ra sau khi MTX làm giảm quá trình tổng hợp purin [12]

Ảnh hưởng niêm mạc: loét niêm mạc miệng thường xảy ra ở một liều

lượng độc tính, làm tăng nguy cơ nhiễm trùng và dẫn đến việc trì hoãn hoá trịliệu, đòi hỏi cần phải có thuốc giải độc tính Sinh lý bệnh liên quan đến hàngrào niêm mạc bị tổn thương là do sau khi sử dụng MTX liều cao làm cho tế bào

bị phá huỷ dẫn đến sự phân chia nhanh chóng của tế bào biểu mô đường tiêuhoá, sự thiếu hoặc chậm dùng thuốc giải axit folinic làm cho tế bào nội môkhông thể trưởng thành và tái tạo [42]

Suy tuỷ: sau dùng MTX liều cao mà chưa được dùng thuốc giải axit

folinic (AF) có thể dẫn đến sự suy tuỷ sâu và kéo dài Tuy nhiên, tần suất vàmức độ của giảm tế bào này sau khi có sử dụng AF đã về mức thấp Khi sự thảitrừ MTX bị gián đoạn do mất vào khoang thứ ba, bù dịch chưa đủ hay tổnthương thận thì giảm dòng bạch cầu hạt, dòng tiểu cầu thường nặng hơn Khi

có suy tuỷ xảy ra, hướng điều trị được đưa ra là truyền chế phẩm máu Việcduy nhất để có thể ngăn không cho suy tuỷ xảy ra đó là ngăn không cho sự giảm

thải trừ MTX có thể xảy ra như tránh tương tác thuốc, bù đủ dịch và đảm bảoliều lượng AF tối ưu [20].

Kỹ thuật định lượng methotrexate

MTX liều cao truyền tĩnh mạch theo sau là thuốc giải AF được sử dụngrộng rãi trong các phác đồ hoá trị liệu Với liều lượng 5000 mg/m2 da trongphác đồ điều trị BCCDL trẻ em FRALLE 2000, việc theo dõi nồng độ MTXtrong huyết tương được đưa ra một cách thường quy để có thể theo dõi nồng độMTX, tránh tình trạng ngộ độc do quá liều dùng và xác định thời điểm can thiệpbằng phác đồ “cứu nguy”, giúp cho việc sử dụng thuốc giải AF có hiệu quả hơntrong việc giảm độc tính Cần theo dõi nồng độ MTX huyết tương đến lúc rấtthấp <0,05 µmol/L hoặc không còn xác định được Có một vài xét nghiệm dùngtrên lâm sàng để định lượng nồng độ MTX huyết tương Kĩ thuật miễn dịch hóaphát quang vi hạt (CMIA) được sử dụng trong xét nghiệm định lượng MTX làmột trong số phương pháp dùng trên lâm sàng

Nguyên lí kĩ thuật miễn dịch hoá phát quang vi hạt:

Mẫu huyết tương của bệnh nhân, anti-methotrexate phủ trên vi hạt thuận

từ, dung dịch pha loãng xét nghiệm và chất kết hợp methotrexate có đánh dấuacridinium được kết hợp lại để tạo hỗn hợp phản ứng Anti-methotrexate phủtrên vi hạt thuận từ gắn với methotrexate có trong mẫu và chất kết hợp có đánhdấu acridinium Sau khi rửa, dung dịch pre-trigger và trigger được thêm vàohỗn hợp phản ứng Kết quả của phản ứng hóa phát quang được tính bằng đơn

vị ánh sáng tương đối (Relative Light Units RLUs) Sự tương quan tỉ lệ nghịchgiữa lượng methotrexate trong mẫu và RLUs sẽ được bộ phận quang học trongmáy phát hiện

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật hóa phát quang vi hạt (CMIA)

Nguồn: https://slideplayer.com/slide/9390882

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 2.

Thiết kế nghiên cứu 2.1.1 Thiết kế nghiên cứu

Mô tả hàng loạt ca

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

Bệnh Viện Truyền Máu Huyết Học Thành phố Hồ Chí Minh (BVTMHHTP.Hồ Chí Minh)

2.1.3 Thời gian

Từ tháng 04/2017 đến tháng 04/2018

Cỡ mẫu 2.2.1 Dân số mục tiêu và dân số chọn mẫu

Tất cả các bệnh nhi (< 16 tuổi) BCCDL điều trị với phác đồ FRALLE

2000 A3, B1, B2, T1 và T2 với MTX liều cao từ tại Bệnh Viện Truyền MáuHuyết Học Thành Phố Hồ Chí Minh

 Điều trị với Methotrexate liều cao từ tháng 04/2017 đến tháng 04/2018

Yêu cầu về mẫu, xử lý và thực hiện xét nghiệm 2.4.1 Yêu cầu về mẫu

Máu được lấy vào ống chống đông EDTA, khoảng 2 ml, vào giờ 24, giờ

 Không sử dụng mẫu máu tán huyết.

 Để có kết quả xác thực, mẫu huyết thanh và huyết tương không nên cófibrin, hồng cầu hay các vật thể lạ khác Mẫu huyết thanh từ bệnh nhân có điềutrị chống đông hay điều trị tan huyết khối có thể chứa fibrin do quá trình đôngmáu chưa hoàn tất

 Để tránh nhiễm chéo, sử dụng pipet hay đầu tip dùng một lần

 Thay pipet hay đầu pipet sử dụng một lần giữa những lần hút mẫu

 Thay đầu pipet giữa các bước pha loãng cho mẫu và mẫu chứng

 Thay găng tay nếu có nghi ngờ nhiễm khuẩn

Bảng 2.1 Tỷ lệ pha loãng Methotrexate

Quy trình pha loãng mẫu:

 Đánh dấu 3 ống sử dụng cho pha loãng mẫu:

 Ống 1: hệ số pha loãng là 20

 Ống 2 : hệ số pha loãng là 400

 Ống 3 : hệ số pha loãng là 8000

 Thêm 950 µl dung dịch pha loãng cho mỗi ống

 Thêm 50 µl mẫu bệnh phẩm vào ống 1

 Lắc trộn mẫu từ 10 – 30 giây để trộn đều

 Ống 1 với hệ số pha loãng là 20 sẵn sàng cho xét nghiệm

 Lấy 50 µl từ ống 1 và thêm vào ống 2

 Lắc trộn mẫu từ 10 – 30 giây để trộn đều

 Ống 2 với hệ số pha loãng là 400 sẵn sàng cho xét nghiệm

 Lấy 50 µl từ ống 2 và thêm vào ống 3

 Lắc trộn mẫu từ 10 – 30 giây để trộn đều

 Ống 3 với hệ số pha loãng là 8000 sẵn sàng cho xét nghiệm

2.4.2.2 Các đặc tính của xét nghiệm định lượng methotrexate trên máy ARCHITECT ci4100

 Khoảng nồng độ đo là khoảng giá trị dao động ở µmol/L đạt giới hạnhiệu năng chấp nhận được cho cả độ không lặp lại và độ lệch cho mẫu khôngpha loãng Khoảng nồng độ đo là 0,40 µmol/L đến 1500 µmol/L

 Độ nhạy :

 Xét nghiệm được thiết kế có giới hạn định lượng  0,004 µmol/L

 Theo hướng dẫn CLSI tài liệu EP17-A2, nghiên cứu được thực hiệnvới 4 mẫu không có nồng độ (mẫu trắng) và 8 mẫu methotrexate nồng độ thấp( nồng độ 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,08; 0,1 và 0,2 µmol/L) Những mẫunày được xét nghiệm trong tới thiểu 6 lần chạy trên 4 ngày sử dụng 2 lô thuốcthử và 2 thiết bị Giới hạn định lượng được định nghĩa là lượng thấp nhất trongmẫu có thể được định lượng chính xác với sai số cho phép 25% Giới hạn địnhlượng cho xét nghiệm Architect methotrexate là 0,02 µmol/L, giới hạn của mẫutrắng là 0,005 µmol/L và giới hạn phát hiện là 0,009 µmol/L

 Độ chính xác: xét nghiệm Architect methotrexate được thiết kế có độkhông chính xác trong phòng xét nghiệm  7,5% CV mẫu có nồng độmethotrexate giữa 0,04 µmol/L và  12,500 µmol/L;  10%CV cho những mẫu

có nồng độ methotrexate >12,500 µmol/L

 Độ tuyến tính: xét nghiệm Architect methotrexate được thiết kế có độlệch từ tuyến tính trong khoảng ± 10% với mẫu có nồng độ methotrexate từ0,04 µmol/L đến 1500 µmol/L

Phương pháp và bộ công cụ thu thập số liệu 2.5.1 Phương pháp thu thập số liệu

Bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn chọn mẫu sẽ được đưa vào nghiên cứu

Thu thập các dữ liệu trong phiếu theo dõi và bệnh án các bệnh nhi điều trị